通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法
阅读：367发布：2020-06-06
专利汇可以提供通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种通过敲除 口 蹄 疫 病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体 转染 羊或猪的 胎儿 成 纤维 细胞 ，通过同源重组获得替换整合素β6亚基基因的核供 体细胞 ，将核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫中，得到的子代即为整合素β6亚基基因被敲除的杂合子转基因羊或猪。杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因羊或猪。用本方法获得的转基因羊或猪低表达或不表达口蹄疫病毒受体整合素β6亚基，使FMDV感染率明显下降，其具备了抗FMD的能 力 。，下面是通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法专利的具体信息内容。
1.一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊或猪的胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素β6亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫中，得到的子代即为整合素β6亚基基因被敲除的杂合子转基因羊或猪。
2.根据权利要求1所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于，还包括以下方法：杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因羊或猪；
或：杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配繁殖而获得纯合子转基因羊或猪。
3.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊为绵羊或山羊。
4.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊或猪胎儿成纤维细胞为35～50日龄胎儿不同组织来源的成纤维细胞。
5.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述羊或猪胎儿成纤维细胞为耳成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞或卵丘细胞。
6.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊或猪胎儿成纤维细胞方法为电转染法、脂质体转染法、病毒载体法或磷酸钙沉淀法。
7.根据权利要求6所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊或猪胎儿成纤维细胞方法为脂质体转染法。
8.根据权利要求7所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述脂质体转染法的条件为：线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA∶脂质体LTX＝1∶3。
9.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
10.根据权利要求1或2所述的通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，其特征在于：所述去核卵母细胞不带有第一极体。
通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄
疫转基因羊或猪的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种动物转基因技术，尤其涉及一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素(Integrin)β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，属于细胞工程领域。
背景技术
[0002] 口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其列为A类烈性传染病之首。一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物，不仅会造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。
[0003] 目前，大多数流行FMD的国家以计划免疫为主的措施预防FMD。尽管新型疫苗不断涌现，但传统灭活疫苗仍是预防FMD的基础。FMDV变异快，血清型多，且不同血清型疫苗之间没有交叉保护，故通过疫苗免疫的单一手段很难控制和根除FMD。因此，科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除、沉默或封闭病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。
[0004] 病毒受体是能够被病毒识别并与之结合，进而导致病毒感染的宿主细胞表面分子，是病毒宿主特异性和组织嗜性的关键因素。FMDV体外感染的受体包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPGs)。一些FMDV弱毒及细胞培养适应毒株可利用HSPGs感染体外培养的细胞(O’Donnell等，2008)，但HSPGs可能只作为一种附属分子增强其它受体的效率，尚无证据表明其在FMDV野毒株感染细胞过程中起作用(Monaghan等，2005)。
[0005] 整合素αv亚家族成员中αvβ1、αvβ3、αvβ6及αvβ8是FMDV感染体外细胞的表面受体(Gutiérrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005；Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Sáenz等，2009；Johns等，2009)，其中整合素受体β6亚基是启动FMDV强毒自然感染的关键性β受体亚基，原因在于：(1)FMDV主要经上呼吸道感染动物，在口咽或相关淋巴组织的上皮细胞起始复制后迅速扩散到口部和蹄部的上皮细胞。在4种整合素受体中，只有αvβ6仅限于FMDV组织嗜性的上皮细胞表面持续且高水平的表达(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮细胞可同时检测出αvβ6和病毒抗原(O′Donnell等，2009)。(2)体外合成的αvβ6可与所有血清型的FMDV结合(Ferris等，2005)，并且亲和力最强(Burman等，2006)，这不仅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亚基成为FMDV整合素受体中利用率最高的β亚基(Duque等，2003)。(3)不仅FMDV非敏感细胞转染β6亚基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗体可抑制受体与病毒间的结合并阻断病毒感染(等，2007；Jackson等，2000)。
[0006] 转基因动物的制作方法主要有逆转录病毒法、受精卵原核显微注射法、精子载体法、ES细胞技术和转基因体细胞核移植技术等，其中受精卵原核显微注射法和转基因体细胞克隆是目前世界各国科学家比较常用的家畜转基因技术。转基因体细胞克隆技术是基因组修饰技术与动物体细胞核移植技术有机结合而产生的一种新的转基因动物制作技术，它部分地克服了传统转基因动物外源基因整合率低、大动物生产成本高的技术瓶颈，代表当前转基因动物制作的主流方向，利用该方法已经相继克隆出转基因牛、山羊和猪等。
[0007] 基因打靶是在胚胎干细胞和同源重组技术基础上产生的，是改变生物体遗传信息的转基因技术，包括通过同源重组将外源基因/修饰的自身基因定点整合到受体细胞基因组(knock in)及将宿主细胞特定基因区段敲除(knock out)。该技术在小鼠转基因中被广泛应用，但是，由于大动物没有公认的家畜ES干细胞系而无法在ES干细胞水平上进行基因打靶，1997年多莉羊的诞生为体细胞基因打靶制备转基因动物开辟了新的途径。用体细胞介导的基因打靶技术制备转基因动物突出的优点是：(1)可以避开复杂的ES细胞技术；(2)可以不经过嵌合体中间步骤；(3)可以控制转基因动物性别；(4)能够在体细胞体外培养水平进行整合筛选和基因打靶，因而可以显著降低制备转基因动物，特别是转基因家畜的成本，在生物技术领域具广阔前景。尽管体细胞体外培养传代的有限性是体细胞基因打靶研究的难点并且成功率低，但是近年来体细胞基因打靶研究也获得了一些突破性进展。2000年，McCreath等首次将α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到绵羊胎儿成纤维细胞的a1原胶原基因座上，获得了AAT较高表达水平的转基因克隆绵羊。随后，国内外科学家相继利用体细胞克隆和基因打靶手段研制出不同的转基因动物。
[0008] Yu等(2006)报道利用基因打靶技术获得敲除了朊病毒一个PrP基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观察这些基因敲除羊没有异常表现。Richt等(2007)利用基因打靶技术灭活牛的PRNP基因，获得生长发育正常、存活2年以上的转基因牛，它们能够很好地抵抗疯牛病的传染。
[0009] 参考文献：
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发明内容
[0029] 针对上述现有技术，本发明的发明人进行了研究，研究表明，整合素β6亚基基因被替换或敲除的杂合子或纯合子转基因羊或猪，低表达或不表达口蹄疫病毒受体β6亚基，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。因此，通过敲除整联蛋白β6亚基的方法是获得抗FMD的转基因羊或猪的最佳方法之一。
[0030] 本发明的目的是提供一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法。通过本发明的方法获得的转基因羊或猪低表达(杂合子)或不表达(纯合子)口蹄疫病毒受体整合素β6亚基，其FMDV感染率明显下降。
[0031] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0032] 一种通过敲除口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因获得抗口蹄疫转基因羊或猪的方法，是将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的打靶载体转染羊或猪的胎儿成纤维细胞，通过同源重组获得替换整合素β6亚基基因的核供体细胞，将核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫中，得到的子代即为整合素β6亚基基因被敲除的杂合子转基因羊或猪。
[0033] 还包括以下方法：杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因羊或猪；或：杂合子转基因公畜和杂合子转基因母畜正常交配繁殖而获得纯合子转基因羊或猪。
[0034] 所述羊为绵羊或山羊等。
[0037] 所述脂质体转染法的条件为：线性化的载体DNA浓度不低于1μg/μL，DNA∶脂质体LTX＝1∶3。
[0038] 所述将线性化的携带有报告基因的突变的整合素β6亚基基因的核供体细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞的方法为显微注射法。
[0039] 所述去核卵母细胞不带有第一极体。
[0040] 本发明利用同源重组和体细胞克隆的方法将线性化的携带有突变的整合素β6亚基基因的第一次打靶载体转染羊或猪胎儿成纤维细胞，获得整合素β6亚基基因敲除的核供体细胞，将其细胞核导入羊或猪的去核卵母细胞中得到重构胚，再将重构胚移入代孕羊或猪的子宫中，得到的子代即为整合素β6亚基基因敲除的杂合子转基因羊或猪。杂合子转基因羊或猪经二次打靶和体细胞克隆获得纯合子转基因羊或猪。用本方法获得的转基因羊或猪低表达(杂合子)或不表达(纯合子)口蹄疫病毒受体整合素β6亚基基因，使FMDV感染率明显下降，具备了抗FMD的能力。本发明打破了传统的通过免疫学手段预防FMD的思维模式，为控制和消灭羊和猪FMD开辟了新的途径，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。附图说明
[0041] 图1为体细胞克隆整合素β6亚基基因被敲除的转基因羊和猪的生产流程图。
[0042] 图2为绵羊整合素β6亚基基因打靶载体的构建示意图。
[0043] 图3为整合素β6亚基基因左侧同源臂重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中，M:DL marker10,000 1：Not I/SalI酶切pRui-S-β6-Left重组载体；2：Not I/SalI酶切pRui空载体对照。
[0044] 图4为整合素β6亚基基因右侧同源臂重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中，M:DL marker10,000；1：Xho I/EcoR I酶切pMD19-Right重组载体；2：XhoI/EcoRI酶切pMD19-T空载体。
[0045] 图5为整合素β6亚基基因第一次打靶载体的质粒酶切鉴定结果，其中，M:DL marker10,000；1：XhoI/EcoR酶切pRui-S-β6鉴定羊右臂；2：NotI/SalI酶切pRui-S-β6鉴定羊左臂。
[0046] 图6为用于β6基因发生第一次同源重组PCR鉴定方法中阳性模板质粒的酶切鉴定结果，其中，M:DL marker 10,000；1.Not I和SalI酶切pRui对照；2.Not I和SalI酶切鉴定pRui-Yang-model。
[0047] 图7为转基因绵羊杂合子胎儿成纤维细胞PCR鉴定结果，pRui-S-β6打靶绵羊胎儿成纤维细胞后形成的单克隆，在跨Left小臂的引物Py-1，Py-2，Py-3，Py-4的引导下，PCR分别扩增3085，3344bp的片段。其中，1为阴性对照、2，3为阳性对照、4-11为未打靶成功的克隆细胞、12-15为两组打靶成功的同源重组阳性克隆细胞。
具体实施方式
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明。
[0049] 下述实施例中无特别说明均为常规方法，所用试剂及药品如无特别说明均购自Sigma公司。
[0050] 实施例1：体细胞克隆整合素β6亚基基因敲除的杂合子转基因绵羊的生产及分子生物学检测
[0051] 体细胞克隆整合素β6亚基基因敲除的杂合子转基因绵羊的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：
[0052] 1.整合素β6亚基基因敲除的第一次打靶载体的构建
[0053] 整合素β6亚基基因敲除第一次打靶载体的构建如图2所示，具体方法如下：
[0054] 以绵羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pL-upper：
[0055] 5’-ATAAGAATGCGGCCGCGCGAGAACTGAAACGGATG-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶NotI的识别位点)
[0056] 和引物pL-lower：
[0057] 5’ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶SalI的识别位点)
[0058] 引导下，PCR克隆片段为1979bp片段，反应条件为：94℃ 30s；94℃ 20s 55℃ 20s68℃2min，25个循环；68℃ 5min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1979bp片段，TA克隆至pEASY-T3(北京全式金公司)载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒。酶切鉴定出含有Left片段的pT3-Left重组质粒，用NotI和SalI酶切该质粒后回收Left片段，并与经相同酶切的载体pRui连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-S-β6-Left(图3)，该载体包含有Integin beta 6基因第一内含子区和第三外显子区。
[0059] 以绵羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物pR-upper：
[0060] 5’-CCGCTCGAGAAAGAAGTGGAGGTGAACAGC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶Xho I的识别位点)
[0061] 和引物pR-lower：
[0062] 5’-CCGGAATTCTGCAGTTACAGTACTCTCCTGTC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶EcoRI的识别位点)
[0063] 引导下，PCR克隆片段为5584bp片段，反应条件为：94℃ 30s；94℃ 20s 55℃20s 68℃4min，25个循环；68℃ 7min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收5584bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后摇菌，提取质粒，酶切鉴定出含有Right片段的菌落命名为pMD19-Right(图4)，将pMD19-Right用上面的引物进行扩增，Xho I和EcoR I酶切后回收Right片段与经相同酶切的载体pRUI-S-β6-Left连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-S-β6，通过Xho I和EcoR I、NotI和SalI分别双酶切pRui-S-β6，检测结果显示Left同源臂与Right同源臂片段均已插入pRui-S-β6中(图5)。pRui-S-β6经序列分析表明，载体上分别插入了绵羊的Integin beta 6的两条基因片段。
[0064] 将载体pRui-S-β6经过限制性内切酶NotI线性化，用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司)回收浓缩纯化14.9kp的线性片段，将其溶解在无菌的超纯水中，-20℃保存。目前GenBank中尚无羊的整合素β6亚基基因序列，只有该基因所编码的mRNA(NM 001113772)被公布，在与mRNA序列比对的同时，我们将所获得的部分羊的整合素β6亚基因序列与牛整合素β6亚基基因序列(NW 001494599)进行了比对，并对我们的pRui-S-β6打靶载体进行了分析。5’端第7-1986位核苷酸序列为推测的Integin beta 6基因第一内含子区和第二、第三外显子区与第二、第三内含子区；第1987-2020位核苷酸序列为Loxp位点；第2021-3840位核苷酸序列为PGK-Neo序列；第3841-3874位核苷酸序列为Loxp位点；第3881-9465位核苷酸为推测的Integin beta 6基因十一外显子区，十一内含子区和十二外显子区；第9466-11791位核苷酸序列为PGK-TK序列，见序列表1。
[0065] pRui-S-β6打靶后，绵羊Integin beta 6基因的第三内含子区至第十内含子将被PGK-neo基因所替换。
[0066] 2.羊胎儿皮肤成纤维细胞系的建立
[0067] 选用30-35日龄的绵羊胎儿，用70％酒精清洗包被绵羊胎儿的羊膜数次后，刺穿3
羊膜，取出绵羊胚胎，于PBS液中洗数遍，取胎儿皮肤组织，剪碎成小块(体积小于1mm)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋白酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含
10％胎牛血清的DMEM:F12营养液分散，1000rpm 10min，再加入10％胎牛血清的DMEM:F12
5
营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10 的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％ DMEM:F12，10％FBS和10％DMSO)，获得羊胎儿皮肤成纤维细胞系。
羊膜，取出绵羊胚胎，于PBS液中洗数遍，取胎儿皮肤组织，剪碎成小块(体积小于1mm)，再用PBS洗2遍后，加入10mL的胶原酶和胰蛋白酶混合液37℃消化20-40min后，加入20mL含
10％胎牛血清的DMEM:F12营养液分散，1000rpm 10min，再加入10％胎牛血清的DMEM:F12
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营养液重新悬浮，细胞计数，按3.0×10 的细胞量接种于100mm的培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养2-3d，待细胞生长至单层后，用0.25％胰蛋白酶消化传代1次，液氮保存(冻存液成分为：80％ DMEM:F12，10％FBS和10％DMSO)，获得羊胎儿皮肤成纤维细胞系。
[0068] 3.羊胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选
[0069] 处于对数生长期的羊胎儿皮肤成纤维细胞，用Opti-MEM洗1次细胞，将载体DNA线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染细胞(DNA∶脂质体LTX＝1∶3)，24h后加入700μg/mL G418和8μM Gancvilor作为筛选压力进行筛选，每3d换液1次，
10d后用0.25％胰蛋白酶消化形成的克隆细胞，培养2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。
10d后用0.25％胰蛋白酶消化形成的克隆细胞，培养2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。
[0070] 4.卵母细胞的成熟培养
[0071] 将取自周边地区屠宰场的成年绵羊的卵巢，用30℃的生理盐水清洗3遍后，用20G的针头抽取直径为1-5mm的卵泡，回收形态均匀、多层卵丘细胞紧密包围的、呈现明显放射冠的的卵丘-卵母细胞-复合体，将其用成熟液(M199培养液中添加10％FBS、10mmol/L NaHCO3、10mg/mL oFSH(Ovagen，ICP，NewZealand)、1mg/mL oLH(ICP)、1mg/mL estradiol、0.1mMcysteamine、50mg/mL kanamycin)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体移入已在二氧化碳培养箱中至少平衡了2h的成熟培养液滴中(上有液体石蜡覆盖)，置于39℃、
5％ CO2的培养箱中培养17-19h，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡
2-3min后，用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞和卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀，并排出第一极体的成熟的卵母细胞为胞质受体。
5％ CO2的培养箱中培养17-19h，将成熟的卵母细胞放入含0.1％透明质酸酶的管内振荡
2-3min后，用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞和卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀，并排出第一极体的成熟的卵母细胞为胞质受体。
[0072] 5.核移植和克隆胚胎的体外培养
[0073] 将步骤4获得的第一极体的卵母细胞移入操作液(M199培养液中添加10％FBS，7.5μg/mL细胞松弛素B)中，在200倍显微镜下用玻璃针于极体上方的透明带切一小口，再用内径20μm的玻璃管将第一极体及其下方的卵母细胞的染色体一并吸除，再用含20％的FBS的M199液体培养基洗3遍，置于38.5℃、5％CO2的培养箱中备用。将步骤3获得的转基因细胞活化至长满单层，用0.25％胰蛋白酶消化，悬浮细胞，离心去上清，再加微量的营养液悬浮，用玻璃针选择胎儿皮肤成纤维细胞的细胞核，用20μm的玻璃管将其移入去核的卵母细胞的透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇、0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4，0.5mMHEPES及0.05％FAF-BSA的溶液中，3-5min后放入融合槽内，转动卵母细胞使供体细胞核与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.26KV/cm、脉冲时间为16msec、脉冲次数为2次的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)，10min后，体视镜下镜检，确认供体细胞与卵母细胞膜的融合。将融合胚胎移入预先平衡好的SOFaaBSA+8mg/mlFAF-BSA溶液中，于38.5℃，5％CO2培养箱培养。放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步的激活处理，重构胚胎在early-SOF溶液培养3～6h后，移入HSOF+1mg/mlFAF-BSA溶液中冲洗并保留在此溶液中10min，然后，将其移入新鲜配置的HSOF+5μM Ionomycin+1mg/mlFAF-BSA溶液中，于37℃激活4min，迅速移入HSOF+30mg/mlFAF-BSA溶液冲洗三遍并保存在其中，从移入该溶液起计时5min后，再将重构胚胎转到SOFaaBSA+10％FBS+2mM 6-DMAP溶液中继续培养4h。绵羊克隆胚胎体外培养体系为SOFaaBSA+8mg/mlFAFBSA(Wells et al，
1998)和late SOF(96h前，用Esof；96h后，用LSOF，Wells et al，1999)培养液，在39℃，
7％O2、5％CO2和88％N2条件下培养，分别于24、48、和96h统计卵裂率、细胞期胚胎和桑椹胚发育率。在early SOF培养96h后，再转移到新鲜配制的later-SOF液滴继续培养，第
7-8天时统计囊胚发育率和观察囊胚的发育状况。
1998)和late SOF(96h前，用Esof；96h后，用LSOF，Wells et al，1999)培养液，在39℃，
7％O2、5％CO2和88％N2条件下培养，分别于24、48、和96h统计卵裂率、细胞期胚胎和桑椹胚发育率。在early SOF培养96h后，再转移到新鲜配制的later-SOF液滴继续培养，第
7-8天时统计囊胚发育率和观察囊胚的发育状况。
[0074] 6.胚胎移植与妊娠检测
[0075] 将形态优良的第7d的克隆囊胚采用子宫手术移植移入已同期的受体绵羊的子宫内。移植后立即肌肉注射黄体酮2mg/只，在移植后的第40d对受体绵羊进行B超检测以确定受胎情况，并在移植后的第60d和90d进行超声波检测以确定妊娠率。共移植受体绵羊34头，移植60d后的超声波检测表明，其中12头怀孕。手术取2个胎儿进行鉴定，均为转基因阳性，制备成纤维细胞，一部分用于体细胞克隆制备杂合子转基因绵羊，一部分用于二次打靶和体细胞克隆制备纯合子转基因绵羊。
[0076] 7.转基因杂合子阳性细胞、胎儿及克隆牛的分子生物学鉴定
[0077] (1)PCR鉴定
[0078] 1)用于PCR鉴定的β6基因发生第一次同源重组的阳性模板质粒的构建[0079] 以绵羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物Y-pLeft upper-1817：
[0080] 5’-ATAAGAATGCGGCCGC GATCAGAGAGGCTGCGACTG-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶NotI的识别位点)
[0081] 与引物Y-pLeft lower：
[0082] 5’ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3’
[0083] 的引导下，PCR克隆片段为3996bp片段，反应条件为：94℃ 30s；94℃ 20s 55℃20s 68℃3min，25个循环；68℃ 7min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将该片段用NotI和SalI酶切后回收与经相同酶切的载体pRui连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-Yang-model(图6)，该质粒包含第一次打靶质粒pRui-S-β6的左侧同源臂和报告基因neo，分别在pRui-Yang-model：
base 1900-1922位点设计上游引物Pyang-1：5’-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3’，在PGK-neo开放阅读框，pRui-Yang-model：base5039-5058上设计下游引物Pyang-2：
5’-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC-3’，PCR扩增产物为3158bp，可做pRui-S-β6打靶后发生同源重组的细胞/胎儿/转基因绵羊跨越式PCR鉴定的模板。
base 1900-1922位点设计上游引物Pyang-1：5’-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3’，在PGK-neo开放阅读框，pRui-Yang-model：base5039-5058上设计下游引物Pyang-2：
5’-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC-3’，PCR扩增产物为3158bp，可做pRui-S-β6打靶后发生同源重组的细胞/胎儿/转基因绵羊跨越式PCR鉴定的模板。
[0084] 2)发生同源重组的跨越式PCR鉴定
[0085] 以经pRui-S-β6打靶获得的绵羊胎儿成纤维neo抗性克隆、转基因克隆胎儿或转基因绵羊的基因组DNA为模板，在用于PCR鉴定的β6基因发生同源重组的阳性模板质粒的构建中的引物Pyang-1，Pyang-2的引导下，PCR扩增3158bp的片段为同源重组阳性。PCR反应条件：94℃ 30s；94℃ 20s 55℃ 20s 68℃ 3min，35个循环；68℃ 7min。转基因绵羊胎儿成纤维细胞鉴定结果如图7所示，M:DL marker 10,000(Takara公司)，第1泳道为以非转基因绵羊成纤维细胞DNA为模板的阴性对照，第2泳道为发生同源重组的阳性模板质粒pRui-Yang-model，第3-14泳道为单克隆细胞基因组DNA，其中第11和13泳道为同源重组阳性转基因细胞，将其依次命名为Yang-5、Yang-23，其余均为阴性。
[0086] (2)Southern杂交鉴定
[0087] 取约10μg转基因克隆绵羊胎儿或新生绵羊耳部组织的基因组DNA，用限制性内切酶Eco81 I酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交。杂交所用探针为利用TM 32rediprimer II random primer labeling system(amersham)、由[α- P]dCTP同位素标记的、经限制性内切酶SalI和Xho I酶切消化的pRUI载体neo基因(报告基因)回收产物，以普通荷斯坦奶牛胎儿或新生犊牛的基因组DNA作为阴性对照，杂交阳性信号为9kb片段。
[0088] (3)Real-time RT-PCR鉴定
[0089] 利用Trizol(Invitrogen)提取正常和转基因绵羊胎儿或新生绵羊的甲状腺或舌上皮组织总RNA，按TaKaRAa RNAPCR Kit(AMV)Ver3.0反转录试剂盒说明书操作步骤反转录，得到cDNA模板。反转录体系为：MgCl2 2.0μl，10×RT Buffer 1.0μl，dNTP Mixture 1.0μl，RNAse Inhibitor 0.25μl，RNAse Free dH2O 3.75μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5μl， 提 取 RNA 1.0μl，Oligo(dT)0.5μl，总 体系10.0μl。 在 上 游 引 物：PRT5：5 ′ -GTTGGGGGTTTCGCTGGCTATTC-3 ′ 和 下 游 引物：PRT6：5′-TGGAGCCTCTGTACAGTGGAT-3 ′的引 导下，Real Time PCR扩增 β6片段为160bp；在上游引物PRT3：5′-TGCCCTGAGGCTCTCTTCC-3′和下游引物：PRT4：5′-GCGTAGAGGTCTTTGCGGATGT-3′的引导下，Real Time PCR扩增β-actin片段115bp。
Real Time PCR反应条件是：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。根据其扩增和融解曲线，制作PCR定量标准曲线，通过求其平均值可以分析出转基因胎儿或新生绵羊β6基因表达的变化。
Real Time PCR反应条件是：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 31s，40个循环。根据其扩增和融解曲线，制作PCR定量标准曲线，通过求其平均值可以分析出转基因胎儿或新生绵羊β6基因表达的变化。
[0090] 8.转基因绵羊的FMDV攻毒实验
[0091] (1)绵羊半数感染量(ID50)的测定
[0092] 选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄绵羊16头，分成4组，每组4头，5 6
分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量分别为0、10、10 和
7
10TCID50，观察8天，未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的实验组绵羊表现为蹄、口腔及其周围和母畜的乳头等部位出现水泡。统计发病绵羊的数量，按照Reed-Muench方法计算
6
ID50，该组织培养毒的ID50为3×10。
分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量分别为0、10、10 和
7
10TCID50，观察8天，未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的实验组绵羊表现为蹄、口腔及其周围和母畜的乳头等部位出现水泡。统计发病绵羊的数量，按照Reed-Muench方法计算
6
ID50，该组织培养毒的ID50为3×10。
[0093] (2)转基因绵羊的FMDV攻毒实验
[0094] 选取未接种FMD疫苗、无FMDV中和抗体、6月龄左右正常及转基因绵羊各8头，分为4组，每组4头。正常及转基因绵羊中，各有一组不接种病毒，另一组分别在舌上表面皮内接种两个点(每点接种0.1mL)，病毒接种剂量为100ID50，观察8天。未接种病毒的对照组不发病，接种病毒的正常绵羊组绵羊全部发病，统计转基因发病绵羊的数量并与正常组发病绵羊的症状进行比较，计算发病率。
[0095] 实施例2：体细胞克隆整合素β6亚基基因敲除的纯合子转基因绵羊的生产及分子生物学检测
[0096] 体细胞克隆整合素β6亚基基因敲除的纯合子转基因绵羊的生产流程如图1所示，具体过程包括如下步骤：
[0097] 1.整合素β6亚基基因敲除的二次打靶载体的构建
[0098] 在整合素β6亚基基因敲除第一次打靶载体的基础上用报告基因GFP替换neo，获得第二次打靶载体。具体方法如下：
[0099] 以pRui为模板，在引物Y-pGK1 upper：
[0100] 5’-CGGGGTACCCTCGAGATAACTTCGTATAGCATAC-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶KpnI的识别位点)
[0101] 与引物Y-pGK1 lower：
[0102] 5’-TGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATATTGGCTGCAGGTCGAAAG-3’(带下划线的碱基为GFP基因5’序列)
[0103] 的引导下，PCR克隆片段为556bp的Y-pGK启动子片段；以Y-pEGFP-N1为模板，在引物Y-pGFP upper：
[0104] 5’CCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’(带下划线的碱基为pGK启动子3’序列)
[0105] 与引物Y-pGFP lower：
[0106] 5’TTCTGCAGACTTACAGCGGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(带下划线的碱基为pGK终止子5’序列)，PCR克隆片段为700bp的GFP基因片段；以pRui为模板，在引物Y-pGK2 upper：
[0107] 5’-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGGGATCCGCTGTAAGTCTGCAG-3’与引物Y-pGK2 lower：
[0108] 5’TTCGAACTCGACGGTATCGAGCTTCTGATGG-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶BspT104I的识别位点)PCR克隆片段为513bp的pGK终止子片段。将纯化的556bp PCR产物与700bp PCR产物混合作为两步法PCR反应的拼接模板，在引物Y-pGK1 upper与引物Y-pGFP lower的引导下，获得1231bp的PCR产物。反应条件为：94℃ 30s；94℃ 20s 56℃20s68℃ 1min，25个循环；68℃ 5min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1231bp片段；以纯化的1231bp PCR产物与513bp PCR产物混合作为两步法PCR反应的拼接模板，在引物Y-pGK1 upper与引物Y-pGK2 lower的引导下，PCR克隆1736bp片段，将该片段用KpnI和BspT104I酶切后回收该片段与经相同酶切的载体pRui-S-β6回收
13863bp片段连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-Yang-GFP-β6(序列2)。
13863bp片段连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-Yang-GFP-β6(序列2)。
[0109] 2.杂合子转基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系的建立
[0110] 选取40日龄的实施例1中获得的杂合子转基因胎儿，其胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法与实施例1绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系的制备方法相同。
[0111] 3.杂合子转基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞的脂质体转染和筛选
[0112] 处于对数生长期的杂合子转基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞，用Opti-MEM洗1次细胞，将二次打靶载体pRui-Yang-GFP-β6线性化后，浓缩浓度不低于1μg/μL，经脂质体LTX转染大量细胞，24h后培养液中含有700μg/mL G418和8μM Gancvilor，每3d换液1次，96h后用0.25％胰蛋白酶消化细胞并进行流式细胞分选，含有GFP的细胞接种于细胞培养皿中，100个细胞/培养皿，用700μg/mL G418和8μM Gancvilor继续进行正负筛选，培养10d后，在荧光倒置显微镜下挑选有绿色荧光的细胞克隆(具备G418和Gancvilor抗性且产生绿色荧光的细胞可能是β6基因敲除的纯合子细胞)，扩繁2-3代，期间取部分细胞进行鉴定，其余细胞液氮保存、备用。
[0113] 4.卵母细胞的成熟培养、去核
[0114] 与实施例1卵母细胞的成熟培养、去核方法相同。
[0115] 5.核移植和克隆胚胎的体外培养
[0116] 与实施例1核移植和克隆胚胎的体外培养方法相同。
[0117] 6.胚胎移植与妊娠检测
[0118] 将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体绵羊的子宫角内。在移植后的第30d、60d和90d对受体绵羊进行B超检测以确定受胎情况。
[0119] 7.转基因纯合子阳性细胞及克隆绵羊的分子生物学鉴定
[0120] (1)PCR鉴定
[0121] 1)用于PCR鉴定的第二条染色体β6基因发生同源重组的阳性模板质粒的构建[0122] 以绵羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA为模板，在引物Y-pLeft upper-1817：
[0123] 5’-ATAAGAATGCGGCCGC GATCAGAGAGGCTGCGACTG-3’(带下划线的碱基为限制性内切酶NotI的识别位点)
[0124] 与引物Y-pLeft lower：
[0125] 5’ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3’
[0126] 的引导下，PCR克隆片段为3996bp片段，反应条件为：94℃ 30s；94℃ 20s 55℃20s68℃ 3min，25个循环；68℃ 7min。反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将该片段用NotI和SalI酶切后回收与经相同酶切的载体pRui连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α，挑取单菌落摇菌、提质粒，并进行酶切和测序鉴定，得到含有目的片段的重组载体，命名为pRui-Yang-model-2，在pRui-Yang-model-2：
base 1900-1922 设 计 上 游 引 物 Pyang-1：5’-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3’( 同pRui-Yang-model)，在pGK-GFP开放阅读框上：base5106-5125设计下游引物Pyang-4：
5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’，可做二次打靶载体pRui-GFP-β6打靶后发生同源重组的细胞/转基因绵羊跨越式PCR鉴定的模板。
base 1900-1922 设 计 上 游 引 物 Pyang-1：5’-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3’( 同pRui-Yang-model)，在pGK-GFP开放阅读框上：base5106-5125设计下游引物Pyang-4：
5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’，可做二次打靶载体pRui-GFP-β6打靶后发生同源重组的细胞/转基因绵羊跨越式PCR鉴定的模板。
[0127] 2)β6基因敲除纯合子的跨越式PCR鉴定
[0128] 以二次打靶获得的绵羊胎儿成纤维neo抗性及绿色荧光克隆或转基因绵羊的基因组DNA为模板，跨越式PCR鉴定引物Pyang-1和Pyang-2及Pyang-1和Pyang-4的分别引导下，PCR扩增3158bp及3225bp的片段分别为第一次和第二次同源重组阳性。PCR反应条件：94℃30s；94℃ 20s 55℃ 20s 68℃3min，35个循环；68℃ 7min。
[0129] (2)Southern杂交鉴定
[0130] 取约10μg转基因克隆绵羊胎儿组织或转基因绵羊耳部组织的基因组DNA，以绵羊基因组DNA作为阴性对照，用限制性内切酶Eco81 I酶切消化，30V低压电泳，转膜后，进TM行Southern杂交。杂交所用探针分别为利用rediprimer II random primer labeling
32
system(amersham)、由[α- P]dCTP同位素标记的、经限制性内切酶SalI和XhoI酶切消化的pRUI载体neo基因或pRui-GFP-β6载体GFP基因回收产物，第一次打靶(β6被neo基因替换)的杂交阳性信号为9kb片段，第二次打靶(β6被GFP基因替换)的杂交阳性信号为8.8kb片段。
32
system(amersham)、由[α- P]dCTP同位素标记的、经限制性内切酶SalI和XhoI酶切消化的pRUI载体neo基因或pRui-GFP-β6载体GFP基因回收产物，第一次打靶(β6被neo基因替换)的杂交阳性信号为9kb片段，第二次打靶(β6被GFP基因替换)的杂交阳性信号为8.8kb片段。
[0131] (3)Real-time RT-PCR鉴定
[0132] 与实施例1Real-time RT-PCR方法相同。
[0133] 8.转基因绵羊的FMDV攻毒实验
[0134] 与实施例1转基因绵羊的FMDV攻毒实验方法相同。
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