抗体进化免疫原
阅读：28发布：2022-10-02
专利汇可以提供抗体进化免疫原专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 主要涉及HIV-1 抗体 ，尤其涉及广泛中和HIV-1抗体，以及HIV-1免疫原，和使用该免疫原来在主体(例如人)中诱导广泛中和HIV-1抗体产生的方法。，下面是抗体进化免疫原专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包括在图17或图19中列出的HIV-1包膜蛋白或包括gp120CD4结合位点环区域的其亚基，以及载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括在图17或图19中列出的HIV-1包膜蛋白的gp120亚基。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括在图19中列出的至少一种HIV-1包膜蛋白，或其所述亚基。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物包括HIV-1包膜蛋白703010505.TF、703010505.w53.16、703010505.w78.33或703010505.w100.B6，或其所述亚基。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括辅助剂。
6.一种构建体，其包括编码图17或图19中列出的HIV-1包膜蛋白或者包括gp120CD4结合位点环区域的其亚基的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列存在于载体中。
7.根据权利要求6所述的构建体，其中，所述载体是病毒载体或分枝杆菌载体。
8.根据权利要求7所述的构建体，其中，所述载体是腺病毒载体或痘病毒载体。
9.一种组合物，其包括根据权利要求6所述的构建体，以及载体。
10.一种诱导免疫反应的方法，其包括对需要其的哺乳动物施用足以产生所述诱导的量的根据权利要求1所述的组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，将HIV-1包膜蛋白703010505.TF或其亚基作为在初免-加强免疫法中的初免施用。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，施用图19中列出的至少一种HIV-1包膜蛋白或其亚基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述至少一种HIV-1包膜蛋白选自由下列各项组成的组中：703010505.w53.16、703010505.w78.33和703010505.w100.B6，或其亚基。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述组合物通过注射施用。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述组合物通过直肠内或通过阴道施用。
16.一种诱导免疫反应的方法，其包括在使得所述核苷酸序列被表达、所述HIV-1包膜蛋白或其亚基被生产，并且所述反应被诱导的条件下，向需要其的哺乳动物施用根据权利要求9所述的组合物。
17.根据权利要求10或16所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
抗体进化免疫原
[0001] 本申请要求2012年9月12日提交的美国临时专利申请61/700252、2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708466和2013年2月13日提交的美国临时专利申请
61/764421的优先权，上述每一项申请的全部内容通过引用结合入本文中。
61/764421的优先权，上述每一项申请的全部内容通过引用结合入本文中。
[0002] 本发明在美国国立卫生研究院授予的资助AI1067854和AI100645的政府支持下进行。美国政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
[0003] 本发明主要涉及HIV-1，尤其涉及广泛中和HIV-1抗体，和HIV-1免疫原，以及在主体(例如人)中使用该免疫原来诱导广泛中和HIV-1抗体的产生的方法。
背景技术
[0004] HIV-1包膜(Env)广泛中和抗体(BnAbs)的诱导是HIV-1疫苗研发的关键目标。BnAbs可以靶向保守区域，该保守区域包括构象多糖、gp41近膜区、V1/
V2区 域、gp120上 结 合 多糖 的 C3/V3，和 CD4结 合 位点 (CD4bs)(Walker et al，Science 326:285-289(2009)，Walker et al,Nature 477:466-470(2011)，Burton et al,Science 337:183-186(2012)，Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，
Zhou et al，Science 329:811-817(2010)，Sattentau and McMichael，FI000Biol.
Rep.2:60(2010),Stamatotos,Curr.Opin.Immunol.24:316-323(2012))。大部分成熟BnAbs具有一个或多个不寻常的特征(长重链第三互补决定区域[HCDR3s]，对于非-HIV-1抗
原具有多反应性，以及高水平的体细胞突变)，表明了对其诱导的大量障碍(Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Haynes et al,Science308:1906-1908(2005)，Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Mouquet and Nussenzweig,Cell Mol.Life Sci.69:1435-1445(2012)，Scheid et al,Nature458:636-640(2009))。尤其是，CD4bs BnAbs具有极高水平的体细胞突变，表明了复杂或延长的成熟通路(Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010))。此外，难以发现以高度亲和力与BnAb生殖细胞系或未突变的共同祖先(UCA)结合的Env，其是可作为用于诱导BnAbs的候选免疫原的特征(Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Chen et al，AIDS Res.Human Retrovirol.23:11(2008)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Ma et al，PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Pancera et al,J.Virol.84:8098-8110(2010)，Xiao et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009))。迄今为止已发现Evn结合至靶向gp41近膜区的BnAb的UCA(Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011))，以及结合至一些V1/V2BnAb的UCA(Bonsignori et al,J.Virol.85:9998-10009(2011))，但是目前没有发现结合CD4bs BnAb世系的UCA的异源性Env(Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Xiao et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009),Mouquet et al,Nature 467:591-595(2010)，Scheid et al,Science 333:1633-1637(2011)，Hoot et al,PLoS Pathog.9:el003106(2013))，although Envs that bind CD4bs BnAb UCAs should exist(Hoot et al,PLoS
Pathog.9:el003106(2013))，虽然结合CD4bs BnAb UCA的Env应该存在。
V2区 域、gp120上 结 合 多糖 的 C3/V3，和 CD4结 合 位点 (CD4bs)(Walker et al，Science 326:285-289(2009)，Walker et al,Nature 477:466-470(2011)，Burton et al,Science 337:183-186(2012)，Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，
Zhou et al，Science 329:811-817(2010)，Sattentau and McMichael，FI000Biol.
Rep.2:60(2010),Stamatotos,Curr.Opin.Immunol.24:316-323(2012))。大部分成熟BnAbs具有一个或多个不寻常的特征(长重链第三互补决定区域[HCDR3s]，对于非-HIV-1抗
原具有多反应性，以及高水平的体细胞突变)，表明了对其诱导的大量障碍(Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Haynes et al,Science308:1906-1908(2005)，Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Mouquet and Nussenzweig,Cell Mol.Life Sci.69:1435-1445(2012)，Scheid et al,Nature458:636-640(2009))。尤其是，CD4bs BnAbs具有极高水平的体细胞突变，表明了复杂或延长的成熟通路(Kwong and Mascola,Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010))。此外，难以发现以高度亲和力与BnAb生殖细胞系或未突变的共同祖先(UCA)结合的Env，其是可作为用于诱导BnAbs的候选免疫原的特征(Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Chen et al，AIDS Res.Human Retrovirol.23:11(2008)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Ma et al，PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Pancera et al,J.Virol.84:8098-8110(2010)，Xiao et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009))。迄今为止已发现Evn结合至靶向gp41近膜区的BnAb的UCA(Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011))，以及结合至一些V1/V2BnAb的UCA(Bonsignori et al,J.Virol.85:9998-10009(2011))，但是目前没有发现结合CD4bs BnAb世系的UCA的异源性Env(Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Xiao et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009),Mouquet et al,Nature 467:591-595(2010)，Scheid et al,Science 333:1633-1637(2011)，Hoot et al,PLoS Pathog.9:el003106(2013))，although Envs that bind CD4bs BnAb UCAs should exist(Hoot et al,PLoS
Pathog.9:el003106(2013))，虽然结合CD4bs BnAb UCA的Env应该存在。
[0005] 百分之八十的异性HIV-1感染通过一种传播/首建(transmitted/founder(T/F))病毒建立(Keele et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:7552-7557(2008))。对此病毒的初始中和抗体反应在传播大约3个月之后产生，并且是株系特异性的(Richman et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:4144-4149(2003)，Corti et al，PLoS One 5:e8805(2010))。对于T/F病毒的抗体反应驱使病毒逃逸，以致病毒突变体变得对自身血浆的中和作用
具有抗性(Richman et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4144-4149(2003)，Corti et al，PLoS One 5:e8805(2010))。该抗体-病毒比赛导致约80％的病人中中和抗体的很
差或受限的特异性；但是，在约20％的病人中，T/F病毒的进化的变异体以相当大的中和宽度诱导抗体，例如BnAbs(Walker et al,Nature 477:466-470(2011)，Bonsignori et al,J.Virol.85:9998-10009(2011)，Corti et al,PLos One 5:e8805(2010)，Gray et al,J.Virol.85:4828-4840(2011)，Klein et al,J.Exp.Med.209:1469-1479(2012)，Lynch et al，J.Virol.86:7588-7595(2012),Moore et al，Curr.Opin.HIV AIDS
4:358-363(2009)，Moore et al,J.Virol.85:3128-3141(2011),Tomaraset al，
J.Virol.85:11502-11519(2011))。
具有抗性(Richman et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4144-4149(2003)，Corti et al，PLoS One 5:e8805(2010))。该抗体-病毒比赛导致约80％的病人中中和抗体的很
差或受限的特异性；但是，在约20％的病人中，T/F病毒的进化的变异体以相当大的中和宽度诱导抗体，例如BnAbs(Walker et al,Nature 477:466-470(2011)，Bonsignori et al,J.Virol.85:9998-10009(2011)，Corti et al,PLos One 5:e8805(2010)，Gray et al,J.Virol.85:4828-4840(2011)，Klein et al,J.Exp.Med.209:1469-1479(2012)，Lynch et al，J.Virol.86:7588-7595(2012),Moore et al，Curr.Opin.HIV AIDS
4:358-363(2009)，Moore et al,J.Virol.85:3128-3141(2011),Tomaraset al，
J.Virol.85:11502-11519(2011))。
[0006] 存在许多潜在的分子途径，通过这些潜在的分子途径，HIV-1可能进化，并且具有不同中和特异性的抗体的种类可能确实遵循不同的途径(Wu et
al,Science333:1593-1602(2011)，Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。
由于初始自身中和抗体反应对于T/F病毒是特异性的(Moore et al,Curr.Opin.HIV
AIDS4:358-363(2009))，可以使一些T/FEnv预先倾向于结合在产生BnAb的稀少病人
中观察到的BnAb的生殖细胞系或未突变的共同祖先(UCA)。因此，尽管中和宽度通常
是直到慢性感染时才被观察到，但是在早期感染中在病毒进化和正在成熟的BnAb世
系之间的相互作用的精确理解可针对最终导致BnAb发展的事件提供洞察力。被研究
的BnAb至今仅仅已从在慢性感染期间被取样的个体中分离(Walker et al,Science
326:285-289(2009)，Burton et al，Science 337:183-186(2012)，Kwong and Mascola，Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science329:856-861(2010)，Wu et al,Science
333:1593-1602(2011),Zhou et al,Science329:811-817(2010)，Bonsignori et al，J.Virol.85:9998-10009(2011)，Corti et al,PLoS One 5:e8805(2010)，Klein et al，J.Exp.Med.209:1469-1479(2012))。因此，从病毒传播时开始的通过广泛中和的发展的病毒和抗体的进化轨迹还是未知的。
al,Science333:1593-1602(2011)，Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。
由于初始自身中和抗体反应对于T/F病毒是特异性的(Moore et al,Curr.Opin.HIV
AIDS4:358-363(2009))，可以使一些T/FEnv预先倾向于结合在产生BnAb的稀少病人
中观察到的BnAb的生殖细胞系或未突变的共同祖先(UCA)。因此，尽管中和宽度通常
是直到慢性感染时才被观察到，但是在早期感染中在病毒进化和正在成熟的BnAb世
系之间的相互作用的精确理解可针对最终导致BnAb发展的事件提供洞察力。被研究
的BnAb至今仅仅已从在慢性感染期间被取样的个体中分离(Walker et al,Science
326:285-289(2009)，Burton et al，Science 337:183-186(2012)，Kwong and Mascola，Immunity 37:412-425(2012)，Wu et al,Science329:856-861(2010)，Wu et al,Science
333:1593-1602(2011),Zhou et al,Science329:811-817(2010)，Bonsignori et al，J.Virol.85:9998-10009(2011)，Corti et al,PLoS One 5:e8805(2010)，Klein et al，J.Exp.Med.209:1469-1479(2012))。因此，从病毒传播时开始的通过广泛中和的发展的病毒和抗体的进化轨迹还是未知的。
[0007] 已提出通过靶向未突变的共同祖先(UCA)、BnAb的推定的天然B细胞受体开始的疫苗策略，其具有相关的Env免疫原以引发具有最终发展宽度的潜
力 的 抗 体 世 系 (Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，Haynes et al,Nat.
Biotechnol.30:423-433(2012)，Scheid et al,Nature 458:636-640(2009)，Chen et al，AIDS Res.Human Retrovirol.23:11(2008)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Xiao et al,Biochem.Biophys.Res.
Commun.390:404-409(2009)，Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011)，Mouquet et al,Nature467:591-595(2010))。随后将是用特异性选出以刺激产生BnAb的细胞突变通路的Env免疫接种。本策略的两个方面都已证明是具有挑战性的，这是因为缺少能够与UCA相互作用的特异性Env和BnAb的早期中间(I)抗体的知识。
力 的 抗 体 世 系 (Wu et al,Science 333:1593-1602(2011)，Haynes et al,Nat.
Biotechnol.30:423-433(2012)，Scheid et al,Nature 458:636-640(2009)，Chen et al，AIDS Res.Human Retrovirol.23:11(2008)，Dimitrol，MAbs 2:347-356(2010)，Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Xiao et al,Biochem.Biophys.Res.
Commun.390:404-409(2009)，Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011)，Mouquet et al,Nature467:591-595(2010))。随后将是用特异性选出以刺激产生BnAb的细胞突变通路的Env免疫接种。本策略的两个方面都已证明是具有挑战性的，这是因为缺少能够与UCA相互作用的特异性Env和BnAb的早期中间(I)抗体的知识。
[0008] 本发明至少部分产生于导致来自非洲病人的CH103CD4bs BnAb克隆性世系CH505的分离的研究，其从急性HIV-1感染随着BnAb发展。本研究显示了CH103BnAb世系比大多数其他CD4结合位点BnAb较少地突变，并且可能在早至HIV-1感染14周后就能被第一
次检测到。通过该世系中的抗体的早期自身中和引发了病毒逃逸，但是在表位区域中和附近的快速和广泛的Env进化在获取定义为异源性病毒的中和的血浆抗体中和宽度之前。
CH103Fab和gp120核心的共晶结构分析证实了抗体中和的新颖的环结合模式。
次检测到。通过该世系中的抗体的早期自身中和引发了病毒逃逸，但是在表位区域中和附近的快速和广泛的Env进化在获取定义为异源性病毒的中和的血浆抗体中和宽度之前。
CH103Fab和gp120核心的共晶结构分析证实了抗体中和的新颖的环结合模式。
发明内容
[0009] 本发明主要涉及HIV-1和广泛中和HIV-1抗体。更具体地，本发明涉及HIV-1免疫原和包括其的组合物。本发明进一步涉及在主体(例如人)中诱导广泛中和HIV-1抗体的产生的方法，以及适合在该方法中使用的化合物和组合物。
[0011] 图1A-1D。在供体CH505中的中和宽度的发展和抗体的分离。图1A，显示的是HIV-1病毒RNA拷贝和纵向血浆样品与HIV-1YU2核心gp120、RSC3和阴性对照ΔRSC3蛋白的反+ + + + -
应性。图1B，使用第136周的PBMC来筛分CD19、CD20、IgG、RSC3和RSC3Δ371I 记忆B
细胞(0.198％)。以橙、蓝和绿点表示的细胞产生mAb CH103、CH104和CH106，如通过索引筛分来鉴定。图1C，显示的是CH103抗体的HIV-1中和强度和宽度。通过邻接法(neighbor joining method)(NJ tree PHYLIP package software)创建的代表主要循环进化枝的196个HIV-1Envs的邻接系统发育树根据通过CH103的中和病毒的IC50染色。图1D，通过显示的HIV-1抗体的CH103结合至YU2gp120的交叉竞争，以及可溶性CD4-Ig在ELISA中被确
定。
应性。图1B，使用第136周的PBMC来筛分CD19、CD20、IgG、RSC3和RSC3Δ371I 记忆B
细胞(0.198％)。以橙、蓝和绿点表示的细胞产生mAb CH103、CH104和CH106，如通过索引筛分来鉴定。图1C，显示的是CH103抗体的HIV-1中和强度和宽度。通过邻接法(neighbor joining method)(NJ tree PHYLIP package software)创建的代表主要循环进化枝的196个HIV-1Envs的邻接系统发育树根据通过CH103的中和病毒的IC50染色。图1D，通过显示的HIV-1抗体的CH103结合至YU2gp120的交叉竞争，以及可溶性CD4-Ig在ELISA中被确
定。
[0012] 图2A-2D。随出现的时间的CH103-克隆家族，VHDJH突变和HIV-1Env反应性。来自分选的单个记忆B细胞和焦磷酸测序的VHDJH(图2A)和VLJL(图2B)序列的系统发育。使用DNA序列和http://www.ebi.ac.uk/Tools/phvlogenv/的EBI生物资讯服务器作图，使用dnaml最大可能性法进行祖先重建。使用邻接法阐明在克隆历史的情况下取样日期和读数丰富度的一致性。在VH单系进化枝并入单个分支的时点，突变频率显示在右边。分离的成熟抗体是红色的，来自于焦磷酸测序的序列是黑色的。至被观察的成熟抗体的推断的进化途径为粗体。图2C，具有推测的中间体的CH103世系(圆圈，I1-4、I7和I8)，突变的VH位点百分比和时间(蓝色)被表示出来。图2D，抗体对自身CH505(左框)和异源B.63521的结合亲和力(Kd，nM)通过SPR测量(右框)。
[0013] 图3A-3D。在复合体中的具有HIV-1gp120的外部结构域(OD)的抗体CH103的结构。图3A，具有gp120多肽的复合体的总体结构用红条带描绘，CH103作为分子表面显示(重链为绿色，轻链为蓝色)。图3B，被CH103连接的OD(红色)和被CH103连接的核心
gp120(灰色)的叠加，多肽以条带表现形式显示。图3C，OD(红色)上的CH103表位(绿
色)，初始CD4结合位点叠加(黄色边界)在表面表现形式上。图3D，结晶的gp120的外部结构域的序列比对显示在第一行，多样的HIV-1Env被CH103识别。第二结构单元在比对上用灰色虚线标记，表示无规则区域。黄色或绿色的标志表示gp120OD分别接触CD4和CH103，开口圆表示主链接触，带射线的开口圆表示侧链接触，实心圆表示主链和侧链接触两者。
gp120(灰色)的叠加，多肽以条带表现形式显示。图3C，OD(红色)上的CH103表位(绿
色)，初始CD4结合位点叠加(黄色边界)在表面表现形式上。图3D，结晶的gp120的外部结构域的序列比对显示在第一行，多样的HIV-1Env被CH103识别。第二结构单元在比对上用灰色虚线标记，表示无规则区域。黄色或绿色的标志表示gp120OD分别接触CD4和CH103，开口圆表示主链接触，带射线的开口圆表示侧链接触，实心圆表示主链和侧链接触两者。
[0014] 图4A-4D。CH103互补位、关键残基和所需的免疫前驱体。图4A，具有CH103的可变结构域的复合体的总体结构以条带表现方式来描绘，gp120以分子表面显示。染色方案与图3A相同。图4B，CH103抗体决定簇表面显示在表面下的多肽带的上部。通过贡献抗体组分对表面着色和标记。图4C，通过基础残基的成熟状态染色的CH103互补位表面。未突变的残基染洋红色，而亲和力成熟的残基对重链和轻链分别染绿色和浅蓝色。图4D，CH103克隆性世系成员的重链和轻链的序列比对。对框架和CDR残基进行标记，对与gp120相互作用的残基也标记(开口圆，主链相互作用；带射线的开口圆，侧链相互作用；实心圆，主链和侧链相互作用两者)。未突变的互补位残基用洋红色突出，成熟获得的互补位残基对重链以绿色突出，对轻链以蓝色突出。
[0015] 图5。在Ch505Env的关键区域中序列标识表现出变异。每个位点的每个氨基酸变异体的频率通过其高度表示，缺失以灰色栏表示。第一重现突变N279K在第4周出现(空心箭头)。BnAb活性发展的时间(从图8和表1)在左边。病毒多样化(在获得宽度之前)通过每个区域的右边的垂直箭头突出。CD4和CH103接触残基和基于HIV-1HXB2的氨基酸位置数目沿着每个标识栏的底部显示。
[0016] 图6A和6B。在CH103克隆性世系中的中和宽度的发展。图6A，系统发育CH103克隆性世系树，其显示自体同源T/F(C.CH505)、异源等级进化枝A(A.Q842)和B(B.BG1168)病毒的中和的IC50(微克/毫升)。图6B，进化中的病毒和发展中的克隆性世系(其在CH103发展的变异体和同时期的病毒的模型中绘图)之间的相互作用。HIV gp120的外部结构域以蠕虫表示方式描绘，蠕虫厚度和颜色(白色到红色)描绘了在每个时间点每个位点序列多样性的程度。抗体中间体的模型以卡通图显示，在每个时间点的体细胞突变在球体中突出，并对从I8至成熟抗体携带的突变着红色，对从I4至成熟抗体携带的突变着蓝绿色，对从I3至成熟抗体携带的突变着绿色，对从I2至成熟抗体携带的突变着蓝色，对从I1至成熟抗体携带的突变着橙色，对从I1的CH103突变着洋红色。直至成熟抗体，并没有一直携带的短暂突变着深橄榄色。抗体(互补位)残基以表面表现形式显示，并通过如图5中的其化学类型来着色。
[0017] 图7A和7B。第4周(图7A)和第14周(图7B)的汉明间距(hamming distance)频率分布。最佳匹配泊松分布的模型以红线显示。使用泊松匹配工具(见如下参考)在来自于主体CH505的第一个可获得的样品(图7A)中的序列多样性的分析表明，序列与星形系统发育相一致，并且突变根据泊松分布(适合度p＝0.11)积累。这与建立感染的单个首建病毒一致，在选择之前随机积累突变。Λ(lambda)参数是1.325，假定突变率为2.1610-05，从最近共同祖先的估计时间是22天(95％CI，18-27)。考虑到该置信区间的上限是27天，很有可能该样品在感染4周内被获取，因此，该取样时间称为“第四周”，作为保守估计。该时间估计进一步被登记时的Feibig分期支持。到第14周(图7B)，树不再与星形系统发育或泊松分布(p<<10-10)一致，表明选择在很好地进行中。注意，尽管在第4周的突变数据(图7A)与泊松分布在统计学上一致，观察到的成对序列一致性的数目相对于预期有所降低了，观察到的汉明距离1和2的数目比预期稍多。这很重要，因为该偏移是在CH103接触残基中在D环中单个突变(N279K)的结果——因此，尽管从泊松的偏移并不显著，考虑到其位置，有可能该位点是选择的非常早期的标志。(Giorgi et al,BMC Bioinformatics Oct
25；11:532(2010)，PMID:20973976http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/POISSON FITTER/poisson fitter.html)
25；11:532(2010)，PMID:20973976http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/POISSON FITTER/poisson fitter.html)
[0018] 图8。CH505病人的血浆抗体随时间结合至自身传播/首建(T/F)和异源HIV-1Env蛋白。血浆样品从HIV-1病人CH505纵向收集(从感染的时间开始(x轴中))，并基于TZM-b1细胞的中和测验，对针对抗自身传播/首建(T/F)病毒和异源HIV-1Env假病毒的中和活性进行测试，所述异源HIV-1Env假病毒包括亚型B(B)SF162、JRFL和BG1168)和亚型A。结果以IC50表示(相互血浆稀释)(在y轴中)。
[0019] 图9A和9B。CH103克隆性世系中的抗体对HIV-1Env重新在表面的核心3(RSC3)和RSC3突变体的反应性。CH103克隆性世系中的抗体以100微克至0.0005微克/毫升范
围的剂量在ELISA中测试对于(图9A)HIV-1Env RSC)和(图9B)具有P363N和D371I突
变的RSC3的结合。结果以EC50(微克/毫升)表达，并在个体抗体旁边表示。NB＝没有可检测到的结合。
围的剂量在ELISA中测试对于(图9A)HIV-1Env RSC)和(图9B)具有P363N和D371I突
变的RSC3的结合。结果以EC50(微克/毫升)表达，并在个体抗体旁边表示。NB＝没有可检测到的结合。
[0020] 图10A和10B。重组HIV-1Env gp140和gp120蛋白*的SDS-PAGE分析。HIV-1Env gp120和gp140蛋白在还原性条件下在SDS-PAGE上分析(图10A)，gp140蛋白在蓝色阴性PAGE上分析(图10B)。在胶的上部鉴定出单独的HIV-1Env蛋白。图10A，在SDS-PAGE
中，在本研究中使用的HIV-1gp120和gp140在还原性条件下没有降解。图10B，大部分异源HIV-1Env gp140Env和所有自身CH505gp140Env主要以三聚体迁移，并也含二聚体和单体形式。
中，在本研究中使用的HIV-1gp120和gp140在还原性条件下没有降解。图10B，大部分异源HIV-1Env gp140Env和所有自身CH505gp140Env主要以三聚体迁移，并也含二聚体和单体形式。
[0021] 图11A-11D。通过HEp-2染色、ANA测验和蛋白阵列微芯片分析对CH103克隆性世系抗体的多反应性进行的分析。CH103克隆性世系中抗体的反应性通过间接免疫荧光染色(图11A)和ANA测验(图11B)来测试。对于单个抗体的免疫荧光染色的*200倍放大的图呈现在抗体ID旁边。显示了使用成组的自体同源抗原通过ANA分析单个抗体的反应性的结果(图11B)。中间抗体(I1)和CH106用HEp-2细胞被鉴定为具有反应性，然后被选择用TM
于进一步的使用Invitrogen ProtoArrays ，用人类宿主细胞抗原对活性的测试(图11C和
11D)。发现I1(图11C)和CH106(图11D)表现出特异性的自身反应性和很强的多反应性。
通过免疫荧光检验法确定结合的抗体，对于151K阵列上9400个重组人类蛋白的相对荧光强度(y轴)对IA1(图11C)和CH106(图11D)阵列中的同源性强度(x轴)作图。所有蛋
白在每个阵列上印2份重复副本，并且每个数据点代表一个荧光测量值。每幅图中的对角线通过I1、CH106和151K对照抗体的相等的荧光强度(等效结合)。被I1和CH106结合
的自身抗原通过相比于151K的高荧光强度来鉴定，并用圆圈表示。多反应性通过显著的并且普遍从对角线偏移来表示。鉴定出的自身抗原：BHMT2(甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶2)；CENP-R(着丝粒蛋白R)【151K】；eEF-2K(真核延长因子2激酶)；UBE3A(泛素-蛋白连接酶E3A)【IA1和CH106】；TGM2(谷氨酰胺转移酶2)【CH106】；NFKBIA(B细胞抑制剂α中κ轻多肽基因增强子的细胞核因子)；FAM184A(具有序列相似性184的家族，成员A)【I1】。
于进一步的使用Invitrogen ProtoArrays ，用人类宿主细胞抗原对活性的测试(图11C和
11D)。发现I1(图11C)和CH106(图11D)表现出特异性的自身反应性和很强的多反应性。
通过免疫荧光检验法确定结合的抗体，对于151K阵列上9400个重组人类蛋白的相对荧光强度(y轴)对IA1(图11C)和CH106(图11D)阵列中的同源性强度(x轴)作图。所有蛋
白在每个阵列上印2份重复副本，并且每个数据点代表一个荧光测量值。每幅图中的对角线通过I1、CH106和151K对照抗体的相等的荧光强度(等效结合)。被I1和CH106结合
的自身抗原通过相比于151K的高荧光强度来鉴定，并用圆圈表示。多反应性通过显著的并且普遍从对角线偏移来表示。鉴定出的自身抗原：BHMT2(甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶2)；CENP-R(着丝粒蛋白R)【151K】；eEF-2K(真核延长因子2激酶)；UBE3A(泛素-蛋白连接酶E3A)【IA1和CH106】；TGM2(谷氨酰胺转移酶2)【CH106】；NFKBIA(B细胞抑制剂α中κ轻多肽基因增强子的细胞核因子)；FAM184A(具有序列相似性184的家族，成员A)【I1】。
[0022] 图12A和12B。在P21空间群中CH103-gp120复合体的晶体堆积。图12A，晶体晶格的视图。在每个非对称单元中的两个复合体被标为红色和蓝色虚线，并在卡通图中显示，其中gp120为红色和浅橙色，CH103重链为绿色和浅绿色，CH103轻链为浅蓝色和蓝绿色。图12B，在两个相邻的复合体之间的晶格的放大视图。当来自VRC01复合体的进化枝C ZM176.66的延伸的核心gp120叠加在其在CH103复合体中有序的相应部分时，以洋红色显示的内部结构域与相邻复合体抵触，表明gp120的内部结构域并不存在于CH103-gp120晶体中，因为在晶体生长期间的蛋白水解降解。
[0023] 图13。在CH505中，HIV随时间进化的像素图和系统发育树。像素工具(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/pixel/pixeI.htmn)被用来显示包膜的V1至V5区域中的氨基变化；焦点在此区域，由于其最关键的CD4bs抗体易感性，并包括所有已知的CD4结合接触，其表示为沿着图的顶部的黑色抖动(tic)标记。蓝色tic标记表示CH103接触残基，水平的蓝线表示gp120的用于CH103晶体结构的部分(尽管接触表面大部分在该处，但是还缺失了对于CD4和VRC01重要的一部分，这就是我们使用CD4接触来帮助限定在那些缺失的区域中可能对CH103结合重要的部分的原因)。每行是序列，并且其被根据系统发育排序。红色部分表示相对于TF病毒的氨基酸改变，黑色部分表示插入或缺失。对翻译的Env序列用PhyML.v2[1]和JTT替代模型[2]来构建右边的系统发育树。该树被
设置为梯状，T/F病毒从传播4周后获得的第一时间点的序列重建。颜色表示感染后的估计周数。该树用APE v3.0-6[3]提出，两者都用R v2.15.1[4]。箭头表示第30-53周的选择性瓶颈。(Guindon et al,Syst.Biol.52:696-704(2003)，Jones et al，Comput Applic Biosci 8:275-282(1992)，Paradis et al,Bioinformatics 20:289-290(2004)，R Core Team.2012.R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3-900051-07-0，URL http://www.R-proiect.org/。)
设置为梯状，T/F病毒从传播4周后获得的第一时间点的序列重建。颜色表示感染后的估计周数。该树用APE v3.0-6[3]提出，两者都用R v2.15.1[4]。箭头表示第30-53周的选择性瓶颈。(Guindon et al,Syst.Biol.52:696-704(2003)，Jones et al，Comput Applic Biosci 8:275-282(1992)，Paradis et al,Bioinformatics 20:289-290(2004)，R Core Team.2012.R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3-900051-07-0，URL http://www.R-proiect.org/。)
[0024] 图14。熵图，其显示在CH505中在每个取样的时间点中的每个位点多样性。显示了全长gp160，突出显示了CD4和CH103接触残基。本图显示了在比对中每个位置的香农熵，其中考虑了位置字符的所有观察到的频率，并且缺口以字符处理(Korber J Virol.1994；68(11):7467-81)。这提供了横跨Env的区域性的时间点内多样性的图，并显示了随着时间流逝突变集中的地方和关键区域的相对多样性。
[0025] 图15A和15B。在与CH103表位相关的区域，在CH505中与在其他主体中病毒序列进化的速度的比较。图15A，序列距离的分布表示为在两个序列之间不同的氨基酸的百分比，这是由在给定时间点取样的所有序列匹配比较得到的。存在所有同源感染的情况，因此，在急性感染中，在CH103相关区域的突变少到几乎没有，或者在病毒(左手边组)中的其他地方。在登记24周后(从在CH505中感染第30周，在此标记为第六个月，因为这是大约的)，开始产生大量突变，其集中于CH103相关区域(上面中间组)，但是不在Env的其他区域(下面中间组)。在该时间框中取样的15个主体中，CH103具有最高排名的多样性(p＝0.067)，表明在该主体中开始得异常早的集中的选择性压力。过一年(第12月表示从登记的10-14个月取得的样品)，该区域开始在许多个体中进化，可能是由于在感染后期开始的自身NAb反应。图15B，基于CH103相关区域的系统发育树。在该视图中，以金色显示的第
6个月偏离T/F病毒的大量进化尤其突出。在第6个月，在CH505中取样的序列和T/F祖先状态取样的序列之间的距离比在第二最多变的个体704010042中的序列多得多(Wilcoxon秩和，p＝0.0003:CH505，中位数＝0.064,范围＝0.019-0.13，N＝25，704010042，中位数＝0.027，范围＝0.009-0.056，N＝26)。
6个月偏离T/F病毒的大量进化尤其突出。在第6个月，在CH505中取样的序列和T/F祖先状态取样的序列之间的距离比在第二最多变的个体704010042中的序列多得多(Wilcoxon秩和，p＝0.0003:CH505，中位数＝0.064,范围＝0.019-0.13，N＝25，704010042，中位数＝0.027，范围＝0.009-0.056，N＝26)。
[0026] 图16。病毒和抗体的共同进化——抗体CH103的成熟和gp120中序列可变性表位之间的相互作用。每个时间点的序列可变性(在样品中)绘制于gp120结构中，其追踪从传播后14周至100周的时间内的病毒进化。每个残基的熵用颜色编码绿色到白色到红色，以表示没有序列变异至轻微变异至高度序列变异。该广泛的病毒时间点内的多样性与最终发展宽度的正在成熟化抗体系相一致。在此，体细胞突变随着CH103克隆系从未突变的共同祖先(UCA)至I-8至I-4至I-3至I-2至I-1并至成熟CH103捕获。抗体的重链(紫色)和轻链(蓝绿色)的着色球表示根据下面方案的进化途径期间体细胞突变的出现/消失。
红色球：在I-8出现并一直保持直到成熟成CH103的突变，橙色球：在I-4出现并一直保持直到成熟成CH103的突变，蓝色球：很早出现但在成熟成CH103前消失的突变，灰色球：在成熟中非常晚期出现的突变。在本工作中确定的来自ZM176.66复合体的Fab CH103-gp120的结构被用于对这些突变作图。在100周的序列熵被用于与CH103匹配，以简单地表示体细胞突变的相对空间位置和gp120中序列可变性。如在本文中讨论的，病毒随时间进化追随中和宽度，该简单的作图支持(i)T/F病毒开始在表位的区域中或邻近表位的区域中非常早期地进行多样化，和(ii)在进化早期产生并在重链中保持固定的体细胞突变倾向于在gp120接触区域聚集，这不同于后期出现的那些突变。
红色球：在I-8出现并一直保持直到成熟成CH103的突变，橙色球：在I-4出现并一直保持直到成熟成CH103的突变，蓝色球：很早出现但在成熟成CH103前消失的突变，灰色球：在成熟中非常晚期出现的突变。在本工作中确定的来自ZM176.66复合体的Fab CH103-gp120的结构被用于对这些突变作图。在100周的序列熵被用于与CH103匹配，以简单地表示体细胞突变的相对空间位置和gp120中序列可变性。如在本文中讨论的，病毒随时间进化追随中和宽度，该简单的作图支持(i)T/F病毒开始在表位的区域中或邻近表位的区域中非常早期地进行多样化，和(ii)在进化早期产生并在重链中保持固定的体细胞突变倾向于在gp120接触区域聚集，这不同于后期出现的那些突变。
[0027] 图17A和17B。氨基酸(图17A)和核酸(图17B)序列。703010505.TF是传播/首建序列，“W和数量”表示传播后的周数。
[0028] 图18。在BnAb诱导之后急性感染病人中抗体-病毒的共同进化。
[0029] 图19A-19D。多价疫苗序列。CH505Env序列(图19A和19B)，CH505_D8gp120序列(图19C)和相应的切割位点突变(图19D)(突出显示的)。
[0030] 图20。HIV-1军备竞赛：来自于慢性感染的病人CH0505的从传播的时间之后的广泛中和抗体的分离。
[0031] 图21。图20中显示CH0505的相同病毒克隆系树——右侧加星形的是为免疫原选择的顺序env的例子，在左边的树上加星形的是图17中的env序列。
[0032] 图22。CD4、VRC01和b12的接触区域，以及影响VRC01和b12中和的b12和标识位点在CH0505中受到很大的选择性压力。
[0033] 图23。在仅仅CD4/b12/VRC01接触残基中的成对区别的数目对于CH0505也相对高。
[0034] 图24。来自CH0505的克隆103的克隆系树——与CH0505传播/首建Envgp140(EC50微克/毫升)结合。
[0035] 图25。来自CH0505的克隆CH103的克隆系树——等级2CH0505(EC50，微克/毫升)的中和。
[0036] 图26。HIV-1疫苗设计。
[0037] 图27。在HIV-1感染的个体(CH505)中的BnAb发展期间的病毒进化。
[0038] 图28。CH505Env gp120与RSC3的比对。
[0039] 图29。对于CH505外部结构域免疫原的设计。
[0040] 图30。通过CH505Env变异体单独或者顺序施用于BALB/c小鼠诱导的RSC3比RSC3Δ371蛋白的血浆结合比例。
具体实施方式
[0041] 在下列实施例中描述的本研究的结果表明T/F Env结合至BnAb世系的UCA B细胞受体导致广谱的中和抗体的诱导，以此来提供疫苗诱导的CD4bs BnAb克隆性活化和扩增的逻辑起始位置。重要的是，实现中和宽度所需的突变数量相比于大多数CD4bs BnAbs来说在CH103系中减少，尽管CH103系相比于突变较多的CD4bs BnAbs来说中和宽度降低。
通过早期感染追踪病毒进化发现，在该个体中，在获得NAb宽度之前，T/F病毒中发生强度选择和表位多样化——由此表明病毒变异体或变异联合体与直接来自于自体同源性中和抗体的BnAb的发生相关，并说明了用于诱导类似B细胞系的通路。(参见图17A、B和图
19A-D中病毒包膜序列(和编码序列)。)用作免疫原的包膜可以全长gp140、具有跨膜部分的gp145、gp120s、重新暴露的于表面于表面核心蛋白gp120、外部结构域构造体gp120，或者具有CH103接触部分(例如gp120D环、V5环和表达的CD4结合位点环区域)的其他最
小gp120构造体的形式表达，以使得UCA和/或中间抗体和/或成熟的CH103、CH104、CH105和CH106成熟抗体与免疫原构造体结合。
通过早期感染追踪病毒进化发现，在该个体中，在获得NAb宽度之前，T/F病毒中发生强度选择和表位多样化——由此表明病毒变异体或变异联合体与直接来自于自体同源性中和抗体的BnAb的发生相关，并说明了用于诱导类似B细胞系的通路。(参见图17A、B和图
19A-D中病毒包膜序列(和编码序列)。)用作免疫原的包膜可以全长gp140、具有跨膜部分的gp145、gp120s、重新暴露的于表面于表面核心蛋白gp120、外部结构域构造体gp120，或者具有CH103接触部分(例如gp120D环、V5环和表达的CD4结合位点环区域)的其他最
小gp120构造体的形式表达，以使得UCA和/或中间抗体和/或成熟的CH103、CH104、CH105和CH106成熟抗体与免疫原构造体结合。
[0042] 根据本发明，免疫方法可包括选自图17和19的Env构造体的顺序免疫，或者可涉及Env联合体的初级和加强免疫，或者施用该序列的“群”(例如图19A-D中的序列)。也可使用免疫原片段/亚基，因为可以编码核苷酸序列。或者，在病人中传播CH505之后，可传播的首建病毒Env构建体可用作初免，然后再用该可传播的首建Env来加强免疫，并在后续次数渐进地顺序加入额外的Env。进一步的，重复免疫可能被CH505Env的“群”影响(例如，包括图19A-D中的蛋白质和核酸序列的多种组合)，其范围为例如2-40个Env。本发明的免疫接种策略的例子在图18中表示。
[0043] 在下列实施例中提供的数据对于理解CH103世系的B细胞成熟通路，以及对于在免疫接种条件下重复类似的通路具有暗示。首先，证明了在CH505中BnAbs由顺序Env进化驱动，其最早起始于传播后的14周，假设是正确的免疫原，与使用疫苗的BnAb世系的这种类型的诱导相容的时间段。第二，虽然异源Env并不结合UCA或者该世系的早期中间抗体，但是CH505T/F Env与CH103UCA非常棒地结合，并且随后的Env与后的续克隆性世系成员以增加的亲和性结合。因此，用Env或Env亚基的类似序列的免疫可以预期为驱动类似的世系。第三，CH103世系相比于VRC01类抗体并不复杂，因为在该世系中的抗体具有较少的体细胞突变，并且没有插入缺失标记，除了CH103VL在LCDR1区域有一个3个氨基酸残基的缺失外。下面实施例1中描述的研究是在一个病人中进行的。但是，在每一个BnAb病人中，病毒进化的分析应该阐明诱导BnAb宽度的进化的Env的类似的通路。感染了CCR5-热带SHIV-AD8病毒的恒河猴频繁地发展出中和宽度(Shingai et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:19769-19774(2012))的观察表明某些包膜可能比其他包膜更有可能诱导宽度和强度。
[0044] 在外缘的亲和力成熟期间，在CH103世系中产生的对于在宿主分子的多反应性与与BnAb活性相一致。该发现与下列假设相一致：BnAbs可能源自于B细胞的内在性多反应性池(其具有多反应性，这通过Env和宿主分子的异源连接提供了中和优势)(ouquet et al,Nature 467:591-595(2010)，Alam et al,J.Immunol.178:4424-4435(2007))。
[0045] 或者，由于CH103亲和力成熟涉及适应多样的共循环形式的表位的同时存在(Malherbe et al,J.Virol..85:5262-5274(2011))，选择能够与大量逃逸株产生的表位多样性相互作用的抗体可能还是驱动多反应性的易获得的进化动力。
[0046] 因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种在主体(例如人)中激活适宜的初始B细胞反应的方法，所述方法通过施用CH505T/F Env或Env亚基(其可包括具有跨膜部分的gp145、gp41和gp120、未剪切的gp140、剪切的gp140、gp120、gp120亚基，例如重新暴露的于表面的核心(Wu X，Science 329:856-61(2010))、外部结构域、或者仅表达CH103与Env的接触点的最小表位，即gp120D环、V5环和CD4结合位点环区域(最小表位，以避免显性Env非中和表位))，然后用随后进化的CH505Env变异体(例如图17和19中的那些)的代表来加强免疫，或者联合施用以模拟亲和力成熟期间的体内观察到的高多样性，或者使用特异性选取以通过与UCA和抗体中间体的高亲和性结合来触发适宜的成熟通路的疫苗免疫原进行连续施用(Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012))。DNA、RNA、蛋白质或加载体的免疫原可以单独或联合使用。在本发明的一个实施方式中，对主体(例如人)施用可传播的首建病毒包膜(例如B.6240(也参加图17))作为初免包膜施用给主体(例如人)，然后以一定量并在一定条件下施用本文中公开的一种或多种顺序包膜作为加强免疫，以使得BnAbs在主体(例如人)中产生。通过实施例的方式，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17或18种包膜(或其亚基)(例如从图19)，一次初免，多次加强免疫。
10、11、12、13、14、15、16、17或18种包膜(或其亚基)(例如从图19)，一次初免，多次加强免疫。
[0047] 在实施例中提供的数据证明了在传播事件之后在血浆BnAb活性的发展期间研究主体对于一起分离T/F病毒和其进化的准种与诱导的BnAbs的克隆性世系的重要性。T/F Env可以作为强效BnAb的刺激物并且最佳地结合该BnAb UCA，该发现对于疫苗的设计有关键的启示作用，并且使得通过靶向UCA和BnAb克隆性世系树的IAs来诱导BnAbs成
为可能(Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012))。本发明包括本发明公开的特定的包膜蛋白(例如图17A和图19A-D中的蛋白)和包括编码该蛋白的核苷酸序列的
核酸(例如图17B中的那些)。优选的序列(氨基酸和核酸)包括命名为703010505.TF、
703010505.w53.16、703010505、w78.33和703010505.wl00.B6的序列。包膜蛋白(和亚基)可以在例如293T细胞、293F细胞或CHO细胞(Liao et al，Virology 353:268-82(2006))中表达。如上所述，包膜蛋白可以例如作为gp120或gp140蛋白来表达，包膜蛋白的部分可以用作免疫原，例如重新暴露的于表面的核心蛋白设计(RSC)(图28)(Wu et al,Science
329:856-861(2010))；另一种可能的设计是外部结构域设计(图29)(Lynch et al，
J.Virol.86:7588-95(2012))。本发明包括本发明公开的包膜序列的免疫原片段/亚基，包括长度为至少6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、
280、300、320或更多氨基酸的片段，以及包括编码该片段的核苷酸序列的核酸，以及包括其的载体。
为可能(Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012))。本发明包括本发明公开的特定的包膜蛋白(例如图17A和图19A-D中的蛋白)和包括编码该蛋白的核苷酸序列的
核酸(例如图17B中的那些)。优选的序列(氨基酸和核酸)包括命名为703010505.TF、
703010505.w53.16、703010505、w78.33和703010505.wl00.B6的序列。包膜蛋白(和亚基)可以在例如293T细胞、293F细胞或CHO细胞(Liao et al，Virology 353:268-82(2006))中表达。如上所述，包膜蛋白可以例如作为gp120或gp140蛋白来表达，包膜蛋白的部分可以用作免疫原，例如重新暴露的于表面的核心蛋白设计(RSC)(图28)(Wu et al,Science
329:856-861(2010))；另一种可能的设计是外部结构域设计(图29)(Lynch et al，
J.Virol.86:7588-95(2012))。本发明包括本发明公开的包膜序列的免疫原片段/亚基，包括长度为至少6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、
280、300、320或更多氨基酸的片段，以及包括编码该片段的核苷酸序列的核酸，以及包括其的载体。
[0048] 在其他实施方式中，本发明提供了图17中的序列的变异体，其中，变异体包括修复胰蛋白酶剪切位点的突变，由此防止蛋白质在Env蛋白在细胞系(例如CHO细胞系中)生产期间剪切。该胰蛋白酶抗性变异体的非限制性实施例在图19D中显示(文件的部分，被称为构造体切割位点突变)。在一个实施方式中，在CH0505TF 7gp120中位点289处的氨基酸“A”变为“T”，位点295处的氨基酸“Q”变为“D”。本发明设计了胰蛋白酶抗性Env变异体，其包括在图17中的任何Env序列中的相应位点的改变。
[0049] 包膜(免疫原)可以采用适宜的载体用标准技术来产生，以生产适用于施用的组合物。组合物可包括辅助剂，例如适用于蛋白免疫的明矾、聚IC、MF-59或其他基于鲨烯的辅助剂、ASO1B或其他基于脂质体的辅助剂。
[0050] 如上所述，编码免疫原的核酸序列(例如DNA序列)也可在使得免疫原在体内表达并且BnAbs被生产的条件下对主体(例如人)施用。DNA可以作为载体中
的插入物存在，例如r腺病毒(Barouch，et al.Nature Med.16:319-23(2010))、重
组分枝杆菌(即BCG或耻垢分支杆菌(M smegmatis))(Yu et al.Clinical Vaccine
Immunol.14:886-093(2007)；ibid 13:1204-11(2006))，或者重组牛痘类型载体(Santra S.Nature Med.16:324-8(2010))。
的插入物存在，例如r腺病毒(Barouch，et al.Nature Med.16:319-23(2010))、重
组分枝杆菌(即BCG或耻垢分支杆菌(M smegmatis))(Yu et al.Clinical Vaccine
Immunol.14:886-093(2007)；ibid 13:1204-11(2006))，或者重组牛痘类型载体(Santra S.Nature Med.16:324-8(2010))。
[0051] 本发明的免疫原和编码其的核酸(例如DNA)适用于在病人(例如人类病人)中对HIV-1产生免疫反应的应用。免疫原或编码序列的施用的方式可以基于具体免疫原、病人和所追求的效果以及类似地施用的剂量变化。通常，施用途径是肌内或皮下注射(也可以使用静脉内和腹膜内注射)。此外，可以通过鼻内途径或直肠内或作为类似栓剂的赋形剂的阴道给药来施用制剂。最佳剂量方式可以很容易地由本领域技术人员确定。免疫原(和编码其的核酸)优选用于预防应用，但是向感染的个体如此给药可以降低病毒载量。
[0052] 以前尝试使用以已在发展了中和宽度的人或动物中随着时间的推移进化的Env蛋白来进行顺序免疫，失败了，主要是因为病毒已被分离但是包膜免疫原自身并没匹配来结合BnAbs，即它们不是免疫原性的。即，在已在BnAb主体中随着时间推移分离的Env的两组研究中，没有获得可传播的首建病毒或者后续(顺序)的病毒，因此要选择的正确的Env免疫原并不是显而易见的(Malherbe et al,J Virol.85:5262-74(2011)；
Pissoni,Vaccine 30:5519-26(2012))。在本文中，不同地方在于驱动BnAbs的诱导和成熟的BnAbs和病毒Env序列都是已知的，因此，在CD4结合位点或者在对于CD4结合位点
BnAb结合重要的区域(例如V5环区域)(Zhou et al,Science 329:811-17(2010)；Wu et al,Science 333:1593-602(2011))，可以用突变选择这些包膜。
Pissoni,Vaccine 30:5519-26(2012))。在本文中，不同地方在于驱动BnAbs的诱导和成熟的BnAbs和病毒Env序列都是已知的，因此，在CD4结合位点或者在对于CD4结合位点
BnAb结合重要的区域(例如V5环区域)(Zhou et al,Science 329:811-17(2010)；Wu et al,Science 333:1593-602(2011))，可以用突变选择这些包膜。
[0053] 本发明的某些方面在下列非限制性的实施例中更加具体地描述。(也参见2011年10月3日提交的美国临时专利申请61/542469、2012年9月12日提交的美国临时专利申请
61/700234、2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708413、2012年9月12日提交
的美国临时专利申请61/700252、2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708466、
2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708503、2013年3月29日提交的美国临时
专利申请61/806717、2011年12月8日提交的美国专利申请13/314712、2012年10月3日
提交的PCT/US2012/000442，其每一篇的全部内容通过引用结合入本文中。)
61/700234、2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708413、2012年9月12日提交
的美国临时专利申请61/700252、2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708466、
2012年10月1日提交的美国临时专利申请61/708503、2013年3月29日提交的美国临时
专利申请61/806717、2011年12月8日提交的美国专利申请13/314712、2012年10月3日
提交的PCT/US2012/000442，其每一篇的全部内容通过引用结合入本文中。)
[0054] 实施例1
[0055] 实验细节
[0056] 总而言之，如描述的那样，从感染之后4周开始直到感染后236周，连续地从HIV-1感染的主体CH505中收集血样。MAbs CH103、CH104和CH106通过如所述
的单个RSC3特异性记忆B细胞的分离、扩增和克隆产生(Scheid et al,J.Immunol.
Methods 343:65-67(2009)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science
333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Scheid et al,Science
333:1633-1637(2011))。对来自传播后的5个时间点的样本进行VHDJH和VLJL 454焦磷
酸测序(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011))。使用如所述的方法实施推断未突变的祖先(UCA)、克隆成员的鉴定和生产(Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))(Kepler,T.B.已提交,2012))。外加VHDJH和VLJL和VLJL基因通过454焦磷酸测序鉴定(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011)，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011)，Boyd et al,Sci.Transl.Med.I:12ra23(2009))，如前人报告的那样，使用筛选的VHDJH和VLJL基因用于制备重组抗体，((Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。病人血浆抗体和CH103克隆性世系抗体成员与自体同源和异源的HIV-1Env的结合通过ELISA和表
面等离子体共振来测定(Alam et al，J.Virol.85:11725-11731(2011),Liao et al，J.Exp.Med.208:2237-2249(2011)，Alam et al，J.Immunol.178:4424-4435(2007)，Alam et al,J.Virol.82:115-125(2008))，并且病人血浆和CH103抗体克隆性世系成员的中和活性在基于TZM-b1的假病毒的中和测试中测定(Wu et al,Science 329:856-861(2010),Seaman et al,J.Virol.84:1439-1452(2010),Montefiori,Cur.Protoc.Immunol.,Chapter 12，Unit 12 11(2005))。CH103结合于HIV-1外部结构域的晶体学分析如前报告地实
施(Zhou et al，Science 329:811-817(2010))。292CH505Envs的GenBank登 记号 是
KC247375-KC247667，CH103克隆性世系中的抗体成员的459VHDJH和174VLJL序列的GenBank登记号分别是KC575845-KC576303和KC576304-KC576477。不结合CH103Fab以及与
ZM176.66外部结构域形成复合体的CH103Fab的协调(coordinates)和结构因子已存入蛋白质数据库(Protein Data Bank)中。
的单个RSC3特异性记忆B细胞的分离、扩增和克隆产生(Scheid et al,J.Immunol.
Methods 343:65-67(2009)，Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al,Science
333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Scheid et al,Science
333:1633-1637(2011))。对来自传播后的5个时间点的样本进行VHDJH和VLJL 454焦磷
酸测序(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011))。使用如所述的方法实施推断未突变的祖先(UCA)、克隆成员的鉴定和生产(Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))(Kepler,T.B.已提交,2012))。外加VHDJH和VLJL和VLJL基因通过454焦磷酸测序鉴定(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011)，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011)，Boyd et al,Sci.Transl.Med.I:12ra23(2009))，如前人报告的那样，使用筛选的VHDJH和VLJL基因用于制备重组抗体，((Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。病人血浆抗体和CH103克隆性世系抗体成员与自体同源和异源的HIV-1Env的结合通过ELISA和表
面等离子体共振来测定(Alam et al，J.Virol.85:11725-11731(2011),Liao et al，J.Exp.Med.208:2237-2249(2011)，Alam et al，J.Immunol.178:4424-4435(2007)，Alam et al,J.Virol.82:115-125(2008))，并且病人血浆和CH103抗体克隆性世系成员的中和活性在基于TZM-b1的假病毒的中和测试中测定(Wu et al,Science 329:856-861(2010),Seaman et al,J.Virol.84:1439-1452(2010),Montefiori,Cur.Protoc.Immunol.,Chapter 12，Unit 12 11(2005))。CH103结合于HIV-1外部结构域的晶体学分析如前报告地实
施(Zhou et al，Science 329:811-817(2010))。292CH505Envs的GenBank登 记号 是
KC247375-KC247667，CH103克隆性世系中的抗体成员的459VHDJH和174VLJL序列的GenBank登记号分别是KC575845-KC576303和KC576304-KC576477。不结合CH103Fab以及与
ZM176.66外部结构域形成复合体的CH103Fab的协调(coordinates)和结构因子已存入蛋白质数据库(Protein Data Bank)中。
[0057] 所用的方法在下面更具体地描述。
[0058] 研究主体。从血样中分离血浆和周边血单核细胞(PBMC)，所述血样从感染后6周至感染后236周，在HIV-1感染的主体CH505中连续收集(表1)，并分别在-80摄氏度和液氮箱的条件下冷冻。在此期间，不施用抗-反转录病毒疗法。与人类主体相关的所有工作符合杜克大学健康系统机构审查委员会(Duke University Health System Institutional Review Board)允许的机构审查委员会方法。
[0059] 未突变的共同祖先(UCA)的推断和克隆成员的鉴定。重链和轻链(VHDJH和VLJL)基因片段的可变区域以其自身的自然成对推出。对于这两个基因片段的后验概率分别为0.999和0.993。UA首先从自然成对中推出。另外，克隆相关可变区序列通过然后从
迭代限定的UCA的深度测序和估算中鉴定出。推出的所有的可变区序列被鉴定为已重新排列成相同的VHDJH和JH，并具有正确的CDR3长度。对于每个序列，对所述序列和推测的VHDJH基因之间的错配的数量进行计数，直到第二个不变的半胱氨酸的密码子。每次重复基于当前后验模式UA的CDR3。对于每个候选序列，计算在其CDR3和UA CDR3之间的
核苷酸错配的数目。对于测试中比例之间的差异，如果z-统计大于2，则放弃该序列作为潜在的克隆成员(Zar,Biostatistical Analysis,entice-Hall，Inc.，Upper Saddle River,NJ(1974))。一旦通过CDR3距离这样筛选出候选序列的集合，则推测UA为所述序列的较大的集合((Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Liao et al，J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。详细描述方法和其数学基础的文献(Kepler,T.B.,Reconstructing a B cell clonal lineage:I.Statistical Inference of Unobserved Ancestors)已存入康奈尔的arXiv preprint collection http://arxiv.org/。如果新的后验模式UA与前一个不同，则重复此过程直到实现收敛。由于来自由观察到的抗体衍生来的VHDJH序列和由454焦磷酸测序鉴定出的序列的CDRH3中发生非常大的不确定性，推出7个最可能的VH UCA序列，导致4个独特的氨基酸序列，其都被生产，并用传播/首建包膜gp140对活性进行了测验(表5)。
迭代限定的UCA的深度测序和估算中鉴定出。推出的所有的可变区序列被鉴定为已重新排列成相同的VHDJH和JH，并具有正确的CDR3长度。对于每个序列，对所述序列和推测的VHDJH基因之间的错配的数量进行计数，直到第二个不变的半胱氨酸的密码子。每次重复基于当前后验模式UA的CDR3。对于每个候选序列，计算在其CDR3和UA CDR3之间的
核苷酸错配的数目。对于测试中比例之间的差异，如果z-统计大于2，则放弃该序列作为潜在的克隆成员(Zar,Biostatistical Analysis,entice-Hall，Inc.，Upper Saddle River,NJ(1974))。一旦通过CDR3距离这样筛选出候选序列的集合，则推测UA为所述序列的较大的集合((Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Ma et al,PLoS Pathog.7:el002200(2001)，Liao et al，J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))。详细描述方法和其数学基础的文献(Kepler,T.B.,Reconstructing a B cell clonal lineage:I.Statistical Inference of Unobserved Ancestors)已存入康奈尔的arXiv preprint collection http://arxiv.org/。如果新的后验模式UA与前一个不同，则重复此过程直到实现收敛。由于来自由观察到的抗体衍生来的VHDJH序列和由454焦磷酸测序鉴定出的序列的CDRH3中发生非常大的不确定性，推出7个最可能的VH UCA序列，导致4个独特的氨基酸序列，其都被生产，并用传播/首建包膜gp140对活性进行了测验(表5)。
[0060] VHDJH和VL基因的分离以及VHDJH和VLJL基因作为全长IgG1重组mAbs的表达。使用如前述方法，通过流式筛选的HIV-1Env RSC3(重新在表面的核心3)特异性记忆B细胞的RT/PCR来扩增观察到的CH103、CH104和CH106的VHDJH和VLJL基因片段对以及CH105的VHDJH基因片段(Scheid et al，J.Immunol.Methods 343:65-67(2009)，Wu et al,Science329:856-861(2010)，Wu et al，Science333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science
329:811-817(2010)，Scheid et al,Science333:1633-1637(2011))。此外，VHDJH和VLJL和VLJL基因通过454焦磷酸测序来鉴定。来源于筛选出的单个B细胞或者454焦磷酸测序的克隆相关的VHDJH和VLJL序列被合并使用，以产生邻接系统发育树(图2A和2B)。从单个记忆B细胞中收回的抗体在图中用红色注释，粗线显示了从UCA到成熟BnAbs的推断的进化途径。为了清楚起见，在同样时间点，在单个系统发育进化枝中成组相关的VH变异体坍缩成单个分支，通过Newick Utilities安装包(v.1.6)的“nw_condense”功能，将457个VHDJH和174个VLJL变异体分别浓缩到119个和46个分支(Junier and Zdobnov,Bioinformatics
26:1669-1670(2010))。在每个B细胞样品中，VHDJH变异体的频率显示在图2A中VHDJH树的右侧，并通过对第53、92和144周的188793、186626和211901个序列的样本大小分别计算出来。两个VHDJH基因(IZ95W和02IV4)在传播后14周被发现，并与用于作为IgG1mAbs的表达的UCA VLJL配对。IZ95W mAb以11微克/毫升的末端滴度与CH505T/F Env gp140微弱地结合。在树中的重链序列中，每个序列的平均距离与其最近的相邻序列被计算为8.1nt。
累积分布函数显示，虽然存在非常紧密在一起的对(pairs)(约30％的序列距离其相邻序列1nt)，所有序列的45％与其最近相邻序列相差6nt或更多。通过PCR和测序产生与起始序列相差6个或更多核苷酸的序列的概率非常小。从总共1亿个PBMC中获得的序列的数
量在50-500抗原特异性B细胞的预期范围中。
329:811-817(2010)，Scheid et al,Science333:1633-1637(2011))。此外，VHDJH和VLJL和VLJL基因通过454焦磷酸测序来鉴定。来源于筛选出的单个B细胞或者454焦磷酸测序的克隆相关的VHDJH和VLJL序列被合并使用，以产生邻接系统发育树(图2A和2B)。从单个记忆B细胞中收回的抗体在图中用红色注释，粗线显示了从UCA到成熟BnAbs的推断的进化途径。为了清楚起见，在同样时间点，在单个系统发育进化枝中成组相关的VH变异体坍缩成单个分支，通过Newick Utilities安装包(v.1.6)的“nw_condense”功能，将457个VHDJH和174个VLJL变异体分别浓缩到119个和46个分支(Junier and Zdobnov,Bioinformatics
26:1669-1670(2010))。在每个B细胞样品中，VHDJH变异体的频率显示在图2A中VHDJH树的右侧，并通过对第53、92和144周的188793、186626和211901个序列的样本大小分别计算出来。两个VHDJH基因(IZ95W和02IV4)在传播后14周被发现，并与用于作为IgG1mAbs的表达的UCA VLJL配对。IZ95W mAb以11微克/毫升的末端滴度与CH505T/F Env gp140微弱地结合。在树中的重链序列中，每个序列的平均距离与其最近的相邻序列被计算为8.1nt。
累积分布函数显示，虽然存在非常紧密在一起的对(pairs)(约30％的序列距离其相邻序列1nt)，所有序列的45％与其最近相邻序列相差6nt或更多。通过PCR和测序产生与起始序列相差6个或更多核苷酸的序列的概率非常小。从总共1亿个PBMC中获得的序列的数
量在50-500抗原特异性B细胞的预期范围中。
[0061] 关于已分离的独特的VHDJH和VLJL基因的数目，该问题已以多种方式分析。首先，已清楚地计算出已从研究的样本中分离的抗原特异性CD4bs记忆B细胞的可能数量。五个病人CH505的时间点通过对总共一亿个研究的PBMC进行每个时间点约两千万的PBMC
的焦磷酸测序来研究。在慢性HIV中，每微升血液中总共有平均145个B细胞，和每微
升血液中有平均60个记忆B细胞(Moir et al,The Journal of Infectious Diseases
197:572-579(2008))。在慢性HIV感染中，总的B细胞的约40％的记忆B细胞的这样高的百分比是因为HIV感染中初始B细胞的选择性损失。因此，在100ml(100000μl)血液中，存在大约6百万记忆B细胞。如果0.1-1.0％是抗原特异性的，则其将是6000-60000个采样的抗原特异性B细胞，如果其中5％是CD4bs抗体，则将从所研究的一亿个PBMC中取到
300-3000CD4bs B细胞样品。这与上述综述者的计算的范围(每5百万PBMC中50CD4bs B
细胞)完全吻合并在此范围内，因为研究了一亿PBMC，所以通过这些计算应该取到了1000个CD4bs B细胞样品。因此，任一种计算得到与扩增的474条VHDJH完全吻合的预测。
的焦磷酸测序来研究。在慢性HIV中，每微升血液中总共有平均145个B细胞，和每微
升血液中有平均60个记忆B细胞(Moir et al,The Journal of Infectious Diseases
197:572-579(2008))。在慢性HIV感染中，总的B细胞的约40％的记忆B细胞的这样高的百分比是因为HIV感染中初始B细胞的选择性损失。因此，在100ml(100000μl)血液中，存在大约6百万记忆B细胞。如果0.1-1.0％是抗原特异性的，则其将是6000-60000个采样的抗原特异性B细胞，如果其中5％是CD4bs抗体，则将从所研究的一亿个PBMC中取到
300-3000CD4bs B细胞样品。这与上述综述者的计算的范围(每5百万PBMC中50CD4bs B
细胞)完全吻合并在此范围内，因为研究了一亿PBMC，所以通过这些计算应该取到了1000个CD4bs B细胞样品。因此，任一种计算得到与扩增的474条VHDJH完全吻合的预测。
[0062] 为了进一步研究分离的序列的可信度，所用的第二种分析的方法如下。在树中的重链中，可以计算每个序列与其最邻近的序列的距离。与最邻近的序列的平均距离为8.1nt。累积分布函数显示，虽然存在非常紧密在一起的匹配(约30％的序列距离其相邻序列为1nt)，所有序列的45％与其最邻近的序列相差6nt或更多。与起始序列相差6个或更多核苷酸的通过PCR和测序得到的序列的概率非常小。据报道在样本中代表性基因的数目比50更接近200，最有可能大于200。
[0063] 实施的第三分析是计算树中的每个重链序列与其最邻近的序列的距离。与最邻近的序列的平均距离为8.1nt。使用凝聚聚类方法(Agglomerative clustering)来精简序列比对。在序列匹配都不是3个核苷酸或以下的阶段，452个序列中有335个序列保留；当匹配都不是相隔6nt或更近时，仍有288个序列保留。因此，用该分析，相信在样本中代表性基因的数目相比于50更接近300，并可能更大。因此，相信通过这些重新分析的总和，图2中树中基因的数目是非常可信的。
[0064] 分离的Ig VHDJH和VLJL基因对、推测的UCA和中间VHDJH和VLJL序列和通过焦磷酸测序鉴定筛选的VHDJH基因序列用实验的方法来研究(表2)，并用于产生系统发育树，其显示突变的VH位点的百分比和传播后出现的时间(图2C)和结合亲和力(图2D)。分离的四种成熟抗体用红色表示，来自于454焦磷酸测序的抗体用黑色表示，推测的中间抗体(I1-I4、I7、I8)在祖先节点用圈表示。树中深度进化枝具有适中的自引支持度，并且当更多序列加入系统发育分析时，分支顺序和UCA的推论稍微改变(比较图2C和图2A的分支
顺序)。在研究中，图2C和2D中描绘的树被用于得出研究早期代表性世系的祖先中间体，并标记出抗体亲和力成熟分析中重要的步骤。合成VHDJH和VLJL基因(GenScript，美国新泽西)，并克隆到pcDNA.1质粒中(Invitrogen,Grand Island,美国纽约)，以制备纯的重组IgG1抗体，如前所述(Liao et al,J.Virol.Methods 158:171-179(2009)，Liao et al，Immunity 38:176-186(2013))。I1-I4、I7、I8的VHDJH基因以及CH105的VHDJH基因可与推测的UCA的VL基因成对，也可与基于VHDJH与UCA或者作为如所述的全长IgG1抗体表达的成熟抗体(Liao et al，J.Meth.Virol.158:171-179(2009))的遗传距离的I2成对(表
2)。
顺序)。在研究中，图2C和2D中描绘的树被用于得出研究早期代表性世系的祖先中间体，并标记出抗体亲和力成熟分析中重要的步骤。合成VHDJH和VLJL基因(GenScript，美国新泽西)，并克隆到pcDNA.1质粒中(Invitrogen,Grand Island,美国纽约)，以制备纯的重组IgG1抗体，如前所述(Liao et al,J.Virol.Methods 158:171-179(2009)，Liao et al，Immunity 38:176-186(2013))。I1-I4、I7、I8的VHDJH基因以及CH105的VHDJH基因可与推测的UCA的VL基因成对，也可与基于VHDJH与UCA或者作为如所述的全长IgG1抗体表达的成熟抗体(Liao et al，J.Meth.Virol.158:171-179(2009))的遗传距离的I2成对(表
2)。
[0065] 重组HIV-1蛋白的制备。包括亚型B-63521、亚型C1086和亚型CRF_01-427299以及亚型C-CH505自体传播/首建Env的HIV-1Env基因，如gp140或gp120(AE.427299)，
从急性感染的HIV-1主体通过如下方法获得：单基因组扩增(Keele et al,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 105:7552-7557(2008))利用高度表达的人类看家基因的密码子的偏好性来优化密码子(Andre et al,Joumalof Virology 72:1497-1503(1998))、从头合成并克隆到哺乳动物表达质粒pcDNA3.1/潮霉素(Invitrogen,Grand Island,美国纽约)中。
在无血清的培养基中培养的293F细胞中生产重组Env糖蛋白，并用表达HIV-1gp140或
gp120的pcDNA3.1质粒转染，通过使用雪花莲凝集素琼脂糖(Vector Labs，Burlingame,美国加尼福尼亚州)柱层析(Ma et al,PLoS Pathog.7:e 1002200(2001))，Liao et
al,Virology353:268-282(2006)，Liao et al,Immunity 38:176-186(2013))纯化转染的
293F细胞的上清液，并储存于-80摄氏度备用。选择制成CH505T/F Env的Env通过进一步叠加6次柱层析以形成三聚体形式来纯化，并用于结合分析，其显示与凝集素纯化的寡聚体类似的结果。
从急性感染的HIV-1主体通过如下方法获得：单基因组扩增(Keele et al,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 105:7552-7557(2008))利用高度表达的人类看家基因的密码子的偏好性来优化密码子(Andre et al,Joumalof Virology 72:1497-1503(1998))、从头合成并克隆到哺乳动物表达质粒pcDNA3.1/潮霉素(Invitrogen,Grand Island,美国纽约)中。
在无血清的培养基中培养的293F细胞中生产重组Env糖蛋白，并用表达HIV-1gp140或
gp120的pcDNA3.1质粒转染，通过使用雪花莲凝集素琼脂糖(Vector Labs，Burlingame,美国加尼福尼亚州)柱层析(Ma et al,PLoS Pathog.7:e 1002200(2001))，Liao et
al,Virology353:268-282(2006)，Liao et al,Immunity 38:176-186(2013))纯化转染的
293F细胞的上清液，并储存于-80摄氏度备用。选择制成CH505T/F Env的Env通过进一步叠加6次柱层析以形成三聚体形式来纯化，并用于结合分析，其显示与凝集素纯化的寡聚体类似的结果。
[0066] 酶联免疫检测(ELISA)。病人血浆抗体和CH103克隆性世系抗体成员与自体同源和异源的HIV-1Env的结合通过如前所述的ELISA来测定(Liao et al,J.Exp.
Med.208:2237-2249(2011)，Liao et al，Immunity 38:176-186(2013))。在PBS中，从1:30开始至1：5214470系列3倍稀释的血浆样品，或者从100μg/ml开始至0.000μg/m系列3倍稀释的纯化mAb，用于结合自体同源和异源的HIV-1Env分析。对通过未标记的HIV-1抗体和从10μg/ml起连续4倍稀释的可溶性CD4的交叉竞争测验了半饱和浓度下的生物素
标记的CH103的结合。确定了血浆样本和mAbs对HIV-1Env的数最大有效浓度(EC50)，并表达为血浆样本的相互稀释度或mAbs的浓度。
Med.208:2237-2249(2011)，Liao et al，Immunity 38:176-186(2013))。在PBS中，从1:30开始至1：5214470系列3倍稀释的血浆样品，或者从100μg/ml开始至0.000μg/m系列3倍稀释的纯化mAb，用于结合自体同源和异源的HIV-1Env分析。对通过未标记的HIV-1抗体和从10μg/ml起连续4倍稀释的可溶性CD4的交叉竞争测验了半饱和浓度下的生物素
标记的CH103的结合。确定了血浆样本和mAbs对HIV-1Env的数最大有效浓度(EC50)，并表达为血浆样本的相互稀释度或mAbs的浓度。
[0067] 表面等离子体共振(SPR)亲和力和动力学测量。对mAbs和所有候选的UCA与自体同源的Env C.CH05gp140和/或异源的Env B.63521gp120的结合Kd和速率常数(结
合速率ka，脱离速率kd)的测量在BIAcore 3000仪上进行，如前所述地(Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011)，Alam et al,J.Immunol.178:4424-4435(2007)，Alam et al,J.Virol.82:115-125(2008))。抗人IgG Fc抗体(Sigma Chemicals)固定于CM5传感
器芯片上，有约15000个反应单元(RU)，每个抗体被捕获于约50-200个RU，其在三个独立的流动室中用于重复分析，此外有一个在相同传感器芯片上捕获对照Synagis(抗-RSV)mAb的流动室。使用对每个mAb-HIV-1Env结合相互作用的双重定位来减去Env蛋白分别
对对照表面和空白缓冲液流动的非特异性结合和信号漂移。对每个mAb优化在传感器表面的抗体捕获水平，以最小化重复结合和任何有关的亲和力效应。C.CH505Env gp120蛋白以
2-25μg/ml的浓度注射，B.63521gp120以50-400μg/ml的浓度对UCA和早期中间体(IA8、IA4)的剂量注射，以10-100μg/ml(IA3)和1-25μg/ml的浓度对末端和成熟的mAbs。所有曲线拟合分析用对1:1Langmuir模型的整体拟合进行，并代表至少三次测验值。所有数据分析使用BIA评估4.1分析软件(GE Healthcare)实施。
合速率ka，脱离速率kd)的测量在BIAcore 3000仪上进行，如前所述地(Alam et al,J.Virol.85:11725-11731(2011)，Alam et al,J.Immunol.178:4424-4435(2007)，Alam et al,J.Virol.82:115-125(2008))。抗人IgG Fc抗体(Sigma Chemicals)固定于CM5传感
器芯片上，有约15000个反应单元(RU)，每个抗体被捕获于约50-200个RU，其在三个独立的流动室中用于重复分析，此外有一个在相同传感器芯片上捕获对照Synagis(抗-RSV)mAb的流动室。使用对每个mAb-HIV-1Env结合相互作用的双重定位来减去Env蛋白分别
对对照表面和空白缓冲液流动的非特异性结合和信号漂移。对每个mAb优化在传感器表面的抗体捕获水平，以最小化重复结合和任何有关的亲和力效应。C.CH505Env gp120蛋白以
2-25μg/ml的浓度注射，B.63521gp120以50-400μg/ml的浓度对UCA和早期中间体(IA8、IA4)的剂量注射，以10-100μg/ml(IA3)和1-25μg/ml的浓度对末端和成熟的mAbs。所有曲线拟合分析用对1:1Langmuir模型的整体拟合进行，并代表至少三次测验值。所有数据分析使用BIA评估4.1分析软件(GE Healthcare)实施。
[0068] 中和分析。TZM-b1细胞中的中和抗体分析如前所述地进行(Montefiori,TheJournal of Infectious Diseases 206:431-441(2012))。在基于TZM-b1的中和使
用中，测定了从1:20稀释开始的8次连续三倍稀释的血浆样品和用于从50μg/ml开
始的8次连续三倍稀释的重组mAb的血浆样品对抗自体同源和异源HIV-1Env准型病
毒的中和活性，其使用如所述的方法(Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Seaman et al,J.Virol.84:1439-1452(2010)，Montefiori，The Journal of Infectious
Diseases206:431-441(2012))。数据用相比于对照孔的荧光单元的减少来计算，并以对于血浆样品的相互稀释或者对于mAb的μg/ml的IC50进行报告。
用中，测定了从1:20稀释开始的8次连续三倍稀释的血浆样品和用于从50μg/ml开
始的8次连续三倍稀释的重组mAb的血浆样品对抗自体同源和异源HIV-1Env准型病
毒的中和活性，其使用如所述的方法(Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Seaman et al,J.Virol.84:1439-1452(2010)，Montefiori，The Journal of Infectious
Diseases206:431-441(2012))。数据用相比于对照孔的荧光单元的减少来计算，并以对于血浆样品的相互稀释或者对于mAb的μg/ml的IC50进行报告。
[0069] 抗体CH103和其gp120复合体的结晶。CH103的抗原结合片段(Fab)通过IgG1CH103的LyS-C(Roche)消化来产生，并用如前所述的方法来纯化(Zhou et
al,Science 329:811-817(2010))。HIV-1进化枝C ZM176.66的延伸的核心gp120被用于与Fab CH103形成复合体。简单地说，延伸核心gp120的去糖基化的ZM176.66(其使用如前述的方法生产(Zhou et al，Science 329:811-817(2010)))和Fab CH103以1：1.2的摩尔比在室温下混合，并用包括0.35M NaCl、2.5mM Tris pH 7.0，0.02％NaN3的缓冲液，通过体积排阻色谱法纯化(Hiload 26/60Superdex S200prep grade,GE Healthcare)。Fab片段或gp120：CH103复合体被浓缩至约10mg/ml，在-80摄氏度保存之前用液氮快速冷冻，然后用于结晶筛选实验。
al,Science 329:811-817(2010))。HIV-1进化枝C ZM176.66的延伸的核心gp120被用于与Fab CH103形成复合体。简单地说，延伸核心gp120的去糖基化的ZM176.66(其使用如前述的方法生产(Zhou et al，Science 329:811-817(2010)))和Fab CH103以1：1.2的摩尔比在室温下混合，并用包括0.35M NaCl、2.5mM Tris pH 7.0，0.02％NaN3的缓冲液，通过体积排阻色谱法纯化(Hiload 26/60Superdex S200prep grade,GE Healthcare)。Fab片段或gp120：CH103复合体被浓缩至约10mg/ml，在-80摄氏度保存之前用液氮快速冷冻，然后用于结晶筛选实验。
[0070] 使用市售筛选(即筛选试剂盒)，如Hampton Crystal Screen(HamptonResearch)、Precipitant Synergy Screen(Emerald BioSystems)、Wizard Screen(Emerald BioSystems)、PACT Suite和JCSG+(Qiagen)来进行Fab CH103和其gp120复合体的初步
结晶筛选。气相扩散悬滴法通过将0.2μl蛋白质与等体积的沉淀剂溶液(Honeybee 963，DigiLab)混合来自动设置。筛选板在20℃储存，用Rocklmager仪(Formulatrix.)在预定时间成像。用JCSG+试剂盒，Fab CH103晶体在一定条件下出现，所述试剂盒包括170mM硫酸铵、15％甘油和25.5％PEG4000。对于gp120：CH103复合体，用PACT suite，晶体在真菌污染的液滴中孵育21天之后获得，所述PACT suite包括200mM甲酸钠、20％PEG 3350和
100mM二缩水甘油醚，pH7.5。
结晶筛选。气相扩散悬滴法通过将0.2μl蛋白质与等体积的沉淀剂溶液(Honeybee 963，DigiLab)混合来自动设置。筛选板在20℃储存，用Rocklmager仪(Formulatrix.)在预定时间成像。用JCSG+试剂盒，Fab CH103晶体在一定条件下出现，所述试剂盒包括170mM硫酸铵、15％甘油和25.5％PEG4000。对于gp120：CH103复合体，用PACT suite，晶体在真菌污染的液滴中孵育21天之后获得，所述PACT suite包括200mM甲酸钠、20％PEG 3350和
100mM二缩水甘油醚，pH7.5。
[0071] gp120：CH103复合体的X射线数据收集，结构确定和优化。在低温条件下收集衍射数据。最佳冷冻保护剂条件通过筛选如前所述几种常用的冷冻保护剂获得(Zhouet al，Science 329:811-817(2010))。X射线衍射数据在阿贡国家实验室的先进光子
源光束ID-22(SER-CAT)上收集，使用 辐射，用HKL2000(Otwinowski,Methods in
Enzymology 276:307(1997))处理和还原。对于Fab CH103晶体，在 分辨率下的数据
集合用低温溶液收集，所述低温溶液包括20％乙二醇、300mM硫酸铵、15％甘油和25％PEG
4000(表7)。对于gp120：CH103晶体，在 分辨率下的数据集合用低温溶液收集，所述
低温溶液包括30％甘油、200mM硫酸铵、30％PEG 3350和100mM二缩水甘油醚，pH 7.5(表
7)。
源光束ID-22(SER-CAT)上收集，使用 辐射，用HKL2000(Otwinowski,Methods in
Enzymology 276:307(1997))处理和还原。对于Fab CH103晶体，在 分辨率下的数据
集合用低温溶液收集，所述低温溶液包括20％乙二醇、300mM硫酸铵、15％甘油和25％PEG
4000(表7)。对于gp120：CH103晶体，在 分辨率下的数据集合用低温溶液收集，所述
低温溶液包括30％甘油、200mM硫酸铵、30％PEG 3350和100mM二缩水甘油醚，pH 7.5(表
7)。
[0072] Fab CH103晶体在细胞尺寸为a＝43.0,b＝146.4，c＝66.3，α＝90.0，β＝97.7，γ＝90.0的P21空间群中，并且包括每非对称单元2个Fab分子(表7)。Fab CH103的晶体结构在CCP4程序组中(CCP4Program Suite，Project，eta Crystallographica Section D 50:760(1994))用已公开的抗体结构作为搜索模用相位器通过分子置换法来解析(McCoy et al,J.Appl.Crystallogr.40:658-674(2007))。gp120：CH103晶体也属于细胞尺寸为a＝48.9,b＝208.7，c＝69.4，α＝90，β＝107.2，γ＝90.0的P21空间群，并且包括每非对称单元2个gp120：CH103复合体(表7)。高分辨率的Fab CH103结构被用作初始模型，以将Fab CH103组分放到复合体中。固定Fab CH103位置，用VRC01结合形式的ZM 176.66d的延伸核心gp120作为初始模型搜索没有将gp120组分放入复合体中。在
gp120模型中修剪内部结构域和桥联片之后，相位器能够将gp120的剩下外部结构域正确放入复合体中，而没有显著的碰撞。晶体晶格的堆积分析表明缺乏容纳gp120的内部结构域的空间，暗示结晶期间，可能通过包含的真菌进行了gp120的蛋白酶剪切。
gp120模型中修剪内部结构域和桥联片之后，相位器能够将gp120的剩下外部结构域正确放入复合体中，而没有显著的碰撞。晶体晶格的堆积分析表明缺乏容纳gp120的内部结构域的空间，暗示结晶期间，可能通过包含的真菌进行了gp120的蛋白酶剪切。
[0073] 结构优化用PHENIX(Adams et al,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:1948-1954(2002))实施。从通过渐冷的扭曲角度刺激退火开始，在COOT(Emsley and
Cowtan,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2126-2132(2004))上实施重复的人工建模，使图由标准位置、个体B-因子、TLS优化算法和非晶轴对称(NCS)限制产生。在每个大循环期间加入有序的溶剂。在整个优化过程期间，使用交叉验证(R自由度)测试集合(由5％的数据构成)，加入氢作为骑式模型(riding model)。结构验证在建模/优
化过程期间使用MolProbity(Davis et al,Nucleic Acids Res.35:W375-383(2007))和pdb-care(Lutteke and von der Lieth，BMC Bioinformatics 5:69(2004))周期性地进行。
X射线晶体衍射数据和优化统计总结于表7。使用卡巴特命名法(Kabat nomenclature)
((Kabat et 1，C.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th
Editiion(1991))对抗体中氨基酸序列中的氨基酸残基计数。
Cowtan,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2126-2132(2004))上实施重复的人工建模，使图由标准位置、个体B-因子、TLS优化算法和非晶轴对称(NCS)限制产生。在每个大循环期间加入有序的溶剂。在整个优化过程期间，使用交叉验证(R自由度)测试集合(由5％的数据构成)，加入氢作为骑式模型(riding model)。结构验证在建模/优
化过程期间使用MolProbity(Davis et al,Nucleic Acids Res.35:W375-383(2007))和pdb-care(Lutteke and von der Lieth，BMC Bioinformatics 5:69(2004))周期性地进行。
X射线晶体衍射数据和优化统计总结于表7。使用卡巴特命名法(Kabat nomenclature)
((Kabat et 1，C.Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th
Editiion(1991))对抗体中氨基酸序列中的氨基酸残基计数。
[0074] 蛋 白 结 构 和 图 示。 使 用 PISA(Krissinel and Henrick,J.Mol.Biol.372:774-797(2007))来进行蛋白-蛋白界面分析。 使用CCP4(Emsley and
Cowtan,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2126-2132(2004))来进行结构比
对。具有蛋白质晶体结构的所有图示用Pymol(DeLano，The PyMOL Molecular Graphics System,DeLano Scientific，San Carlos,CA,USA http://wvAv.pymol.Org(2002))进行。
Cowtan,Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:2126-2132(2004))来进行结构比
对。具有蛋白质晶体结构的所有图示用Pymol(DeLano，The PyMOL Molecular Graphics System,DeLano Scientific，San Carlos,CA,USA http://wvAv.pymol.Org(2002))进行。
[0075] CH103克隆性世系抗体通过HEp-2细胞染色、ANA测验和蛋白阵列微芯片的多反应性分析。以50μg/ml的CH103克隆性世系中所有抗体对HEp-2细胞(Inverness
Medical Professional Diagnostics,Princeton，NJ)的自身反应性(通过间接免疫荧光染色)和一板抗原(panel of autogen)(通过使用如前所述的方法的ANA测验(Haynes
et al,Science 308:1906-1908(2005)))进行了分析。中间抗体(IA1)和CH106被鉴定为对HEp-2细胞具有反应性，然后使用ProtoArray 5microchip(根据微芯片制造商的指导)(Invitrogen,Grand Island，美国纽约)，选择其用于进一步测试对与人宿主细胞抗原的反应性。简单地说，ProtoArray 5microchip被阻断，并在4℃下暴露的于表面于2μg/ml IA1、CH106或人类骨髓瘤蛋白151K(Southern Biotech)相匹配的同种型(IgG1，k)中90分钟。蛋白-抗体相互作用用1μg/ml Alexa荧光647标记的抗人IgG来检测。测验在
635nm处以10μm分辨率使用100％功率和600增大(GenePix 4000B scanner,Molecular Devices)扫描。荧光强度使用GenePix Pro 5.0(Molecular Devices)来定量。特定组的蛋白点定义由微芯片供应商提供，并比对到图像上。
Medical Professional Diagnostics,Princeton，NJ)的自身反应性(通过间接免疫荧光染色)和一板抗原(panel of autogen)(通过使用如前所述的方法的ANA测验(Haynes
et al,Science 308:1906-1908(2005)))进行了分析。中间抗体(IA1)和CH106被鉴定为对HEp-2细胞具有反应性，然后使用ProtoArray 5microchip(根据微芯片制造商的指导)(Invitrogen,Grand Island，美国纽约)，选择其用于进一步测试对与人宿主细胞抗原的反应性。简单地说，ProtoArray 5microchip被阻断，并在4℃下暴露的于表面于2μg/ml IA1、CH106或人类骨髓瘤蛋白151K(Southern Biotech)相匹配的同种型(IgG1，k)中90分钟。蛋白-抗体相互作用用1μg/ml Alexa荧光647标记的抗人IgG来检测。测验在
635nm处以10μm分辨率使用100％功率和600增大(GenePix 4000B scanner,Molecular Devices)扫描。荧光强度使用GenePix Pro 5.0(Molecular Devices)来定量。特定组的蛋白点定义由微芯片供应商提供，并比对到图像上。
[0076] 结果
[0077] CH103BnAb世系的分离
[0078] HIV-1感染后约4周CH505供体登记在CHAVI001急性HIV-1感染群中(Tomaraset al,J.Virol.82:12449-12463(2008))(图7)，并被追踪超过3年。传播后4周53种血
浆病毒Env gp160RNA的单基因组扩增鉴定出单一进化枝C传播/首建(T/F)病毒。血清
学分析表明了在第14周自体同源的中和抗体的发生、在第53周结合于重组Env蛋白(重
新暴露的于表面的核心，RSC3)(Wu et al,Science 329:856-861(2010))的CD4结合位点(CD4bs)抗体的发生，以及传播后41-92周血浆交叉反应中和活性的进化(Lynch et al3J.Virol.86:7588-7595(2012))(图1，表1，图8)。抗体CH103、CH104、CH106的重链(VHDJH)和轻链(VLJL)基因对的天然可变区域从传播后136周的周边血单核细胞(PBMC)中分离，其通过与RSC3Env蛋白结合的记忆B细胞的流式筛选进行(Scheid et al，J.Immunol.Methods
343:65-67(2009)，Wu et al，Science 329:856-861(2010)，(Scheid et al，Nature
458:636-640(2009))(图1B)。抗体CH105的VHDJH基因类似于从相同细胞中分离的VHDJH基因，但是鉴定出VLJL基因。在mAbs CH103、CH104、CH105和CH106中的VHDJH(VH4-59[后验概率，PP＝0.99]，D3-16(PP＝0.74)，JH4[PP＝1.00])和VLJL(Vλ3-1[PP＝1.00]，Jλ1[PP＝1.00])的重排的特征的分析显示，这些抗体是称作CH103克隆性世系的单克隆世系代表(图2，表2)。
浆病毒Env gp160RNA的单基因组扩增鉴定出单一进化枝C传播/首建(T/F)病毒。血清
学分析表明了在第14周自体同源的中和抗体的发生、在第53周结合于重组Env蛋白(重
新暴露的于表面的核心，RSC3)(Wu et al,Science 329:856-861(2010))的CD4结合位点(CD4bs)抗体的发生，以及传播后41-92周血浆交叉反应中和活性的进化(Lynch et al3J.Virol.86:7588-7595(2012))(图1，表1，图8)。抗体CH103、CH104、CH106的重链(VHDJH)和轻链(VLJL)基因对的天然可变区域从传播后136周的周边血单核细胞(PBMC)中分离，其通过与RSC3Env蛋白结合的记忆B细胞的流式筛选进行(Scheid et al，J.Immunol.Methods
343:65-67(2009)，Wu et al，Science 329:856-861(2010)，(Scheid et al，Nature
458:636-640(2009))(图1B)。抗体CH105的VHDJH基因类似于从相同细胞中分离的VHDJH基因，但是鉴定出VLJL基因。在mAbs CH103、CH104、CH105和CH106中的VHDJH(VH4-59[后验概率，PP＝0.99]，D3-16(PP＝0.74)，JH4[PP＝1.00])和VLJL(Vλ3-1[PP＝1.00]，Jλ1[PP＝1.00])的重排的特征的分析显示，这些抗体是称作CH103克隆性世系的单克隆世系代表(图2，表2)。
[0079] 使用如前所述的地理上和遗传多样的Env假病毒(其代表主要循环遗传亚型和循环重组形式)的(Wu et al,Science 329:856-861(2010)，(Seaman et al,J.
Virol.84:1439-1452(2010))196板(panel)进行中和分析显示，CH103中和55％的病毒
分离物，敏感分离物中的IC50的几何平均值为4.54μg/ml(图1C，表3)。ELISA交叉竞
争分析显示结合于gp120的CH103与已知的CD4bs配体(例如mAb VRC01和嵌合蛋白
CD4-Ig)竞争(图1D)；与RSC3Env结合的CH103也通过gp120与具有已知能降低大部分
CD4bs mAbs结合的P363N和Δ371I突变体的结合实质上减少(图9)(Wu et al,Science
329:856-861(2010)，Lynch et al，J.Virol.86:7588-7595(2012))。
Virol.84:1439-1452(2010))196板(panel)进行中和分析显示，CH103中和55％的病毒
分离物，敏感分离物中的IC50的几何平均值为4.54μg/ml(图1C，表3)。ELISA交叉竞
争分析显示结合于gp120的CH103与已知的CD4bs配体(例如mAb VRC01和嵌合蛋白
CD4-Ig)竞争(图1D)；与RSC3Env结合的CH103也通过gp120与具有已知能降低大部分
CD4bs mAbs结合的P363N和Δ371I突变体的结合实质上减少(图9)(Wu et al,Science
329:856-861(2010)，Lynch et al，J.Virol.86:7588-7595(2012))。
[0080] CH103BnAb世系的分子表征
[0081] RSC3探针通过单细胞流式筛选分离CH103、CH104、CH105和CH106BnAbs。通 过 焦 磷 酸 测 序 传 播 后66 和140 周 获 得 的 PBMC DNA(Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011)，Boyd et al,Sci.Transl.Med.I:12ra23(2009))，以及传播后
6、14、53、92周获得的cDNA抗体转录本(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011))鉴定的VHDJH和VLJL序列丰富了CH103克隆性世系。从抗体基因转录本的焦磷酸测序，发现了457个独特的重链和171个独特的轻链克隆成员(图2A，2B)。为了综合研究，从焦磷
酸测序回收的VHDJH序列(1AH92U、1AZCET和1A102R)和推断的中间体(I)抗体(I1-I4、
I7、I8)的VHDJH基因(Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Ma et al5PLoS Pathog.7:el002200(2001))，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))(Kepler,TB，Submitted,2012)中重建了代表性的14个成员的BnAb通路，所述VHDJH基因是成对的，并用基于VHDJH与UCA或成熟抗体的遗传距离的UCA或者I2VLJL进行表达(图2C，表2)。成
熟CH103、CH104和CH106抗体与其天然VLJL配对。从RSC3记忆B细胞筛选分离的CH105
天然VHDHJH与I2的VLJL配对。
6、14、53、92周获得的cDNA抗体转录本(Wu et al，Science 333:1593-1602(2011))鉴定的VHDJH和VLJL序列丰富了CH103克隆性世系。从抗体基因转录本的焦磷酸测序，发现了457个独特的重链和171个独特的轻链克隆成员(图2A，2B)。为了综合研究，从焦磷
酸测序回收的VHDJH序列(1AH92U、1AZCET和1A102R)和推断的中间体(I)抗体(I1-I4、
I7、I8)的VHDJH基因(Haynes et al,Nat.Biotechnol.30:423-433(2012)，Ma et al5PLoS Pathog.7:el002200(2001))，Liao et al,J.Exp.Med.208:2237-2249(2011))(Kepler,TB，Submitted,2012)中重建了代表性的14个成员的BnAb通路，所述VHDJH基因是成对的，并用基于VHDJH与UCA或成熟抗体的遗传距离的UCA或者I2VLJL进行表达(图2C，表2)。成
熟CH103、CH104和CH106抗体与其天然VLJL配对。从RSC3记忆B细胞筛选分离的CH105
天然VHDHJH与I2的VLJL配对。
[0082] 虽 然 已 公 开 的 CD4bs BnAbs VRC01、CH31 和 NIH45-46VHDJH的V HDJH突 变 频 率 是 30-36 ％ (Wu et al,Science 329:856-861(2010)，Wu et al，
Science333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010),Scheid et al,Science333:1633-1637(2011)，(Bonsignori et al,J,Virol.86:4688-4692(2012))，但是CH103世系CH103、CH104、CH105和CH106VHDJH的频率是13-17％(图2C)。此外，CH103克隆性世系中的抗体并不包括在BnAbs(1-3)的VRC01类中常见的大的(>3nt)插入或缺失突变，除了包括3aa LCDR1缺失的CH103的VLJL之外。
Science333:1593-1602(2011)，Zhou et al,Science 329:811-817(2010),Scheid et al,Science333:1633-1637(2011)，(Bonsignori et al,J,Virol.86:4688-4692(2012))，但是CH103世系CH103、CH104、CH105和CH106VHDJH的频率是13-17％(图2C)。此外，CH103克隆性世系中的抗体并不包括在BnAbs(1-3)的VRC01类中常见的大的(>3nt)插入或缺失突变，除了包括3aa LCDR1缺失的CH103的VLJL之外。
[0083] 已提出，难以诱导CD4bs BnAbs的一个原因是异源HIV-1Envs并不结合其UCAs(Zhou et al,Science 329:811-817(2010)，Xiao et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.390:404-409(2009)),Scheid et al,Science 333:1633-1637(2011))。呈现的问题在于，相比于异源Env，CH505T/F Env(用于CH103BnAb世系的初始驱动抗原)是否将优
先结合早期的CH103克隆性世系成员和UCA。实际上，异源gp120T/F Env(B.63521)并不结合CH103UCA(图2D)，但结合于克隆性世系的后面的成员。在CH103世系的体细胞进化期间，对该异源Env的亲和力增加了4个数量级，在成熟CH103-CH106mAbs中最大Kd值为
2.4-7.0nM(图2D)。CH103UCA mAb也并不结合其他异源T/F Env AE.427299、B.9021和
C.1086(表4)，证明了没有结合CD4bs UCA的异源Env。此外，gp120Env RSC3蛋白也并不结合CH103UCA和克隆性世系的早期的成员(图9A)，并且没有发现与RSC3突变蛋白(已知其干扰CD4bs BnAb的结合)结合(图9B)。
先结合早期的CH103克隆性世系成员和UCA。实际上，异源gp120T/F Env(B.63521)并不结合CH103UCA(图2D)，但结合于克隆性世系的后面的成员。在CH103世系的体细胞进化期间，对该异源Env的亲和力增加了4个数量级，在成熟CH103-CH106mAbs中最大Kd值为
2.4-7.0nM(图2D)。CH103UCA mAb也并不结合其他异源T/F Env AE.427299、B.9021和
C.1086(表4)，证明了没有结合CD4bs UCA的异源Env。此外，gp120Env RSC3蛋白也并不结合CH103UCA和克隆性世系的早期的成员(图9A)，并且没有发现与RSC3突变蛋白(已知其干扰CD4bs BnAb的结合)结合(图9B)。
[0084] 与异源Env相反，CH505T/F Env gp140与所有候选UCA(表5)结合良好，并具有最高Kd＝37.5的UCA亲和力。此外，CH505T/F Env gp140被CH103克隆性世系的所有成员识别(图2D)。虽然对异源T/F Env B.63521的亲和力随着CH103世系成熟增加超过4
个数量级，但是对CH505T/F Env的亲和力增加不超过10倍(图2D)。为了直接证明Env
逃逸CH103世系成员，在感染后30、53和78周分离的自体同源重组gp140Env被表达，并与CH505T/F Env比较同CH103克隆性世系的BnAb臂的结合能力(表6，图10)。逃逸突变株
Env可以分离，其与CH103克隆性世系成员有逐渐减小地反应性。从第30、53和78周分离的Env失去UCA反应性，并仅结合中间抗体3、2和1，以及BnAbs CH103、CH104、CH105和CH106(表6)。此外，第78周病毒中的两株Env逃逸突变株也失去与所有中间抗体或者所有世系成员的强反应性(表6)。
个数量级，但是对CH505T/F Env的亲和力增加不超过10倍(图2D)。为了直接证明Env
逃逸CH103世系成员，在感染后30、53和78周分离的自体同源重组gp140Env被表达，并与CH505T/F Env比较同CH103克隆性世系的BnAb臂的结合能力(表6，图10)。逃逸突变株
Env可以分离，其与CH103克隆性世系成员有逐渐减小地反应性。从第30、53和78周分离的Env失去UCA反应性，并仅结合中间抗体3、2和1，以及BnAbs CH103、CH104、CH105和CH106(表6)。此外，第78周病毒中的两株Env逃逸突变株也失去与所有中间抗体或者所有世系成员的强反应性(表6)。
[0085] 为了对来自初始世代的CH103克隆性世变异体诱导的中和的广谱性和效力的进行定量，使用了来自5个时间点(传播后第6、14、53、92和144周)的抗体cDNA转录本进行焦磷酸测序(表7)。发现了与CH103克隆性世系紧密相关并且可能是CH103克隆性世系成员的两种VHDJH链(图2A，表7)。此外，当以全长IgG1骨架重建并用UCA VLJL表达时，这些VHDJH中的一个在11μg/ml的端点滴度与CH505T/F Env gp140有微弱结合(图2A)。
这些重建的抗体伴有传播后14周的CH505血浆自体同源中和活性(图8)。结合CH505T/F Env的抗体早在传播后4周就呈现在血浆中(数据未显示)。CH103世系VHDJH和VLJL序列
在第53周达到顶峰，分别具有230个和83个独特的转录本。VHDJH克隆成员在第144周降低至46个，VLJL成员在第144周降低至76个。
这些重建的抗体伴有传播后14周的CH505血浆自体同源中和活性(图8)。结合CH505T/F Env的抗体早在传播后4周就呈现在血浆中(数据未显示)。CH103世系VHDJH和VLJL序列
在第53周达到顶峰，分别具有230个和83个独特的转录本。VHDJH克隆成员在第144周降低至46个，VLJL成员在第144周降低至76个。
[0086] 多反应性是BnAbs的常见特征，这表明一些BnAbs的产生可能通过耐受机制控制(Haynes et al,Science 308:1906-1908(2005)，Mouquet et al,Nature467:591-595(2010),Haynes et al,Hum.Antibodies 14:59-67(2005))。相反地，多反应性可在B细胞的体细胞进化期间在生发中心(germinal center)中产生以作为B细胞发育的正常
组分(Wardemann et al,Science 301:1374-1377(2003))。评估CH103克隆性世系的多
反应性，通过HEp-2细胞反应性和对自身抗原组的结合来测得(Haynes et al,Science
308:1906-1908(2005))。尽管CH103克隆性世系的较早成员通过这些测试并不是多反应性的，但是多反应性的获得是与通过中间抗体I2、I1和克隆成员CH103、CH104和CH106的BnAb活性相协调的(图11A、11B)。BnAbs CH106和中间抗体I1也在蛋白测验中显示出多反应性，其对几种人类自身抗原(包括延长因子-2激酶和泛素-蛋白质连接酶E3A)具有
特异性的反应性(图11C和11D)。
组分(Wardemann et al,Science 301:1374-1377(2003))。评估CH103克隆性世系的多
反应性，通过HEp-2细胞反应性和对自身抗原组的结合来测得(Haynes et al,Science
308:1906-1908(2005))。尽管CH103克隆性世系的较早成员通过这些测试并不是多反应性的，但是多反应性的获得是与通过中间抗体I2、I1和克隆成员CH103、CH104和CH106的BnAb活性相协调的(图11A、11B)。BnAbs CH106和中间抗体I1也在蛋白测验中显示出多反应性，其对几种人类自身抗原(包括延长因子-2激酶和泛素-蛋白质连接酶E3A)具有
特异性的反应性(图11C和11D)。
[0087] 具有HIV-1gp120的复合体中的CH103结构
[0088] Fab CH103和HIV的ZM 176.66株之间的复合体的晶体以 的分辨率衍射，分子置换法鉴别出对于Fab CH103和对于gp120的外部结构域的溶液(图3A)。CH103-gp120晶体晶格(图12)的检查显示，gp120内部结构域的缺失有可能与延伸的gp120核心到
外部结构域片段的蛋白水解的降解有关。优化至R晶体/R自由度为19.1％/25.3％(表8)证实了缺少gp120残基N末端至残基Val 255gp120或C末端至Gly472gp120(gp120残基根
据标准HXB2命名法计数)的电子密度，并且对于残基301-324gp120(V3)、398-411gp120(V4)和421-439gp120(β20-21)的残基，没有发现电子密度。在CH103的复合体中的gp120的有序部分(gp120残基根据标准HXB2命名法计数)与被抗体VRC01结合的完全延伸的
核心gp120(Zhou et al,Science 329:811-817(2010))的重叠显示了高度相似的结构
(Cα-rmsd )(图3B)。尽管缺少核心gp120的部分，但是整个CH103表位似乎存在于
对于实验观察到的gp120外部结构域的电子密度中。
外部结构域片段的蛋白水解的降解有关。优化至R晶体/R自由度为19.1％/25.3％(表8)证实了缺少gp120残基N末端至残基Val 255gp120或C末端至Gly472gp120(gp120残基根
据标准HXB2命名法计数)的电子密度，并且对于残基301-324gp120(V3)、398-411gp120(V4)和421-439gp120(β20-21)的残基，没有发现电子密度。在CH103的复合体中的gp120的有序部分(gp120残基根据标准HXB2命名法计数)与被抗体VRC01结合的完全延伸的
核心gp120(Zhou et al,Science 329:811-817(2010))的重叠显示了高度相似的结构
(Cα-rmsd )(图3B)。尽管缺少核心gp120的部分，但是整个CH103表位似乎存在于
对于实验观察到的gp120外部结构域的电子密度中。
[0089] 被CH103结合的表面形成了狭长的斑块，其尺寸为约 其延伸穿过gp120外部结构域与CD4接触的初始位点(图3C)。被CH103识别的gp120表面与CD4接触的初始
位点很好地关联；在被CH103接触的残基中，仅八个没被预测为与CD4相互作用。CH103与这些残基通过侧链在D环中与Ser256gp120接触，主链和侧链在CD4结合环中与His364gp120和Leu369gp120接触，以及主链和侧链在V5环中与Asn463gp120和Asp464gp120接触来相互作用(图
3D)。显著的，残基463是ZM176.66株以及自体同源CH505病毒中的N-连接糖基化的预测位点，但是没有观察到对于N-连接聚糖的电子密度。总体上，在观察到的mAb CH103接触的gp120上的22个残基中，预计14个与CD4相互作用(这些残基中的16个与抗体VRC01
相互作用)，这提供了CH103对于CD4表位特异性和其广谱识别的结构基础(表9)。
位点很好地关联；在被CH103接触的残基中，仅八个没被预测为与CD4相互作用。CH103与这些残基通过侧链在D环中与Ser256gp120接触，主链和侧链在CD4结合环中与His364gp120和Leu369gp120接触，以及主链和侧链在V5环中与Asn463gp120和Asp464gp120接触来相互作用(图
3D)。显著的，残基463是ZM176.66株以及自体同源CH505病毒中的N-连接糖基化的预测位点，但是没有观察到对于N-连接聚糖的电子密度。总体上，在观察到的mAb CH103接触的gp120上的22个残基中，预计14个与CD4相互作用(这些残基中的16个与抗体VRC01
相互作用)，这提供了CH103对于CD4表位特异性和其广谱识别的结构基础(表9)。
[0090] 在抗体重链上的残基1-215HC与1-209LC显示良好限定的骨架密度。总体上，CH103利用CDR H3显性模式的相互作用，尽管所有六个互补决定区(CDR)与gp120以及轻链框架区域3(FWR3)相互作用(图4A、B，表10和11)。重要的是要注意约40％的抗体接触表面在两个区域(在CDR H2和CDR L1、L2和FWR3)被体细胞突变改变。尤其是，残基56HC、50LC、51LC和66LC被体细胞突变改变以与gp120的CD4结合环、D环和V5环形成氢键。但是，在CH103种系中，88％的CH103VHDJH和44％的VλJλ接触区域氨基酸未突变，这潜在提供了T/F Env强力结合CH103UCA的一种解释(图4C、4D和表12)。
[0091] 传播/首建Env序列的进化追踪BnAb活性的获得
[0092] 使用单基因组扩增和测序(Keele et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:7552-7557(2008))，CH505env基因的进化从直到传播后160周的T/F病毒纵向地追踪(图5、图12)。
在感染后4周发现在Env中的最早的频发突变N279K(HIV-1HXB2编号)，并在Env D环中
一个CH103接触残基中。到第14周，D环中出现另外的突变，然后在第20周在V1中出现
突变和插入。到第30周，V5环中的插入和突变开始累积(图5)。因此，从感染的3个月内开始，T/F病毒开始在关键CD4接触区域多样化(图13、14)。D环和V5突变直接在CH103/Env接触残基中或邻近CH103/Env接触残基。虽然V1区域并不包括在CH103-Env共晶中，观察到的V1CH505Env突变与对于CD4和VRC01的接触残基相邻，因此其有可能相关。也有可能早期V1插入(图5)通过抑制到达三聚体中的CD4bs来选择，或者其响应于早期T细
胞压力而产生。到第78周，出现CD4结合环突变。一旦能直接影响CH103世系结合的区域开始进化(环D、V5、CD4结合环和有可能地V1)，它们就在整个研究期间处于持续的正向选择压力之下(图5、图13、14，表13)。
在感染后4周发现在Env中的最早的频发突变N279K(HIV-1HXB2编号)，并在Env D环中
一个CH103接触残基中。到第14周，D环中出现另外的突变，然后在第20周在V1中出现
突变和插入。到第30周，V5环中的插入和突变开始累积(图5)。因此，从感染的3个月内开始，T/F病毒开始在关键CD4接触区域多样化(图13、14)。D环和V5突变直接在CH103/Env接触残基中或邻近CH103/Env接触残基。虽然V1区域并不包括在CH103-Env共晶中，观察到的V1CH505Env突变与对于CD4和VRC01的接触残基相邻，因此其有可能相关。也有可能早期V1插入(图5)通过抑制到达三聚体中的CD4bs来选择，或者其响应于早期T细
胞压力而产生。到第78周，出现CD4结合环突变。一旦能直接影响CH103世系结合的区域开始进化(环D、V5、CD4结合环和有可能地V1)，它们就在整个研究期间处于持续的正向选择压力之下(图5、图13、14，表13)。
[0093] 大量样品内病毒的变异性明显在可能影响CH103世系抗体结合的Env区域中，在这些区域内的多样化先于中和宽度。在病毒进化早期(传播后4-22周)的增大的多样化符合自身自体同源NAbs发展，与自体同源Nab逃逸突变相一致。在CH505Env接触区域中之后在发生Nab宽度之前，从41-78周立即积累突变(图5，图13、14)。到第30-53周，大量样品内多样化产生于CH103接触残基中和其周围的点突变，和在V1和V5中的多个插入和缺失(图14)。强的选择性压力似乎在第30和53周参与进来，也许这是因为自体同源中和逃逸，以及此时间点之后发生中和宽度(图5、13、14)。重要的是，由于30周和53周之间的显而易见的强的正向选择性压力，在病毒种群中存在大的漂移(这在系统发育树中显而易见)，以致于仅仅是携带有相对于T/F的多个突变(尤其在CH103接触区域)的病毒才延续到第30周后。随后是从第53周开始，在关键表位区域中极端和增多的时间点内多样化(图14)。具有中和宽度的抗体的出现在此时间发生(图8，表1)。因此，在高度多样形式的CH103表位接触区域存在的条件下，血浆宽度进化了(图5，图8)。
[0094] 为了评估和比较对在CH103和CD4接触的区域中的氨基酸的免疫压力，比较在感染的第一年期间病人CH505的进化中的T/F序列中，和随着时间的流逝在被追踪的16个其他急性感染的病人中的突变的频率(图15)。CH505病毒种群中的突变的累积在可能与从CH103世系逃逸相关的区域集中(图15A)，在CH505中比在其他主体中，这些区域的多样化在感染的最初6个月期间更加广泛得多(图15B)。但是，感染一年后，来自其他主体的病毒也开始在这些区域获得突变。因此，在CH103接触区域的早期和持续的突变积累可能强化了在病人CH505中的中和抗体宽度的早期发生。
[0095] 自体同源和异源病毒以及CH103世系的中和
[0096] 自体同源BnAb的活性被限制在CH103世系的BnAb臂的较后的成员(I3和更后面的)，这通过它们的携带等级2的Envs A.Q842和B.BG1168的假病毒的中和能力证明(图
6A)。用Envs A.Q 168、B.JRFL、B.SF162和C.ZM106也显示出了类似的结果(表14和15)。
相反，克隆性世系成员抗自体同源T/F Env假病毒的中和活性较早出现，除mAb 1AH92U外，在UCA之后，所有世系的成员有可测量的CH505T/F病毒的中和(图6A)。因此，在CH103
世系内，早期中间抗体中和了T/F病毒，但后期中间抗体获得了中和宽度，这表明了具有亲和力成熟的中和宽度的进化，并且CH103-CH106BnAb从早期自体同源中和抗体反应进化而来。此外，克隆性世系是异源的，其具有在图6A中表示的、进化出中和宽度的世系的臂，和能够仅调节自体同源T/F病毒中和的另一抗体臂。尽管某些逃逸病毒明显是随着时间流逝出现的(表4)，但是需要重点指出的是，尽管逃逸突变体病毒驱动BnAb进化，但是BnAb仍能够中和CH505T/F病毒(图6A)。应注意，重链世系中最早的突变在与gp120的接触点近处聚集，它们在整个研究期间保持固定，但是后来累积的突变倾向于进一步来自于结合位点，并可能更间接地影响结合(图10)。因此，CH103BnAbs的刺激以与在T/F Env上存在的核心CD4bs表位保持有活性的方式发生。可以解释这一点的一种可能性是，UCA结合的印迹收缩至CH103成熟抗体的中央核心结合位点。获得具有T/F Env的UCA的晶体结构应知道这一理念。另一种可能性是因为亲和力成熟在高度多样形式的CD4bs表位的存在下发生，选择在表位中和周边的倾向于耐受变异的抗体，而不是用特定逃逸Env来增加的亲和力的那些抗体。在这两种情况下，将预料对T/F形式和早期病毒变异体的活性的持续性。图6B和图16显示在抗体决定簇和被mAb CH103结合的Env表位的平行进化期间突变或者熵的
积累的视图。
6A)。用Envs A.Q 168、B.JRFL、B.SF162和C.ZM106也显示出了类似的结果(表14和15)。
相反，克隆性世系成员抗自体同源T/F Env假病毒的中和活性较早出现，除mAb 1AH92U外，在UCA之后，所有世系的成员有可测量的CH505T/F病毒的中和(图6A)。因此，在CH103
世系内，早期中间抗体中和了T/F病毒，但后期中间抗体获得了中和宽度，这表明了具有亲和力成熟的中和宽度的进化，并且CH103-CH106BnAb从早期自体同源中和抗体反应进化而来。此外，克隆性世系是异源的，其具有在图6A中表示的、进化出中和宽度的世系的臂，和能够仅调节自体同源T/F病毒中和的另一抗体臂。尽管某些逃逸病毒明显是随着时间流逝出现的(表4)，但是需要重点指出的是，尽管逃逸突变体病毒驱动BnAb进化，但是BnAb仍能够中和CH505T/F病毒(图6A)。应注意，重链世系中最早的突变在与gp120的接触点近处聚集，它们在整个研究期间保持固定，但是后来累积的突变倾向于进一步来自于结合位点，并可能更间接地影响结合(图10)。因此，CH103BnAbs的刺激以与在T/F Env上存在的核心CD4bs表位保持有活性的方式发生。可以解释这一点的一种可能性是，UCA结合的印迹收缩至CH103成熟抗体的中央核心结合位点。获得具有T/F Env的UCA的晶体结构应知道这一理念。另一种可能性是因为亲和力成熟在高度多样形式的CD4bs表位的存在下发生，选择在表位中和周边的倾向于耐受变异的抗体，而不是用特定逃逸Env来增加的亲和力的那些抗体。在这两种情况下，将预料对T/F形式和早期病毒变异体的活性的持续性。图6B和图16显示在抗体决定簇和被mAb CH103结合的Env表位的平行进化期间突变或者熵的
积累的视图。
[0097]
[0098]
[0099] 表3a.CH103和其他CD4bs mAb抗25个进化枝A Env假病毒的中和活性的比较
[0100]
[0101] 值<1μg/ml以红色表示，值为1-50μg/ml以绿色表示。
[0102] 对中和敏感性病毒计算几何平均值，IC50或IC80值<50μg/ml。
[0103] 表3a、b和c中总结的118个分离物的结果对于总共196个受测试的分离物是具有代表性的。
[0104] 表3b.CH103和其他CD4bs mAb抗39个进化枝B Env假病毒的中和活性的比较
[0105]
[0106] a值<1μg/ml以红色表示，值为1-50μg/ml以绿色表示。
[0107] b对中和敏感性病毒计算几何平均值，IC50或IC80值<50μg/ml。
[0108] 表3c.CH103和其他CD4bs mAb抗54个进化枝C Env假病毒的中和活性的比较
[0109]
[0110] a值<1μg/ml以红色表示，值为1-50μg/ml以绿色表示。
[0111] b对中和敏感性病毒计算几何平均值，IC50或IC80值<50μg/ml。
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116] 表8.晶体数据收集和优化统计
[0117]
[0118] *括号中的值是针对最高分辨率壳。
[0119] CH103的抗原结合片段(Fab)被筛选用于通过其自身或者具有用延伸的gp120核1 2
心 表达的多种株HIV-1的复合体的结晶，其已被去糖基成蛋白相邻的N-乙酰葡萄糖胺 。
Fab CH103本身的晶体衍射到 分辨率，通过分子置换法求解Fab CH103结构并优化至
17.9％/20.1％的R晶体/R自由。
心 表达的多种株HIV-1的复合体的结晶，其已被去糖基成蛋白相邻的N-乙酰葡萄糖胺 。
Fab CH103本身的晶体衍射到 分辨率，通过分子置换法求解Fab CH103结构并优化至
17.9％/20.1％的R晶体/R自由。
[0120] 1Kwon YD,et al(2012)Unliganded HIV-1gpl20core structures assume the CD4-bound conformation with regulation by quaternary interactions and variable loops.Proc Natl Acad Sci USA 109(15):5663-5668.
[0121] 2Kwong PD,et al.(1999)Probability analysis of variationalcrystallization and its application to gpl20,the exterior envelope glycoprotein of type 1human immunodeficiency virus(HIV-1).J Biol Chem 274(7):4115-4123.
[0122] 表9.HIV-1gp120和CD4、CH103和其他CD4结合位点抗体之间的相互作用的比较[0123]
[0124] 表9续：
[0125]
[0126] *：具有小于2.0 的相互作用表面积的残基未列出。
[0127] 表10.抗体CH103和ZM176.66gp120之间的界面
[0128] 补充表10a，横跨CH103和HIV-1gp120的界面的所有被掩埋的表面积
[0129]
[0130] *键类型：H：氢键；S：盐桥。
[0131] 详细的gp120：CH103相互作用数据在EBI PISA服务器上计算
[0132] (http://www.ebi.ac.uk/msdsrv/prot int/cgi-bin/piserver)
[0133] 表10c.CH103互补位残基的残基-残基掩埋的表面积
[0134]
[0135] *键类型：H：氢键，D：二硫键，S：盐桥，C：共价连接。
[0136] 详细的gp120：CH103相互作用数据在EBI PISA服务器上计算
[0137] (http://www.ebi.ac.uk/msdsrv/prot_int/cgi-bin/piserver)
[0138] 表11.CH103和ZM176.66gp120之间的氢键和盐桥
[0139]
[0140] 表12.抗体CH103上的未突变病毒突变残基的残基-残基特异性
[0141] 重链突变
[0142]
[0143] (表12延续到下页)
[0144] 表12续：
[0145] 轻链突变
[0146]
[0147] 为了确定潜在可能作为世系CH103的未突变的共同祖先的生殖系抗体的频率，我们研究了与CH505病人无关的三个HIV感染主体的454焦磷酸测序的合并的数据集。该数据集中的基因片段频率显示，VH4-59基因的频率是4.2％，JH4是49.7％，CH103VH长度(15个聚合物)的HCDR3长度的频率是8.9％。具有所有三种特征的序列的比例为1/540，若独立为VH4-59/JH4/CDR3长度＝15，在合并的分析数据集中的真实计数＝637/386853＝
1/607。
1/607。
[0148] 该频率显然非常常见。剩下的问题涉及CDR3的相关特征的流行。
[0149] 例如，HC CDR3接触残基(从文献的图4)为从HCDR3的位点4开始的RGQLVN，其具有下列保守替换：
[0150] R:K；G:A；Q:E；L:I，V；V:I,V；N:D
[0151] 因此，我们使用HCDR3基序：XXX(R/K)(G/A)(Q/E)(L/V/l)(L/V/I)(N/D)nX，并对其出现频率扫描我们的焦磷酸测序重链数据集。该基序在我们的焦磷酸测序数据库中的337567个框内HCDR3中出现了10次。
[0152] 如果我们允许除了第四个(其包括对于盐桥是必需的R/K)以外的位点改变，我们得到下表。观察到的HCDR3从CH103HCDR3基序改变之处的位点的数目在左边，337567个HCDR3序列外的数目在右边。该表中的所有CDR3在位点4处具有R或K。
[0153]
[0154] 适宜的轻链UCA也有可能容易获得。我们从Genbank下载了2312个重排的人λV-区域序列，分析它们以进行比较。CH103轻链使用IGLV3-1和IGLJ1。这些基因分别在Genbankλ数据库中的所有序列中的9.6％和15.5％中发现。CH103轻链为30nt长，如同23.7％的Genbankλ。轻链CDR3中的单个接触残基为第三CDR3位置处的色氨酸，其由IGLV基因编码。实际上，所有Genbankλ链中的43％在CDR3的位点3处具有W。因此，存在大量证据证明CH103系的生殖系通过多种标准来说是相对常见的。
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161] 实施例2
[0162] 图19中所示的是用于多效价-效价疫苗的CH505Env序列，其用RNA(Geallet al,Proc.Natl.Acad.Sci.109:14604-14609(2012)) 和 DNA(Ledgerwood,et al.Clin Vaccine Immunol.19:1792-7(2012))都可以制备为gp160用作遗传免疫，以及制
备 为gp160 和gp140(Liao et al,Nature 201:469-76(2013)) 用 于 在ALVAC( 金 丝雀痘毒)载体中的痘病毒载体免疫，例如被用于RV144(Rerks-Ngarm et al.NEJM
361:2209-2220(2009))和NYVAC中，其是可复制性的(例如NYVAC-KC,Kibler et al,PLoS One 6:e25674,Epub 2011,Nov 9)或非复制性的(例如NYVAC-C，Perreau et al,J.
Virol.85:9854-62(2011))。选择Env的标准基于如下标准：(i)表达的Env最佳地结合
CH103BnAb世系的成员；或者(ii)具有逃逸CH103世系的Env的病毒，并因此参与其早期刺激，或者(iii)具有不从CH103世系逃逸的Env的病毒，并因此能够继续刺激CH103系的后续阶段，或者(iv)具有被CH103世系中和高度敏感的Env的病毒，并因此能够最佳地驱动CH103世系。
备 为gp160 和gp140(Liao et al,Nature 201:469-76(2013)) 用 于 在ALVAC( 金 丝雀痘毒)载体中的痘病毒载体免疫，例如被用于RV144(Rerks-Ngarm et al.NEJM
361:2209-2220(2009))和NYVAC中，其是可复制性的(例如NYVAC-KC,Kibler et al,PLoS One 6:e25674,Epub 2011,Nov 9)或非复制性的(例如NYVAC-C，Perreau et al,J.
Virol.85:9854-62(2011))。选择Env的标准基于如下标准：(i)表达的Env最佳地结合
CH103BnAb世系的成员；或者(ii)具有逃逸CH103世系的Env的病毒，并因此参与其早期刺激，或者(iii)具有不从CH103世系逃逸的Env的病毒，并因此能够继续刺激CH103系的后续阶段，或者(iv)具有被CH103世系中和高度敏感的Env的病毒，并因此能够最佳地驱动CH103世系。
[0163] 实施例3
[0164] 病人CH505中的HIV-1军备竞赛显示于图20中，其中CD4结合位点BnAbs响应于HIV-1病毒进化随着时间发展(“抗体”下的克隆性世系)。在所示的克隆性世系中，结合于异源63521进化枝B传播首建Env的env在克隆性世系发展期间增加了4个数量级。
[0165] 图21显示了CH0505的相同病毒克隆性世系树图，并在后侧图中以星号显示为选择用于免疫原的顺序env的例子(p37页码)。在左图中的树图中的奠基星号是图17中显示的env序列。
[0166] 对于CD4、VRC01和b12的接触区域和影响VRC01和b12中和的标志性位点在CH0505中受到非常强的选择性压力。图22阐释了几点：i)在CD4bs中或其附近的110个
位点比不在CD4bs区域中的846个位点受到大得多的选择性压力(见“在CD4b中或其附
近”与“CD4b以外”)，ii)使用具有24周时间点的10个CHAVI 17样品(蓝色)可以看出，在CD4bs中或其附近的多样化在CH0505中在很早的时候(已经在第24周)就明显很高，
iii)使用具有1-2年(范围：60-96周)之间的样品的9CHAVI 17样品可以看出，对CD4bs
区域的压力相比于其他主体是不屈不挠的和显著的，iv)种群宽度首先在第92周出现，此自体同源压力首先驱动CD4区域中的大量多样化，然后驱动在这些多样形式存在下的发展的宽度。
位点比不在CD4bs区域中的846个位点受到大得多的选择性压力(见“在CD4b中或其附
近”与“CD4b以外”)，ii)使用具有24周时间点的10个CHAVI 17样品(蓝色)可以看出，在CD4bs中或其附近的多样化在CH0505中在很早的时候(已经在第24周)就明显很高，
iii)使用具有1-2年(范围：60-96周)之间的样品的9CHAVI 17样品可以看出，对CD4bs
区域的压力相比于其他主体是不屈不挠的和显著的，iv)种群宽度首先在第92周出现，此自体同源压力首先驱动CD4区域中的大量多样化，然后驱动在这些多样形式存在下的发展的宽度。
[0167] 图23，如同图22，其显示了CH0505病毒序列的CD4结合位点内的位点如何响应于该病人中产生的抗体而高度突变。
[0168] 图24显示了CH0505的单个传播/首建病毒包膜gp140C与从CH0505分离的CH103、104和105CD4结合位点bnAbs的未突变的共同祖先结合得非常好，并且该env应该能够驱动此克隆性世系。
[0169] 图25显示了I4抗体处的在克隆性世系中早期就产生的中和，从UCA到免疫原必须诱导的I4存在相对来说少得几乎没有的免疫原。
[0170] 图27显示了在HIV-1感染的个体CH505中BnAb发展期间的病毒进化。
[0171] 实施例4
[0172] 图26显示了通过缺失用红色字体(加下划线)突出显示的V1、V2和V3环序列(例如CH0505_CON gp120)、得到核心Env(例如在CH0505_DV123core的例子中显示的)，来设计用来聚焦CD4结合位点抗体诱导的Env。该策略还可用于进化的CH0505Env(进化
的CH0505Env是在传播后顺序时间中获得的Env序列)的列表中，以及其他异源HIV-1Env中。
的CH0505Env是在传播后顺序时间中获得的Env序列)的列表中，以及其他异源HIV-1Env中。
[0173] 实施例5
[0174] 用25μg每剂量的CH505传播/首建(T/F)EnvΔ7gp120X4、53周的e16CH505变异体X4、78周的33CH505变异体X4或者100周的B6CH505变异体对BALB/c小鼠来进行IM
免疫。此外，还用顺序Env T/F、然后53周的e16Env gp120、然后78周的33Env gp120，然后然后100周B6CH505Env gp120对BALB/c小鼠来进行IM免疫。当存在对重新暴露的于表面的核心3(RSC3)的血浆滴度>1:200(即比结合至在位点371处异亮氨酸缺失的RSC3的
血浆>2.8倍(Lynch RM et al.J.Virol.86:7588-95，2012))时，CD4结合位点抗体的显著水平发生。每组代表每组3-4只小鼠的平均值。数据表示结合RSC#至RSCΔ371蛋白的比率，其以曲线(AUC)RSC3/log AUC RSC3Δ371下的log面积表示。每只动物端点结合滴度为>200。图30证明了用个体gp120单独免疫4次并不诱导大于2的比率的抗体，除了533
周nv，该处比例为3左右。但是，顺序免疫诱导的RSC3结合抗体的RSC3/RSC3D371比大于
4，表示诱导所需类型的CD4结合位点抗体的该特定抗体组合优于单独的Env免疫。
免疫。此外，还用顺序Env T/F、然后53周的e16Env gp120、然后78周的33Env gp120，然后然后100周B6CH505Env gp120对BALB/c小鼠来进行IM免疫。当存在对重新暴露的于表面的核心3(RSC3)的血浆滴度>1:200(即比结合至在位点371处异亮氨酸缺失的RSC3的
血浆>2.8倍(Lynch RM et al.J.Virol.86:7588-95，2012))时，CD4结合位点抗体的显著水平发生。每组代表每组3-4只小鼠的平均值。数据表示结合RSC#至RSCΔ371蛋白的比率，其以曲线(AUC)RSC3/log AUC RSC3Δ371下的log面积表示。每只动物端点结合滴度为>200。图30证明了用个体gp120单独免疫4次并不诱导大于2的比率的抗体，除了533
周nv，该处比例为3左右。但是，顺序免疫诱导的RSC3结合抗体的RSC3/RSC3D371比大于
4，表示诱导所需类型的CD4结合位点抗体的该特定抗体组合优于单独的Env免疫。
[0175] ***
[0176] 本文中引用的所有文件和其他信息通过引用以其全文并入本文中。通过引用还并入有如下文献：Wei et al，Nature 422:307-12(2003)；McMichael et
al,Nature Rev.Immunol.10:11-23(2010)Epub 2009 Dec 11；Cohen et al,New Eng.
J.Med.364:1943-54(2011)，Bar et al,PLoS Pathog.8:el002721，Epub 2012 May 31；
Goonetilleke et al,J.Exp.Med.206:1253-72(2009)；Keele et al,Proc.Natl.Acad.Sci.105:7552-7(2008)，Gray et al,J.Virol.85:4828-40(2011)；Moore et al,PLoS Pathogens 5:el000598，Epub 2009，Sept 18；Gray et al，J.Virol.83:11265-74(2009)；
Morris et al，PLoS One 6:e23532(2011)Sept 30；McElrath and Haynes，Immunity
33:542-54(2010)and Haynes et al,Nature Biotech.30:423-33(2012)。
al,Nature Rev.Immunol.10:11-23(2010)Epub 2009 Dec 11；Cohen et al,New Eng.
J.Med.364:1943-54(2011)，Bar et al,PLoS Pathog.8:el002721，Epub 2012 May 31；
Goonetilleke et al,J.Exp.Med.206:1253-72(2009)；Keele et al,Proc.Natl.Acad.Sci.105:7552-7(2008)，Gray et al,J.Virol.85:4828-40(2011)；Moore et al,PLoS Pathogens 5:el000598，Epub 2009，Sept 18；Gray et al，J.Virol.83:11265-74(2009)；
Morris et al，PLoS One 6:e23532(2011)Sept 30；McElrath and Haynes，Immunity
33:542-54(2010)and Haynes et al,Nature Biotech.30:423-33(2012)。
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