一种突变蜂毒肽MEL-pep及其应用
阅读：265发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种突变蜂毒肽MEL-pep及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种突变 蜂毒 肽MEL‑pep及其应用，该多肽的 氨 基酸序列如SEQ ID：NO.1所示。实验结果表明MEL‑pep具有明显的抑制5‑氟尿嘧啶(5‑FU)耐药的人肝癌细胞BEL‑7402/5‑FU生长的作用，显著下调BEL‑7402/5‑FU细胞表面P‑gp，能够抑制BEL‑7402/5‑FU细胞耐药蛋白P‑gp蛋白以及基因的表达；MEL‑pep能显著抑制BEL‑7402/5‑FU细胞荷瘤鼠 肿瘤 体内生长，并呈剂量依赖性，而且MEL‑pep体内抗BEL‑7402/5‑FU 细胞增殖 活性显著。，下面是一种突变蜂毒肽MEL-pep及其应用专利的具体信息内容。
一种突变蜂毒肽MEL-pep及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗菌肽是一类广泛存在于各种生物体内的天然小分子多肽，是天然免疫系统的组成部分，具有抵抗外源微生物和清除体内病变细胞等作用。除了抗菌作用外，抗菌肽以其独特、迅速的抗肿瘤活性，备受关注。抗菌肽大部分带正电荷，富含疏水碱基，能形成两亲性结构。抗菌肽具有特殊的抗肿瘤机制，且作用迅速；与一般抗肿瘤药物相比，能够选择性作用于肿瘤细胞；对哺乳动物的正常细胞毒性较低，也不易产生耐药性，这些优势使抗菌肽成为抗肿瘤药物研发的热点之一。
[0003] 蜂毒是工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的淡黄色透明毒液,具有多种药理学和生物学活性的复杂混合物。蜂毒肽(Melittin，MEL)是蜂毒的主要组成部分，约占蜂毒干重的50％，是一种由26个氨基酸残基组成的线性多肽，相对分子量为2847，等电点约为12.02，全序列为：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-色氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酸-谷氨酸。蜂毒肽能够抑制多种类型肿瘤细胞的生长，是一个非常具有应用前景的抗肿瘤天然药物。
发明内容
[0004] 本发明解决的内容在于提供一种突变蜂毒肽MEL-pep及其应用，以蜂毒肽的氨基酸序列为基础合成新型多肽，其具有抗肝癌效果。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0006] 一种突变蜂毒肽MEL-pep，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示。
[0008] 所述的突变蜂毒肽MEL-pep在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0009] 所述的突变蜂毒肽MEL-pep在制备治疗对5-FU耐药的肝癌的药物中的应用。
[0010] 所述的突变蜂毒肽MEL-pep在制备能够作用于5-FU耐药的肝癌细胞膜的药物中的应用。
[0011] 所述的突变蜂毒肽MEL-pep在制备逆转5-FU耐药的肝癌的药物中的应用。
[0012] 所述的突变蜂毒肽MEL-pep在制备抑制5-FU耐药的肝癌细胞体内生长抑制的药物中的应用。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0014] 本发明提供的突变蜂毒肽MEL-pep，以α-螺旋轮模型为理论模型，提高多肽的螺旋程度，并增强多肽的正电荷性，将MEL第八位的缬氨酸和第十四位的脯氨酸均改为赖氨酸，得到新型多肽MEL-pep。多肽MEL-pep不仅提高了螺旋程度，并且将其净电荷数由5提升至7，使其具有更强的抗肿瘤活性。实验结果表明MEL-pep具有明显的抑制5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的人肝癌细胞BEL-7402/5-FU生长的作用，可用来制备抗肝癌治疗的药物。
[0015] 本发明提供的突变蜂毒肽MEL-pep，其抑制细胞生长的作用比多肽MEL更为显著，多肽MEL的半数抑制浓度IC50值为11.09μM，多肽MEL-pep IC50值为4.44μM，与MEL相比下降了6.85μM(约为MEL IC50值的59.96％)；而且多肽MEL-pep能够明显抑制BEL-7402/5-FU细胞的生长，并呈时间、剂量依赖关系。
[0016] 本发明提供的突变蜂毒肽MEL-pep，处理后的细胞，细胞膜出现明显的孔洞，多肽MEL-pep对BEL-7402/5-FU细胞膜具有明显的破坏作用；MEL-pep对BEL-7402/5-FU细胞的LDH释放作用呈剂量依赖关系，并且具有统计学差异(**P<0.01)。
[0017] 本发明提供的突变蜂毒肽MEL-pep，显著下调BEL-7402/5-FU细胞表面P-gp，证实MEL-pep能够抑制BEL-7402/5-FU细胞耐药蛋白P-gp蛋白以及基因的表达；MEL-pep能显著抑制BEL-7402/5-FU细胞荷瘤鼠肿瘤体内生长，并呈剂量依赖性，而且MEL-pep体内抗BEL-7402/5-FU细胞增殖活性显著。
附图说明
附图说明
[0018] 图1为多肽MEL-pep对不同细胞的体外生长抑制作用；
[0019] 图2为多肽MEL、MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU生长抑制活性比较；
[0020] 图3为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU生长的影响；
[0021] 图4为多肽FITC-labeled-MEL-pep与5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU的结合作用；
[0022] 图5为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU细胞膜结构的影响；
[0023] 图6为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU LDH释放的影响；
[0024] 图7为多肽MEL-pep逆转5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU对5-FU的耐药作用；
[0025] 图8为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU MDR1mRNA表达的影响；
[0026] 图9为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU细胞膜P-gp表达的影响；
[0027] 图10为多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU Rhodamine 123蓄积的影响；
[0028] 图11为多肽MEL-pep体内对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU荷瘤鼠肿瘤生长的影响；
[0029] 图12为多肽MEL-pep体内对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU荷瘤鼠瘤重的影响；
[0030] 图13为多肽MEL-pep体内对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU荷瘤鼠体重的影响；
[0031] 图14为实验各组小鼠肿瘤组织HE染色图片。
具体实施方式
[0032] 下面结合附图对本发明做进一步详细描述。
[0033] 本发明以蜂毒肽MEL的氨基酸序列为基础，以α-螺旋轮模型为理论模型，提高多肽的螺旋程度，并增强多肽的正电荷性。将MEL第八位的缬氨酸和第十四位的脯氨酸均改为赖氨酸，得到新型多肽MEL-pep。多肽MEL-pep的基酸序列如SEQ ID：No.1所示，其氨基酸全序列为：甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-色氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺，其分子量为2907.5，等电点为12.04。多肽的螺旋程度以及电荷数与其活性密切相关，与蜂毒肽MEL相比，多肽MEL-pep不仅提高了螺旋程度，并且将其净电荷数由5提升至7，使其具有更强的抗肿瘤活性。
[0034] 本发明采用固相化学合成法获得具有更高抗肝癌活性抗肿瘤多肽MEL-pep，并其开展了体内及体外药效学实验，结果表明MEL-pep具有明显的抑制5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的人肝癌细胞BEL-7402/5-FU生长的作用，可用来制备抗肝癌治疗的药物。
[0035] 下面是本发明的部分药效学实验及结果
[0036] 一、多肽MEL-pep对不同细胞的体外生长抑制作用
[0037] 取大鼠原代骨髓间充质干细胞(BMSC)、对数生长期的人正常肝细胞L02、人肝癌细胞BEL-7402、人5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU。其中，BMSC细胞用含有10％FBS的DMEM-F12培养基，L02细胞以及BEL-7402细胞用含有10％FBS的RPMI 1640培养基，BEL-7402/5-FU细胞用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养基。
[0038] 每种细胞用各自培养基调整细胞浓度为5×104/mL，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl。培养过夜后，加入用培养液稀释的不同浓度MEL-pep 20μl/孔(终浓度分别为：0、2.5、5、7.5、10、20、40、80μM)，培养液调零，37℃、5％CO2培养24、48、72小时后，吸去上清，加入90μl新鲜培养液，然后每孔加入10μl CCK-8，继续培养1.5-2.5小时，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，按公式计算细胞活率：
[0039]
[0040] 结果如图1所示，在48小时，10μM浓度范围内多肽MEL-pep对大鼠原代细胞BMSC、人正常肝细胞L02的生长没有抑制作用，但是对肿瘤细胞：BEL-7402细胞以及BEL-7402/5-FU细胞有明显的抑制作用，且剂效关系明显，并与每种细胞的空白对照组相比有统计学差异(**P<0.01)。多肽MEL-pep对各细胞株的IC50值如表1所示：
[0041] 表1多肽MEL-pep对各细胞株的IC50(μM)
[0042]
[0043]
[0044] 二、多肽MEL与多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU生长抑制活性对比
[0045] 取对数生长期的人5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU(含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养基)，用其培养基调整细胞浓度为5×104/mL，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度MEL、MEL-pep 20μl/孔(终浓度分别为：0、1.25、2.5、5、10、20、40μM)，培养液调零，37℃、5％CO2培养48小时后，吸去上清，加入90μl新鲜培养液，然后每孔加入10μl CCK-8，继续培养1.5-2.5小时，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，按公式计算细胞活率：
[0046]
[0047] 结果如图2所示，多肽MEL与MEL-pep均能抑制BEL-7402/5-FU细胞的生长。与多肽MEL相比，MEL-pep的抑制细胞生长的作用更为显著，多肽MEL的半数抑制浓度IC50值为11.09μM，多肽MEL-pep IC50值为4.44μM，与MEL相比下降了6.85μM(约为MEL IC50值的59.96％)。
[0048] 三、多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU体外生长抑制的时间和剂量依赖关系
[0049] 取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL5-FU的RPMI 4
1640培养调整细胞浓度为5×10/mL。在E-Plate L8培养板的孔中加入150μl培养基，将E-Plate L8放到iCelligence系统上，系统会自动进行扫描。取出E-Plate L8，在孔中加入300μl混合均匀的BEL-7402/5-FU细胞悬液，使每孔中细胞数目为15,000cells。E-Plate L8置于超净台中室温放置30min，随后将培养板放到培养箱中的iCelligence上，启动机器，检测细胞增殖曲线。过夜培养后，加入50μL不同浓度的MEL-pep(终浓度为0、2、4、6、8、10μM)，每
15min检测一次细胞增值曲线。
1640培养调整细胞浓度为5×10/mL。在E-Plate L8培养板的孔中加入150μl培养基，将E-Plate L8放到iCelligence系统上，系统会自动进行扫描。取出E-Plate L8，在孔中加入300μl混合均匀的BEL-7402/5-FU细胞悬液，使每孔中细胞数目为15,000cells。E-Plate L8置于超净台中室温放置30min，随后将培养板放到培养箱中的iCelligence上，启动机器，检测细胞增殖曲线。过夜培养后，加入50μL不同浓度的MEL-pep(终浓度为0、2、4、6、8、10μM)，每
15min检测一次细胞增值曲线。
[0050] 结果如图3所示，多肽MEL-pep能够明显抑制BEL-7402/5-FU细胞的生长，并呈时间、剂量依赖关系。
[0051] 四、多肽MEL-pep与5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU细胞的结合作用
[0052] 取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，用PBS调整细胞浓度为3×105/mL，500μL/样。向每个样品中加入50μL PBS稀释的FITC标记的多肽MEL-pep(FITC-labeled-MEL-pep)，终浓度为：0、1、2、4μM，4℃避光孵育30min。随后收集细胞，1000rpm离心5min,弃去上清，加入预冷的PBS 5mL,细胞沉淀缓慢吹匀，1000rpm离心5min，弃去上清。PBS重复洗涤2次。细胞重悬于500μl PBS中，流式细胞仪检测FITC平均荧光强度。
[0053] 结果见附图4，与对照组相比，FITC-labeled-MEL-pep与BEL-7402/5-FU细胞孵育组细胞的荧光强度明显增强，主要表现为峰形图向右位移明显，证明多肽MEL-pep能够与BEL-7402/5-FU细胞结合，并呈计量依赖性。
[0054] 五、多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU细胞膜结构的影响[0055] 取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，将其铺至10cm的细胞培养皿中。待细胞长至60％融合时，向培养基中加入MEL-pep(终浓度分别为0、4μM)。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养，孵育24h后，收集细胞，1000rpm离心5min,弃去上清。加入5mL PBS重复洗涤2次，1000rpm离心5min,弃去上清。加入500μL 2.5％戊二醛固定，扫描电镜观察细胞膜结构。
[0056] 结果见附图5，对照组细胞的细胞膜结构完整，而多肽MEL-pep处理后的细胞，细胞膜出现明显的孔洞，因此，多肽MEL-pep对BEL-7402/5-FU细胞膜具有明显的破坏作用。
[0057] 六、多肽MEL-pep对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU的LDH释放的影响
[0058] 取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养调整细胞浓度为5×104/mL，将细胞接种至96孔板中，每孔100μl。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养，24h后，细胞贴壁。每孔加入20μl不同浓度多肽MEL-pep(终浓度为0、2、4、6、8、10μM)，刺激24h。收集细胞培养液上清。
[0059] 测定时，分为空白孔，标准孔，测定孔和对照孔4组。按照下表进行操作。
[0060]
[0061] 结果见附图6，在24h，与同一时间点的空白对照组相比，MEL-pep对BEL-7402/5-FU**细胞的LDH释放作用呈剂量依赖关系，并且具有统计学差异( P<0.01)。本实验进一步验证了多肽MEL-pep杀伤BEL-7402/5-FU是通过破膜作用的结论。
[0062] 七、多肽MEL-pep逆转5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU的耐药作用
[0063] 取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养调整细胞浓度为5×104/mL，将细胞接种至96孔板中，每孔100μl。加入用培养液稀释的不同浓度MEL-pep 20μl/孔(终浓度为：0、2、4μM)，培养液调零，37℃、5％CO2培养2h后加入不同浓度5-FU 20μl/孔(终浓度为：0、1、10、100、1000μg/mL)。37℃、5％CO2培养24h后，吸去上清，加入90μl新鲜培养液，然后每孔加入10μl CCK-8，继续培养1.5-2.5小时，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，按公式计算细胞活率：
[0064]
[0065] 结果如图7所示，与5-FU单独处理组相比，MEL-pep在IC50(4μM)和二分之一IC50(2μM)分别与5-FU联用后，5-FU的IC50由1298.97μg/mL显著降低至519.76、295.67μg/mL。因此，MEL-pep能够逆转BEL-7402/5-FU细胞对5-FU的耐药性。
[0066] 八、多肽MEL-pep抑制5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU耐药基因MDR1mRNA表达[0067] 取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养调整细胞浓度为2×105/mL，将细胞接种至6孔板中，每孔1.5mL。培养过夜后，加入用培养液稀释的不同浓度MEL-pep 500μl/孔(终浓度为：0、1、2、4μM)，37℃、5％CO2继续培养24h。向细胞培养孔内加入3mL预冷的PBS洗涤3次后，加入500μL trizol。提取细胞RNA，进行荧光定量PCR检测。
[0068] 结果如附图8所示，与对照组相比，MEL-pep干预后，BEL-7402/5-FU细胞耐药基因MDR1mRNA表达降低，并呈显著的剂量依赖性。
[0069] 九、多肽MEL-pep抑制5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU P-糖蛋白(P-gp)的表达
[0070] 取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养调整细胞浓度为2×105/mL，将细胞接种至6孔板中，每孔1.5mL。培养过夜后，加入用培养液稀释的不同浓度MEL-pep 500μl/孔(终浓度为：0、1、2、4μM)，37℃、5％CO2继续培养24h。收集细胞，离心弃上清。加入5mL PBS重复洗涤2次，1000rpm离心5min,弃去上清。加入100μL PBS重悬，加入5μL anti-P-glycoprotein-PE标记抗体，室温孵育30min。离心收集细胞，离心弃上清。加入5mL PBS重复洗涤2次，1000rpm离心5min,弃去上清。加入500μL PBS重悬，流式细胞仪检测。
[0071] 结果如附图9所示，与荧光定量PCR检测结果相似，MEL-pep显著下调BEL-7402/5-FU细胞表面P-gp，证实MEL-pep能够抑制BEL-7402/5-FU细胞耐药蛋白P-gp蛋白以及基因的表达。
[0072] 九、多肽MEL-pep抑制5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU Rhodamine123胞内蓄积
[0073] 取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后离心收集细胞，用含有10％FBS以及20μg/mL 5-FU的RPMI 1640培养调整细胞浓度为2×105/mL，将细胞接种至6孔板中，每孔1.5mL。培养过夜后，加入用培养液稀释的不同浓度MEL-pep 500μl/孔(终浓度为：0、1、2、4μM)，37℃、5％CO2继续培养24h。收集细胞，离心弃上清。加入5mL PBS重复洗涤2次，1000rpm离心5min,弃去上清。加入500μL PBS重悬，加入Rhodamine 123(终浓度5μg/mL)[0074] 37℃条件下避光孵育60min，空白对照组加入等体积的培养液。孵育结束后，冷PBS洗涤2遍，流式细胞仪检测细胞内的平均荧光强度。
[0075] 结果如图10所示，Rhodamine 123是一种特异性的P-gp荧光底物，细胞内Rhodamine 123的蓄积能够反映抑制P-gp活性的效率。MEL-pep作用后，BEL-7402/5-FU细胞内Rhodamine 123蓄积显著降低，证实MEL-pep能够抑制P-gp的功能。
[0076] 十、Cathelicidin-BF对5-FU耐药的肝癌细胞BEL-7402/5-FU体内生长抑制作用[0077] 取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，PBS稀释，台盼蓝染色后用血球计数板在倒置式显微镜下计数，活细胞数为98％以上，调整细胞浓度5×108/mL。实验采用3周龄裸小鼠3
24只，小鼠腋下右侧皮下接种0.1mL细胞。待小鼠瘤体积长至100-300mm 时，随机分为4组：
肿瘤模型组，MEL-pep低、中、高剂量治疗组(1、1.5、2mg/kg)，每组6只。给药方式为瘤内注射，每周给药三次，一共给药三周。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每3天测1次。给药21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
24只，小鼠腋下右侧皮下接种0.1mL细胞。待小鼠瘤体积长至100-300mm 时，随机分为4组：
肿瘤模型组，MEL-pep低、中、高剂量治疗组(1、1.5、2mg/kg)，每组6只。给药方式为瘤内注射，每周给药三次，一共给药三周。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每3天测1次。给药21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
[0078] 肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：
[0079] TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。
[0080] 肿瘤抑瘤率计算公式如下：
[0081]
[0082] 结果如附图11-12所示，MEL-pep能显著抑制BEL-7402/5-FU细胞荷瘤鼠肿瘤体内生长，并呈剂量依赖性。其中MEL-pep1、1.5、2mg/kg三个剂量组的抑瘤率分别为：50.69％、61.46％,and 72.92％。附图13体重曲线表明，MEL-pep给药组小鼠的体重曲线与模型组相比，并无显著下降。附图14实验各组小鼠肿瘤组织HE染色结果显示，模型组小鼠肿瘤组织增殖分裂明显，而给药组小鼠肿瘤组织坏死区域明显。因此，MEL-pep体内抗BEL-7402/5-FU细胞增殖活性显著。
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