转基因动物是一种有用的技术，对阐明基因的结构和功能关系，基因在 动物体内表达的调控机理，及改良动物的经济性状等都有意义。但是，目前 普遍应用的转基因技术是直接向受精卵注射外源基因，然后将经过注射的 受精卵进行胚胎移植，效率非常低。在小鼠实验中平均成功率只有2.6％，在 大家畜中成功率还不到1％(Wall.r.j，1996，Therio-genolgy 45：57-68)。 成功率低下带来了高成本，使得动物转基因技术难以普遍应用。现有转基 因技术效率低的主要原因，被认为是对动物胚胎的体外操作，包括从生殖 道中冲出胚胎，对胚胎进行离心处理，用玻璃针向胚胎直接注射DNA等操作 步骤，造成胚胎严重损伤(Wall.R.J.and Sciael，G.Jr.1992， Therogenology 38：337-357)。

本发明的目的是提供一种不对受精卵造成机械损伤的转基因方法，其 技术核心是对精子经过获能处理，使外源基因粘附于精子表面，在精子和 卵子受精结合时将DNA带入卵子内，达到转基因的目的。本发明的其它目 的还包括：通过激素处理使供体母畜更多提供卵子；对受精后的卵进行体 外培养和药物筛选；对转基因胚胎和胚胎移植的后代进行分子及其它的技 术检测，确定外源基因的整合和表达。
本发明与现行方法有很大的不同。其核心区别：本发明方法在受精前 精子经获能处理，和精子表面膜上结合外源DNA，受精后带到卵子。
本发明的内容由以下各部分组成，其核心是精子携带DNA的条件。其 它各部分是提高转基因效率不可缺少的，也是本发明的重要组成部分。现 分述如下：
供体母畜超数排卵技术：
使母畜在一个生殖周期内生产更多的卵子，是提高动物转基因效率的 关键措施之一。本发明采用了多次激素处理母畜的技术，具体方法如下：对 刚刚性成熟或经产母畜从实验第一日起，皮下注射促卵泡成熟素(FSH)30 -50微克/公斤体重。此后，每间隔两日注射一次，用量相同。对家兔总共 注射六次，对羊和牛总共注射八次。在最后一次注射促卵泡成熟素(FSH) 之后的第12小时，由耳静脉注身人绒毛促性激素(HCG)30单位/公斤体重。
本发明也包括用促卵泡成熟素(FSH)和促黄体生成素(CH)相配合诱导 母畜超数排卵，以及用孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛促性激素(HCG) 相配合诱导母畜超数排卵。
受体母畜的激素处理：
受体母畜的处理方法是，在供体母畜注射人绒毛促性激素(HCG)12个 小时之后，静脉注射人绒毛促性激素(HCG)30单位/公斤体重。如此处理之 后，受体母畜可被用来接受胚胎移植。
卵子的收集：
供体母畜在经过人类绒毛促性激素处理之后12-14小时，进行卵子采 集。采集的方法可使用以下两种方法中任何一种。第一种方法是将母畜的 卵巢和输卵管摘除下来，从输卵管中冲出已发生排卵、进入输卵管的成熟 卵子，并用注射器从卵巢上抽取已发育，尚未从卵巢上排出的卵子，用体 外培养法使之成熟。第二种方法是不摘除母畜卵巢，用手术在母畜腹部作 一切口，拉出子宫和卵巢，从输卵管中冲出已排卵到达输卵管的成熟卵子， 并用注射器从卵巢上抽取尚未排卵的已发育卵子。本发明也包括不进行任 何激素处理，直接从屠宰场收集废弃不用的新鲜卵巢，从上面抽取可供体 外培养成熟的卵子，在体外培育成熟并使之受精的采卵技术。
精子获能处理：
采集新鲜精液或使用冷冻保存的精液解冻后，按下列顺序进行获能处 理。将精液0.2毫升加精子洗涤液(一)10毫升混匀，在38℃水浴中温育10分 钟，放在离心机中，在速度达到1000g的离心力条件下离心处理5分钟，弃去 上清液，保留沉淀至管底的精子。在管中加10毫升精子洗涤液(二)，混匀后 在38℃水浴中温育10分钟。再次离心处理，离心条件为离心力800g，时间 10分钟。离心后弃去上清液，在管中加获能液2毫升，不要摇动，把管子 放在38℃水浴中让精子自己上浮，允许精子上浮时间为20分钟。用吸管吸 取液体上部，收集自己上浮的精子，弃去停在管底的精子。将收集到的精子 用精子获能液稀释至每毫升含5×106精子的密度，分成400微升的小滴，小 滴上盖液体石蜡，置于二氧化碳培养箱中保持6-8小时。环境条件为38℃ ，100％湿度，CO25％受精。
受精：
精子在获能液中培养获能后，在培养小滴(400μl获能液上盖石蜡油) 中加入DNA 5-10μg，加入的DNA量视其分子量大小而变化。DNA分子大小超 过10kb的，按每毫升溶液10μg添加，分子大小在10kb以下的按每毫升溶液5 μg添加。加入DNA后，在同样条件下(38℃，100％湿度，5％CO2)温育一小时， 使DNA分子与精子结合。完成DNA分子与精子结合的步骤之后，于每小滴中 放入10-15个卵细胞，继续培养2小时。
胚胎的体外培养：
完成受精过程之后，用吸管将卵子(此时尚无法区分受精卵与非受精 卵)移入胚胎培养液小滴进行培养。培养胚胎的小滴含胚胎体外培养液( 表四)50μl，上复液体石蜡，每个小滴放置胚胎10枚。培养条件仍为38℃ ，100％湿度，5％CO2。对于培养的胚胎，每12小时观察一次，每48小时更换一 次培养液。一般情况下，24小时后可以确定已受精的胚胎和未受精的卵子， 因为此时胚胎已发育到2-8细胞阶段。如不进行其它处理，此时的胚胎即 可进行移植。
转基因胚胎的化学筛选：
本发明包括对含有外源DNA的胚胎进行化学法筛选的步骤，以区别那 些由精子将外源DNA带入胚胎和未带入DNA的胚胎。其原理是在被转移的 DNA分子上带有一个可在胚胎细胞中早期表达的抗新霉素基因。此基因在 胚胎中的表达可使胚胎耐受一定量的G418，能耐受的是含外源DNA的胚胎。 不能耐受的是不含外源DNA的胚胎，将在G418的选择压力下停止发育。本 发明发现在培养液中添加G418的浓度为300μg/ml时，可以有效地区分含有 外源DNA和不含外源DNA的胚胎。选择出的胚胎不一定是真正需要的转基因 胚胎，因为真正需要的胚胎是外源DNA整合到染色体上并且获得表达的胚 胎。但是，筛选步骤可以把那些根本不含外源DNA的胚胎去掉，不必等到 移植后生下仔畜来再区分转基因动物和非转基因动物，可以使工作量减少 一半。
胚胎移植：
如果不进行胚胎筛选，一般在体外培养24-30小时后，胚胎发育到8-16 细胞时进行移植。移植时经过注射HCG的母畜经麻醉后，用手术法将胚胎移 植到两侧输卵管子宫端的三分之一处。移植的数目根据畜种而定，一般比 其正常产仔数多一至两倍。如果进行胚胎筛选，允许被筛选的胚胎发育到 致密桑椹胚胎阶段再进行移植。移植时可以通过手术法将胚胎放到子宫角 上部，也可以通过阴道将胚胎移入子宫深部。移植的胚胎数一般比该畜种 的正常产仔数多一倍。
转基因动物的检测：
本发明使用的转基因动物检测技术基本上与用其它方法转基因相同。 幼畜出生后，在尾部或耳部剪取小块组织，提取DNA，用特异基因探针进行 分子杂交，确证外源基因已插入染色体，如果外源基因生产一种特殊产品， 如乳腺分泌外源蛋白质，则该产品是转基动物的重要标志。如果用其它方 法如显色基因，也可更直观地检测阳性胚胎。
本发明不使用机械方法向卵细胞或受精后的单细胞或多细胞胚胎注射 DNA，避免对它们造成机械性损伤，大大提高了胚胎移植后胚胎的存活率。 同时，药物筛选(G418筛选)使那些不含外源基因或外源基因在胚胎内无功 能的胚胎停止发育，致使移植到受体母畜中的胚胎发育成转基因动物的比 例增加。利用本发明的技术体系，可以使生产转基因动物，特别是小鼠以 外的其它动物的成本降低80％。具体情况可用以下实施例来加以说明：
应该明白，下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明 的范围。
附图说明
图1表示用本发明生产转基因动物的主要工艺流程。供体母畜经激素 处理后发生超数排卵，这些卵通过手术的方法从输卵管中冲出已排出卵巢 之外的输卵管卵①，并从卵巢上用注射器抽出已经发育、但未排出的卵巢 卵子②。卵巢卵子在体外培养成熟后③移到一个器皿中，与事先移入此处 的输卵管卵子⑤放置在一起，用经过获能处理④并带上外源DNA的精子一 同进行体外受精。受精后的胚胎(单细胞或培养到多细胞)移植到供体母 畜体内⑥。生出的后代中有转基因动物，可以通过外源基因或外源基因产 品的检测，找出转基因个体⑦。
图2是现有技术的工艺流程。母畜经激素处理①后，用公畜交配进行 体内受精②。胚胎可通过手术的方法从母畜输卵管或子宫角中冲出来③。 冲出的单细胞或双细胞胚胎在显微镜下用细玻璃针将外源DNA注射到其原 核内(尚未发生融合的来自卵子或精子的细胞核)④。经过外源基因注射 的胚胎被移植到受体母畜体内⑤。出生的后代用检测外源基因或者其产品 的方法，确定哪些是转基因动物。
图3所示为标记基因及其载体结构；
图4表明胚胎经过组织化学染色后，凡有外源基因LacZ的变成兰色，并 因表达强弱不同而兰色深浅不同。非转基因胚胎为无色。
图5所示是LacZ基因在胎儿组织中表达的照片，凡是LacZ基困表过的地 方，都出现兰色，未表达的组织为浅色，图5a为非转基因胎儿染色后未出现 兰色。图5b为转基因兔在LacZ基因表达的组织中显现兰色。
图6为融合质粒的构建过程。
图7为质粒PMT/PGH的详细结构。
图8是斑点杂交和索氏分子杂交的结构。图8a为斑点杂交结果，图8b为 索氏杂交显示。
图9表明转基因兔(大的)与其同窝姐妹(小的)在三月令时的照片。

实施例1、用显色的标记基因生产转基因兔
(1)基因的结构及DNA样品的制备：
实验中使用的标记基因为LacZ基因，它的表达产物半乳糖苷酶可以把 化学试剂X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)降解而产生 兰色，具有直观和可靠的优点。标记基因及其载体结构如附图(三)所示， LacZ基因前面加上了CRE(血管活性肠肽基因)和SRE(C-fos基因血清反应 元)的调控序列，保证标记基因在胚胎早其和胎儿期都能表达。基因尾部 装有SV40PA序列，是LacZ基因在真核细胞表达所需要的。此外，在载体部 分还装有AmpR基因，是载体在大肠杆菌中复制时必要的。NeoR基因是在动 物胚胎用G418筛选时需要的。此载体(PHM-CR)引自国外(Kaestner，et al， 1994，Gene 148：67-70)。DNA制备按《现代分子生物学实验技术》中方法 进行(卢圣栋主编，高等教育出版社，1993)。将含有质粒PHM-CR的大肠杆菌 接种到500ml LB培养基中培养过夜。培温度为37℃，摇床转速为200转/分。 次日，离心收集菌体，离心速度为3000转/分，时间为10分钟，菌体经50ml STE溶液C 0.1M Nacl，10mM Tris.Cl，(PH.8.0，1mM EDTA)洗涤一次， 并按上述条件重新离心收集菌体。加入5ml SI溶液(50mM GLucose，25 mM Tris，CL，PH.8.0，10mM EDTA)悬浮细菌。加入10ml SII熔液(0.2N NaCL，1％SDS)至含菌的离心管中，轻轻将离心管上下颠倒5-7次，并在室温 下放置5分钟。然后，在管中加入7.5ml SIII溶液(5MKAc 60ml+HA。11.5mL +H2O 28.5ml混匀)，轻轻摇匀，在冰上放置10分钟，在高速离心机中将上述 样品离心10分钟，离心条件为离心力12000g，温度4℃。离心完成后，将含 质粒DNA的上清液移入另一个干净的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇混匀， 在室温下放置10分钟，然后，在室温下用12000g的离心力在高速度心机中 离心15分钟沉淀DNA，弃去上清，管底的DNA用70％乙醇漂洗一次，真空抽干乙 醇，将DNA溶解于1.5ml TE溶液中(101mM Tris.CL，1mM EDTA，PH8.0)。此 DNA可不用进一步纯化和进行酶切处理，直接用于转基因试验。
(2)母兔的超数排卵处理：
供体母兔为刚性成熟的新西兰白兔，体重约3.5公斤。饲喂方式为笼 养自由采食，环境条件是自然光照，未采用人工光照调节性周期。母兔激素 处理采用连续6次注射促卵泡成熟素(FSH.，中国科学院动物研究所产品)处 理。第一次注射后，中间隔2日再进行第二次注射，依次类推直至第六次注 射。注射剂量为每次0.15毫克，总量为0.9毫克，注射部位为皮下。在最后 注射FSH后的第12小时，由耳静脉注射人绒毛促性激素(HCG)100单位。对于 受体母兔不注射促卵泡成熟素，只在供体母兔注射人绒毛促性激素之后的 12小时，一次静脉注射人绒毛促性激素100单位，使其性周期被调节到比供 体母兔晚大约12小时。
(3)输卵管卵和卵泡卵的采集：
供体母兔注射人绒毛促性激素(HCG)12.5-13.5小时后，放血处死。在 无菌条件下，用PBS+3mg/ml BSA液从双侧输卵管将卵母细胞和卵丘复合体 冲入平皿，每侧输卵管用冲卵液约5毫升。冲完输卵管中的卵子后，用5ml一 次性使用的注射器吸取卵巢上直径大于2毫米的滤泡中的卵母细胞和卵丘 复合体，置于另一平皿中。在实体显微镜下从冲卵液中和从卵巢抽取液中 检出卵母细胞和卵丘复合体，置于含0.1％透明质酶(Sigma产品)的PSS液中 消化5分钟，温度为38℃。经消化后，粘附的支撑细胞被松散脱离，在实体显 微镜下检出紧密结合在一起的卵子和卵丘复合体，置于另一平皿中用精子 获能液洗两次，移入0.4ml同样溶液的小滴中，盖上石蜡油，放在二氧化碳培 养箱中，在温度38℃，湿度100％和CO2浓度5％条件下培养6-8小时。此时，精 子获能处理完毕，就可以进行受精。
(4)精子的获能和携带DNA处理：
选择精子活力好(评分在80％以上)的公兔，用假阴道采集精液，经显 微镜检查证明精子活力符合要求后，进行如下步骤的处理。取精液0.2ml， 加进盛有10ml精子洗涤液(一)(见表一)的玻璃离心管中，轻轻摇动混匀，放 入38℃的水浴中温育10分钟。取出离心管，擦干外表，放入离心机，在室 温下以1000g的离心力离心处理5分钟。离心机停转后，取出离心管，用干净 管吸去上清液，保留沉淀在管底的精子。然后，在管中加入精子洗涤液(二 )(成份见表二)10ml，轻轻摇动使精子与溶液混合，放入38℃水浴温育15分 钟。取出离心管，如前次一样在离心管中离心处理10分钟。此次，也可以 将离心力降至800g，不过对结果影响不大。第二次离心后，  用吸管轻轻吸 去上清液保留沉淀在管底的精子。下一步是在管中加入2ml精子获能液表( 三)不要摇动，放在38℃水浴中温育20-30分钟，让活动力好的精子游动和上 浮到溶液中，死精子和伤残精子将会留在管子的底部。上浮结束后，吸出上 部三分之二的溶液，取样在显微镜下检查精子的活力和密度，将精子密度调 整到每毫升1-9×106个，分成0.4ml的小滴，置于30毫米直径的玻璃或塑料 培养皿中。小滴上盖上石蜡油，将平皿盖上盖子，置于二氧化碳培养箱中放 6-8小时，环境条件保持在温度38℃，湿度100％，CO2含量5％。
(5)体外受精和基因转移：
体外受精和基因转移在同一个反应中完成。具体操作步骤是，在精子 获能处理结束前一小时，将纯化好的PHM-CRDNA按5mg/μl的用量加入小滴， 使精子与DNA在小滴中共育一小时。然后，将卵子从培养小滴中移入精子小 滴，使精、卵在小滴中完成受精作用，时间为30分钟。完成受精作用后， 用一支口径与卵子直径相近的细玻璃管，轻轻吹打卵子，使粘附其周围的 卵丘细胞脱离。然后，将经过受精处理的卵子(此时，从外观上不好区别 受精卵与非受精卵)移入予先平衡好的发育培养液小滴。
(6)胚胎的体外培养：
胚胎的体外培养在本发明附表(四)中所列的培养液中进行。将胚胎体 外培养液滴在直径30毫米的培养皿底部，作成许多50μl的小滴，上复石蜡 油，防止蒸发。小滴作好后，盖上培养皿的盖子，放入二氧化碳培养箱， 在38℃，100％湿度和5％CO2条件下平衡一小时。然后，将上一节描述的经 过受精处理的卵子按每一小滴放置10枚的密度移入，并按平衡时的条件培 养，体外培养的卵子每12小时观察一次每48小时更换一半培养液。按本发 明的程序，无论是从输卵管收集的卵子或是从卵巢上抽出的卵子，都有较 高的受精率和发育率。表五(见附表)列出了输卵管卵受精和发育百分比， 其中A处理为徐君等人使用的方法(徐君等，1990西北农业大学学报18(1) ：19-24)C处理为本发明使用的方法。表六(见附表)列出了卵巢抽出的卵 子受精和发育情况，其中A处理为Brackett等人的方法(Brackett，B.G.et .al.1982.J.Amdrol.3：402-411)。B处理为本发明的方法。
(7)含外源基因的胚胎的药物筛选：
本实施例使用的基因其载体上还有一个NeoR基因，是筛选标记基因，该 基因的产物可以有效抵抗药物G418对胚胎的毒害作用(参阅附表七)。在上 节胚胎培养操作中，精子与DNA共育后将卵子移入小滴，以便完成受精作 用。然后，又将完成受精作用的卵子移入体外培养小滴，进行体外培养。 进行G418药物筛时，除一切按照上节描述的方法进行外，在体外培养小滴中 添加G418(Sigma产品)浓度为300μg/ml。G418筛选使22-35％的胚胎发育到 多细胞阶段(见附表七)，其结果和外源基因进入并在胚胎中表达高度相关。
(8)X-gal组织化学染色：
早期胚胎的组织化学染色参照Alberts的方法(Alberts.A.S.at.al .1993.DNA and Cell Biology 12：935-943)并作修改后进行。具体方法是， 将胚胎于室温下用PBM，(PBS+2mmol.MgCL2，PH7.4)洗涤三次，每次5分钟。 然后，移入固定液(PBM+0.2％[v/v]戊二醛+0.8％[v/v]甲醛)在室温下固定 三十分钟。固定后的胚胎用含有0.02％(v/v)的NP-40的PBM在室温下洗涤 三次，每次20分钟。完成固定后，将胚胎放入染色液，在37℃染色18-24小 时。染液的成份是：在PBM中添加0.5％mg/ml x-gal，0.5mmol K4Fe(CN)6，0 .5mmol K3Fe(CN)6和0.05％(v/v)Tviton-100。然后，将胚胎取出，经PBM 洗涤后观察并照相。有LacZ基因表达的胚胎出现兰色，为转基因胚胎(见附 图4所示)胎儿和出生后幼畜的组织染色略有不同(参阅Gardmer，D.P.et .al，Transgenic Research 5：37-48)附图4表明胚胎经过组织化学染色后 ，A有外源基因LacZ的变成兰色，并困表达强弱不同而兰色深浅不同。非转 基因胚胎为无色。具体方法是：胎儿从子宫中取出元后，先用PBS(PH7.4) 冲洗三次，再用含4％多聚甲醛的PBS在4℃下固定2小时。完成固定后，在PBS 中漂洗三次，每次10分钟。然后染色12-16小时，染色液是在PBM(PH8.0)中 添加：0.5mg/ml X-gal，20mmol K3Fe(CN)6，20mmol K4Fe(CN)6。完成染 色后用PBS冲洗三次，每次10分钟。后固定用含4％多聚甲醛的PBM，在4℃下 反应1小时。后固定完成后胎儿组织使用乙醇梯度脱水，分别在50％、60％、 70％、80％、90％和100％的乙醇溶液中浸泡24小时。最后，用二甲苯清晰化， 照相，附图5所示是LacZ基因在胎儿组织中表达的照片，凡是LacZ基因表达 的地方，都出现兰色，未表达的组织为浅色，图5a为非转基因胎儿染色后未 出现兰色。图5b为转基因兔在LacZ基因表达的组织中显现兰色。
(9)X-gal组织化学染色与G418筛选的比较：
经300μg/ml G418选择培养的胚胎到72小时，胚胎已育到致密桑椹胚阶 段，不能抵抗G418的胚胎已停止发育在早期阶段，按上节胚胎染色的方法对 这些胚胎染色，并比较能发育到桑椹胚有胚胎占实验中使用的原核胚数和 兰色胚胎数。结果发现凡经过G418筛选的胚胎全部为兰色，一些未发育到 桑椹胚阶段的胚胎也有显示兰色的。反映了基因在胚胎中的复杂情况，有 的胚胎中虽含有外源DNA，但表达较低，不能有效抵御G418的选择压。这 一结果列在表七中，可供比较两者关系。
(10)胚胎移植：
胚胎移植采用输卵管移植法。体外受精后24-30小时，此时胚胎发育到 2-8细胞阶段，可供向输卵管移植。具体方法是：受体母兔耳静脉注射0 .3ml/只麻醉剂846(长春解放军农牧大学产品)全身麻醉，在腹部作5cmm长 的切口，暴露输卵管，用玻璃针从培养小滴中吸取胚胎，放入输卵管子宫端 三分之一处。每侧输卵管移入胚胎6-8枚。移植完成后缝合伤口并彻底消 毒和敷上消炎药，移植的另一种方法是将胚胎培养到桑椹胚或囊胚时再进 行，程序基本相同，但胚胎要放在子宫角，而不是输卵管。
检测阳性转基因动物可以在妊娠中期或待胎儿产出后进行，检测方法 是组织化学染色(方法已在第9节中描述)。实验中得到的转基因动物是 中途停止妊娠的胎儿，结果显示在图5中。
实施例2：用生长激素基因生产转基因兔
(1)表达载体的构建：
实验中使用的基因是羊金属硫蛋白基因(MT)启动子和猪生长激素基因 (GH)的融合基因。羊MT基因启动子(在PMT011上)为澳大利亚科学家Murra y赠送，其公开之处为：MURRAY J.D，Nancaarrow.C.D，Marshall，j.t，haxel ton，I.G，amd Ward，k.a，(1989)，Produotion of tramsgenic merimo she ep by microinjection of ovine metallothionein-ovin growfh hormo ne fusion genes，Rep.Fert，Dev.1.147-155)，猪生长激素基因是中国科学 院发育生物研究所采德秀教授惠赠。融合基因构建过程如图六所示，将质 粒PMT011用内切酶BamH1切开，同时将质粒PGH，pGH结构公开之处为(Vixe，P. D.and Wells，J.R.E.(1987)GENE，55：339-344)用BamH1和Sal1进行双酶切， 将BamH1——Sal片段从质粒载体上切下。用电泳的方法纯化BamH1—— Sal1 DNA片段(参照曼尼安蒂斯《分子克隆手册》中的方法)，此片段中含有 完整的猪生长激素基因。然后，将此片段加到已用BamH1切开的质粒载体P MT-011中，加T4DNA连结酶连上5’端。此后，用DNA多聚酶大片段补平3’端， 再用T4DNA连结酶封合质粒，就得到了重组质粒PMT/PGH，用BamH1可将此质 粒上的羊MT/猪GH融合基因切下，用于生产转基因兔，融合质粒的构建过程 如图6所示，质粒PMT/PGH的详细结构如图7所示。DNA操作过程基本上按 照已发表的方法进行(卢圣栋等，现代分子生物学实验技术，1993，高等教育 出版社)。
(2)动物胚胎操作：
供体动物和受体动物的激素处理，卵子的采集，精子获能技术，精子携 带DNA的处理，体外受精，胚胎体外培养和胚胎移植等技术环节，完全与实施 例1中的方法相同，这里不再重复叙述。
(3)胚胎和转基因兔的检测：
A探针的准备
采用DNA缺口平移法标记探针，条件如下：
10×缺口平移缓冲液                     5μl
DNA(aMT启动子)                        1μg
未标记dMTPs                            3μl(1mmol/L)
[α-32P]dCTP                          100pmol
双蒸水                                 44μl
将混合物冷却至0℃，加入0.5μl DNase I(0.1μg/ml)至反应混合液 中，涡旋混合均匀，然后加入大肠杆菌DNA聚合酶I，混匀，16℃保温60分钟， 加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应。
B样品总DNA的提取及酶切处理
(i)兔肝DNA的提取
取少量肝组织冰冻后一研钵捣碎，加入细胞裂解液(0.5mEDTA，pH8.0，0. 5％SDS；蛋白酶K100μg/ml)于37℃摇床消化5-6小时，消化完全后经酚抽提2 次，再用氯仿∶酚(1∶1)抽提一次，然后用乙醚提取2-3次。抽提完毕加入等 体积无水乙醇，摇晃充分于-20℃过夜，次日离心沉淀弃上清，用70％酒精洗 2-3次，于真空干燥器中抽干。
(ii)兔耳DNA的提取
a.切一小块 耳组织剪去耳毛，用蒸镏水洗静再剪碎放于1.5ml eppendorf离心管。
b.加入0.7ml破碎液(50mM Tris，8.0，1.00mM EDTA，0.5％SDS)，再加入 35μl 10mg/ml蛋白酶K溶液。
c.55℃培养过夜(水浴摇床)
d，取出加入0.7ml苯酚，振荡3分钟，混合液相。
e.离心3分钟，分离相面，转移水相于新管。
f，加酚抽提，以下处理同提肝DNA。
沉淀出来的DNA用TE pH8.0溶解后，加入BamHI及SalI酶切，酶切后，加 入0.5Mol/L EDTA，使终浓度为10mMol/L，终止反应。
C.斑点杂交点样
(1)20μg DNA，用10N NaOH调至0.3M。
(2)热水煮沸10分钟后立即置入冰水使迅速充分冷却。
(3)室温平衡5分钟，然后用乙酸铵调至2M。
(4)将硝酸纤维膜浸泡入20×SSC至少5分钟。
(5)用膜置于点样板上(真空抽气)，点样。
(6)吸5ml点样，待吸干后继续点样，直至点完。
(7)空气干燥1小时。
(8)室温50ml 6×SSC洗膜两次。
(9)吸干，空气干燥1小时。
(10)80℃真空炉烤干2小时，夹于两滤纸保存。
D.索氏转移(Southern transgfering)
(1)20μg DNA经酶切后，于70％琼脂糖凝胶电泳分离。
(2)电泳毕，EB染色并照相。
(3)将凝胶浸入3倍体积的0.5N NaOH 1.5mol/L NaCl溶液中，室温摇晃 1小时变性DNA。
(4)浸入于3倍体积中和液(1mol/L Tris.Cl，pH8.0.1.5mol/L NaCl) 室温摇晃中和DNA。
(5)剪取与胶同样大小的硝酸纤维膜浸于5×TBE 10分钟，胶也浸泡10 分钟。
(6)于LKB2110多功能电泳仪上进行电转[70]，电转电流20mA，电转时间 8小时左右。
(7)电转毕，取出胶及膜，紫外灯观察转移效果。
(8)将膜浸入5×SSC室温5分钟。
(9)于滤纸上干燥。
(10)真空80℃烤干2小时。
E.斑点杂交及索氏杂交(dotbloting and southren hybridization)
(1)烘烤固定后的硝酸纤维膜置于6×SSC5分钟。
(2)将膜置入塑料袋(略大于膜)缝合三边，加入杂交液(含50％甲酰胺) 至正好润湿膜面，加入50微克[α-p32]-OMT/pGH融合基因片段。
(3)42℃杂交20小时后，取出杂交袋剪一角倒出杂交液于废液桶，剪三 边取出膜。
(4)洗膜，条件如下[73]：
6×SSC        4℃         10分钟        1次
6×SSC        42℃        10分钟        1次
6×SSC        室温        5分钟         2次
2×SSC        室温        5分钟         2次
洗膜后，用同位素检测仪测其放线性强度，如本底太高，应重新洗膜。
F.X-底片曝光：
将杂交好的膜在室温阴干后，放入底片夹，盖X-光胶片。放射性粒子将 使X光片曝光，在底片上留下分子杂交结果。X-光底片经冲洗后保存。
图8是斑点杂交和索氏分子杂交的结果，阴性样本只留下本底信号， 转基因动物身上取下的DNA给出强阳性信号，表现为明显黑色斑点(斑点杂 交)或电泳图上的黑色条带(索氏杂交)，附图8转为基因兔分子检测。斑点 杂交(图8a)和索氏杂交(8b)显示，转基因兔的染色体DNA可以和特异性探针 杂交。
(4)转基动物表型观察：
本例中转移的是猪生长基因。猪的生长激素基因在兔中有生物活性， 可以刺激兔快速生长。转基因兔和它们的同窝兄弟姐妹饲养在完会相同的 条件下，每月对它们称重一次，记录增重速度。转基因兔的生长速度比同 窝的兄弟姐妹快50％——70％。图9是转基因兔(大的)与其同窝姐妹(小 的)在三月令时的照片，图9表明转基因兔(左)比其同窝姐妹(右)生长快。
        表一、精子洗涤液(一)的配方成份
成份                                         含量(mg/100ml)
Na2HPO4·12H2O                           580
KH2PO4                                    40
Nacl                                         1800
KCl                                          100
MgCl2·6H2O                               20
CaCL2·2H2O                              26
K-青霉素                                     20
脂蛋白                                       200
Triton 100                                   50μL
PH8.0
        表二 精子洗涤液(二)配方   成份 含量(mg/100ml)   NaH2PO4·H2O     12   NaHCO3     395   Nacl     655   Kcl     50   CaCl2·2H2O     33   MgCl2·6H2O     11   葡萄糖     300   青霉素     10   链霉素     5   PH7.5
       表三 精子获能液  成份 含量(mg/100ml)  NaH2PO4·H2O     12  NaHCO3     395  NaCl     655  KCl     50  CaCl2·2H2O     33  MgCL2·6H2O     11  葡萄糖     500  丙酮酸钠     20  ATP     5  脂蛋白     300  青霉素     10  链霉素     5  DMSO     5％(v/v)  酚红     1％(v/v)  PH8.0
  表四 胚胎体外培养液 M199(GIBCO公司产品) 10％FBS(国产品) 1.25mmol丙酮酸钠(GIBCO产品) 0.1mmol EDTA(SIGMA产品) 青霉素G    0.1mg/ml 链霉素     0.05mg.ml
         表五 不同获能方法对输卵管卵发育的影响   组别   重复次数     卵子数   24小时卵裂数   囊胚数   A   7     84   27(32.1％)   23(27.3％)   B   7     154   100(64.9％)   90(58.4％)   C   14     764   700(91.6％)   651(85.2％)
A.DM法(徐君等，西北农业大学学报，1990.18(1).19-24
B.DM-H1S法(赵庆顺等，江苏农业学报，1992.8(2)：25-30)
C.本发明的方法。
        表六 不同获能方法对卵泡卵子发育的影响 组别 重复次数     卵子数  24小时卵裂率   囊胚率 A 14     258   153(59.3％)   137(53.1％) B 4     38   26(63.2％)   17(44.7％)
     表七  G418选择和X-gal染色结果比较     组别   原核胚数     致密桑堪胚数   兰色胚胎数     1   22     5(22.7％)   9(40.9％)     2   14     5(35.7％)   7(50.0％)     总计   36     10(27.8％)   16(44.4％)