一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用
阅读：343发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了一种 蜂毒 素-死亡素重组多肽，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签。所述所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签，所述MBP标签能够促进蜂毒素-死亡素重组多肽的表达，提高蜂毒素-死亡素重组多肽的表达量，且能够提高蜂毒素-死亡素重组多肽的纯度。，下面是一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用专利的具体信息内容。
1.一种蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签。
2.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，N端融合了MBP标签的蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽中蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽中死亡素的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述MBP标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.如权利要求书1-6任意一项所述蜂毒素-死亡素重组多肽在生产蜂毒素-死亡素重组多肽上的应用。
一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用
技术领域
[0001] 本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用。
背景技术
[0002] 蜂毒是公蜂用螫针刺向敌害时排出的毒汁，蜂毒素(Melittin)是其主要活性成分，由26个氨基酸组成，具有抗菌、消炎、抗辐射、抗关节炎、抗肿瘤、抗艾滋病以及治疗心血管疾病等作用。蜂毒素能够抑制20～30种革兰氏阴性病原微生物的发育。蜂毒素是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。由于许多疼痛是炎症导致的，因此蜂毒素在治疗关节炎、痛风等炎性疼痛方面，具有显著的成效。
[0003] 死亡素(thanatin)，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺-益蝽(Podisus maculiventris)中发现的由21个氨基酸残基组成的抗菌肽，抑菌谱非常广，但是对哺乳动物细胞不表现出溶血性。
[0004] 将蜂毒素N端5-12位氨基酸与死亡素4-21位氨基酸氨基酸融合表达成杂合肽(MT)。新型抗菌肽由26个氨基酸组成，有效提高了抗菌肽的杀菌活性，尤其是针对耐药性革兰氏阴性致病菌，抑菌效价提高大大提高。但是在制备蜂毒素-死亡素杂合肽时，蜂毒素-死亡素杂合肽的表达量非常低，且纯度不高。发明内容
[0005] 本公开的目的是提供种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用，以达到提高蜂毒素-死亡素杂合肽的表达量的目的。
[0006] 为实现上述目的，技术方案如下：
[0007] 一种蜂毒素-死亡素重组多肽(MBP-MT重组蛋白)，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP(meltosebinding protein，麦芽糖结合蛋白)标签。
[0008] N端融合了MBP标签的蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 所述蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示
[0010] 所述蜂毒素-死亡素重组多肽中蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 所述蜂毒素-死亡素重组多肽中死亡素的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012] 所述MBP标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013] 一种蜂毒素-死亡素重组多肽在生产蜂毒素-死亡素重组多肽上的应用。
[0014] 本公开的有益效果是：提供了一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用，所述所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签，所述MBP标签能够促进蜂毒素-死亡素重组多肽的表达，提高蜂毒素-死亡素重组多肽的表达量，且能够提高蜂毒素-死亡素重组多肽的纯度。附图说明
[0016] 图2为实施例1MBP-MT重组蛋白基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0017] 图3为实施例2MBP-MT重组蛋白-pGAPZαA重组载体菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0018] 图4为实施例3MBP-MT重组蛋白-毕赤酵母酵母单菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0019] 图5为实施例4中MBP-MT重组蛋白在毕赤酵母中表达的Weston blot检测图。
[0020] 图6为为实施例4中MBP-MT重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
[0021] 以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
[0022] 实施例1 MBP-MT重组蛋白的基因构建
[0023] 1.目的基因片段和引物的设计
[0024] 根据蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和死亡素的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段、pMAL-c5x载体结构特点以及两个酶切位点EcoR1和Xbal设计如下：
[0025] Gene1：GTGCTGAAAGTGCTGACCACGGGCAAACCGGTGCCGATTATCTA(SEQ ID NO.6)；
[0026] Gene2：CATACGCTGGCACTTGCCGGTACGACGATTGCAGTAGATAATCGGCACCGGTTTG(SEQ ID NO.7)；
[0027] MBP-MT-FP：GGCCGAATTCATGAAAATCGAAG(SEQ ID NO.8)；
[0028] MBP-MT-RP：CAGCACTTTCAGCACCCTTCCCTCGATCCC(SEQ ID NO.9)；
[0029] MBP-MT-geneRP：GGCCTCTAGAAACATACGCTGGCACTTGC(SEQ ID NO.10)。
[0030] 2.MT目的基因的拼接重组
[0031] 2.1编码MT目的蛋白基因的拼接
[0032] 拼接PCR的反应体系如表1。
[0033] 表1拼接PCR反应体系
[0034] 2×PfuMax HiFi PCR ProMix 10μLGene1和Gene2 各0.4μL
ddH2O Add to 20μL
ddH2O Add to 20μL
[0035] 拼接PCR的反应条件如表2。
[0036] 表2拼接PCR反应条件
[0037]
[0038] 拼接后得到的MT目的蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0039] 2.2 MBP基因的获取
[0040] MBP基因扩增体系如表3。
[0041] 表3 MBP基因扩增体系
[0042]
[0043] MBP基因反应条件为(降落PCR)如表4所示。
[0044] 表4 MBP基因反应条件
[0045]
[0046] PCR反应结束后，取PCR产物进行1.0％琼脂糖电泳分析，结果如图1(泳道M：DNA Marker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1，2为MBP标签扩增产物)所示，扩增产物大小与理论分子量相符，约为1.1kb。
[0047] PCR产物回收：按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度。结果如表5，可以看出PCR回收DNA的浓度和纯度较高。经测序MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
[0048] 表5检测结果
[0049]
[0050] 2.3蜂毒素-死亡素重组多肽的合成
[0051] PCR反应体系如表6。
[0052] 表6 PCR反应体系
[0053]
[0054] 反应条件(降落PCR)如表7。
[0055] 表7反应条件
[0056]
[0057] PCR反应结束后，取PCR产物进行1.0％琼脂糖电泳分析，结果如图2(泳道M：DNA Marker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1～10为MBP-MT重组蛋白基因产物)所示，扩增产物大小与理论分子量相符，约为1.2kb；经测序MBP-MT重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0058] PCR产物回收，按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度。结果如表8。
[0059] 表8 PCR产物回收的浓度及纯度
[0060]
[0061] 实施例2 MBP-MT重组蛋白-pGAPZαA重组载体构建
[0062] 1.双酶切
[0063] MBP-MT重组蛋白基因及载体双酶切，用EcoRI和XbaI对MBP-MT重组蛋白基因和pGAPZa A载体分别进行双酶切，反应温度为37℃，反应时间为2小时。酶切反应体系如表9。
[0064] 表9酶切反应体系
[0066] 酶切后产物回收，酶切结束后，纯化回收酶切产物。按照DNA纯化试剂盒说明书纯化回收酶切产物。超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度，结果如表10。
[0067] 表10 MBP-MT重组蛋白基因和pGAPZa A载体酶切后产物的浓度与纯度
[0068]样品(双酶切后) 浓度(ng/uL) A260/A280
MBP-MT重组蛋白基因 42.0 1.790
pGAPZa A载体 20.4 1.747
MBP-MT重组蛋白基因 42.0 1.790
pGAPZa A载体 20.4 1.747
[0069] 连接反应，反应体系如表11：
[0070] 表11连接反应体系
[0071]组分 体积
T4 Quick Ligation Mix 5μL
插入DNA片段 50ng
pGAPZαA载体 50ng
灭菌去离子水 补充至10μL
T4 Quick Ligation Mix 5μL
插入DNA片段 50ng
pGAPZαA载体 50ng
灭菌去离子水 补充至10μL
[0072] 将上述材料混合后，22℃连接2h。
[0073] 2.转化
[0074] (1)取5μL连接产物加到50μL DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min；
[0075] (2)将上述转化液置于42℃水浴90s，取出后立即置于冰浴中放置5min；
[0076] (3)向其中加入500μlL37℃预热的Low Salt LB(不含抗生素LLB)培养液，180rpm、37℃振荡培养45min；
[0077] (4)2500rpm离心5min，将上清液吸走，留200μL混匀菌液，加到含Low Salt LB固体琼脂培养基上(Zeocin浓度25μg/mL)，用无菌的玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
[0078] 3.菌落PCR鉴定
[0079] 挑取上述平板上的单菌落个，分别溶到20μL的Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中，于80℃加热30min，后离心每管取1μl菌液做模板，利用载体通用上游引物：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA -3’(SEQ ID NO.11)和载体通用下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.12)进行PCR。反应体系设计为10μL总体系如表12。
[0080] 表12菌落PCR鉴定反应体系
[0081] 2×SsoRubost Taq PCR ProMix 5μl上述转化后菌液 1μl
载体通用上游引物(10μM) 0.25μl
载体通用上游引物(10μM) 0.25μl
H2O 3.5μl
载体通用上游引物(10μM) 0.25μl
载体通用上游引物(10μM) 0.25μl
H2O 3.5μl
[0082] 反应条件如表13。
[0083] 表13菌落PCR鉴定反应条件
[0084]
[0085]
[0086] 挑取上述平板上的单菌落10个，分别溶到500μl含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液，37℃、180rpm/min震荡培养4h。每管取1μL菌液做模板，用载体的通用上游和下游引物进行PCR扩增，后进行琼脂琼脂糖凝胶检测条带理论大小为1.7kb左右，结果如图3(泳道M：DNA Marker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1、2、3、4、5均为单菌落菌落PCR产物)所示，可看出所挑取的单菌落均为阳性克隆，与理论大小相同。
[0087] 实施例3毕赤酵母电转化
[0088] 1.重组质粒的大量提取
[0089] 1)从-80℃冰箱取出上述实施例2中鉴定正确的、含有重组质粒的EcoliDH5α，用枪头戳取菌液接种于含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液中，接种于37℃、200r/min的摇床中过夜培养(12～16h)，至少培养20mL；
[0090] 2)按照质粒提取试剂盒提取质粒，用微量分光光度计进行质粒浓度测定，浓度为，A260/A280为，-20℃保存备用。
[0091] 2.重组质粒的线性化及纯化
[0092] 根据质粒pGAPZa A中可选择的线性化位点以及插入基因的碱基序列，最终选取限制性内切酶AvrⅡ进行重组质粒的线性化处理。线性化体系如表14所示。
[0093] 表14线性化反应体系
[0094] 成分 添加量10×Cutsmart Buffer 20μL
重组质粒 20μg
AvrⅡ内切酶 4μL
补充无菌水至 200μL
重组质粒 20μg
AvrⅡ内切酶 4μL
补充无菌水至 200μL
[0095] 可分为两管反应，每管100μL，将线性化溶液混匀后置于恒温水浴槽中，37℃酶切2h后，取2μL酶切后的产物用1.5％(v/v)的琼脂糖凝胶检测重组质粒是否线性化完全。剩余线性化产物用琼脂糖电泳DNA回收试剂盒回收，分别50μL预热的水洗脱两遍，汇总至一根管子中，进行过夜冻干。
[0096] 3.毕赤酵母GS115的电转化
[0097] 3.1 GS115感受态细胞的制备
[0099] (2)挑取纯化后的GS115单菌落接种至5mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下过夜培养；
[0100] (3)按1：1000的比例将上述酵母菌液接种至100mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养至OD值达1.3-1.5；
[0101] (4)将上述菌液分装至两个50mL无菌离心管中，4℃条件下1500g/min离心5min后，去除培养基；
[0102] (5)加入40mL新配(2h内)的LDST溶液(100mM LiAc，10mM dithiothreitol,0.6M sorbitol and 10mM Tris-Hcl pH 7.5，现用现配不能保存)，30℃孵育30min；
[0103] (6)室温6000rpm离心5min；弃上清，用1mL冰浴1M山梨醇重悬菌体，转至1.5mLEP管；
[0104] (7)用1mL冰浴1M山梨醇洗涤菌体3次(应快速，菌脆弱)最后用400μL冰浴1M山梨醇重悬菌体，分装80μL/管(现配现用)。
[0105] 3.2重组质粒电转入GS115感受态细胞
[0106] (1)打开电转化仪，预热30min；
[0108] (3)将5-10μg纯化后的线性化质粒加入到新鲜制备的GS115感受态细胞中，轻轻旋转离心管，使质粒和感受态细胞完全混匀后，将其全部转移至冰预冷处理的0.2cm无菌电转杯中；
[0109] (4)将电转杯继续冰浴5min后，放入电击槽，开始电击；
[0110] (5)电击结束后，立即向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇，用移液枪轻轻吹打混匀后，将其全部转移至无菌的1.5mL离心管中；
[0111] (6)将上述离心管置于30℃恒温培养箱中静置孵育1-2h；
[0112] (7)分别吸取10、25、50、100、200μL菌液涂布在含100μg/ml Zeocin的YPDS固体培养基上；
[0113] (8)30℃恒温倒置平板2-3天，至长出单菌落。
[0114] 3.3重组毕赤酵母基因组PCR鉴定
[0115] (1)将筛选出的5个耐Zeocin的转化子接种于10mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养12-16h；
[0116] (2)取酵母裂解液50ul加入1μL的过夜培养的酵母菌液，85℃孵育30min，12000r/min离心2min，取1μL上清进行PCR扩增；
[0117] (3)采用载体通用引物分别对酵母基因组DNA进行PCR扩增：pGAP Forword：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’(SEQ ID NO.11)；3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.12)；
[0118] 反应体系如表15所示：
[0119] 表15反应体系
[0120] 2×Hotstart Taq PCR ProMix 5μL酵母细胞裂解液上清 1μL
pGAP Forword 0.25μL
3’AOX1 0.25μL
H2O 3.5μL
pGAP Forword 0.25μL
3’AOX1 0.25μL
H2O 3.5μL
[0121] 反应条件如表16所示：
[0122] 表16反应条件
[0123]
[0124]
[0125] PCR反应完取5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，得到如下电泳图，条带理论大小为1.7kb，从图4中可看出实际与理论相符合，5个单克隆菌株均为阳性单克隆。
[0126] 实施例4 MBP-MT重组蛋白在毕赤酵母中的表达
[0127] 1.MBP-MT重组蛋白表达
[0128] 挑取上述实施例3中的阳性单克隆于10mLYPD过夜培养，后取100μL接种到5瓶10mL(250mL摇瓶)的YPD培养基中，于30℃、250r/min条件下摇瓶表达。
[0129] 分别在培养0h、24h、36h、48h、60h后取样，于8000r/min离心5min，将上清转至干净的50mL离心管，后将上清和菌沉淀，并放入-80℃保存，直至检测蛋白表达时取出。
[0130] 2.重组蛋白在毕赤酵母中的表达检测
[0131] 将表达时间为0h、6h、12h、24h、48h的培养液上清经超滤浓缩、硫酸铵沉淀并复溶后进行Weston blot检测，并用已表达目的蛋白进行纯化，结果如图5(泳道M为蛋白Marker，泳道1～5为别为0h、6h、12h、24h、48h培养液上清)所示，从图5结果可以确定，带MBP融合标签的MT蛋白获得可溶表达，并且在24h培养后目的蛋白的表达量趋于饱和，因此确定表达培养时间为24h较好。
[0132] 3.重组蛋白纯化
[0133] 3.1酸氨沉淀
[0134] 称取硫酸铵：按照每升上清加361g硫酸氨的比例称取硫酸氨粉末；
[0136] 静置沉淀：4℃冰箱静置4h，12000r/min离心30min，弃上清；
[0137] 蛋白复溶：按1L发酵液上清加入20mL组氨酸标签-亲和层析柱结合缓冲液(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)的比例加入加入缓冲液，并涡旋直至所有蛋白复溶；
[0138] 过膜转移：将复溶后所得溶液过0.22μm过滤头，转移到新的无菌瓶中。
[0139] 3.2亲和层析
[0140] 选用1mlMBP标签-亲和层析柱，纯化系统GE Healthcare AKTA pure；
[0141] 洗泵:用蒸馏水洗A1、B1泵后，再分别用结合缓冲液Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)、洗脱缓冲液Buffer B(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、500mM咪唑、5％甘油)分别洗A1、B1泵，流速75ml/min；
[0142] 平衡柱子：将A1泵放入Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)中，平衡10个柱体积结合缓冲液Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)，流速1ml/min；
[0143] 上样：用A1泵上样，流速为0.5ml/min；
[0144] 洗脱：按0％Buffer B、10％Buffer B、40％Buffer B、60％Buffer B、100％Buffer B进行梯度洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积；
[0145] 收集：按梯度收集，并超滤浓缩；
[0146] 电泳检测：将收集到的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。
[0147] SDS-PAGE电泳检测的结果如图6(泳道1为穿透液蛋白条带；泳道2为0％buffer B洗脱蛋白条带；泳道3为10％buffer B洗脱蛋白条带；泳道4与40％buffer B洗脱蛋白条带；泳道5为60％bufferB洗脱蛋白条带；泳道6为100％bufferB洗脱蛋白条带；泳道M为Thermo Scientific PierceTMUnstained Protein MW Marker)所示，可以看出40％Buffer B洗脱的效果最好，且可以看出蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签后能够提高蜂毒素-死亡素重组多肽蛋白质的浓度及纯度。
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