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通过质谱或离子迁移谱进行的组织分析

阅读:1041发布:2020-06-28

专利汇可以提供通过质谱或离子迁移谱进行的组织分析专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且披露了一种使用质谱和/或离子迁移谱或离子迁移谱分析的方法,该方法包括:使用第一装置以从 生物 材料 的第一靶标的一个或多个区域产生 气溶胶 、烟雾或蒸气;以及 质量 和/或离子迁移分析和/或离子迁移分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子以便获得第一谱数据。该方法可使用环境电离方法。,下面是通过质谱或离子迁移谱进行的组织分析专利的具体信息内容。

1.一种使用质谱和/或离子迁移谱分析的方法,该方法包括:
a)使用第一装置以从生物材料的第一靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气;并且
b)质量分析和/或离子迁移分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子以便获得第一谱数据,
其中所述生物材料是人类受试者、非人类动物受试者、或者来源于所述人类或非人类动物受试者的标本。
2.如权利要求1所述的方法,该方法进一步包括(c)分析所述谱数据以便分析与该靶生物材料的该一个或多个区域相关的以下各项中的一种或多种:(i)确定癌症或肿瘤的等级、类型或亚型;(ii)确定疾病的等级、严重性、时期、存在或不存在;(iii)确定一种或多种细胞的表型和/或基因型;(iv)检测坏死平、类型、存在或不存在;(v)确定一种或多种微生物的类型、水平、存在或不存在和/或基因型和/或表型;(vi)分析微生物与组织相互关系;(vii)分析生态失调;(viii)确定化合物和/或生物标志物的类型、水平、存在或不存在;
(ix)分析组织的状况;和/或(x)鉴定和/或展示两种不同组织类型之间和/或患病组织与健康组织之间的边限。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其中该标本是外科手术切除标本、活检标本、异种移植物标本、签、涂片、体液标本或粪便标本,和/或其中该生物材料是体内或离体组织。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标的所述一个或多个区域中的疾病的严重性、等级、时期、存在或不存在。
5.如权利要求4所述的方法,其中通过分析所述谱数据来确定该疾病的严重性、等级、时期、存在或不存在以确定所述疾病的生物标志物的类型、水平、存在或不存在。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中基于该谱数据诊断疾病或该疾病。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中基于该谱数据确定疾病或该疾病的预后,并且任选地根据所述预后分层具有该疾病的这些受试者。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中基于该谱数据预测疾病或该疾病响应于治疗的可能性,并且任选地根据所述可能性分层具有该疾病的这些受试者。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中的疾病或该疾病的分布。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该靶标是或来自健康组织与非健康组织之间的边限。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中疾病或该疾病与不具有该疾病的该靶标的区域之间的边限。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标的所述一个或多个区域中的癌症、肿瘤细胞或肿瘤组织的严重性、等级、时期、存在或不存在。
13.如权利要求12所述的方法,其中通过分析所述谱数据来确定该癌症、肿瘤细胞或肿瘤组织的严重性、等级、时期、存在或不存在以确定所述癌症或肿瘤的生物标志物的类型、水平、存在或不存在。
14.如权利要求12或13所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该肿瘤是否是良性的、恶性的和/或转移性的。
15.如权利要求12、13或14所述的方法,其中该靶标的所述一个或多个区域包括肿瘤基质或由其组成;任选地其中该肿瘤基质能够被重复地和间歇地分析以确定基质变化。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标内不同赘生性细胞之间的差异。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定所述癌症或肿瘤的类型或亚型。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法,该方法包括任选地通过检测该组织或细胞中的基因突变,基于该谱数据确定该癌症的表型和/或基因型。
19.如权利要求2-18中任一项所述的方法,其中所述疾病是选自以下各项的癌症:急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、腺瘤、肛癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、Birch-Hirschfield、母细胞瘤、膀胱癌、骨癌、尤因肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、多形性成胶质细胞瘤(“GBM”)、脊髓癌症、颅咽管瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、儿童原位管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维腺瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、生殖细胞瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、卡勒病、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌瘤、嘴唇和口腔癌、肝癌、癌(诸如非小细胞或小细胞)、淋巴瘤、淋巴母细胞瘤、男性乳腺癌、骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、黑素癌、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、肾胚细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤、垂体腺瘤、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎莱综合征、皮肤癌、精原细胞瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、胸部癌症、尿道癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和威姆氏瘤。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括从该谱数据中鉴定和/或表征存在于该靶标中的不同细胞类型,任选地确定所述细胞类型中的一种或多种的基因型和/或表型。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标的细胞组成。
22.如权利要求20或21所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该靶组织内的细胞类型中的一种或多种的数值比例。
23.如权利要求22所述的方法,该方法包括从该谱数据的强度值确定该组织内的该一种或多种特定细胞类型的数值比例。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括使用所述谱数据来分析该生物材料中的细胞材料的坏死。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述分析坏死包括从该谱数据中分析坏死的水平、类型、存在或不存在。
26.如权利要求24或25所述的方法,其中该坏死是凝固性、液化性、干酪样、脂肪性坏死、纤维蛋白样坏死和/或坏疽性坏死。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法,其中该靶标处于或取自健康与坏死组织之间的边限;和/或从所述谱数据中将其确定为健康与坏死组织之间的边限。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法,其中该坏死由以下各项引起或与其相关:
损伤、感染、癌症、梗塞、毒素、炎症、对伤口部位缺乏合适护理、冻伤、糖尿病和/或动脉粥样硬化。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该靶标是体内或离体生物组织或从其来源的细胞,并且其中该组织或从其来源的细胞的一种或多种特性从该谱数据确定。
30.如权利要求29所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中的一种或多种微生物的类型、水平、存在或不存在;或基于该谱数据分析该组织中的一种或多种微生物,其中该微生物任选地选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析微生物与该靶组织相互作用;或基于该谱数据分析微生物与该靶组织相互作用的变化;或分析粘膜微生物组,其中该微生物任选地选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
32.如权利要求30或31所述的方法,其中所述微生物选自白色假丝酵母、蒙特利假单胞菌、表皮葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌和乳杆菌。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中的一种或多种淋巴细胞、反应性物质和/或中性粒细胞的类型、水平、存在或不存在;或基于该谱数据分析该靶标中的一种或多种淋巴细胞、反应性氧物质和/或中性粒细胞。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中的一种或多种NET和/或产生NET的中性粒细胞的类型、水平、存在或不存在;或基于该谱数据分析该靶标中的一种或多种NET和/或产生NET的中性粒细胞。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标中的一种或多种单核细胞化学引诱物和/或产生单核细胞化学引诱物的中性粒细胞的类型、水平、存在或不存在;或基于该谱数据分析该靶标中的一种或多种单核细胞化学引诱物和/或产生单核细胞化学引诱物的中性粒细胞。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶组织的氧合状况。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶组织处理氧气的功能性能
38.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶组织中的含氧血红蛋白(OxyHb)和/或脱氧血红蛋白(DeoxyHb)。
39.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中该靶标是粪便标本和/或体液标本,并且其中该标本的一种或多种特性从该谱数据确定。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括分析所述谱数据以确定该靶标内的化合物、生物标志物、微生物或细胞类型的类型、水平、存在或不存在。
41.如权利要求40所述的方法,其中该生物标志物是微生物生物标志物和/或该微生物选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括使用该谱数据来分析该靶标的该一个或多个区域中的一种或多种化合物和/或生物标志物。
43.如权利要求42所述的方法,该方法包括基于该谱数据鉴定和/或定量和/或检测所述化合物和/或生物标志物的存在。
44.如权利要求42或43所述的方法,其中该化合物或生物标志物选自由以下各项组成的组:细胞内化合物;细胞外化合物;脂质;水化合物;DNA;RNA;蛋白质;多肽;寡肽;脂蛋白;脂肽;基酸;化学分子;初级代谢物;次级代谢物;抗生素;群体感应分子;脂肪酸合酶产物;信息素;和生物聚合物
45.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶标中的至少一些细胞的基因型和/或表型;和/或基于该谱数据鉴定该靶标中的至少一些细胞的基因型和/或表型。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶标中的一种或多种微生物;和/或基于该谱数据鉴定和/或定量该靶标中的一种或多种微生物,其中该微生物任选地选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
47.如权利要求46所述的方法,该方法包括基于该谱数据鉴定该靶标中的一种或多种微生物的类型。
48.如权利要求46或47所述的方法,其中通过分析所述谱数据来确定该一种或多种微生物的存在和/或数量和/或类型以确定所述一种或多种微生物的生物标志物的水平、存在或不存在。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据鉴定和/或定量该靶标中的一种或多种微生物的一种或多种微生物生物标志物的存在。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据检测和/或诊断感染。
51.如权利要求50所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定引起感染的微生物的基因型或表型。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶标中的一种或多种微生物相互作用的存在;和/或基于该谱数据鉴定和/或定量该靶标中的一种或多种微生物相互作用的存在。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析该靶标内的微生物组。
54.如权利要求53所述的方法,该方法包括基于该谱数据确定该靶标内的微生物组的组成。
55.如权利要求53或54所述的方法,该方法包括基于该谱数据分析所述微生物组中的生态失调。
56.如权利要求53至55中任一项所述的方法,其中该靶标是怀孕人类或动物的一部分或来自怀孕人类或动物,并且基于该谱数据分析该微生物组以确定该怀孕的一种或多种特性,诸如异常。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该靶标包括来自患者的离体或体外生物样品或患者的体内区域。
58.如权利要求57所述的方法,该方法包括基于该谱数据的该分析或通过其帮助对该患者进行外科手术。
59.如权利要求57或58所述的方法,该方法包括使用该谱数据来确定该样品或该患者的该区域的该病症或一种或多种特性。
60.如权利要求59所述的方法,该方法包括将该谱数据与先前获得的实验数据或理论数据比较以确定该样品或该患者的区域的所述病症或一种或多种特性。
61.如权利要求57-60中任一项所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该样品或该患者的该区域中的该组织的类型。
62.如权利要求57-61中任一项所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该样品或该患者的该区域是患病还是未患病的;和/或
包括从该谱数据确定该样品或该患者的该区域是包括死亡组织还是活组织。
63.如权利要求57-62中任一项所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该样品或该患者的该区域中的组织是癌性还是非癌性的。
64.如权利要求63所述的方法,该方法包括从该谱数据确定组织癌症的等级。
65.如权利要求57-64中任一项所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该样品或该患者的该区域是否包括粘膜组织或粘膜下层组织。
66.如权利要求57-65中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据选择性地切除、去除、治疗或破坏该患者或样品中的生物材料。
67.如权利要求57-66中任一项所述的方法,该方法包括基于该谱数据提供声学、视觉或触觉反馈,从而指示该样品或该患者的该区域的该病症或一种或多种特性。
68.如权利要求67所述的方法,该方法包括基于该反馈选择性地切除、去除、治疗或破坏该患者或样品中的生物材料。
69.如权利要求67或68所述的方法,该方法包括切除、去除、治疗或破坏该患者中的生物材料;并且基于该反馈选择性地继续或中断该生物材料的该切除、去除、治疗或破坏。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中从所述谱数据,该靶标处于或取自健康组织与非健康组织之间的边限;和/或从所述谱数据中,将其确定为健康组织与非健康组织之间的边限。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括使用该第一装置以从该靶标上的多个不同区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气。
72.如权利要求71所述的方法,其中该气溶胶、烟雾或蒸气从该靶标中的多个不连续区域中产生。
73.如权利要求71或72所述的方法,该方法包括针对在所述不同区域中的每一个处产生的气溶胶、烟雾、蒸气对所述气溶胶、烟雾、蒸气或从其来源的离子进行质量分析和/或离子迁移分析以便获得针对这些不同区域的所述谱数据,并且将该谱数据与其该靶标上的相应区域相关以便提供针对该靶标的离子成像或图谱数据。
74.如权利要求73所述的方法,该方法包括将每个区域的该谱数据转化成代表该靶标中的所述区域处的该材料的类型、病症或成分的数据;并且任选地将该代表性数据展示为离子图像或图谱,该离子图像或图谱示出了该靶标中的作为位置函数的该材料的类型、病症或成分。
75.如权利要求74所述的方法,其中该代表性数据指示该靶标中这些区域中的每一个处的患病材料;癌性材料;或坏死材料的类型、水平和/或存在和/或不存在。
76.如权利要求74或75所述的方法,该方法包括鉴定和/或展示该靶标中患病组织、癌性组织和/或坏死组织的边限。
77.如权利要求74、75或76所述的方法,该方法包括鉴定和/或展示所关注的一种或多种细胞或组织类型的位置和/或边限。
78.如权利要求77所述的方法,其中该所关注的细胞或组织类型包括该靶标中的患病和/或癌性和/或坏死组织或细胞;和/或
其中该所关注的细胞或组织类型包括健康组织或细胞。
79.如权利要求74-78中任一项所述的方法,其中该代表性数据指示该靶标中的不同类型的细胞或成分。
80.如权利要求74-79中任一项所述的方法,该方法包括鉴定和/或展示靶标内的不同微生物的分布,其中这些微生物任选地选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和/或病毒。
81.如权利要求74-80中任一项所述的方法,该方法包括鉴定和/或展示该靶标上的生物标志物的分布。
82.如权利要求73-81中任一项所述的方法,其中该离子成像或图谱数据实时产生和/或展示。
83.如权利要求82所述的方法,该方法包括在该离子图像或图谱上展示该第一装置的至少一部分相对于该靶标的当前位置;和/或在该离子图像或图谱上展示工具的当前位置。
84.如权利要求83所述的方法,其中该第一装置的所述部分包括从该靶标中产生所述气溶胶、烟雾或蒸气的部分;和/或其中该工具是外科手术工具,诸如用于切除或消融组织的工具。
85.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该靶标来自人类或动物或作为人类或动物的一部分,并且该方法包括基于该谱数据确定向该人类或动物提供的治疗。
86.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括向该靶标或向受试者给予药物、治疗剂或治疗,并且然后从该受试者中取得该靶标,之后在该靶标上进行如权利要求1所述的步骤a)和b);并且基于该谱数据确定该药物、治疗剂或治疗对该靶标或对该靶标内的组分的作用。
87.如权利要求86所述的方法,该方法包括从该谱数据确定该药物、治疗剂或治疗对该靶标或受试者的作用或有效性。
88.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括在第一时间产生所述气溶胶、烟雾或蒸气以便获得所述第一谱数据;
在随后第二时间从所述第一靶标的一个或多个区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气;
质量分析和/或离子迁移分析在该第二时间产生的该气溶胶、烟雾或蒸气、或从其来源的离子以便获得第二谱数据;并且
比较该第一谱数据和该第二谱数据以确定该第一靶标或其组分中的变化。
89.如权利要求88所述的方法,其中在一个或多个另外的时间下重复产生气溶胶、烟雾或蒸气的步骤和分析的步骤以分别获得第三谱数据或另外的谱数据;任选地其中将该第三谱数据或该另外的谱数据与该第一谱数据和/或该第二谱数据比较以确定该第一靶标或其组分中的变化。
90.如权利要求88或89所述的方法,该方法包括在所述第一时间与所述第二时间之间向该第一靶标给予药物、治疗剂或治疗;并且比较该第一数据和该第二数据以确定该药物、治疗剂或治疗对该靶标的作用或有效性。
91.如权利要求1-87中任一项所述的方法,该方法包括在第一时间产生所述气溶胶、烟雾或蒸气以便获得所述第一谱数据;
在所述第一时间和/或在随后第二时间从第二不同靶标的一个或多个区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气;
质量分析和/或离子迁移分析在该第一时间和/或该第二时间从该第二靶标中产生的该气溶胶、烟雾或蒸气、或从其来源的离子以便获得第二谱数据;并且
比较该第一谱数据和该第二谱数据以确定该第一靶标与该第二靶标之间的差异。
92.如权利要求91所述的方法,其中从第三靶标或另外的靶标中产生气溶胶、药物或蒸气,并且分析的步骤能够进行一次或更多次以分别获得第三谱数据或另外的谱数据;任选地其中将该第三谱数据或该另外的谱数据与该第一谱数据和/或该第二谱数据比较以确定该第三靶标和/或该第一靶标和该第二靶标之间的差异。
95.如权利要求92所述的方法,其中该第一靶标和该第二靶标是或来自不同受试者。
96.如权利要求92所述的方法,其中该第一靶标和该第二靶标是或来自相同受试者的不同区域。
97.如权利要求92、95或96所述的方法,其中这些靶标中的一个取自或处于已知或怀疑是健康的位置;并且这些靶标中的另一个取自或处于已知或怀疑是非健康、患病的肿瘤边限、肿瘤基质或赘生性肿瘤的位置。
98.如权利要求92-97中任一项所述的方法,其中在该第一时间和该第二时间分析的这些靶标来自或处于该一个或多个受试者的相同区域或组织。
99.如权利要求92-98中任一项所述的方法,其中在该第一时间和该第二时间分析的这些靶标来自或处于相同组织类型。
100.如权利要求96或98-99中任一项所述的方法,其中该第一靶标和该第二靶标取自或处于相同受试者;其中在所述第二时间从该第二靶标的所述一个或多个区域中产生该气溶胶、烟雾或蒸气;并且其中该方法包括在所述第一时间与所述第二时间之间向该受试者给予药物、治疗剂或治疗;并且比较该第一数据和该第二数据以确定该药物、治疗剂或治疗对该受试者的作用或有效性。
101.如权利要求90或100所述的方法,其中给予治疗剂的步骤包括给予治疗有效量的该治疗剂。
102.如权利要求90、100或101所述的方法,其中该药物、治疗剂或治疗是抗癌治疗和/或辐射和/或外科手术;和/或
其中该药物、治疗剂或治疗是抗微生物或益生菌治疗。
103.如权利要求90、100、101或102所述的方法,该方法包括确定所述药物、治疗剂或治疗对该靶标内的一种或多种微生物或该微生物组的作用。
104.如权利要求103所述的方法,该方法包括确定该微生物的一种或多种毒力因子。
105.如权利要求88、89或90所述的方法,该方法包括比较该第一谱数据和该第二谱数据以确定随时间推移该靶标内的该微生物组中的变化。
106.如权利要求88、89、90或105所述的方法,该方法包括比较该第一谱数据和该第二谱数据以确定由该靶标内的一种或多种微生物引起的感染进展或消退。
107.如权利要求88、89、90、105或106所述的方法,该方法包括在所述第一时间与所述第二时间之间向该靶标给予疫苗;并且比较该第一谱数据和该第二谱数据以确定该接种疫苗的有效性。
108.如权利要求88-90或105-107中任一项所述的方法,该方法包括比较该第一谱数据和该第二谱数据以监测随时间推移疾病的进展或发展;和/或评价治疗对该受试者的有效性或进展;并且任选地基于所述监测和/或评价做出诊断、预后和/或分层这些受试者。
109.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包括分析所述谱数据以便分析生物标志物的类型、水平、存在或不存在,其中该生物标志物是直接生物标志物或间接生物标志物。
110.如权利要求109所述的方法,其中该生物标志物是脂质生物标志物;和/或
其中该生物标志物选自由以下各项组成的组:脂肪酸、甘油脂、固醇脂、鞘脂、孕烯醇脂、糖脂和/或磷脂;和/或
其中该生物标志物是代谢物、初级代谢物、次级代谢物、抗生素、群体感应分子、脂肪酸合酶产物、信息素和/或生物聚合物;和/或
其中该生物标志物是细菌的生物标志物;和/或
其中该生物标志物是外源性化合物或内源性化合物。
111.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述生物材料是人类或非人类动物材料。
112.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述生物材料包括体内生物材料或由其组成。
113.如权利要求1-111中任一项所述的方法,其中所述生物组织包括离体生物组织或由其组成。
114.如权利要求1-111中任一项所述的方法,其中所述生物组织包括体外生物组织或由其组成。
115.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该靶标包括外科手术切除标本、活检标本、棉签、涂片、粪便标本或体液标本。
116.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶标包括生物组织。
117.如权利要求116所述的方法,其中所述组织选自由以下各项组成的组:肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、骨骼、肠组织、脑组织、乳腺组织、支气管、头颅组织、耳组织、食管组织、眼睛组织、子宫内膜样组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾脏组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肝脏组织、肺组织、淋巴结、口组织、粘膜、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、脑垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织、小肠组织、脊髓、脾组织、胃组织、胸腺组织、气管组织、甲状腺组织、软组织、结缔组织、腹膜组织、血管组织、脂肪组织、输尿管组织、尿道组织、软组织和结缔组织、腹膜组织、血管组织和/或脂肪组织;(ii)I级、II级、III级或IV级癌性组织;(iii)转移性癌性组织;(iv)混合级癌性组织;(v)亚级癌性组织;(vi)健康或正常组织;或(vii)癌性或异常组织。
118.如权利要求116或117所述的方法,其中所述组织受选自由以下各项组成的组的病症影响:病灶;糖尿病病灶;伤口;溃疡;脓肿;肿瘤;癌症;和坏死。
119.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中该方法包括分析来源于该气溶胶、烟雾或蒸气的分析物离子。
120.如权利要求119所述的方法,该方法包括在仅负离子模式下、仅正离子模式下、在负离子模式并且然后正离子模式或正离子模式并且然后负离子模式下分析该离子。
121.如权利要求119或120所述的方法,其中分析所述分析物离子的所述步骤包括:(i)质量分析所述分析物离子;(ii)分析所述分析物离子的离子迁移率或微分离子迁移率;
(iii)分析所述分析物离子的离子横截面或碰撞横截面;(iv)根据其离子迁移率或微分离子迁移率来分离所述分析物离子;(v)根据其离子迁移率或微分离子迁移率来分离所述分析物离子,之后质量分析所述分析物离子;或(vi)基于其离子迁移率或微分离子迁移率来排除或丢弃分析物离子。
122.如权利要求119、120或121所述的方法,该方法包括用离子分析仪分析这些分析物离子以获得该谱数据,分析定质量、锁定离子迁移率或校准离子,并且基于从分析所述锁定质量、锁定离子迁移率或校准离子获得的该数据校准所述离子分析仪或调整该谱数据。
123.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述第一装置包括环境离子或电离源或构成其部分;或其中所述第一装置从待分析的该靶标中产生所述气溶胶、烟雾或蒸气,并且该气溶胶、烟雾或蒸气含有离子和/或随后被环境离子或电离源或其他电离源电离。
124.如权利要求123所述的方法,其中该靶标是天然或未改性的生物材料。
125.如权利要求124所述的方法,其中所述天然或未改性的靶标是通过加入基质或试剂而未改性的。
126.如权利要求123-125中任一项所述的方法,其中所述第一装置在没有该靶标的先前制备的情况下用于从该靶标的该一个或多个区域中产生该气溶胶、烟雾或蒸气。
127.如权利要求123-126中任一项所述的方法,其中该靶标在如权利要求1所述的步骤a)和b)之前被冷冻、化学固定、化学染色或切片。
128.如权利要求127所述的方法,其中该靶标是未改性的,而不是在如权利要求1所述的步骤a)和b)之前被冷冻、化学固定、化学染色或切片。
129.如权利要求123-128中任一项所述的方法,其中所述第一装置包括选自由以下各项组成的组的离子源或构成其部分:(i)快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源;任选地,第一装置包括选自由以下各项组成的组的装置或离子源或构成其部分:(i)快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源;(ii)解吸电喷雾电离(“DESI”)离子源;(iii)激光解吸电离(“LDI”)离子源;(iv)热解吸离子源;(v)激光二极管热解吸(“LDTD”)离子源;(vi)解吸电流动聚焦(“DEFFI”)离子源;(vii)电介质阻挡放电(“DBD”)等离子体离子源;(viii)大气固体分析探针(“ASAP”)离子源;(ix)超声辅助喷雾电离离子源;(x)简单环境超声喷雾电离(“EASI”)离子源;(xi)解吸大气压光致电离(“DAPPI”)离子源;(xii)纸喷雾(“PS”)离子源;(xiii)射流解吸电离(“JeDI”)离子源;(xiv)触摸喷雾(“TS”)离子源;(xv)纳米DESI离子源;(xvi)激光消融电喷雾(“LAESI”)离子源;(xvii)实时直接分析(“DART”)离子源;(xviii)探针电喷雾电离(“PESI”)离子源;(xix)固体探针辅助电喷雾电离(“SPA-ESI”)离子源;(xx)无痛穿孔锥超声手术吸气器(“CUSA”)装置;(xxi)混合CUSA-透热装置;(xxii)聚焦或未聚焦超声消融装置;(xxiii)混合聚焦或未聚焦超声消融和透热装置;(xxiv)微波共振装置;(xxv)脉冲等离子体RF解剖装置;(xxvi)氩等离子体凝固装置;(xxvi)混合脉冲等离子体RF解剖和氩等离子体凝固装置;(xxvii)混合脉冲等离子体RF解剖和JeDI装置;(xxviii)外科手术水/盐水射流装置;(xxix)混合电外科手术和氩等离子体凝固装置;以及(xxx)混合氩等离子体凝固和水/盐水射流装置。
130.如权利要求123-129中任一项所述的方法,其中使用所述第一装置以从所述靶标的一个或多个区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气的所述步骤包括使所述靶标与一个或多个电极接触
131.如权利要求130所述的方法,其中所述一个或多个电极包括以下各项中的任一种:
(i)单极装置,其中所述方法任选地进一步包括提供分开的返回电极;(ii)双极装置;或(iii)多相RF装置,其中所述方法任选地进一步包括提供一个或多个分开的返回电极。
132.如权利要求130或131所述的方法,其中所述一个或多个电极包括快速蒸发电离质谱(“REIMS”)装置或构成其部分。
133.如权利要求130-132中任一项所述的方法,该方法进一步包括将AC或RF电压施加到所述一个或多个电极以便产生所述气溶胶、烟雾或蒸气。
134.如权利要求133所述的方法,其中将所述AC或RF电压施加到所述一个或多个电极的步骤进一步包括将所述AC或RF电压的一个或多个脉冲施加到所述一个或多个电极。
135.如权利要求133或134所述的方法,其中将所述AC或RF电压施加到所述一个或多个电极的所述步骤引起热量分散到所述靶标中。
136.如权利要求123-129中任一项所述的方法,其中使用所述第一装置以从该靶标的一个或多个区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气的所述步骤进一步包括用激光照射该靶标。
137.如权利要求123-136中任一项所述的方法,其中所述第一装置通过焦耳加热或透热疗法使来自所述靶标的靶材料直接蒸发或气化而从该靶标的一个或多个区域中产生气溶胶。
138.如权利要求123-137中任一项所述的方法,其中使用所述第一装置以从该靶标的一个或多个区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气的所述步骤进一步包括将超声能引导到所述靶标中。
139.如权利要求123-138中任一项所述的方法,其中所述气溶胶包含不带电的水性液滴,任选地包含细胞材料。
140.如权利要求123-139中任一项所述的方法,其中所述第一装置包括床旁检测(“POC”)、诊断或外科手术装置。
141.如权利要求123-140中任一项所述的方法,该方法包括使所述气溶胶、烟雾或蒸气中的至少一些或所述气溶胶、烟雾或蒸气中的分析物电离,以便产生分析物离子。
142.如权利要求123-141中任一项所述的方法,该方法包括将所述气溶胶、烟雾或蒸气中的至少一些引导或抽吸到质谱仪和/或离子迁移谱仪的真空室中;和/或使所述质谱仪和/或离子迁移谱仪的一个真空室或所述真空室内的至少一些所述气溶胶、烟雾或蒸气、或其中的分析物电离,以便产生多个分析物离子。
143.如权利要求141或142所述的方法,该方法包括引起所述气溶胶、烟雾或蒸气、或其中的分析物在任选地位于所述质谱仪和/或离子迁移谱仪的一个真空室或该真空室内的碰撞表面上撞击,以便产生该多个分析物离子。
144.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括将基质加入所述气溶胶、烟雾或蒸气中,任选地之后该气溶胶、烟雾或蒸气被电离和/或在碰撞表面上撞击。
145.如权利要求144所述的方法,其中所述基质选自由以下各项组成的组:(i)用于所述气溶胶、烟雾或蒸气或其中的分析物的溶剂;(ii)有机溶剂;(iii)挥发性化合物;(iv)极性分子;(v)水;(vi)一种或多种醇;(vii)甲醇;(viii)乙醇;(ix)异丙醇;(x)丙酮;(xi)乙腈;(xii)1-丁醇;(xiii)四氢呋喃;(xiv)乙酸乙酯;(xv)乙二醇;(xvi)二甲亚砜;
(xviii)酮;(xiv)非极性分子;(xx)己烷;(xxi)氯仿;以及(xxii)1-丙醇。
146.如权利要求141-145中任一项所述的方法,该方法包括质量分析和/或离子迁移分析所述分析物离子或从其来源的离子以便获得该谱数据。
147.如权利要求146所述的方法,该方法包括分析所述谱数据以便进行以下各项中的任一种:(i)在健康与患病组织之间区分;(ii)在潜在癌性与非癌性组织之间区分;(iii)在不同类型或等级的癌性组织之间区分;(iv)在不同类型或类别的靶材料之间区分;(v)确定一种或多种希望的或不希望的物质是否存在于所述靶标中;(vi)证实所述靶标的身份或真实性;(vii)确定一种或多种杂质、违禁物质或不希望的物质是否存在于所述靶标中;
(viii)确定人类或动物患者是否处于增加的遭受不利结局的险中;(ix)做出或帮助做出诊断或预后;和(x)告知外科医生、护士、医师或机器人医学、外科学或诊断学的结局。
148.如前述权利要求中任一项所述的方法,该方法包括分析该谱数据,其中分析该谱数据包括分析一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类。
149.如权利要求148所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括非监督分析该一种或多种样品谱(例如,用于降维)和/或监督分析该一种或多种样品谱(例如,用于分类)。
150.如权利要求148或149所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括使用以下各项中的一种或多种:单变量分析;多变量分析;主成分分析(PCA);线性判别分析(LDA);最大边限标准(MMC);基于库的分析;类相似性的软独立建模(SIMCA);因子分析(FA);递归分区(决策树);随机森林;独立成分分析(ICA);
偏最小二乘法判别分析(PLS-DA);潜在结构的正交(偏最小二乘)投射(OPLS);OPLS判别分析(OPLS-DA);支持向量机(SVM);(人工)神经网络;多层感知机;径向基函数(RBF)网络;贝叶斯分析;聚类分析;核化的方法;和子空间判别分析。
151.如权利要求148、149或150所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括使用一种或多种参考样品谱来开发分类模型或库。
152.如权利要求148-151中任一项所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括在进行主成分分析(PCA)(例如,用于降维)之后进行线性判别分析(LDA)(例如,用于分类)。
153.如权利要求148-152中任一项所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括在进行主成分分析(PCA)(例如,用于降维)之后进行最大边限标准(MMC)(例如,用于分类)。
154.如权利要求148-153中任一项所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括在分类模型或库内定义一个或多个类别。
155.如权利要求148-154中任一项所述的方法,其中分析该一种或多种样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括根据一种或多种类别或聚类标准在分类模型或库内手动地或自动地定义一个或多个类别。
156.如权利要求155所述的方法,其中该一个或多个类别或聚类标准基于以下各项中的一种或多种:模型空间内的参考样品谱的一对或多对参考点之间的距离;模型空间内的参考样品谱的多组参考点之间的方差值;和模型空间内的参考样品谱的一组参考点内的方差值。
157.如权利要求154、155或156所述的方法,其中该一个或多个类别各自通过一个或多个类别定义来定义。
158.如权利要求157所述的方法,其中该一个或多个类别定义包括以下各项中的一种或多种:模型空间内参考样品谱、值、边界、线、面、超平面、方差、体积、Voronoi单元和/或位置的一组一个或多个参考点;和类别层次结构内的一个或多个位置。
159.如权利要求148-158中任一项所述的方法,其中分析该一份或多份样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括使用分类模型或库来对一份或多份未知样品谱进行分类。
160.如权利要求148-159中任一项所述的方法,其中分析该一份或多份样品谱以便对该气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类包括根据一种或多种分类标准对一份或多份样品谱进行手动地或自动地分类。
161.如权利要求160所述的方法,其中该一种或多种分类标准包括以下各项中的一种或多种:
模型空间内一种或多种样品谱的一个或多个投射样品点与模型空间内一种或多种参考样品谱、值、边界、线、面、超平面、体积、Voronoi单元或位置的一组一个或多个参考点之间的距离低于距离阈值或是最小该距离;
模型空间内一种或多种样品谱的一个或多个投射样品点的位置是模型空间内一种或多种参考样品谱、值、边界、线、面、超平面或位置的一个或多个参考点的一侧或另一侧;
模型空间内一种或多种样品谱的一个或多个投射样品点的位置在模型空间内的一个或多个体积或Voronoi单元内;和
概率或分类得分高于概率或分类得分阈值或是最高该概率或分类得分。
162.一种确定生物材料中的疾病的严重性、等级、时期、存在或不存在的方法,该方法包括前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶标是所述生物材料。
163.一种确定靶标中的癌症、肿瘤细胞或肿瘤组织的严重性、等级、时期、存在或不存在的方法,该方法包括前述权利要求中任一项所述的方法。
164.一种分析生物材料的细胞组成的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该生物材料是所述靶标并且其中从该谱数据确定该细胞组成。
165.一种分析生物材料中的细胞材料的坏死的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该生物材料是所述靶标,并且其中所述分析坏死包括使用所述谱数据。
166.一种分析生物组织的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该生物材料是所述靶标并且其中从该谱数据中确定该组织的一种或多种特性。
167.一种分析粪便标本和/或体液标本的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该靶标是该粪便标本和/或体液标本并且其中从该谱数据中确定该粪便标本和/或体液标本的一种或多种特性。
168.一种分析一种或多种化合物和/或生物标志物的方法,该方法包括如权利要求1-
163中任一项所述的方法,其中该靶标的该一个或多个区域包含该化合物和/或生物标志物,并且其中该方法基于该谱数据分析所述一种或多种化合物和/或生物标志物。
169.一种分析细胞的基因型和/或表型的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该靶标包含这些细胞,并且其中该方法基于该谱数据分析这些细胞的该基因型和/或表型。
170.一种分析微生物的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该靶标包含该微生物,并且其中该方法基于该谱数据分析该微生物,其中该微生物任选地选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
171.一种在患者上进行外科手术的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该靶标包括来自该患者或该患者区域的生物样品。
172.一种治疗人类或动物受试者的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该靶标包括来自该受试者或该受试者区域的生物样品,并且确定待提供的该治疗是基于该谱数据的,并且向所述受试者给予适当的治疗。
173.一种分析的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,该方法包括使用所述谱数据以进行以下各项:
(i)诊断所述疾病或疾病;
(ii)监测所述疾病或疾病随时间推移的进展或发展;
(iii)确定所述疾病或疾病的预后;
(iv)预测所述疾病或疾病响应于治疗的可能性;
(v)监测所述疾病或疾病对治疗的响应;
(vi)分层受试者;
(vii)确定该靶标内的所述疾病或疾病的分布;或
(viii)确定该靶标中所述疾病或疾病与不具有该疾病的该靶标区域之间的边限。
174.一种分析生物材料中的癌症的方法,该方法包括如权利要求1-163中任一项所述的方法,其中该生物材料是肿瘤,该肿瘤包括注射或异种移植到动物中的人类癌细胞或由其组成,其中所述生物材料是所述靶标,并且其中所述分析癌症包括使用所述谱数据。
175.如权利要求174所述的方法,其中所述人类癌症细胞包括转基因和/或沉默基因。
176.一种装置,安排并且配置以进行如前述权利要求中任一项所述的方法,该装置包括:
所述第一装置,用于从该第一靶标的一个或多个区域中产生所述气溶胶、烟雾或蒸气;
质量分析仪和/或离子迁移分析仪,安排并且配置以分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子以便获得该第一谱数据。

说明书全文

通过质谱或离子迁移谱进行的组织分析

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2015年3月6日提交的英国专利申请号1503876.3、于2015年3月6日提交的英国专利申请号1503864.9、于2015年10月16日提交的英国专利申请号1518369.2、
于2015年3月6日提交的英国专利申请号1503877.1、于2015年3月6日提交的英国专利申请
号1503867.2、于2015年3月6日提交的英国专利申请号1503863.1、于2015年3月6 日提交的英国专利申请号1503878.9、于2015年3月6日提交的英国专利申请号1503879.7 以及于
2015年9月9日提交的英国专利申请号1516003.9的优先权和权益。这些申请的全部内容通
过引用结合在此。

技术领域

[0003] 本发明总体上涉及质谱和/或离子迁移谱,并且具体地涉及体内、离体或体外标本和/或组织分析的方法。

背景技术

[0004] 癌症是全世界发病和死亡的主要原因的重要部分,在2012年,有大约1400万新发病例和820万癌症相关的死亡。根据世界卫生组织,预计在未来20年内新发病例数将增加约
70%。
[0005] 胃肠癌是死亡的主要原因,并且占全世界癌症相关死亡的23%。
[0006] 乳房癌是乳腺组织癌。它是全世界妇女中最常见的癌症形式,(在西方国家)对所有女性的大约10%在其生命中的某个时期有影响。虽然已做出重大的努来实现早期检测
和有效治疗,但是约20%的患有乳腺癌的所有妇女仍死于该疾病。乳房癌是妇女癌症死亡
的第二大常见原因。
[0007] 为了改善来自癌症和其他疾病的结局,需要新颖的组织表征方法以便促进准确的诊断。
[0008] 常见的治疗选项是外科手术。当前的外科手术方法依赖于外科医生受过训练的眼睛,有时借助于手术显微镜和/或外科手术之前进行的扫描的成像。
[0009] 肿瘤外科手术的主要目标是使肿瘤切除最大化同时保留尽可能多的健康组织和其功能。然而,使用现有的技术,可能难以或不可能描绘出肿瘤边界。类似考虑适用于坏死组织的外科手术。
[0010] 因此,外科手术切除通常涉及去除作为“安全界限”的表面正常组织,但是这可能会增加发病率和并发症险。此外,存在“安全界限”太小,从而留下癌性或坏死组织的风险。例如,高达40%的经历乳腺癌外科手术的受试者需要另外的手术,因为外科医生可能无法在初次手术中去除所有癌性组织。
[0011] 因此,需要将帮助外科医生更好地区分癌性组织与正常组织的工具,从而减少需要重复手术的风险。
[0012] 还需要促进正确诊断和/或治疗另外的疾病(诸如坏死或炎性病症)的新颖方法。
[0013] 还需要检测感染和/或分析彼此之间和/或与宿主的生物相互作用的新颖方法。
[0014] 生物样品的质谱成像(“MSI”)分析是已知的,并且允许同时和空间分辨检测直接来自生物组织切片代谢物蛋白质和脂质。
[0015] 该技术已经在最近二十年期间通过引入新技术而获得明显的发展势头,这些新技术是诸如基质辅助激光解吸/电离(“MALDI”)、二次离子质谱(“SIMS”)以及解吸电喷雾电离 (“DESI”)。
[0016] 所得到的数据的空间分辨性质允许其用作组织的组织病理学表征和分类的补充信息层,包括癌症生物标志物探索的可能性。
[0017] 快速蒸发电离质谱(“REIMS”)是最近已开发用于在外科手术干预期间实时鉴定组织的技术。REIMS技术与手持式取样装置的结合已产生智能刀(iKnife)取样技术,该取样技术可以提供术中组织鉴定。智能刀取样技术允许外科医生通过使去除的健康组织的量最小
化同时确保去除所有癌性组织而更有效地在术中切除肿瘤。
[0018] 已显示生物组织的REIMS分析产生展示高组织学和组织病理学特异性的磷脂谱,该 REIMS分析类似于基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)、二次离子质谱(“SIMS”)和解吸电喷雾电离(“DESI”)成像。通过使细胞生物质经受在引起局部焦加热和细胞破坏连同带电粒子和中性粒子解吸的射频下的交变电流而获得质谱信号。然后将所得到的气溶胶或外科
手术烟雾运送到质谱仪以用于在线质谱分析。
[0019] 在此过程中,细胞生物质被置于钳子尖端之间,并且施加电流从而引起细胞经历热崩解并且释放被运送到质谱仪的部分带电气溶胶。
[0020] REIMS性能分析应用通常需要参考质谱的谱库以便建立基于图案的鉴定所必要的多变量分类模型。
[0021] 通过手动电外科取样离体组织标本、接着组织病理学检查剩余材料来进行使用智能刀取样技术的参考质谱的收集。虽然工作流程提供令人满意的数据,但是存在在验证步
骤涉及的一定程度的不确定性,因为由于在分析期间被蒸发使产生谱数据的组织部分不能
被研究。因此,照惯例所有鉴定基于对蒸发的组织的组织学环境的内推进行。

发明内容

[0022] 本发明提供一种质谱和/或离子迁移谱的方法,该方法包括;
[0023] 使用第一装置以从靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气;以及
[0024] 质量分析和/或离子迁移分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子。
[0025] 本发明还提供一种使用质谱和/或离子迁移谱分析的方法,该方法包括;
[0026] (a)使用第一装置以从靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气;
[0027] (b)质量分析和/或离子迁移分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子以便获得谱数据;以及
[0028] (c)分析所述谱数据以便分析所述靶标。
[0029] 本发明的实施例还提供分析、诊断、预后、监测、分层、治疗和/或外科手术的方法。
[0030] 这些方法的实施例的细节在详细说明中进行讨论。
[0031] 这些方法中的任一者的可选特征在下文中进行讨论。因此,除非另外说明,否则对“一种方法”或“该方法”的任何提及旨在是对在此列出的本发明的任何方法的提及。明确的意图是,这些特征中的任一者能以任何组合存在于这些方法中的任一者中。
[0032] 考虑了分析物离子例如通过环境电离离子源从靶标、气溶胶、烟雾或蒸气中产生的各种实施例。分析物离子或从其来源的离子可以经受:(i)通过质量分析仪诸如四极质量分析仪或飞行时间质量分析仪进行的质量分析;(ii)离子迁移分析(IMS)和/或微分离子迁
移分析  (DMA)和/或场不对称离子迁移谱(FAIMS)分析;和/或(iii)首先离子迁移分析
(IMS) 和/或微分离子迁移分析(DMA)和/或场不对称离子迁移谱(FAIMS)分析接着其次通
过质量分析仪诸如四极质量分析仪或飞行时间质量分析仪进行的质量分析(反之亦然)的
组合。各种实施例还涉及离子迁移谱仪和/或质量分析仪以及离子迁移谱的方法和/或质量
分析的方法。
[0033] 获得谱数据可包括记录从烟雾、气溶胶或蒸气来源的离子、作为一种或多种物理化学特性的函数(或作为与其相关的特性的函数)的离子信号强度。例如,可以将离子信号
强度记录为质荷比和/或离子迁移率的函数。然后这个记录的离子信号中的峰的位置和/或
大小和/ 或图案可用于表征或鉴定存在于烟雾、气溶胶或蒸气中的一种或多种分析物。
[0034] 串联质谱可用于将分析物/化合物分配到每个峰。例如,具有对应于峰的物理化学特性 (例如,质荷比)的母体离子可被分离(例如,使用质量过滤器)、然后碎片化或反应以便产生碎片或产物离子。然后这些碎片或产物离子可被分析(例如,通过质量分析),并且其确定的特性用于鉴定在离子信号中产生该峰的母体离子。这样的串联质谱可例如用于鉴定
谱数据中的生物标志物。
[0035] 质谱仪和/或离子迁移谱仪可获得仅负离子模式下、仅正离子模式下或正离子模式和负离子模式两者下的数据。正离子模式谱数据可与负离子模式谱数据组合或级联。负
离子模式可提供用于对气溶胶、烟雾或蒸气样品(诸如来自包含脂质的靶标的气溶胶、烟雾或蒸气样品)进行分类的特别有用的谱。
[0036] 离子迁移谱数据可使用不同离子迁移率漂移气体获得,或可将掺杂剂添加到漂移气体中以诱导一种或多种物质漂移时间的变化。然后可将此数据组合或级联。考虑了用于
从靶标产生气溶胶、烟雾或蒸气的第一装置可包括氩等离子体凝固(“APC”)装置的其他实施例。氩等离子体凝固装置涉及使用通过探针引导的电离氩气(等离子体)射流。探针可穿
内窥镜。氩等离子体凝固实质上是非接触方法,因为探针被放置在与靶标具有一定距离
处。氩气从探针中发出,然后通过高压放电(例如,6kV)而电离。然后通过气体射流实施高频电流,从而导致在射流的另一端上对靶标进行凝固。凝固的深度通常仅有几毫米。
[0037] 于在此的任一方面或实施例中披露的第一装置、手术或电外科工具、装置或探针或其他取样装置或探针可包括非接触性手术装置,诸如以下各项中的一种或多种:力外
科 (hydrosurgical)装置、手术水射流装置、氩等离子体凝固装置、混合氩等离子体凝固装置、水射流装置以及激光装置。
[0038] 非接触性手术装置可被定义为一种手术装置,该手术装置被安排并适配以切除、碎片化、液化、抽吸、电灼或以其他方式破坏生物组织而无需物理接触该组织。实例包括激光装置、水力外科装置、氩等离子体凝固装置以及混合氩等离子体凝固装置。
[0039] 由于非接触性装置可不与组织物理接触,该程序可视为相对安全的并且可用于治疗具有低细胞内结合的精细组织,诸如皮肤或脂肪。
附图说明
[0040] 现将仅以举例的方式并参照附图来描述各种实施例,在附图中:
[0041] 图1A示出了根据其中通过质谱仪和/或离子迁移谱仪来分析由电外科电极尖端产生的烟雾、气溶胶或蒸气的实施例的内窥镜实验设置,并且图1B示出了根据本发明的实施
例的胃肠道(GI)息肉的切除;
[0042] 图2示出了电外科装置与质谱仪和/或离子迁移谱仪之间的接口的实施例;
[0043] 图3展示了REIMS的方法,其中将RF电压施加到两极钳,从而导致烟雾、气溶胶或蒸气的产生,所述烟雾、气溶胶或蒸气然后通过质谱仪和/或离子迁移谱仪来分析;
[0044] 图4展示了根据各种实施例的解吸电喷雾电离(“DESI”)的技术;
[0045] 图5a示出了实例1的结果:在负离子模式下对II级浸润性导管癌(IDC)的PCA分析;
[0046] 图5b示出了实例1的结果:II级IDC负离子模式的MMC分析;
[0047] 图6a示出了实例1的结果:在正离子模式下对II级IDC的PCA分析;
[0048] 图6b示出了实例1的结果:II级IDC正离子模式的MMC分析;
[0049] 图7a和图7b示出了实例1的结果:在负离子模式下(7a)和在正离子模式下(7b)对 II级IDC中的不同组织类型的留一交叉验证;
[0050] 图8示出了实例2的结果:对来自多种样品的组合数据集的分析(负离子模式)。a)鉴定的区域的PCA;b)MMC监督分析;c)排除具有在b)中鉴定的异常值的样品的MMC分析;d)对应的每位患者一个区域的留一交叉验证;
[0051] 图9示出了实例2的结果:a)对健康卵巢、边界肿瘤和癌的监督MMC分析连同b)一位患者的留一交叉验证;
[0052] 图10示出了实例2的结果:a)对健康卵巢和不同上皮癌(子宫内膜样和浆液性)的监督MMC分析以及对应的b)一位患者的留一交叉验证;
[0053] 图11示出了实例2的结果:将具有未知组织学的样品用于预测不同组织类型。正确预测了浆液性癌、浆液性癌相关的基质、正常卵巢基质以及背景。进行基于组织学注释的这种预测的交叉验证并且达到几乎100%的分类准确性;
[0054] 图12示出了来自实例3的数据:切割模式(来自61位患者的正常组织,280个谱,来自37位患者的肿瘤组织,80个谱);
[0055] 图13示出了来自实例3的数据:凝固模式(来自66位患者的正常组织,281个谱,来自31位患者的肿瘤组织,59个谱);
[0056] 图14示出了在乳房切除术样品上运行的边限测试的实例(实例4);
[0057] 图15示出了来自实例6的数据。示出正常与癌症之间以及正常、边界与卵巢病灶之间的边界边限的组织分离的线性判别分析;
[0058] 图16示出了来自实例8的结果,这在此图上提供了更多细节;
[0059] 图17示出了来自实例9的结果,这在此图上提供了更多细节;
[0060] 图18示出了来自实例10的结果,这在此图上提供了更多细节;
[0061] 图19示出了实例11的结果。显示结肠直肠组织标本中的组织类型分布的DESI-MS图像;在原始图片中,肿瘤组织用绿色示出并且基质组织用红色示出。在黑白版本中,肿瘤组织用浅灰色示出并且基质组织用更深的灰色示出;B)DESI后的H&E染色和组织病理学注
释的切片;
[0062] 图20示出了实例11的结果。对于图19所示的相同组织切片的结肠直肠腺癌、肿瘤周围基质和坏死组织的全扫描质谱。星号指示主要分类学标志物;
[0063] 图21示出了实例11的结果。对于作为分类学标志物而显示出特异性的已知和经证实的同源鞘脂物质的单离子图像和代表性强度分布图;
[0064] 图22示出了实例11的结果。对于其他分类学标志物的单离子图像和强度选择的分布图;
[0065] 图23(a)和图23(b)示出了实例12的结果;
[0066] 图24示出了实例13的结果;
[0067] 图25示出了当使用快速蒸发电离质谱(“REIMS”)分析来分析粪便样品时所观察到的谱;
[0068] 图26示意性地示出了存在于人类微生物组中的各种微生物;
[0069] 图27示意性地示出了存在于人体中的各种粘液膜(mucosa)或粘膜(mucosal membrane);
[0070] 图28示意性地示出了包含生物组织和细菌的粘液膜或粘膜;
[0071] 图29示意性地示出了存在于粘液膜中的分析物可如何有用于鉴定许多临床失调;
[0072] 图30示意性地示出了来自粘膜的分析物的代谢组学分析可如何有用于鉴定临床失调诸如过敏症、炎症和早产;
[0073] 图31示出了用于微生物分析的各种方法连同使用根据各种实施例的环境质谱进行的实时快速且直接的分析方法;
[0074] 图32示意性地示出了使用医学签作为取样装置从所选择的人体部分(例如,泌尿生殖道、口腔或鼻腔)中取样的粘膜,其中医学棉签表面然后可通过根据各种实施例的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱来直接分析,而不需要先前的样品制备程序;
[0075] 图33A示出了使用Xevo G2-S Q-Tof(RTM)质谱仪记录的来自阴道粘液膜、口腔粘液膜和鼻粘液膜的平均负离子解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱,并且图33B示出了对于使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱所获得的阴道粘液膜(n=68,示为带阴影的圆圈)、口腔粘液膜(n=15,示为白色填充的圆圈)和鼻腔粘液膜(n=20,示为黑色填充的圆圈)的 PCA和MMC得分图;
[0076] 图34示出了从医学棉签中获得的在负离子模式下的阴道粘膜、口腔粘膜和鼻粘膜的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱,连同提供不同粘膜类别(鼻、口腔、阴道)之间的分离的主成分分析(PCA)和最大边限标准分析,其中通过留一交叉验证获得的预测准确性在 92%-
100%的范围内;
[0077] 图35示出了从医学棉签、在负离子模式下获得的孕期阴道粘膜的解吸电喷雾电离 (“DESI”)质谱,其中发现泌尿生殖器粘液膜产生具有质荷比465.41的胆固醇硫酸盐[M-H]-作为最丰富的脂质物质以及不同的甘油磷脂物质,诸如具有质荷比788.50的甘油磷酸乙醇
胺(PE)[PE(40:7)-H]-、具有质荷比760.50的甘油磷酸丝酸(PS)[PS(34:1)-H]-和具有质
-
荷比863.58的甘油磷酸肌醇(PI)[PI(36:1)-H];
[0078] 图36A示出了在负离子模式下获得的来自孕期组和非孕期组的质量范围m/z 150-1000 内的平均解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱,图36B示出了使用递归最大边限标准
(“RMMC”) 的主成分分析和判别分析,图36C示出了基于阴道粘膜中的化学特征用于在高度准确的鉴定 (>80%)下对组类别进行增强分离的留一交叉验证分析,图36D示出了指示非
孕期阴道粘膜与孕期阴道粘膜之间的主要在质荷比(“m/z”)范围550-1000内的所选择峰的丰度的显著性差异的箱线图,并且图36E示出了留一交叉验证;
[0079] 图37A示出了根据各种实施例对棉签上的细菌样品的解吸电喷雾电离(“DESI”)谱分析并且示出了细菌样品可以使用DESI来检测;并且图37B示出了与直接来自琼脂板的细
菌样品的快速蒸发电离质谱(“REIMS”)分析连同飞行时间质量分析的比较;
[0080] 图38A示出了各种各样分析的微生物物种(包括白色假丝酵母菌(Candida albicans)、蒙特利假单胞菌(Pseudomonas montelli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus 
epidermis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、炎克雷伯菌(Klebsiella 
pneumonia)和乳杆菌(Lactobacillus sp))以及孕期阴道粘液膜的平均解吸电喷雾电离
(“DESI”)质谱,并且图38B和图38C示出了PCA图,这些PCA图示出来自前两种成分内的微生物物种的阴道粘液膜(孕期组与非孕期组)之间的分离以及不同细菌和真菌物种之间的分
离;
[0081] 图39示意性地示出了根据各种实施例对棉签上的样品的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱分析、快速蒸发电离质谱(“REIMS”)质谱分析和基于培养的分析;
[0082] 图40示出了根据各种实施例包括建立分类模型的分析方法;
[0083] 图41示出了从两类已知的参考样品中获得的一组参考样品谱;
[0084] 图42示出了具有由强度坐标轴限定的三个维度的多变量空间,其中多变量空间包括复数个参考点,每个参考点对应于来源于参考样品谱的一组三个峰强度值;
[0085] 图43示出了累计方差与PCA模型的成分数之间的一般关系;
[0086] 图44示出了具有由主成分坐标轴限定的两个维度的PCA空间,其中PCA空间包括复数个转换的参考点或得分,每个转换的参考点或得分对应于图42的参考点;
[0087] 图45示出了具有单个维度或坐标轴的PCA-LDA空间,其中基于图44的PCA空间进行LDA,PCA-LDA空间包括复数个进一步转换的参考点或类别得分,每个进一步转换的参考点
或类别得分对应于图44的转换的参考点或得分。
[0088] 图46示出了根据各种实施例包括使用分类模型的分析方法;
[0089] 图47示出了从未知样品获得的样品谱;
[0090] 图48示出了图45的PCA-LDA空间,其中PCA-LDA空间进一步包括来源于图47的样品谱的峰强度值的PCA-LDA投射的样品点;
[0091] 图49示出了根据各种实施例包括建立分类库的分析方法;
[0092] 图50示出了根据各种实施例包括使用分类库的分析方法;
[0093] 图51示出了通过快速蒸发电离质谱和DESI分析的具有转移肿瘤的肝脏样品的样品图像、H&E图像和质谱多变量图像,其中显而易见的是这两种技术清楚地区分组织类型;
[0094] 图52示出了对于快速蒸发电离质谱成像切割和指向模式以及对于DESI数据的健康和癌性肝脏组织的主成分分析图,其中PC是主成分并且百分比数值解释为方差;
[0095] 图53示出了单一磷脂离子物质的单变量强度比较,其中所描绘的样品图像是对应离子的离子图像并且DESI和快速蒸发电离质谱示出相同离子的类似相对强度值,其中PE是
磷脂酰乙醇胺;
[0096] 图54A示出了使用改进型Xevo G2-S(RTM)Q-Tof质谱仪(沃特斯公司(Waters)(RTM)) 记录的胃粘液膜、胃粘液膜下层和腺癌组织的质谱,其中癌性和健康粘液膜组织的主要特征在于600-900m/z范围内的磷脂,而粘液膜下层特征在于800-1000m/z范围内的甘
油三酯和磷脂酰肌醇物质,并且图54B示出了所选择的峰的丰度的比较,该比较示出使用 
Kruskal-Wallis ANOVA得到的在600-900m/z范围内的癌性与健康组织之间的显著性差异,
其中当将粘液膜下层与其他两种组织类型比较时,高于m/z 800的所有峰显著不同;
[0097] 图55A示出了使用LTQ Velos(RTM)质谱仪从七位患者获得的人类结肠腺癌(n=43) 和健康结肠粘膜数据(n=45)的3维PCA图,其中从两位患者收集的腺瘤性息肉(n=5) 
在其取出之后离体取样,并且其中可在PCA空间中观察到所有三个组之间的显著性差异,并且图55B示出了使用Xevo G2-S(RTM)Q-Tof质谱仪(沃特斯公司(RTM))从三位患者离体获得
的健康胃粘液膜(n=32)、胃粘液膜下层(n=10)和胃腺癌(n=29)的3维PCA图,其中粘液膜下层与其他两个层之间的显著性差异可用于为根据实施例的介入内窥镜检查提供穿孔风
险预警系统;并且
[0098] 图56A示出了体内使用快速蒸发电离质谱相容的内窥镜系统以及取自经受结肠镜检查的三位患者的取样点,并且图56B示出了在3维PCA图上描绘的取样点,其中当去除的息肉位于不同空间部分时体内获得谱,而所有其他粘膜谱独立于取样位置是拟一致的。

具体实施方式

[0099] 尽管已参考优选实施例描述了本发明,但是本领域技术人员应当理解可以在不脱离本发明的范围情况下如随附权利要求书所阐述进行形式和细节上的各种改变。
[0100] 技术人员将理解在此列出的任何特征能以任何组合进行组合。
[0101] 对组织进行的基于质谱(“MS”)的鉴定已知为使用对组织进行的成像技术、取样探针/ 电喷雾系统以及直接环境电离质谱研究。直接环境电离质谱(诸如REIMS技术)已作为允许通过使用电外科工具作为质谱离子源来原位实时分析的技术而出现。人类组织的
REIMS 指纹图谱示出与标准组织学具有90%-100%一致的高组织学特异性。
[0102] 在此所述的本发明的实施例可例如用于实时稳健的组织表征工具中或与其一起使用,该组织表征工具使用了环境电离技术,诸如REIMS技术。任选地,该工具可以是内窥镜工具。
[0103] 如将进一步变得明显,在此所述的实施例使得能够获得并且使用准确的实时谱数据,例如以便降低误诊率并且提高完全切除率。
[0104] 现在将在下文中更详细地描述各种实施例,其总体上涉及使用环境电离离子源从靶标 (其细节在本文的其他地方提供,例如体内组织)的一个或多个区域产生气溶胶、外科手术烟雾或蒸气。然后可使气溶胶、外科手术烟雾或蒸气与基质混合并且抽吸到质谱仪和/或离子迁移谱仪的真空室中。可以致使该混合物在碰撞表面上撞击,从而引起气溶胶、烟雾或蒸气通过撞击电离而被电离,这导致分析物离子的产生。然后可对所得到的分析物离子
(或来源于分析物离子的碎片或产物离子)进行质量和/或离子迁移分析,并且所得到的质
谱数据和/或离子迁移谱数据可经受多变量分析或其他数学处理以便实时确定靶标的一种
或多种特性。例如,多变量分析可以能够对目前切除的组织部分是否是癌性的进行判断。
[0105] 环境电离离子源
[0106] 在本发明的任何方法中,可使用装置从靶标(其细节在本文的其他地方提供,例如体内组织)的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气。该装置可包括环境电离离子源,该环境电离离子源的特征在于从靶标(其细节在本文的其他地方提供)产生分析物气溶胶、烟
雾或蒸气的能力,该靶标可例如是天然或未改性的靶标。相比之下,其他类型的电离离子源诸如基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)离子源需要在电离之前将基质或试剂加入样品中。
[0107] 将显而易见的是,将基质或试剂直接添加到样品中的要求可能妨碍了执行体内组织分析的能力,并且更普遍地妨碍了提供对靶材料的快速简单分析的能力。
[0108] 环境电离技术是特别有用的,因为首先它们不需要将基质或试剂加入样品中(并且因此适合于体内组织的分析)并且因为其次它们使得能够进行靶材料的快速简单分析。
虽然不存在将基质或试剂加入样品中以便进行环境电离技术的需要,但是该方法可任选地
包括在分析之前将基质或试剂加入靶标中(例如,直接加入靶标中)的步骤。可将基质或试
剂加入靶标中,例如以便溶解靶标的细胞或增强分析过程中由靶标的细胞产生的信号。
[0109] 许多不同的环境电离技术是已知的并且旨在落入本发明的范围内。作为历史记录,解吸电喷雾电离(“DESI”)是开发的第一种环境电离技术并且披露于2004年。自2004年以来,已开发了许多其他环境电离技术。这些环境电离技术的不同之处在于它们的精确电
离方法,但是它们共享从(例如,天然、未处理或未改性的)样品直接产生气相离子的相同一般能力。旨在落入本发明的范围内的不同环境电离技术可以不需要任何先前的样品制备。
因此,不同环境电离技术使得能够分析体内组织和离体组织样品两者,而没有与将基质或
试剂加入组织样品或其他靶材料中相关的时间、费用和问题。
[0110] 旨在落入本发明的范围内的环境电离技术的列表在以下表格中给出:
[0111]
[0112]
[0113]
[0114] 根据实施例,环境电离离子源可包括快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源,其中将 RF电压施加到一个或多个电极以便通过焦耳加热来产生烟雾、气溶胶或蒸气。
[0115] 然而,将了解的是,也可以使用包括上文提到的那些环境离子源的其他环境离子源。例如,根据另一个实施例,环境电离离子源可包括激光电离离子源。根据实施例,激光电离离子源可包括中IR激光消融离子源。例如,存在若干种激光,这些激光发出接近2.94μm或 
2.94μm处的辐射,该2.94μm与水吸收谱中的峰对应。根据各种实施例,环境电离离子源可包括基于2.94μm处的水的高吸收系数的具有接近2.94μm波长的激光消融离子源。根据实施
例,激光消融离子源可包括发出2.94μm处的辐射的Er:YAG激光。
[0116] 考虑了其中中红外光学参量振荡器(“OPO”)可用于产生具有长于2.94μm波长的激光消融离子源的其他实施例。例如,Er:YAG送的ZGP-OPO可用于产生具有例如6.1μm、 6.45μm或6.73μm波长的激光辐射。在一些情况下,使用具有比2.94μm更短或更长的波长的激光消融离子源可能是有利的,因为将仅消融表面层并且可引起更少热损害。根据实施例,Co:MgF2激光可用作激光消融离子源,其中激光可被调谐在1.75-2.5μm范围内。根据另一个实施例,由Nd:YAG激光器泵送的光学参量振荡器(“OPO”)系统可用于产生具有 2.9-3.1μm之间的波长的激光消融离子源。根据另一个实施例,具有10.6μm波长的CO2激光可用于产生气溶胶、烟雾或蒸气。
[0117] 根据其他实施例,环境电离离子源可包括超声消融离子源、或产生然后被抽吸为气溶胶的液体样品的混合电外科-超声消融源。超声消融离子源可包括聚焦或未聚焦超声。
[0118] 根据实施例,用于从靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气的第一装置可包括使用RF电压(诸如连续RF波形)的工具。根据其他实施例,可使用射频组织解剖系统,所述射频组织解剖系统被安排以将脉冲等离子体RF能量供应到工具。该工具可包括例如等
离子刀(PlasmaBlade)(RTM)。脉冲等离子体RF工具在低于常规电外科工具的温度(例如, 
40℃-170℃参照200℃-350℃)下操作,从而减小热损伤深度。脉冲波形和占空比可通过沿
着薄绝缘电极的一个或多个切割边缘诱导电等离子体来用于切割和凝固操作模式两者。
[0119] 根据实施例,第一装置包括手术水/盐水射流装置(诸如切除装置)、这样的装置与本文的任何其他装置的混合装置、电外科氩等离子体凝固装置、混合氩等离子体凝固以及
水/盐水射流装置。根据实施例,第一装置包括环境离子或电离源或构成其部分;或所述第一装置从靶标产生所述气溶胶、烟雾或蒸气并且含有离子和/或随后被环境离子或电离源、或其他电离源电离。
[0120] 任选地,第一装置包括选自由以下各项组成的组的装置或离子源或构成其部分:(i)快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源;任选地,第一装置包括选自由以下各项组成的组的装置或离子源或组成其部分:(i)快速蒸发电离质谱(“REIMS”)离子源;(ii)解吸电喷雾电离(“DESI”)离子源;(iii)激光解吸电离(“LDI”)离子源;(iv)热解吸离子源;(v)激光二极管热解吸(“LDTD”)离子源;(vi)解吸电流动聚焦(“DEFFI”)离子源;(vii)介质阻挡放电(“DBD”)等离子体离子源;(viii)大气固体分析探针(“ASAP”)离子源;(ix)超声辅助喷雾电离离子源;(x)简单环境超声喷雾电离(“EASI”)离子源;(xi)解吸大气压光致电离
(“DAPPI”)离子源;(xii)纸喷雾(“PS”)离子源;(xiii)射流解吸电离(“JeDI”)离子源;
(xiv)触摸喷雾(“TS”)离子源;(xv)纳米DESI离子源;(xvi)激光消融电喷雾 (“LAESI”)离子源;(xvii)实时直接分析(“DART”)离子源;(xviii)探针电喷雾电离 (“PESI”)离子源;
(xix)固体探针辅助电喷雾电离(“SPA-ESI”)离子源;(xx)无痛穿孔锥超声手术吸气器
(“CUSA”)装置;(xxi)混合CUSA-透热装置;(xxii)聚焦或未聚焦超声消融装置;(xxiii)混合聚焦或未聚焦超声消融和透热装置;(xxiv)微波共振装置;(xxv)脉冲等离子体RF解剖装置;(xxvi)氩等离子体凝固装置;(xxvi)混合脉冲等离子体RF解剖和氩等离子体凝固装置;
(xxvii)混合脉冲等离子体RF解剖和JeDI装置;(xxviii)外科手术水/盐水射流装置;
(xxix)混合电外科手术和氩等离子体凝固装置;以及(xxx)混合氩等离子体凝固和水/盐水
射流装置。
[0121] 任选地,使用所述第一装置来产生气溶胶、烟雾或蒸气的步骤包括使所述靶标与一个或多个电极接触。
[0122] 任选地,所述一个或多个电极包括以下各项中的任一种:(i)单极装置,其中所述方法任选地进一步包括提供分开的返回电极;(ii)双极装置;或(iii)多相RF装置,其中所述方法任选地进一步包括提供一个或多个分开的返回电极。
[0123] 任选地,所述一个或多个电极包括快速蒸发电离质谱(“REIMS”)装置或构成快速蒸发电离质谱(“REIMS”)装置的部分。
[0124] 任选地,所述方法进一步包括将AC或RF电压施加到所述一个或多个电极以便产生所述气溶胶、烟雾或蒸气。
[0125] 任选地,将所述AC或RF电压施加到所述一个或多个电极的步骤进一步包括将所述AC 或RF电压的一个或多个脉冲施加到所述一个或多个电极。
[0126] 任选地,将所述AC或RF电压施加到所述一个或多个电极的所述步骤引起热量分散到所述靶标中。
[0127] 任选地,使用所述第一装置来从靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气的所述步骤进一步包括用激光照射靶标。
[0128] 任选地,所述第一装置通过焦耳加热或透热疗法使来自所述靶标的靶材料直接蒸发或汽化而从靶标的一个或多个区域产生气溶胶。
[0129] 任选地,使用所述第一装置来从靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气的所述步骤进一步包括将超声能引导到所述靶标中。
[0130] 任选地,所述气溶胶包含不带电的水性液滴,任选地包含细胞材料。
[0131] 任选地,由所述第一装置产生并且形成所述气溶胶的质量或物质的至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%可以处于液滴的形式。
[0132] 第一装置可被安排并且适配成产生气溶胶,其中所述气溶胶的沙得氏平均直径(Sauter mean diameter,“SMD”,d32)在以下范围内:(i)<5μm;(ii)5-10μm;(iii)10-15μm;
(iv)15-20 μm;(v)20-25μm;或(vi)>25μm。
[0133] 气溶胶可横越具有以下范围内的雷诺数(Re)的流动区:(i)<2000;(ii)2000-2500;(iii) 2500-3000;(iv)3000-3500;(v)3500-4000;或(vi)>4000。
[0134] 基本上在产生气溶胶的时候,气溶胶可包含具有选自由以下各项组成的组的韦伯数 (Weber number,We)的液滴:(i)<50;(ii)50-100;(iii)100-150;(iv)150-200;(v)200-
250; (vi)250-300;(vii)300-350;(viii)350-400;(ix)400-450;(x)450-500;(xi)500-
550;(xii)550-600; (xiii)600-650;(xiv)650-700;(xv)700-750;(xvi)750-800;(xvii)
800-850;(xviii)850-900; (xix)900-950;(xx)950-1000;以及(xxi)>1000。
[0135] 基本上在产生气溶胶的时候,气溶胶可包含具有以下范围内的斯托克斯数(Stokes number,Sk)的液滴:(i)1-5;(ii)5-10;(iii)10-15;(iv)15-20;(v)20-25;(vi)
25-30;(vii)30-35;(viii)35-40;(ix)40-45;(x)45-50;以及(xi)>50。
[0136] 基本上在,产生气溶胶的时候,气溶胶可包含具有选自由以下各项组成的组的平均轴向速度的液滴:(i)<20m/s;(ii)20-30m/s;(iii)30-40m/s;(iv)40-50m/s;(v)50-60m/s;(vi)60-70 m/s;(vii)70-80m/s;(viii)80-90m/s;(ix)90-100m/s;(x)100-110m/s;(xi)
110-120m/s;(xii) 120-130m/s;(xiii)130-140m/s;(xiv)140-150m/s;以及(xv)>150m/s。
[0137] 任选地,所述气溶胶包含不带电的水性液滴,其可包含细胞材料。
[0138] 任选地,该方法包括使所述气溶胶、烟雾或蒸气中的至少一些或其中的分析物电离,以便产生分析物离子;其中所述分析物离子被分析以获得所述谱数据。
[0139] 任选地,该方法包括将所述气溶胶、烟雾或蒸气中的至少一些引导或抽吸到质谱仪和/ 或离子迁移谱仪的真空室中;和/或使所述谱仪的一个真空室或所述真空室内的至
少一些所述气溶胶、烟雾或蒸气、或其中的分析物电离,以便产生多个分析物离子。
[0140] 任选地,该方法包括致使所述气溶胶、烟雾或蒸气、或其中的分析物在任选地位于所述谱仪的一个真空室或该真空室内的碰撞表面上撞击,以便产生多个分析物离子。
[0141] 任选地,碰撞表面可被加热。碰撞表面可被加热到选自由以下各项组成的组的温度:(i) 约<100℃;(ii)约100℃-200℃;(iii)约200℃-300℃;(iv)约300℃-400℃;(v)约 
400℃-500℃;(vi)约500℃-600℃;(vii)约600℃-700℃;(viii)约700℃-800℃;(ix)约 
800℃-900℃;(x)约900℃-1000℃;(xi)约1000℃-1100℃;以及(xii)约>1100℃。
[0142] 任选地,该方法包括将基质加入所述气溶胶、烟雾或蒸气中;
[0143] 任选地其中所述基质选自由以下各项组成的组:(i)用于所述气溶胶、烟雾或蒸气或其中的分析物的溶剂;(ii)有机溶剂;(iii)挥发性化合物;(iv)极性分子;(v)水;(vi)一种或多种醇;(vii)甲醇;(viii)乙醇;(ix)异丙醇;(x)丙;(xi)乙腈;(xii)1-丁醇;
(xiii)四氢呋喃;(xiv)乙酸乙酯;(xv)乙二醇;(xvi)二甲亚砜;;(xviii)酮;(xiv)非极性分子; (xx)己烷;(xxi)氯仿;以及(xxii)丙醇。
[0144] 快速蒸发电离质谱(“REIMS”)技术
[0145] 图1A和图1B示出了根据本发明的实施例的REIMS技术内窥镜和勒除器安排。根据该实施例,可提供息肉切除勒除器。如图1B所示,勒除器116包括穿过管113长度运行的丝套圈。钢丝套圈被附接到操纵器,如图1A所示该操纵器可由使用者经由内窥镜组套101 操
作。操纵器允许使用者在息肉117周围闭合勒除器116。钢丝勒除器116被连接到RF电压发生器(未示出)。钢丝勒除器116用作电外科工具并且可穿过内窥镜107中的端口112 而部署,
并用于例如经由食管109而切除例如位于胃111、幽110或结肠等中的息肉117。当息肉切
除勒除器116被部署并且在息肉117周围收紧时,息肉117有效地限制或密封容纳钢丝勒除
器116的管113的开口端114。
[0146] 当将RF电压施加到钢丝勒除器116时,钢丝勒除器116用作电外科工具并且有效地切割并去除息肉117。同时,产生外科手术烟雾或气溶胶118,其基本上不能进入容纳钢丝勒除器116的管材113的端部114。容纳钢丝勒除器116的管113另外地配备有窗孔或使外科手
术烟雾或气溶胶118能够抽吸到容纳钢丝勒除器116的管113中的一个或多个抽吸端口 
115。外科手术烟雾或气溶胶118可通过连接到管的泵(未示出)朝向管吸入,并且烟雾吸入
的方向可如箭头119所展示,即外科手术烟雾或气溶胶118可朝向管113吸入并穿过窗孔或
一个或多个抽吸端口115。然后外科手术烟雾或气溶胶118沿着管113的长度抽吸,并且如图
1A所示,通过连接器106传递到质谱仪和/或离子迁移谱仪102的真空室,于是外科手术烟雾或气溶胶118例如在撞击碰撞表面之后被电离。
[0147] 然后对所得到的分析物离子进行质量和/或离子迁移分析,并且可将关于正被切除的组织的实时信息提供给使用者(其可例如是外科医生或专科护士)。除了远离胃111或
结肠的衬壁切割息肉117以外,勒除器116还可用于将息肉117夹住不放以使得息肉117可从
胃111 或结肠中去除,任选地对其进行分析并且然后处置。
[0148] 内窥镜可发出光108并且包括照相机使得使用者可适当地操纵设备。
[0149] 根据其他实施例,电外科工具和相关的内窥镜可用于任何其他体腔和器官(其细节在本文的其他地方提供,包括肺、鼻和尿道)中。
[0150] 勒除器116可包括单极装置,并且用作返回电极的相对大的衬垫可放置在患者下方以使得电流从勒除器电极流过患者到达返回电极。可替代地,勒除器电极可包括双极装
置使得电流不会流过患者的身体。双极装置可例如用于非常敏感的手术(诸如脑外科手术)
中,其中明显不希望电流流过周围组织。
[0151] 还考虑了其中电外科工具可包括多相或3相装置并且可包括例如三个或更多个分开的电极或探针的其他实施例。
[0152] 通过电外科工具抽吸的外科手术烟雾、气溶胶或蒸气118可经由液体分离器或液阱(未示出)来传递,以便去除或减少向前传输到质谱仪和/或离子迁移谱仪102的液体的
量。
[0153] 可将基质加入烟雾、气溶胶或蒸气中或与其混合,任选地在烟雾、气溶胶或蒸气在碰撞表面上撞击之前。基质可溶解、稀释烟雾、气溶胶或蒸气内的至少一些分析物,或与其形成团簇。这可辅助分析物的电离。
[0154] 基质可选自由以下各项组成的组:(i)用于所述气溶胶、烟雾或蒸气或其中的分析物的溶剂;(ii)有机溶剂;(iii)挥发性化合物;(iv)极性分子;(v)水;(vi)一种或多种醇;
(vii) 甲醇;(viii)乙醇;(ix)异丙醇;(x)丙酮;(xi)乙腈;(xii)1-丁醇;(xiii)四氢呋喃;
(xiv)乙酸乙酯;(xv)乙二醇;(xvi)二甲亚砜;醛;(xviii)酮;(xiv)非极性分子;(xx)己烷;
(xxi) 氯仿;以及(xxii)1-丙醇。异丙醇是例如在脂质和甘油三酯的分析中特别受关注的。
[0155] 基质和/或气溶胶、烟雾或蒸气可与一种或多种添加剂掺杂,以例如增强用基质对分析物的溶解或稀释,或用于增强气溶胶、烟雾或蒸气内的分析物的电离。
[0156] 掺杂化合物可以是酸性或性添加剂,例如像甲酸或二乙胺。
[0157] 基质和/或掺杂化合物可致使气溶胶、烟雾或蒸气中的分析物的衍生化。例如,基质和/ 或掺杂化合物可致使分析物中的胆固醇或类固醇的衍生化。这可使得分析物更易于
电离。
[0158] 基质的加入是特别有利的,因为稀释待分析的样品、将分析物溶解在基质中或形成所述团簇可减少分析物分子之间的分子间键合。这增强了分析物的电离。例如,如果分析物然后例如通过与碰撞表面碰撞而原子化,则分析物将碎片化成更小的液滴或团簇,其中
任何给定的液滴或团簇可能含有比如果基质不存在的情况下更少的分析物分子。当每个液
滴中的基质蒸发时,这进而引起更有效地产生离子。
[0159] 图1A还更详细地示出了其中内窥镜息肉切除勒除器被装备有另外的T形管连接器106 以便在组织蒸发点与质谱仪和/或离子迁移谱仪102的大气入口103之间确立转移线的
实施例。大气入口103可包括接地104。
[0160] 最初优化REIMS内窥镜设置,并且使用猪胃模型来评价其再现性。在猪胃粘液膜内创建人工息肉117,并且使用如图1B所示的息肉切除勒除器116来进行切除。这种装配允许
精确模拟标准的内窥镜切除。如可从图1B中所见,因为在切除过程中息肉117完全阻塞勒除器116的塑料护套管113的开口或工具部署开口114,所以由切除产生的气溶胶118被抽吸穿
过提供在勒除器116的塑料护套113上的窗孔115。
[0161] 在REIMS勒除器的塑料护套113上提供窗孔115并且这些窗孔远离勒除器的工具部署开口114是特别有利的,因为窗孔或抽吸端口115在工具部署开口114被至少部分或完全
阻塞时允许抽吸外科手术烟雾、气溶胶或蒸气118。
[0162] 然后通过窗孔或抽吸端口115进入容纳REIMS勒除器116的管113的气溶胶颗粒118 可通过PTFE管105转移到质谱仪和/或离子迁移谱仪102,该PTFE管可连接到勒除器的一个
端口。勒除器116可连接到REIMS内窥镜107的近端。管可直接连接到质谱仪和/或离子迁移
谱仪102的入口毛细管或离子取样孔口。将理解的是,质谱仪和/或离子迁移谱仪在蒸发点
远侧。
[0163] 可使用由标准医学空气驱动的文丘里管泵来促进气溶胶的抽吸。
[0164] 质谱仪和/或离子迁移谱仪可包括大气接口,该大气接口包括上文提到的碰撞表面,如将关于图2所述。
[0165] 图2示出了电外科工具与质谱仪和/或离子迁移谱仪之间的接口的实施例的示意图。该仪器可包括离子分析仪207,该离子分析仪具有入口206、真空区208、所述碰撞表面
209 以及安排在真空区208内的离子光学器件212(诸如梯阶波(RTM)离子导向器)。该仪器
还可包括样品转移管202和基质引入导管203。样品转移管202具有用于接收来自所研究样
品的烟雾、气溶胶或蒸气样品201(其可对应于关于图1所述的卷流118)的入口和连接到离
子分析仪207的入口206的出口。基质引入导管203具有用于接收基质化合物的入口和与样
品转移管202相交以便允许基质204在样品转移管202中与气溶胶样品201相互混合的出口。
T型接合部件可提供在管202、203与206之间的接合处。管202、203和206可拆卸地插入到T型接合中。
[0166] 现在将描述操作图2的装置的方法。可使样品(诸如生物组织)经受REIMS技术。例如,可使用透热装置从样品中蒸发生物组织以便形成气溶胶,例如如上文关于图1所述的。
然后将气溶胶颗粒201引入到样品转移管202的入口中。将基质化合物204引入到基质引入
导管203的入口中。经由由处于比管202、203的入口更低的压力下的真空室208引起的压差,将气溶胶颗粒201和基质化合物204朝向离子分析仪207的入口206抽吸。气溶胶颗粒 201可
在样品转移管202与基质引入导管203相交的区域中并且在该区域下游遇到基质化合物204
的分子。气溶胶颗粒201与基质204相互混合,以便形成含有基质分子205的气溶胶颗粒,所述气溶胶颗粒中存在气溶胶样品201和基质化合物204的两种分子成分。基质分子 204可以
与气溶胶样品201的分子成分相比过量。
[0167] 颗粒205可离开样品转移管202并进入离子分析仪207的入口206。然后颗粒205进入减压区208,并且由于从样品转移管202中进入真空区208的气体的绝热膨胀并且由于相
关的自由射流形成而获得基本上线性的速度。加速的颗粒205可在碰撞表面209上撞击,其
中撞击事件使颗粒205碎片化,从而导致最终形成气溶胶样品201的分子成分的气相离子
210 并且形成基质分子211。碰撞表面209可被控制并且维持在大大高于环境温度的温度
下。
[0168] 基质204包括用于分析物201的溶剂,使得分析物201被基质204溶解,从而消除分析物分子201之间的分子间键合。因此,当溶解的分析物205接着与碰撞表面209碰撞时,溶解的分析物205将碎片化成液滴,并且任何给定的液滴可能含有比如果基质不存在的情况
下更少的分析物分子。当每个液滴中的基质蒸发时,这进而引起更有效地产生分析物离子
210。基质可包括有机溶剂和/或挥发性化合物。基质可包括极性分子、水、一种或多种醇、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或乙腈。异丙醇是特别受关注的。
[0169] 基质分子211可自由扩散到真空中。相比之下,气溶胶样品201的分子成分的气相离子 210可由离子光学器件212转移到离子分析仪207的分析区(未示出)。离子210可通过
将电压施加到离子光学器件212而导向到分析区。
[0170] 光学器件2012可以是梯阶波(RTM)离子导向器。碰撞表面可沿着并且相邻梯阶波 (RTM)离子导向器的大开口的中心轴线定位。如本领域技术人员将理解的是,梯阶波 (RTM)离子导向器包括两个联合的离子隧道离子导向器。每个离子导向器包括多个环或其他电
极,其中离子穿过由环或其他电极提供的中心孔。离子连同可能存在的任何中性物质进入
第一个离子导向器,并且行进穿过第一离子导向器。然后将离子正交引导到第二个离子导
向器中并且传输穿过其中。将瞬态DC电压或电势施加到电极以驱动离子穿过它们。梯阶波 (RTM)离子导向器基于叠加环离子导向器技术,并且被设计成用于使离子从来源至质量和 
/或离子迁移分析仪的传输最大化。该装置允许有效去除中性污染物,因为中性物质不被正交引导到第二离子导向器中,从而提供总体信噪比增强。该设计使得能够有效捕获进入第
一较低位的扩散离子,然后扩散离子云可集中到较高的离子导向器中以用于转移到离子
分析仪。然后通过离子分析仪来分析离子,该离子分析仪可包括质谱仪和/或离子迁移谱
仪、或两者的组合。作为分析的结果,可获得关于样品201的化学信息。
[0171] 从猪胃模型中记录的在600-1000的m/z范围内的REIMS谱主要特征在于磷脂,对于先前REIMS实验中的所有哺乳动物组织类型已观察到这些磷脂。
[0172] 在离体人类样品(包括胃腺癌、健康胃粘液膜和健康胃粘液膜下层)上对REIMS内窥镜设置进行测试。从三位单独的患者获得样品,所有这三位患者提供书面知情同意书。也对人类进行体内测试。
[0173] 可向电外科工具的使用者提供实时和/或滞后信息,该信息可包括谱信息和/或组织分类信息。还可提供反馈装置和/或警报和/或警告,以便向电外科工具的使用者提供来
自不希望的靶区域或范围的分析物正被分析仪分析或电外科工具正在不希望的靶区域或
范围中操作和/或位于不希望的靶区域或范围的反馈和/或警报和/或警告。
[0174] 在来自不希望的靶区域或范围的分析物正被分析仪分析和/或电外科工具在不希望的靶区域或范围中操作和/或位于不希望的靶区域或范围的情况下,可减少和/或停止对
电外科工具提供的电力。
[0175] 液阱或分离器可提供在电外科探针与分析仪之间,该液阱或分离器捕获或废弃由探针抽吸的不希望的液体,同时可允许气溶胶或外科手术烟雾本身相对不受抑制地传递到
质谱仪和 /或离子迁移谱仪。这在不影响气溶胶或外科手术烟雾测量的情况下防止不希望
的液体到达分析仪。液阱或分离器可被安排成用于捕获液体,可使用液体收集器以用于后
面的处置。
[0176] 图3展示了本发明的另一个REIMS实施例,其中两极钳301与患者303的体内组织302 形成接触。在图3示出的实例中,两极钳301可在对患者脑部进行外科手术期间与患者
303 的脑组织302形成接触。可将来自RF电压发生器304的RF电压施加到两极钳301,这引起对组织302的局部焦耳或透热加热。因此,产生烟雾、气溶胶或蒸气305。然后烟雾、气溶胶或蒸气305可被捕获或以另外的方式抽吸穿过两极钳301的冲洗端口。因此,两极钳 301的冲
洗端口再用作抽吸端口。然后烟雾、气溶胶或蒸气305可从两极钳301的冲洗(抽吸)端口传
递到管306(例如,1/8”或3.2mm直径的Teflon(RTM)管)。管306被安排以将烟雾、气溶胶或蒸气305转移到质谱仪和/或离子迁移谱仪308的大气压接口307。
[0177] 虽然已描述了其中分析体内组织的实施例,但是本发明延伸到分析离体或体外标本的实施例。同样,本发明延伸到体内、离体或体外分析非组织标本的实施例。例如,可分析体液样品或粪便样品。
[0178] 虽然已描述了其中REIMS用于产生烟雾、气溶胶或蒸气用于分析的实施例,但是也可使用其他环境电离技术,例如像解吸电喷雾电离(“DESI”)。
[0179] 解吸电喷雾电离(“DESI”)
[0180] 解吸电喷雾电离(“DESI”)也被发现是用于实时快速而直接分析生物材料(诸如组织) 的特别有用和方便的方法。DESI技术允许直接快速分析表面而不需要先前样品制备。
现在将参考图4更详细地描述该技术。
[0181] 如图4所示,DESI技术是涉及将(初级)带电液滴401的喷雾引导到靶标上的环境电离方法。电喷雾薄雾由喷雾器400气动地引导在靶标处,在所述靶标处随后飞溅的(二级) 
液滴405携带解吸的电离分析物(例如解吸的脂质离子)。喷雾器400可配备有溶剂406、气体
407(诸如氮气)和来自高压源408的电压。电离之后,离子行进穿过空气进入质谱仪和/或离子迁移谱仪或者质量分析仪和/或离子迁移分析仪(未示出)的大气压接口409,这例如通过
转移毛细管410来实现。转移毛细管410可被例如加热到高达500℃的温度。
[0182] 离子可通过关于图2所述的方法或通过其他方法来分析。DESI技术例如允许直接分析处于其天然状态的生物化合物(诸如脂质、代谢物和肽)而不需要任何预先的样品制
备。
[0183] 本发明的一般方法
[0184] 本发明提供一种使用质谱和/或离子迁移谱分析的方法,该方法包括:
[0185] a)使用第一装置以从生物材料的第一靶标的一个或多个区域产生气溶胶、烟雾或蒸气;并且
[0186] b)质量分析和/或离子迁移分析所述气溶胶、烟雾或蒸气或从其来源的离子以便获得第一谱数据,
[0187] 其中所述生物材料是人类受试者、非人类动物受试者、或者来源于所述人类或非人类动物受试者的标本。
[0188] 在一个方面,该方法可以是分析疾病、患病组织和/或疾病的生物标志物的方法。因此,该方法可任选地包括分析疾病、患病组织和/或疾病的生物标志物的步骤。
[0189] 该方法可以是以下各项的方法,或获得关于以下各项的信息的方法,
[0190] (i)诊断疾病;(ii)监测疾病的进展或发展;(iii)疾病预后;
[0191] (iv)预测疾病响应于治疗的可能性;(v)监测疾病对治疗的响应;(vi)分层受试者;(vii) 确定患病组织的分布;和/或(viii)确定患病与健康组织之间的边限。
[0192] 因此,该方法可任选地包括以下步骤
[0193] (i)诊断疾病;(ii)监测疾病的进展或发展;(iii)疾病预后;
[0194] (iv)预测疾病响应于治疗的可能性;(v)监测疾病对治疗的响应;(vi)分层受试者;(vii) 确定患病组织的分布;和/或(viii)确定患病与健康组织之间的边限。
[0195] 适合的疾病的细节在本文的其他地方提供。
[0196] 在一个方面,该方法可以是分析微生物、微生物相互作用、微生物生物标志物和/或微生物组的方法。因此,该方法可任选地包括分析微生物、微生物相互作用、微生物生物标志物和/或微生物组的步骤。
[0197] 在一个方面,该方法可以是分析细胞的基因型和/或表型的方法。因此,该方法可任选地包括分析细胞的基因型和/或表型的步骤。
[0198] 在一个方面,该方法可以是治疗方法。因此,该方法可任选地包括将治疗有效量的治疗剂给予至对其有需要的受试者的步骤。
[0199] 在一个方面,该方法可以是外科手术方法。因此,该方法可任选地包括在任选地分析的方法之前、期间和/或之后切除组织的外科手术步骤。该方法可任选地是外科手术方法,包括使用该方法以确定哪个组织要切除,或包括切除如由同过方法被鉴定、表征和/或证实为患病的组织。
[0200] 在一个方面,该方法可以是分析粪便和/或体液标本的方法。因此,该方法可任选地包括分析粪便和/或体液标本的步骤。
[0201] 在一个方面,该方法可以是分析化合物的方法。因此,该方法可任选地包括分析化合物和/或化合物的生物标志物的步骤。
[0202] 任选地,该方法可包括在此披露的方面中的2个或更多个方面,例如3个或更多个、4 个或更多个、5个或更多个方面等。例如,该方法可任选地包括分析粪便和/或体液标本的步骤,其中微生物标志物和/或化合物标志物被分析。
[0203] 这些方法中的任一者的可选特征在下文中进行讨论。因此,除非另外说明,否则对“一种方法”或“该方法”的任何提及旨在是对在此列出的本发明的任何方法的提及。明确的意图是,这些特征中的任一者能以任何组合存在于这些方法中的任一者中。
[0204] 靶标及其分析
[0205] 该方法可对“靶标”进行,该靶标可任选地是生物材料,例如受试者或来源于受试者的标本。
[0206] “受试者”可以是人类或非人类动物。受试者可以是活的或死的。如果该方法在活的受试者上进行,则其可被称为体内方法。如果该方法在标本上进行,则其可被称为体外或离体方法。
[0207] 任选地,动物可以是任选地例如选自以下各项的哺乳动物:任何家畜、家养动物或实验室动物,诸如小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、山羊、猪、猫、狗、绵羊、兔、奶、骆驼、驴、水牛、羔羊、鸡、鸭、鹅和/或猴。任选地,其可以是昆虫、或鱼,例如苍蝇或蠕虫。因此,考虑了本发明的方法的任何兽医学应用。
[0208] 该方法可任选地对体内靶标(即对活的受试者)进行。例如,该方法可通过使用热消融方法来进行。
[0209] 可替代地或另外地,该方法可任选地对死的受试者进行,例如作为尸检或验尸的一部分。
[0210] 可替代地或另外地,该方法可任选地对离体或体外靶标(例如,对标本)进行。标本可任选地是所提供的标本,即先前从受试者获得或去除的标本。任选地,该方法可包括从受试者获得标本的步骤。
[0211] 因此,该方法可任选地对标本进行,该标本可任选地例如选自外科手术切除标本、活检标本、异种移植物标本、棉签、涂片、体液标本和/或粪便标本。
[0212] 切除是外科手术去除组织的一部分或全部。
[0213] 活检标本可任选地例如通过使用针来取出包含细胞的组织和/或流体;通过使用内窥镜;和/或在外科手术期间而获得。活检物可任选地是切开的、切除的、或从外科手术切除中取回的。活检标本包含细胞,并且可任选地是例如包括患病和/或未患病组织或由其组成的组织标本。
[0214] “异种移植物标本”是来源于异种移植物的组织标本。“异种移植物”是指起源于第一受试者并且插入第二受试者中的细胞材料,诸如组织。任选地,异种移植物可包括肿瘤细胞或由其组成。例如,从人类肿瘤获得的细胞或组织可被异种移植到宿主动物中。
[0215] 任选地,可体内分析异种移植物,在该情况下靶标可被称为包含异种移植物的受试者。因此,靶标可任选地是包含异种移植物的受试者。任选地,标本可来源于异种移植物。
[0216] “棉签”旨在理解为包括“标准医学棉签”,即设计用于对生物样品诸如粘膜进行取样的棉签。例如,术语“标准医学棉签”应当理解为涵盖“棉棒”(英国)或“棉签”(美国),即在管的一端或两端周围缠绕一小团棉花。该管可由塑料、卷纸或木材制成。
[0217] 棉签可任选地例如包含组织或其他细胞材料,例如粘膜样品。
[0218] 涂片可例如任选地是已被涂抹在固体支撑物上(例如两个载玻片之间)的标本。
[0219] 体液可例如任选地选自血液、血浆、血清、痰液、灌洗液、脓、尿液、唾液、黏痰、呕吐物、粪便、羊水脑脊液、胸膜液、精液、唾液、阴道分泌物、间质液和/或淋巴液。任选地,该体液可被干燥、用棉签收集和/或分配在吸附载体(例如过滤器或纸)上。任选地,该体液可为沉淀物。沉淀物可例如通过在适合的力下对体液进行离心并且持续适合的时间以使任何细胞、大结构和/或大分子沉积以形成沉淀物来制备。然后该体液的其余部分(即上清液)可例如通过经由抽吸将其倒出而丢弃。
[0220] 任选地,标本可被切片和/或按顺序解离,例如通过机械方式和/或酶促方式(例如使用胰蛋白酶),以获得标本的不同层和/或从标本的不同层得到细胞。例如,如果标本是组织(例如异种移植物组织),则这可以是受关注的。然后可分析样品的不同层或来源于不同
层的细胞。在细胞生长和/或维持期间,组织的不同层可已被暴露于不同的环境条件,和/或暴露于不同浓度的物质,因为物质可能不以相同速率穿透各个层。因此,该方法可任选地用于分析标本的一个或多个不同层或来源于一个或多个不同层的细胞。
[0221] 该方法可任选地涉及一种或多种不同靶标的分析。任选地,可分析来自不同受试者和/ 或来自受试者内的不同位置的2种或更多种靶标。任选地,靶标可处于或来自2个或
更多个不同位置,例如标本可处于或来自受试者体内和/或受试者的2个或更多个位置。例
如,在乳糜泻的情况下,建议从胃肠道的第二和第三十二指肠部分中的每一个获得越来越
多的活检标本,并且此种策略还可适用于在此所讨论的任何其他疾病。
[0222] 任选地,靶标可处于或来自已知或怀疑是健康的一个或多个位置;以及已知或怀疑是患病的一个或多个位置。在癌症的情况下,例如,靶标可任选地处于或来自已知或怀疑是健康的至少1个位置;已知或怀疑是肿瘤边限的至少1个位置;已知或怀疑是肿瘤基质的
至少1 个位置;和/或已知或怀疑是赘生性肿瘤的至少1个位置。
[0223] 任选地,该方法可涉及靶标的2个或更多个位置的分析。任选地,可分析靶标的不同位置,例如可对一系列点进行取样,任选地在具有或不具有出于成像目的的空间编码
息的情况下。
[0224] 可任选地在术中进行该分析,即在外科手术正在进行中时。因此,该分析可任选地用于提供对靶标的实时分析。该分析可任选地用于鉴定疾病边限。可任选地例如通过分析特定细胞类型(例如,靶区域中的患病、癌性和/或坏死的细胞)的浓度来分析疾病边限。可任选地在体内(例如,在外科手术期间)进行该分析。这可任选地涉及使用例如热消融外科
手术方法,例如REIMS技术,诸如智能刀技术。例如,可在体内分析其上正进行外科手术的组织,并且分析结果可用于通知、影响或确定进一步的外科手术步骤。
[0225] 外科手术可任选地是关于本文提到的任何疾病的外科手术,诸如癌症外科手术、神经外科手术等。外科手术可任选地是用腹腔镜检查的和/或用内窥镜检查的。
[0226] 可任选地在体外或离体进行该分析。这可任选地例如与外科手术并行。例如,可在外科手术期间获得标本,诸如活检物。然后这样的所提供的标本可被离体分析,并且分析结果可用于通知、影响或确定进一步的外科手术步骤。
[0227] 该方法可任选地在天然的靶标上进行。“天然”意指靶标在进行本发明的方法之前尚未被改性。具体地说,靶标可以是天然的,因为存在于靶标中的组织或细胞在进行本发明的方法之前没有受到裂解或萃取(例如,脂质萃取)的步骤。因此,靶标可以是天然的,因为它包含或主要由完整的细胞组成。因此,天然意指靶标尚未被化学或物理改性,并且因此是在化学和物理上天然的。任选地,靶标可以是化学上天然的,即它可以是化学上未改性的,意指它尚未与化学试剂接触以改变其化学性质。使靶标与基质接触是化学改性的实例。
[0228] 任选地,靶标可以是物理上天然的,即它可以是物理上未改性的,意指它尚未被物理改性。冷冻、解冻和/或切片是物理改性的实例。技术人员将了解,虽然物理行为(诸如冷冻) 可能影响标本的化学性质,但是出于本发明的目的,此类行为不被认为是化学改性。
[0229] 因此,任选地靶标可以是化学上天然的,但不是物理上天然的,例如因为它已被冷冻和 /或切片。
[0230] 任选地,如关于标本制备所讨论,靶标可被冷冻、先冷冻然后解冻、固定、切片和/或以另外的方式制备。任选地,该方法可在尚未经历特别用于质谱和/或离子迁移谱分析的目的的制备步骤的靶标上进行。
[0231] 在从靶标产生烟雾、气溶胶或蒸气之前,靶标可以尚未与溶剂或除了水以外的溶剂接触。
[0232] 另外地或可替代地,在从靶标产生烟雾、气溶胶或蒸气之前,靶标可以不与基质接触。例如,靶标可以不与MALDI基质或用于辅助靶标中的材料电离的其他基质接触。MALDI 基质可例如包括小分子有机酸或由其组成,诸如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和/或2,5- 二羟基苯甲酸(DHB)。
[0233] 该方法可任选地在已制备用于特定的质谱和/或离子迁移谱分析;和/或已制备用于在本文的其他地方提到的任何分析的靶标上进行。
[0234] 标本制备(用于本发明的任何方法和/或在此披露的任何分析方法)可任选地涉及以下内容中的一种或多种。
[0235] 标本或其部分可任选地沉积在固体表面诸如玻璃或塑料载玻片上。
[0236] 标本可任选地化学固定或通过冷冻切片程序固定,例如以便保护组织不受降解并且维持细胞和亚细胞组分(诸如细胞器,例如细胞核、内质网和/或线粒体)的结构。固定剂可例如是10%中性缓冲的福尔马林。标本可任选地例如使用环树脂丙烯酸树脂来处理
以允许或促进切成切片。样品可任选地例如包埋在石蜡中。标本可任选地切成例如1μm至
200nm 的切片。例如,标本可任选地为约5μm厚(用于光学显微术),或为约80-100nm厚(用于电子显微术)。任选地,标本可切成至少1、3、5、7、9、10、12、14、16、18、20、22、 24或25μm并且不大于100、90、80、70、60、50、40、35、30、28或26μm的切片,例如5-25μm的切片。
[0237] 冷冻切片可任选地例如通过冷冻并且切片标本来制备。在冷冻之前,标本可任选地例如如上所述进行包埋。包埋介质在冷冻期间帮助将热量传导远离标本,在储存期间帮
助保护组织免于干燥,并且在切片期间支撑组织。
[0238] 冷冻可任选地例如通过使标本与适合的冷却介质接触来进行,该冷却介质诸如干、液氮或已在干冰或液氮中冷却的试剂,例如异戊烷(2-甲基丁烷)。冷冻标本可任选地储存在例如约-80摄氏度与-4摄氏度之间,例如-70摄氏度或-20摄氏度。
[0239] 标本或其切片可例如用苏木精和伊红染色(H&E染色)。苏木精(碱性染料)由于对细胞核中核酸的亲和力而使细胞核染成蓝色;伊红(酸性染料)使细胞质染成粉红色。
[0240] 任何方法可任选地包括自动取样,该自动取样可任选地使用REIMS装置来进行。任何方法可任选地包括使用一次性取样吸头
[0241] 生物标志物
[0242] 该方法可任选地涉及一种或多种生物标志物的分析。生物标志物可以是例如细胞类型、疾病状况、微生物、化合物和/或生物过程的客观可定量的特征。
[0243] 有时在此明确地使用术语“生物标志物”,但是还应当理解在此提到的任何分析可任选地是生物标志物的分析。因此,例如对分析“微生物”的任何提及应当任选地理解为“分析微生物生物标志物”;对分析“胆汁”的任何提及应当任选地理解为“分析胆汁生物标志物”;对分析“化合物”的任何引用应当任选地理解为“分析所述化合物的生物标志物”等。
[0244] 生物标志物可任选地是谱的生物标志物。在此使用术语“(质)谱的生物标志物”是指作为细胞类型、疾病状况、微生物、化合物和/或生物过程的特征的谱数据,但是为了简单,谱的生物标志物可简单地称为“生物标志物”。
[0245] “细胞类型的特征”意指生物标志物可任选地用于分析,例如检测、鉴定和/或表征所述细胞类型。任选地,生物标志物可用于对以下各项进行区分:起源于不同组织的细胞之间;基因型和/或表型不同的细胞类型之间;动物细胞与微生物细胞之间;正常与异常细胞之间;野生型与突变型细胞之间;和/或患病与健康细胞之间。
[0246] “疾病状况的特征”意指生物标志物可任选地用于分析靶标的疾病状况。任选地,生物标志物可用于对健康与患病细胞之间进行区分;和/或分析疾病的严重性、等级和/或时期。
[0247] “微生物的特征”意指生物标志物可任选地用于分析,例如检测、鉴定和/或表征所述微生物。如在本文的其他地方所讨论,鉴定可以是在任何层次上,例如在分类学层次上。允许将微生物鉴定为属于特定分类学层次的生物标志物可被称为“分类学标志物”或“分类学生物标志物”。因此,分类学标志物可特定于界、门、纲、目、科、属、种和/或株。
[0248] “化合物的特征”意指生物标志物可任选地用于分析,例如检测、鉴定和/或表征所述化合物。
[0249] “生物过程的特征”意指生物标志物可任选地用于分析生物过程。任选地,生物标志物可用于分析生物过程的开始、进展、速度、效率、特异性和/或结束。
[0250] 不同的细胞类型、疾病状态、化合物、微生物、生物过程等可通过可充当生物标志物的一种或多种化合物的存在或不存在和/或相对丰度来表征。在此对作为特定化合物或化合物类别的生物标志物的任何提及应当任选地理解为所述化合物或化合物类别的谱数
据。
[0251] 例如,对“C24:1硫苷脂(C48H91NO11S)”生物标志物的提及应当理解为对与C24:1 硫苷脂(C48H91NO11S)对应的谱数据的提及,该谱数据可例如是对应于m/z为约888.6 的信号;而对“糖基化神经酰胺”生物标志物的提及应当理解为对与糖基化神经酰胺对应的谱数据的提及,该谱数据可例如是对应于m/z为842、844或846的信号。
[0252] 如上所解释,生物标志物可指示细胞类型、疾病状况、微生物、化合物和/或生物过程。因此,指示癌症的生物标志物可被称为“癌症生物标志物”;指示绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物标志物可被称为“铜绿假单胞菌生物标志物”等。
[0253] 任选地,谱的生物标志物可被鉴定为特定化合物或化合物类别的谱数据。因此,对应于特定质量、电荷状态、m/z和/或离子迁移率的信号(例如,由于横截面形状或面积引起)可任选地被鉴定为指示特定化合物或化合物类别的存在。
[0254] 任选地,谱信号可充当生物标志物,即使尚未做出关于特定化合物或化合物类别导致所述信号的确定。任选地,谱信号的图案可充当生物标志物,即使尚未做出关于特定化合物或化合物类别导致所述图案中的一个或多个信号或以图案中的任何信号的确定。
[0255] 在此披露的工作已导致对一系列生物标志物的鉴定以及允许对其他生物标志物的鉴定。任选地,生物标志物可选自在此披露的任何生物标志物,包括在任何实例和/或表格(具体地表1-19)中。任选地,生物标志物可以是在此提到的任何生物标志物的取代或未
取代形式的生物标志物;和或是在此提到的任何生物标志物的醚、酯、磷酸化和/或糖基化形式或其他衍生物的生物标志物。
[0256] 任选地,生物标志物可以是以下各项的生物标志物:脂质;蛋白质;水化合物;DNA 分子;RNA分子;多肽,诸如核糖体肽或非核糖体肽;寡肽;脂蛋白;脂肽;氨基酸;和/ 或化学化合物,任选地有机化学分子或无机化学分子。
[0257] 生物标志物可任选地是特定化合物的明显存在或不存在,其本身可任选地表现为对应于特定质量、电荷状态、m/z和/或离子迁移率的谱信号的存在或不存在。
[0258] 生物标志物可任选地是特定生物分子或化合物的相对丰度,其本身可任选地表现为对应于特定质量、电荷状态、m/z和/或离子迁移率的谱信号的相对强度。
[0259] 生物标志物可任选地是越来越多种化合物的相对丰度,其本身可任选地表现为对应于两种或更多种特定质量、电荷状态、m/z和/或离子迁移率的两种或更多种谱信号的相
对强度。
[0260] 因此,生物标志物可任选地是一种或多种化合物(例如,代谢物、脂肽和/或脂质物质) 的增加的水平或降低的水平,其本身可任选地表现为对应于两种或更多种特定质量、电荷状态、m/z和/或离子迁移率的两种或更多种谱信号的强度的增加和/或降低。
[0261] 各种化合物的存在、不存在和相对丰度可被称为分子“指纹图谱”或“分布图”。细胞脂质的总体性可被称为脂质组学指纹图谱/分布图,而由细胞产生的代谢物的总体性可被称为代谢组学指纹图谱/分布图。
[0262] 因此,生物标志物可以是分子指纹图谱,例如脂质指纹和/或代谢组学指纹图谱,更具体地例如(i)脂质组学分布图;(ii)脂肪酸分布图;(iii)磷脂分布图;(iv)磷脂酸(PA)分布图;(v)磷脂酰乙醇胺(PE)分布图;(vi)磷脂酰甘油(PG)分布图;(vii)磷脂酰丝氨酸
(PS)分布图;或(viii)磷脂酰肌醇(PI)分布图。
[0263] 以举例的方式,磷脂酰甘油可存在于几乎所有细菌类型中,但是它能以不同的相对量存在于不同的细菌中。磷脂酰甘油在大多数动物组织中能以仅1%-2%的水平存在。因此,它可以是动物标本中细菌的生物标志物和/或特定细菌类型的生物标志物。
[0264] 生物标志物可任选地是直接生物标志物或间接生物标志物。“直接”生物标志物意指谱数据直接由生物标志物产生。例如,如果特定化合物具有特殊谱信号或信号图案,则从样品中获得这种信号或信号图案提供关于所述化合物存在的直接信息。这可以是例如针对由细胞或微生物大量产生的代谢物的情况。任选地,在这样一个实例中,来自化合物的谱数据可替代地或另外地充当产生这种化合物的细胞或微生物的间接生物标志物。
[0265] “间接”生物标志物意指谱数据由指示特定化合物、生物过程和/或微生物或细胞类型的一种或多种生物标志物产生。因此,间接生物标志物是由提供关于不同分子的信息
的一种或多种分子产生的谱数据。例如,分子指纹图谱(诸如脂质指纹图谱)可指示特定蛋
白质(例如受体);或特定细胞类型或微生物类型的表达。
[0266] 脂质生物标志物可任选地选自例如脂肪酸、甘油脂、固醇脂、鞘脂、孕烯醇酮脂、糖脂和/或磷脂。各种脂质的简要概述在下文中提供,但是必须了解任何特定脂质可落入在此提到的多于一个组中。
[0267] 脂肪酸是脂肪族一元羧酸。脂肪酸可任选地具有碳链,该碳链包含精确地或至少4、6、 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、38或40个碳。它可任选地是单不饱和的、多不饱和的或饱和的。它可任选地是类花生酸。它可例如是油酸、棕榈酸、花生四烯酸、前列腺素、环前列腺素、凝血噁烷、白三烯或环氧二十碳三烯酸。
[0268] 甘油脂可任选地选自例如单酰甘油、二酰甘油和/或三酰甘油。
[0269] 固醇可任选地选自游离固醇、酰化固醇(固醇酯)、烷基化固醇(甾基烷基醚)、磺化固醇(固醇硫酸盐)、连接到糖苷部分的固醇(甾基糖苷)和/或连接到糖苷部分的酰化固醇(酰化固醇糖苷)。
[0270] 固醇可任选地具有精确地或至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 10、21、22、23、24、25、26、27、28、29、20、35或40个碳原子的脂肪族侧链。脂肪族侧链中的碳原子数可通过字母C后接数字来表达,例如对于胆固醇为C27。它可例如选自胆固醇、胆固醇硫酸
盐、麦固醇、羊毛固醇、甲藻甾醇(4a,23,24-三甲基-5a-胆甾-22E-烯-3b- 醇)、氧化甾醇和/或任何其衍生物。
[0271] 磷脂可包含两个脂肪酸、甘油单元、磷酸基团和极性分子。磷脂可任选地包含甘油的酯、醚和/或其他O-衍生物。磷脂可任选地选自例如磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油(心磷脂)、酰基磷脂酰甘油(1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸基-(3'-酰基)-1'-sn-甘油)和/或缩醛磷脂。
[0272] 磷脂酰甘油脂质可任选地选自磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)和/或磷脂酰丝氨酸(PS)。
[0273] 鞘脂是含有鞘氨醇类的脂质。它可任选地选自例如神经酰胺,即N-酰化鞘氨醇类;鞘磷脂,即神经酰胺-1-磷酸胆碱;磷酸乙醇胺二氢神经酰胺和/或鞘糖脂,即含有鞘氨醇类和一个或多个糖的脂质。例如,它可任选地是糖基化的神经酰胺。
[0274] 生物标志物可任选地是代谢物,诸如初级或次级代谢物;抗生素;群体感应分子(quorum sensing molecule);脂肪酸合酶产物;信息素和/或生物聚合物
[0275] 生物标志物化合物可任选地通过以下官能团中的一种或多种来表征:醇、酯、烷、烯烃、炔烃、醚、酮、醛、酸酐、胺、酰胺、腈、芳香烃、羧酸、烷基卤化物和/或羰基。任选地,其可另外地被鉴定为伯、仲或叔,例如伯醇、仲胺等。
[0276] 例如,其可任选地是萜烯;异戊二烯基醌;固醇;类萜;生物碱;糖苷;表面活性素;地衣素、2-庚基-3-羟基-4(1H)-喹诺酮或2-庚基-3,4-二羟基喹啉(“PQS”或假单胞菌喹诺酮信号);4-羟基-2-庚基喹啉(“HHQ”);苯酚,诸如天然苯酚;吩嗪;联苯;二苯并呋喃;β- 内酰胺;聚酮化合物;鼠李糖脂;霉菌酸;和/或聚羟基脂肪酸酯;
[0277] 生物标志物可任选地选自例如甘油磷酰胆碱、鞘磷脂、甘油磷脂、半乳糖神经酰胺、甘油磷酸肌醇、甘油磷酸丝氨酸、甘油磷酸甘油、胆固醇硫酸盐、硫苷脂、甘露糖脂 (seminolipid)、柠檬酸、甘油磷酸乙醇胺、甘油磷酸乙醇胺、2-羟基戊二酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、棕榈酰甘氨酸、泛醌、钆特醇和/或在此(包括任何表格) 提到的任何其他生物标志物。
[0278] 诸位发明人已特别鉴定出以下生物标志物:
[0279] 对于属于棒状杆菌亚目(Corynebacterineae)的细菌(诸如分枝杆菌(Mycobacterium) 属、棒状杆菌(Corynebacterium)属和红球菌(Rhodococcus)属)的霉菌
酸。具体地说,已从相应的属中检测以下霉菌酸:
[0280] 分枝杆菌属:C77-C81(偶数和奇数,0-2个不饱和度);棒状杆菌属:C28-C36(偶数, 0-2个不饱和度);
[0281] 诺卡氏菌属:C48-C56(偶数,0-3个不饱和度);
[0282] 红球菌属:C28-C38(偶数和奇数,0-4个不饱和度)。
[0283] 发现各种鞘脂物质对拟杆菌门的成员是特异的。这些鞘脂包括氧化的神经酰胺物质、磷酸乙醇胺二氢神经酰胺以及C15:0-取代的磷酸甘油二氢神经酰胺和二氢神经酰胺。
在那些鞘脂物质中,发现一系列半乳糖基化的鞘脂对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)
(脆弱拟杆菌α- 半乳糖神经酰胺)是特异的。
[0284] 在细菌中,缩醛磷脂是对厌氧细菌诸如梭菌属和梭形杆菌属是高度特异的。这是由于需氧细菌失去缩醛磷脂合成所需要的生物化学途径的事实。人类能够合成缩醛磷脂
(虽然通过与厌氧细菌不同的生物化学途径),但通常发现这些缩醛磷脂具有比细菌缩醛磷
脂更长的链长度。
[0285] 指示细菌的某个基团的其他生物标志物包括例如由某些芽孢杆菌物种特异性地产生的脂肽,诸如对于枯草芽孢杆菌的表面活性素和对于地衣芽孢杆菌的地衣素。这两种
分子的产生还使得能够直截了当地区分这些在其他方面非常近缘的细菌。另外的实例包括
PQS衍生的群体感应分子以及对于铜绿假单胞菌发现的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂物质。
[0286] 群体感应是细胞间通讯的形式,其依赖于当单个微生物将群体感应分子释放到环境中时,此类分子的浓度太低而不被检测到的原理。然而,当存在足够细菌时,群体感应分子浓度达到允许微生物感觉到关键细胞质量并且作为响应激活或抑制特定基因的阈值
平。因此,群体感应分子可又被称为自体诱导物。病原体可使用群体感应分子作为毒力
子。
[0287] 群体感应分子的一些实例在上文中列出。另外的实例包括N-酰基高丝氨酸内酯(N-酰基HSL),诸如3-氧代-C8-HSL、3-氧代-C10-HSL或3-氧代-C12-HSL;二酮哌嗪;3-羟基棕榈酸甲酯;以及基于肽的群体感应分子,诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基于肽的群体感应分子,其是已被称为自动诱导肽(AIP)的由基因agrD编码的寡肽。活性
AIP 是7-9个氨基酸,具有5元硫代内酯环。
[0288] 以举例的方式,鞘磷脂脂质可任选地是例如癌症的生物标志物;麦角固醇可任选地是例如真菌的生物标志物;甲藻甾醇可任选地是例如沟鞭藻类的生物标志物;胆固醇硫
酸盐可任选地是例如癌症的生物标志物;2-羟基戊二酸盐可任选地是例如癌症的生物标志
物;和/或一种或多种硫苷脂可任选地是例如癌症(例如星形细胞瘤)的生物标志物。任选
地,硫苷脂可选自C48H91NO11S、C48H92NO12S和/或C50H94NO11S。
[0289] 异C15:0取代的磷酸甘油二氢神经酰胺可对紫单胞菌科是特异的。m/z=566.4790可以是黄杆菌纲的成员的生物标志物。
[0290] 本发明的方法可任选地涉及外源性化合物的分析,即给予至受试者和/或与受试者或标本形成接触的化合物。因此,生物标志物可以是外源性化合物。外源性化合物可任选地例如是造影剂,例如任选地选自以下各项的含钆造影剂:钆特酸盐、钆双胺、钆贝酸盐、钆喷酸盐(gadopentetate)、钆特醇、钆弗塞胺、钆塞酸盐(gadoxetate)和/或钆布醇。
[0291] 化合物
[0292] 该方法可任选地涉及一种或多种化合物的分析。除非另外说明,否则术语“化合物”、“分子”和“生物分子”在此可互换使用。
[0293] 化合物可任选地是细胞内的和/或细胞外的。它可任选地是内源性的,即由受试者产生,和/或外源性的,即加入受试者、组织、细胞和/或微生物中。
[0294] 化合物可任选地包括在此提到的任何化合物或化合物类别(例如,在此提到的任何生物标志物化合物)或由其组成。任选地,它可包括以下各项或由其组成:例如脂质,诸如糖脂或磷脂;碳水化合物;DNA;RNA;蛋白质;多肽,诸如核糖体肽或非核糖体肽;寡肽;脂蛋白;脂肽;氨基酸;和/或化学分子,任选地有机化学分子。
[0295] 化合物可任选地是直链、环状或支链的。
[0296] 化合物可任选地是代谢物,诸如初级或次级代谢物;抗生素;群体感应分子;脂肪酸合酶产物;信息素和/或生物聚合物。
[0297] 化合物可任选地通过以下官能团中的一种或多种来表征:醇、酯、烷烃、烯烃、炔烃、醚、酮、醛、酸酐、胺、酰胺、腈、芳香烃、羧酸、烷基卤化物和/或羰基。任选地,其可另外地被鉴定为伯、仲或叔,例如伯醇、仲胺等。
[0298] 组织的分析
[0299] 在此使用术语“组织”指代细胞的结构,其可任选地是例如结构、器官或器官的结构的一部分。组织可以是在体内或离体的。其可存在于人类或非人类动物中或来自其中。
[0300] 可任选地被分析的组织的实例是肾上腺组织、阑尾组织、膀胱组织、骨骼、肠组织、脑组织、乳腺组织、支气管、耳组织、食管组织、眼睛组织、子宫内膜样组织、胆囊组织、生殖器组织、心脏组织、下丘脑组织、肾脏组织、大肠组织、肠组织、喉组织、肝脏组织、肺组织、淋巴结、口组织、鼻组织、胰腺组织、甲状旁腺组织、脑垂体组织、前列腺组织、直肠组织、唾液腺组织、骨骼肌组织、皮肤组织、小肠组织、脊髓、脾组织、胃组织、胸腺组织、气管组织、甲状腺组织、输尿管组织、尿道组织、软组织和结缔组织、腹膜组织、血管组织和/或脂肪组织;(ii)I级、II级、III级或IV级癌性组织;(iii)转移性癌性组织;(iv)混合级癌性组织;(v)亚级癌性组织;(vi)健康或正常组织;或(vii)癌性或异常组织。
[0301] 该分析可任选地涉及疾病或病症,诸如在本节中和/或在本文的其他地方所列出的任何疾病或病症。术语“疾病”和“病症”本文可互换使用。
[0302] 病症可任选地是例如选自以下各项的皮肤病症:痤疮、脱发、疖疮、鲍文病、大疱性类天疱疮(BP)、痈、蜂窝组织炎、冻疮、囊肿、毛囊角化病、皮炎、皮肌炎、湿疹、红斑、疹、毛囊炎、冻伤、疱疹、鱼鳞癣、脓疱病、擦烂、角化病、扁平苔癣、线状IgA病、黑色素瘤、痣、甲癣、乳头瘤、瘀点、痒疹、牛皮癣、酒渣鼻、疥疮、硬皮病、皮脂囊肿、带状疱疹/水痘、毛细管扩张、荨麻疹(假膜性喉头炎)、疣和/或干皮病。
[0303] 病症可任选地是例如选自以下各项的肝脏病症:肝炎、脂肪肝疾病、酒精性肝炎、肝硬化症和/或肝硬化。
[0304] 肺部病症可任选地选自例如哮喘、肺不张、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肺癌、肺炎、肺水肿、气胸和/或肺栓塞。
[0305] 甲状腺是通常产生甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的内分泌腺。病症可任选地是甲状腺病症,例如甲状腺功能减退或甲状腺机能亢进。
[0306] 任选地,可对任选地在此提到的任何组织的病灶进行分析。病灶是组织中的由于例如损伤或疾病而引起异常的区域。病灶可例如选自伤口、溃疡、脓肿和/或肿瘤。病灶可例如是糖尿病病灶,诸如糖尿病足或足趾、或糖尿病性溃疡。
[0307] 可被分析的组织的另外实例在本文的其他地方讨论,例如受癌症、坏死、微生物等影响或处于其附近的组织。例如,组织可任选地包括粘液膜或由其组成,该粘液膜在本文的其他地方讨论。
[0308] 任选地,该方法可涉及组织的细胞组成的分析。例如,可分析一种或多种特定细胞类型的比例。细胞类型可任选地选自任何已知的细胞类型,例如在此提到的任何细胞类型。
[0309] 任选地,该方法可包括分析对疾病(该疾病可任选地选自在本文的其他地方所列出的任何疾病)例如对癌症和/或感染的免疫应答。因此,任选地,可分析组成受试者免疫应答的一部分的细胞。例如,可例如在组织中分析组成受试者免疫应答的一部分的一种或多
种细胞的存在、位置、空间分布、浓度和/或类型。
[0310] 癌症和/或肿瘤分析
[0311] 本发明的方法可任选地涉及癌症或肿瘤细胞或组织的分析。本发明的方法可任选地涉及癌症生物标志物的分析。
[0312] 细胞的失控生长和分裂可导致癌症,诸如血癌或恶性肿瘤;或良性肿瘤。以失控方式生长和分裂的细胞可又被称为赘生性细胞。因此,癌症可又被称为“赘生物”并且肿瘤可被称为包含“赘生性”细胞。
[0313] “肿瘤”是通过异常生长来表征的细胞群体。大多数肿瘤是实体的,即细胞团。基于扩散与入侵的标准,肿瘤通常被分类为良性的或恶性的。恶性肿瘤能够入侵并且破坏周围的组织。它们的细胞也可以超过肿瘤的原始部位而扩散。良性肿瘤不具有这些特征,但是良性肿瘤可进展到恶性期,所以检测并且潜在地治疗良性肿瘤可以是有用的。例如,在口腔鳞癌中,通常不治疗瘤形成,但是这种病症可快速地进展到恶性期中,在该恶性期中部分或整个舌头不得不进行外科手术去除。此外,良性肿瘤本身也可能是不希望的,特别是如果它们比较大并且相邻于重要器官生长,所以良性肿瘤的治疗(其由此减少随后的类似良性肿
瘤)可能是希望的。
[0314] 因此,“恶性”细胞可被定义为表现出失控增殖、逃避生长抑制剂、避免细胞死亡、无限增殖能力(即永生)、转移能力和/或遗传不稳定性或其任何组合的细胞。
[0315] 任选地,肿瘤可以是良性的或恶性的,其可任选地在进行本发明的方法之前是已知的。任选地,可分析肿瘤以确定其是良性的还是恶性的。因此,本发明的方法可任选地涉及肿瘤作为良性的或恶性的表征。
[0316] 转移是一系列复杂的生物步骤,其中癌性细胞离开原始部位并且经由许多不同的可能途径(诸如经由血流、淋巴系统或通过直接蔓延)迁移到受试者的另一个部位。转移癌
或“转移”是癌症从受试者中的一个器官扩散到另一个器官或另一个部位。因此,转移癌引起转移肿瘤,即处于受试者内原发性肿瘤部位的远端部位的“转移瘤”。
[0317] 本发明的方法可任选地涉及肿瘤作为转移性的表征。任选地,可分析一种或多种转移瘤。
[0318] 任选地,可分析癌性前状态。
[0319] 在研究治疗癌症的方法中,极大的障碍是癌症由起源于受试者自己身体的细胞发展而成。免疫系统努力将它们识别为异常。由免疫系统对外来或异常细胞的识别通常涉及
位于细胞表面的分子(抗原)的检测。大多数癌细胞具有至少一种类型的使它们与正常细胞
区分的抗原,并且在许多情况下,该抗原对特定类型的癌症是特异的。一些癌细胞可具有各种抗原,而其他癌细胞可仅具有单一类型的抗原。抗原类型、不同抗原数和抗原在细胞表面上的突出性都可影响免疫系统可将癌细胞识别为异常的机会。许多类型的癌症具有非常少
的抗原,或仅具有被免疫系统较弱地识别为外来的并且因此能够逃避通过免疫系统进行的
识别和破坏的抗原。因此,任何特定癌症类型所具有的抗原类型和数量在确定癌症有多大
的“免疫原性”的方面扮演了重要角色。“免疫原性”意指引起免疫应答的能力,所以癌症越有免疫原性,它将越可能被免疫系统识别并且攻击。本发明的方法可任选地涉及分析癌症
有多大的免疫原性。
[0320] 肿瘤包括两种相异但相互依赖的区室:主要由赘生性细胞组成的软细胞组织;以及基质。基质包括各种非赘生性细胞类型,包括例如纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、免疫活性细胞、血管细胞和/或平滑肌细胞;以及细胞外基质(ECM) 和细胞外分子,诸如炎性细胞因子和/或趋化因子。巨噬细胞可例如代表高达50%的肿瘤团块。
[0321] 虽然基质中的大多数细胞最初具有某些肿瘤抑制能力,但是基质通常在恶性肿瘤期间变化并且最终促进生长、入侵和/或转移。基质变化可包括通过成纤维细胞向CAF分化
转化而出现癌相关的成纤维细胞(CAF),这通常由癌症来源的细胞因子诸如转化生长因子-
β驱动至极大的程度。CAF可构成大部分的肿瘤基质并且在肿瘤进展方面起决定性作用。
[0322] 本发明的方法可任选地涉及肿瘤基质的分析。
[0323] 该方法可任选地涉及肿瘤边限的分析,例如实质、基质和/或健康组织之间的边限。
[0324] 使用术语“肿瘤异质性”是指不同受试者中相同类型的肿瘤之间的差异以及肿瘤内赘生性细胞之间的差异。这两者可导致对疗法的不同响应。差异可例如是遗传的和/或后生的。
[0325] 本发明的方法可任选地涉及肿瘤异质性的分析。
[0326] 癌症或肿瘤可任选地选自例如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和神经胶质瘤。
[0327] 更具体地说,其可任选地选自例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病 (AML)、肾上腺皮质癌、腺瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、 Birch-Hirschfield、母细胞瘤、膀胱癌、骨癌、尤因肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、多形性成胶质细胞瘤(“GBM”)、星形细胞瘤、脊髓癌症、颅咽管瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(Carcinoid Tumour)、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、儿童原位管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维腺瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、胆囊癌、胃部(胃) 癌、生殖细胞瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、卡勒病 (Kahler)、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌瘤、嘴唇和口腔癌、肝癌、肺癌(诸如非小细胞或小细胞)、淋巴瘤、淋巴母细胞瘤、男性乳腺癌、骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、黑素癌、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、肾胚细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎莱综合征、皮肤癌、精原细胞瘤、畸胎瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、胸部癌症、尿道癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和 /或威耳姆氏瘤(Wilm’s tumour)。在以上列表中,对“癌症”或“肿瘤”的任何提及应当理解为包括对所述类型的“癌症和/或肿瘤”的提及。
[0328] 任选地,脑癌可以是多形性成胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤、巨细胞性成胶质细胞瘤、复发性成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和/或弥漫性星形细胞瘤。
[0329] 如果癌症是乳腺癌,它可任选地选自例如原位管癌(DCIS)、小叶原位癌(LCIS)、浸润性乳腺癌(NST)、浸润性小叶乳腺癌、炎性乳腺癌、与佩吉特氏病相关的乳腺癌以及乳腺的血管肉瘤。
[0330] 癌症可由突变或其他遗传改变引起、与其相关和/或由其表征,该突变或其他遗传改变可任选地导致分子的表达改变,例如包括以下各项或由其组成的分子:脂质,诸如糖脂或磷脂;碳水化合物;DNA;RNA;蛋白质;多肽,诸如核糖体肽或非核糖体肽;寡肽;脂蛋白;脂肽;氨基酸;和/或化学化合物,任选地是有机化学化合物。更具体地,突变可任选地导致蛋白质和/或代谢物的表达改变。
[0331] 癌症可任选地表达可充当所述癌症的生物标志物的一种或多种代谢物。例如,任选地代谢物诸如琥珀酸盐、富马酸盐、2-HG和/或在此提到的任何其他代谢物可积聚在癌症中。
[0332] 可任选地例如基于这种改变的表达而鉴定癌症的亚型。例如,基于例如选自雌激素受体 (ER)、黄体酮受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER2)的受体的表达或其缺乏,
癌症可任选地被鉴定为具有特定亚型。因此,如果癌症缺乏ER的表达,癌症可例如被称为 ER阴性;或者如果癌症是ER-、PR-和Her2-,癌症被称为三阴性乳腺癌(TNBC)。
[0333] 突变可任选地例如在基因编码异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2) 中,从而产生能够使α-酮戊二酸转化成2-羟基戊二酸盐(2-HG)的突变酶。这样的突变可任选地例如存在于神经胶质瘤、肝内胆管癌、急性骨髓性白血病(AML)和/或软骨肉瘤
中。因此2-HG可被称为癌代谢物。2-HG能以非常小的量存在于正常组织中,而它能以高浓度 (例如,每克肿瘤若干微摩尔)存在于突变肿瘤中。
[0334] 因此,癌症亚型可具有特定生物标志物。本发明的方法可任选地涉及癌症亚型的分析。
[0335] 该方法可任选地涉及癌症的表型和/或基因型的分析,其可任选地涉及上文所讨论的任何突变的分析。
[0336] 肿瘤等级是肿瘤侵犯性潜力的量度。它是肿瘤可能如何快速地生长和扩散的指示物。一般而言,“低级”癌症倾向于比“高级”癌症侵犯性更小。
[0337] 肿瘤等级是尤其基于肿瘤细胞的分化期的肿瘤描述。可通过显微镜评价分化期。用外行人话来说,它是在显微镜下肿瘤细胞和肿瘤组织看起来有多异常的量度。如果肿瘤
的细胞和肿瘤组织的组织结构与正常细胞和组织的那些接近,则肿瘤可被称为“分化良
好”。如果肿瘤包含看起来异常的细胞和/或肿瘤组织缺乏正常组织结构,则肿瘤可被称为“未分化”或“分化不良”。
[0338] 基于显微镜检外观的这些和其他差异,数字“等级”可分配给大多数癌症。用于确定肿瘤等级的因素在不同类型的癌症之间改变。因此,取决于癌症类型分级系统不同。
[0339] 通常,取决于异常的量,肿瘤可任选地被分级为1、2、3或4级。在1级肿瘤中,肿瘤细胞和肿瘤组织的组织结构看起来接近于正常。这些肿瘤倾向于缓慢生长和扩散。相反,3 级和4级肿瘤的细胞和组织看起来不像正常的细胞和组织。3级和4级肿瘤倾向于快速地生长并且比具有更低等级的肿瘤扩散更快。
[0340] 如果没有规定肿瘤类型的分级系统,可任选地使用以下系统:
[0341] GX:不能评价等级(未确定等级)
[0342] G1:良好分化(低级)
[0343] G2:中等分化(中级)
[0344] G3:不良分化(高级)
[0345] G4:未分化(高级)
[0346] 乳腺癌和前列腺癌是具有其自身分级系统的最常见类型的癌症。
[0347] 诺丁汉(Nottingham)分级系统(又称为Elston-Ellis改良的Scarff-Bloom-Richardson分级系统)可任选地用于乳腺癌。基于以下特征,这个系统对乳腺肿瘤进行分
级:(i)细管形成:肿瘤组织具有多少正常乳腺(乳)管结构;(ii)细胞核级:肿瘤细胞中细胞核大小和形状的评估;以及(iii)有丝分裂率:存在多少分裂细胞,这是肿瘤细胞生长和分裂有多快的量度。
[0348] 每个分类获得1与3之间的得分;得分“1”意指细胞和肿瘤组织看起来最像正常的细胞和组织,并且得分“3”意指细胞和组织看起来最异常。然后对三种分类的得分进行加和,得到3至9的总得分。三个等级是可能的:(i)总得分=3-5:G1(低级或分化良好);(ii)总得分=6-7:G2(中级或中等分化);(iii)总得分=8-9:G3(高级或分化不良)。
[0349] 格里森(Gleason)评分系统可任选地用于对前列腺癌进行分级。格里森得分基于从前列腺中取得的活检样品。病理学家检查样品以查看肿瘤组织看起来与正常的前列腺组
织有多相似。鉴定组织结构的初级和次级图案。初级图案代表肿瘤中所见的最常见的组织
图案,并且次级图案代表下一个最常见的图案。给予每个图案从1至5的等级,其中1看起来最像正常的前列腺组织并且5看起来最异常。然后对两个等级进行加和以给出格里森得分。
基于美国癌症联合委员会的建议,格里森得分可被分组成以下类别:(i)格里森X:不能确定格里森得分;(ii)格里森2-6:肿瘤组织分化良好;(iii)格里森7:肿瘤组织中等分化;(iv)格里森8-10:肿瘤组织分化不良或未分化。
[0350] 关于膀胱癌,术语“高级膀胱癌”(HGBC)意指并包括入侵到膀胱固有肌层中的肿瘤:非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC,Ta,Tl)以及肌层浸润性膀胱癌(MIBC,>T2)(包括膀胱癌转移)。
[0351] 本发明的方法可任选地涉及肿瘤等级的分析。
[0352] 除了或替代肿瘤等级,可使用一种或多种其他因素(诸如癌症期和/或受试者年龄和总体健康状况)来制定治疗计划并且确定受试者预后。通常,较低等级指示较好的预后。
较高级癌症可生长和扩散较快,并且可需要中等或更有攻击性的治疗。肿瘤等级在计划治
疗和确定受试者预后方面的重要性对癌症特别重要,诸如软组织肉瘤、原发性脑肿瘤以及
乳腺和/ 或前列腺癌。
[0353] 分期是描述(原发性)肿瘤的大小和其已生长得多快的熟知方法。癌症可任选地是1期、2期、3期或4期;或可替代地观察的早期、晚期和/或转移性;或可替代地观察的非侵润性非转移性、非侵润性转移性、侵润性非转移性或侵润性转移性。
[0354] 1期还可被称为“早期”癌症,并且通过相对较小并包含在其开始的器官内的肿瘤来表征。2期通常意指癌症尚未扩散到周围组织,但是肿瘤比1期大。取决于特定类型的癌
症,癌细胞可以扩散或可以不扩散z'z附近的淋巴结中。3期还可被称为“晚期”癌症。它通过可开始扩散到周围组织中的较大肿瘤来表征。它还通过至少一些淋巴结中的癌细胞来表
征。 4期还可被称为“转移性”癌症。(原发性)肿瘤的这些时期可被称为T1、T2、T3和/或T4。
[0355] 该方法可任选地在体内的癌性组织上和/或标本(诸如活检物)上进行。标本可任选地包括肿瘤组织、基质组织和/或健康组织。标本可任选地包括肿瘤的一部分或全部。标本可任选地包括来自淋巴结(例如,前哨淋巴结和/或区域淋巴结)的组织。区域淋巴结是从肿瘤周围的区域中排出淋巴液的淋巴结。前哨淋巴结被定义为癌细胞最可能从原发性肿瘤
扩散到其中的第一淋巴结。有时,可以存在多于一个前哨淋巴结。
[0356] 癌症可替代地或另外地参考淋巴结来分期。
[0357] 字母N接着从0至3的数字指示癌症是否已扩散到原发性肿瘤附近的淋巴结,并且如果扩散,影响多少淋巴结。这些时期可被称为NX、N0、N1、N2和/或N3。
[0358] NX:不能评价附近的淋巴结(例如,如果它们先前被去除)。N0:癌症尚未扩散到附近的淋巴结。N1至N3指示癌症严重扩散到淋巴结。精确的分期标准在癌症与癌症之间改变,但一般来说,N1指代扩散到至少1个或较少数量的淋巴结;N2指代扩散到更多数量的淋巴结;并且N3指代扩散到甚至更多数量的淋巴结。
[0359] 癌症可替代地或另外地参考转移来分期。
[0360] MX:不能评价远处扩散(转移);M0:用x射线(或其他成像程序)或通过物理检查未发现远处扩散;M1:癌症已扩散到远处器官。
[0361] 该方法可任选地涉及癌症时期的分析。
[0362] 任选地,癌症或肿瘤的类型、亚型、表型、等级和/或时期可提供预后信息。因此,任选地,该方法可以是预后方法和/或涉及进行预后的步骤。
[0363] 该方法可任选地涉及动物模型中(例如,异种移植物模型中)的癌症的分析。例如,肿瘤或其标本可从受试者中获得和/或可使用肿瘤细胞系。肿瘤细胞可任选地被遗传操纵,例如,它可通过引入转基因和/或通过使其暴露于诱变剂来转化。肿瘤细胞可任选地离体培养。(任选转化的)肿瘤细胞可任选地被注入或异种移植到动物模型中,该动物模型可任选地选自在此提到的任何动物。动物模型可任选地用已知的抗癌剂和/或测试剂来处理。可任选地分析肿瘤、其基质和/或肿瘤附近(例如肿瘤微环境)的组织。这个方法可任选地用于分析转基因对癌症的作用;分析抗癌剂对癌症的作用;和/或分析测试剂对癌症的作用。
[0364] 细胞的遗传操纵可任选地涉及靶向诱变和/或随机诱变,其可任选地例如是敲除、更改和/或插入遗传信息。已通过靶向突变操纵的细胞可被称为“转化的”细胞,特别是如果已插入新基因或基因变体,即“转基因”。已被敲除的基因还可被称为沉默的基因。
[0365] 现在将参考卵巢癌更详细地讨论癌症的分析,但是应当理解信息需在细节上作必要的修改来适用于任何其他癌症类型,例如在本文的其他地方列出的任何其他癌症类型。
[0366] 原发性上皮性卵巢癌(EOC)具有不良预后并且仍然是最致命的妇科恶性肿瘤。在大于 80%的病例中,一旦EOC已经离开骨盆的领域,该疾病呈现为晚期疾病。在这个时期的疾病负担可以是很广泛的并且涉及转移性散播到上腹、隔膜、肝脾实质以及远处扩散超过
腹腔。对于呈现三期和四期的EOC的五年相对存活率分别是18.6%和3.5%。
[0367] 已证明细胞减灭术对无疾病进展和总体存活率的预后益处,尤其在患有III期和IV期疾病的患者中。一项研究显示在具有零残留疾病的患者中三年总体存活率为72.4%对
比在具有>1cm残留疾病的患者中为45.2%。细胞减灭术可以是仅有的治疗,但是可替代地
和/或另外地患者可接受化疗例如基于铂和/或紫杉烷的化疗。最大程度的细胞减灭通常带
来存活益处。
[0368] 一旦疾病已进展超过卵巢并且影响其他腹膜表面,可能难以与非恶性疾病区别。这种鉴定可在给予新辅助化疗之后在延迟初次手术设置中是更具有挑战的。病灶可经历形
态学变化,这可包括纤维化、化和/或淋巴细胞性浸润。外科医生可例如依赖于化疗前计算机断层成像和/或经验来鉴定病灶的位置和恶性性质。有力证据证明来自最大外科手术
努力的存活率益处可促进更激进的手术方法。用于EOC的减量手术可包括例如阑尾切除术、脾切除术、腹膜切开、网膜切除术、横隔膜剥离和/或全子宫切除术与双侧输卵管卵巢切除术。直到最近,尚未存在手术期间准确指导外科医生的技术。外科医生不能确定完全切除疾病并且可能过量取出组织的健康边限。
[0369] 在外科手术之前,骨盆或卵巢肿瘤的精确组织病理学性质通常是未知的。可仅在外科手术期间进行诊断的尝试。仅建立的用于术中诊断的技术是组织病理学冷冻切片,该
技术是耗时、昂贵的并且其诊断准确性有变化。18项研究的元分析显示对于良性肿瘤的诊
断灵敏度为65%-97%,并且对于冷冻切片的恶性肿瘤诊断灵敏度为71%-100%。其他研究已显示,冷冻切片下的交界性卵巢肿瘤尤其难以表征,其中诊断灵敏度在25%-87%范围
内。低期交界性卵巢肿瘤可被更保守地治疗,并且更年轻的妇女可希望选择单侧卵巢切除
以保存她们的生育能力。因为对于交界性肿瘤的冷冻切片诊断准确度如此低,以致于许多
育龄妇女可能进行激进的细胞减灭术,该细胞减灭术可能是不必要的。
[0370] 在外科手术期间,电外科透热仪器可用于切割组织,因为它们提供止血。外科手术烟雾是切割组织时的副产物,其过去从外科手术视野提取。然而,这种烟雾可以是生物信息的丰富来源并且质谱(MS)和/或离子迁移谱可用于测量其代谢组学组成。
[0371] 外科手术透热疗法(其使组织组分转化成气相离子物质)与质谱仪的这种偶联已被描述为快速蒸发电离质谱(REIMS)技术。用MS在术中直接取样在过去是不可能的,因为MS 通常需要样品制备,在外科手术设置中该样品制备是不可能的。REIMS在环境条件下在大气压下起作用,这使其在术中使用是理想的。
[0372] REIMS技术与手持式取样装置的结合已产生智能刀取样技术,该取样技术可以提供术中组织鉴定。智能刀取样技术允许外科医生通过使去除的健康组织的量最小化同时确
保去除所有癌性组织而更有效地在术中切除肿瘤。
[0373] REIMS谱与过去真实的谱库比较的统计分析可任选地用于主要组织类型的清楚的体内或离体鉴定,这些主要组织类型任选地选自在本文的其他地方提到的任何组织类型,
诸如肝脏、肺和/或结肠。它可任选地用于鉴定离体和/或体内设置中的转移病灶的起点。它可任选地用于体内内窥镜设置中,例如对肠壁、癌症和/或息肉进行分类。
[0374] 本申请呈现了外科手术透热疗法与谱分析在妇科靶标中的第一用途。如实例(具体地实例13)所解释,包括在正常至恶性范围内的样品来证明该方法作为实时诊断外科手
术工具的潜力。
[0375] 坏死的分析
[0376] “坏死”是非程序性细胞死亡,其可与作为程序性细胞死亡形式的细胞凋亡形成对比。
[0377] 坏死通常涉及细胞膜的损害和/或细胞内区室(诸如溶酶体)的损害。坏死通常伴随细胞内分子(诸如酶、有机化学分子等)的释放。例如,它可包括溶酶体酶的释放。此类分子的释放可引起炎症和/或对邻近细胞的损害。
[0378] 坏死可任选地由以下各项引起或与其相关:例如损伤、感染、癌症、梗塞、毒素、炎症、对伤口部位缺乏合适护理、冻伤、糖尿病和/或动脉粥样硬化。任选地,坏死可以是癌性或非癌性组织的坏死。
[0379] 坏死可任选地例如是凝固性、液化性、干酪样、脂肪性坏死、纤维蛋白样坏死和/或坏疽性坏死。
[0380] 可任选地进行受试者或组织样品的目视和/或显微镜检查以确定选自以下各项的坏死类型的一个或多个特征的存在或不存在:凝固性、液化性、干酪样、脂肪性坏死、纤维蛋白样坏死和/或坏疽性坏死。目视检查意指在不需要显微镜的帮助下,通常用裸眼进行的检查。
[0381] 凝固性坏死可由于缺血、即缺乏血液流动到受影响的组织而出现。通过目视,它可通过坚韧组织来表征。通过显微镜,它可通过保存的细胞外廓(即无血色外观的细胞)以及发红来表征。
[0382] 液化性坏死可由于感染而出现,尽管它可替代地由于脑梗塞而发生。通过目视,它可通过可为乳黄色的液化组织和/或脓来表征。通过显微镜,它可通过中性粒细胞和细胞碎片的存在来表征。
[0383] 干酪样坏死可由于感染(诸如肺结核)而出现,响应于该感染,身体试图用巨噬细胞斗争感染性微生物。通过目视,它可通过白色柔软的干酪样材料来表征。通过显微镜,它可通过肉芽肿瘤来表征,诸如被一圈淋巴细胞和巨噬细胞包围的碎片化细胞和碎片。
[0384] 脂肪性坏死可由于例如来自安全带、活组织检查或植入物去除术的损伤或创伤而出现。通过目视,它可通过皂化,即来自新形成的游离脂肪酸与钙的组合的白垩质白色区域来表征。通过显微镜,它可通过死亡脂肪细胞的模糊外廓和/或来自钙沉积的蓝色铸型来表征。
[0385] 纤维蛋白样坏死可由于自身免疫病症诸如类风湿性关节炎或多动脉炎而出现。通过目视,它可通过纤维蛋白的所回忆起的非晶态嗜酸性物质的存在来表征。通过显微镜,它可通过增厚和桃红色的血管壁,通常称为“纤维蛋白样”来表征。
[0386] 坏死还可被称为“坏疽”,其可被分成“干性坏疽”和“湿性坏疽”。
[0387] 坏死治疗可涉及外科手术,诸如清创术(外科手术去除死亡和干燥的组织)和/或截肢。必须在需要去除坏死组织与希望维持尽可能多的受试者受影响区域(诸如肢体、指趾或器官) 之间进行平衡。
[0388] 该方法可任选地涉及坏死的分析,例如组织的分析以确定特定组织是否是坏死的或健康的。因此,健康与坏死组织之间的边限可任选地被分析。这个分析可用于辅助决定通过外科手术去除哪个组织并且哪个组织可足够有活力而被受试者保留。
[0389] 坏死可通过组织的氧合不足而出现。因此,分析例如组织的氧合状况或能力可以是希望的。因此,任选地,该方法可涉及组织氧合的分析。任选地,可分析组织处理氧气的功能性能力,其可任选地用于确定组织的生活力。例如,可分析含氧血红蛋白(OxyHb)和/或脱氧血红蛋白(DeoxyHb)。DeoxyHb是不具有氧血红蛋白的形式,而OxyHb是具有氧血红蛋白的形式。例如,可分析OxyHb与DeoxyHb的相对量。
[0390] 粘膜分析
[0391] 粘液膜排列在身体的若干通道和空腔中,具体地具有暴露于外部环境中的开口的那些,包括口咽腔、胃肠(GI)道、呼吸道、泌尿生殖道和外分泌腺。
[0392] 因此,粘液膜可任选地选自支气管粘液膜、子宫内膜(子宫粘液膜)、食管粘液膜、胃粘液膜、肠粘液膜(Intestinal mucosa)(肠粘液膜(gut mucosa))、鼻粘液膜、嗅粘液膜、口腔粘液膜、阴茎粘液膜和/或阴道粘液膜。
[0393] 广义地说,粘液膜包括粘液层(内粘液层);上皮;基底膜、固有层(LP),其是结缔组织层;以及粘膜肌层,其是平滑肌薄层。因此,在此使用术语“粘液膜”是指这整个复合体,除非另外说明。使用术语“粘膜”是指不具有粘液层的粘液膜,即,上皮、基底膜、LP和粘膜肌层。粘液膜还可以被另外的外粘液层覆盖,该外粘液层通常与其更松散地结合。在此对“粘液膜”的任何提及可包括对这种另外的外粘液层的提及。与粘液膜相邻的是粘液膜下层。
[0394] GI道中的粘液膜下层代表含有小动脉、小静脉和淋巴管的结缔组织层。它主要由胶原纤维和弹性纤维与不同量的脂肪元件组成。
[0395] 内粘液层可被微生物分解。例如,粘蛋白单糖可被细菌(例如共生菌)用作能源。因此,内粘液层的不断更新是非常重要的。
[0396] 上皮是上皮细胞的单层或多层。上皮可包括例如上皮内淋巴细胞(IEL)、内分泌细胞、杯状细胞、肠细胞和/或帕内特细胞。
[0397] 基底膜可包括不同蛋白质,具体地结构蛋白或粘附蛋白,诸如层粘连蛋白、胶原例如胶原IV、蛋白聚糖和/或钙结合蛋白诸如腓骨蛋白。
[0398] 固有层是可包括例如浆细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞、肥大细胞和/或淋巴细胞的结缔组织。中性粒细胞通常不存在于健康人类的固有层中。
[0399] 如下所讨论,粘液膜还可包括例如抗原递呈细胞(APC)和微褶细胞(M细胞)。粘液膜可包括一种或多种不同类型的调节免疫细胞,包括肠上皮内淋巴细胞(IEL)、Foxp3(+)调节T细胞、调节B细胞、替代性活化巨噬细胞、树突细胞和/或先天性淋巴样细胞。
[0400] 粘液膜通常分泌粘液,其在粘膜上皮与管腔之间形成粘液层。粘液层可具有保护功能。粘液的主要成分是粘蛋白,其由称为杯状细胞的专门的粘膜细胞产生。粘蛋白是主要通过高水平O-连接的寡糖表征的糖蛋白。蛋白质部分连接至碳水化合物部分的水平以及碳
水化合物部分的精确同一性可明显改变。
[0401] 粘液膜有时在敌对外部环境与内环境之间建立屏障。然而,粘液膜还负责营养物吸收和废弃物分泌,这需要选择性通透屏障。这些功能使粘膜上皮置于粘膜免疫系统与管
腔内容物(包括食物性抗原和微生物产物)之间的相互作用中心。因此,许多生理学和免疫
学刺激物触发粘液膜中的反应。不正常的反应可促成疾病。
[0402] 粘膜免疫系统是局部和特定的免疫组织结构。不同器官处的粘膜免疫系统共享类似的解剖组织结构和特征。GI粘膜免疫系统是最好理解的,并且出于说明性目的在下文中
进行讨论。GI粘膜免疫系统包括三大分区:上皮层;固有层(LP);和粘膜相关的淋巴样组织(MALT),其在GI道中可被称为肠相关的淋巴样组织,并且其包括淋巴集结和分离的淋巴样
滤泡。
[0403] 树突细胞可将树突伸入上皮中以摄取抗原并且迁移到LP、次级淋巴样组织和引流淋巴结,其中它们刺激(prime)天然T细胞。位于淋巴集结(Peyer’s patch)上皮中的微褶细胞 (M细胞)可将抗原传递到树突细胞、巨噬细胞和其他抗原递呈细胞。次级淋巴样组织中
的天然T细胞可在被抗原递呈细胞刺激并且归巢到LP(称为LPL)或渗透到发炎上皮中之后
变成活化的。
[0404] 胃肠(GI)道可按以下顺序分成包围管腔的四个同心层:(i)粘液膜;(ii)粘液膜下层; (iii)肌层;和(iv)外膜或浆膜。
[0405] 因此,GI粘膜是胃肠道的最内层。这个层与所消化的食物形成直接接触。在GI粘液膜中,上皮负责大多数消化、吸收和分泌过程,而粘膜肌层帮助材料传递并且通过搅拌和蠕动增强上皮层与管腔内容物之间的相互作用。GI粘液膜在GI道的每个器官中是高度特化的以应对不同条件。大部分的变化可发生在上皮中。
[0406] 不同类型的粘液膜彼此不同,并且诸位发明人已显示本发明的方法可任选地例如用于在不同类型粘液膜(例如阴道的、鼻的和口腔的)之间区分。
[0407] 图26展示了可存在于人类微生物组中的各种微生物。如图26所示,人类微生物组可包括不同细菌、真菌、古生菌、病毒、酵母、原生动物等,其可存在于例如口、咽、呼吸系统、皮肤、胃、肠和/或泌尿生殖道等中。
[0408] 图27展示了存在于人体中的各种不同的粘液膜或粘膜。
[0409] 粘膜2700包括上皮组织层,其排列在对外部环境开放的人体中所有通道中,包括鼻和消化道、泌尿生殖道和呼吸道的一部分。粘膜通常充当捕获病原体诸如细菌、病毒和真菌的保护性屏障。如图27所示,粘膜存在于口、咽和呼吸系统2710以及胃肠道2720和泌尿生殖道2730中,并且包括子宫内膜、肠、胃、口腔、阴道、食管、齿龈、鼻、颊和支气管的膜。
[0410] 作为人类微生物组项目的一部分的研究已揭示由粘液膜内的不同微生物物种进行的集群对人类健康和疾病具有巨大影响。如在本文的其他地方所讨论,许多疾病(例如癌症、感染等)与粘液膜相关。因此,粘膜是分析例如诊断疾病(例如,微生物和/或癌性相关疾病) 的容易进入和高度临床相关的样品。
[0411] 如图28所示,典型的粘膜可存在于管腔2800中,并且可包括粘液2810、细菌2820、淋巴管2830、血管2840、粘液腺2850和粘液膜下层2860。如图28所展示,粘液膜本身的生物组织例如粘液2810和/或细菌2820存在于粘液膜代表性潜在分析物/生物标志物中或与其相关。例如,膜脂质和/或粘液膜炎性标志物和/或复合脂质和/或完整细菌细胞的信号传导分子代表潜在分析物/生物标志物。
[0412] 粘膜分析
[0413] 任选地,该方法可涉及粘膜靶标的分析,该粘膜靶标可以是体内的、或包括粘液膜或由其组成的标本。任选地,该方法可涉及粘膜靶标的分析以分析粘液膜的细胞组成;分析疾病;分析对药物的响应;分析对特定食物、膳食和/或膳食变化的响应;分析粘膜微生物;分析微生物与粘液膜相互作用和/或分析粘膜微生物组。
[0414] 粘液膜的细胞组成的分析可例如分析一种或多种细胞类型的存在或不存在和/或比例,该一种或多种细胞类型可任选地选自在此列出的任何细胞类型。任选地,该方法可涉及 MALT和/或淋巴集结的分析。任选地,该方法可涉及一种或多种细胞类型的表型和/或基因型的分析,该一种或多种细胞类型可任选地选自在此列出的任何细胞类型。
[0415] 任选地,该方法可涉及粘液膜中的变化的分析,该变化可任选地是例如粘液膜细胞组成、与粘液膜的微生物相互作用和/或粘膜微生物组中的变化。粘液膜中的“变化”意指粘液膜不同于它将通常存在于健康受试者那样;与同一受试者内的另一个位置相比,它在
一个位置处不同;和/或它不同于其在更早的时间点分析时那样。粘液膜中的变化可任选地例如由疾病、对物质诸如药物的响应和/或对食物、膳食和/或膳食变化的响应引起或与其
相关。
[0416] 疾病可任选地选自自身免疫失调、炎性疾病、热带口炎性腹泻、食物不耐受、感染、癌症和/或在此提到的任何失调。
[0417] 更具体地说,疾病可任选地选自例如哮喘、乳糜泄、胃炎、消化性十二指肠炎、谷蛋白敏感性肠病;过敏和/或对过敏原不耐受,例如牛奶、大豆、一种或多种树坚果、鸡蛋、小麦、肉、鱼、贝类、花生、种子(诸如芝麻、向日葵和/或罂粟籽)、大蒜、芥菜、芫荽和/ 或洋葱;桥本氏甲状腺炎;肠道易激综合症;格雷夫氏病;反应性关节炎;牛皮癣;多发性硬化症;系统性红斑狼疮(SLE或狼疮);强直性脊柱炎;进行性系统性硬化症(PSS);肾小球肾炎;自身免疫性肠病;IgA缺陷;普通多样性免疫缺陷;克罗恩病;结肠炎,诸如淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎和/或溃疡性结肠炎;弥漫性淋巴细胞胃肠炎;溃疡;肠T 细胞淋巴瘤;感染,例如咽炎、支气管炎、和/或被微生物感染,该微生物选自例如贾第虫、隐孢子虫、螺杆菌和/或在此提到的任何其他微生物;和/或癌症,其细节在本文的其他地方进行讨论。
[0418] 该方法可例如任选地涉及粘液膜与微生物的相互作用、或由这种相互作用引起或与其相关的粘液膜中的变化的分析。任选地,该相互作用可例如是微生物移位到粘液膜中,例如共生菌的移位。该方法可例如任选地涉及粘膜微生物组、或由粘膜微生物组引起或与
其相关的粘液膜中的变化的分析。该方法可例如任选地涉及感染、或由感染引起或与其相
关的粘液膜中的变化的分析。微生物、微生物相互作用、感染和/或微生物组的分析也在本文的其他地方进行讨论。
[0419] 如上所提到,IEL是小肠粘液膜的正常成分。它们在免疫监测和激活中起重要作用。在健康人类中,大多数的IEL是T细胞类型并且在其表面上表达α/βT细胞受体。普遍接受的是,健康人类在肠粘液膜中每100个上皮细胞具有不超过约20个淋巴细胞。
[0420] 粘膜标本中的淋巴细胞数量增加可任选地指示诸如疾病、对药物的响应的变化和/或微生物变化。因此,术语“升高”或“增加”水平的IEL用于指在肠粘液膜中每100个上皮细胞超过20个IEL,任选地在肠粘液膜中每100个上皮细胞至少22、24、25、26、28、30、 32、
34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、65、70、75、80 20个 IEL。
[0421] 正常条件下,不超过2%-3%的T淋巴细胞表达T淋巴细胞的γδ受体。因此,表达这种受体的T淋巴细胞百分比增加可指示诸如疾病、对药物的响应的变化和/或微生物变化等变化。因此,该方法可涉及确定T淋巴细胞γδ受体表达的存在或百分比。例如,在乳糜泻中, 
20%-30%粘膜T淋巴细胞可表达这种受体。
[0422] 因此,该方法可任选地涉及靶标中淋巴细胞的分析,这些淋巴细胞可任选地是T淋巴细胞,例如γδ受体阳性的T淋巴细胞。任选地,可分析靶标的淋巴细胞数量的增加或减少。任选地,可分析淋巴细胞的表型和/或基因型。
[0423] 多形核白细胞(PMN)(又称为中性粒细胞)是血液中最丰富的白细胞群,其占循环白细胞的50%-60%(25×109个细胞)。PMN是先天性免疫应答的关键组分,其对保护宿主例
如免遭微生物病原体,同时还使由细胞死亡或损伤介导的有害作用最小化至关重要。
[0424] PMN可执行各种抗微生物功能,诸如脱粒和吞噬。它们能够独特地形成大量反应性氧物质和可减弱和/或破坏病原体的其他毒性分子。在PMN接触入侵微生物后,反应性氧物
质可通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶以氧爆发的形式产生。PMN还可拥有不
同的细胞内颗粒池,其含有抗微生物肽,诸如α-防御素和/或抗菌肽;髓过氧化物酶;水解酶,诸如溶菌酶、唾液酸酶和/或胶原蛋白酶;蛋白酶,诸如组织蛋白酶G;天青杀素和/ 或弹性蛋白酶;阳离子磷脂酶;和/或金属螯合物诸如乳蛋白。此类颗粒可在与微生物接触后释放。
[0425] PMN还可以能够用中性粒细胞细胞外诱捕网(NET)印记组织。NET可包括与来自细胞内颗粒和细胞溶质的毒性分子混合的细胞核内容物(DNA和染色质)。入侵微生物可在这
些NET中被隔离并且被有效地破坏。
[0426] 在肠炎过程中,驻留的单核细胞通过产生巨噬细胞衍生的趋化因子促成中性粒细胞聚集。存在于血液中的中性粒细胞感觉趋化物梯度并且穿过血管内皮到达肠固有层。以
此方式,在数分钟内中性粒细胞被聚集到感染或炎性刺激物的部位。反应通常在24-48小时达到峰值。在某些生理学或病理学条件下,中性粒细胞可穿过上皮进入肠腔。
[0427] 在炎性部位处,中性粒细胞可选择性地释放单核细胞化学引诱物,诸如CAP18、组织蛋白酶G和/或天青杀素。因此,在PMN达到粘液膜后不久,巨噬细胞被聚集用于第二波炎性反应,其确保持续接下来的若干天。
[0428] 因此,该方法可任选地涉及靶标中的中性粒细胞的分析。任选地,可分析靶标中的反应性氧物质和/或产生反应性氧物质的中性粒细胞的存在。任选地,可分析靶标中的NET和/ 或产生NET的中性粒细胞的存在。任选地,可分析靶标中的单核细胞化学引诱物和/或
产生单核细胞化学引诱物的中性粒细胞的存在。
[0429] 如实例所述,从三个组(泌尿生殖道、鼻和口腔)中收集总共n=85的粘膜模型。使粘膜样品经受解吸电喷雾电离(“DESI”)谱分析并且使所得到的谱数据经受多变量统计分
析。多变量统计分析能够分离不同的粘液膜类别和可与粘液膜内的各种各样微生物组相关
的生物标志变化。
[0430] 根据各种实施例,可例如使用基于环境质谱和/或离子迁移谱技术诸如解吸电喷雾电离 (“DESI”)技术和快速蒸发电离质谱(“REIMS”)技术来表征微生物(例如,细菌)和/或动物(例如,人类)粘膜分析物。
[0431] 如图29所展示,这些分析物(例如,膜脂质和粘液膜的炎性标志物以及复合脂质和完整细菌细胞的信号传导分子)可有用于鉴定许多临床病症。
[0432] 因此,各种实施例涉及开发实时床旁检测(“POC”)诊断方法以研究不同临床失调。具体地说,各种实施例涉及基于质谱(“MS”)和/或离子迁移谱的实时床旁检测(“POC”)技术。
[0433] 例如,感染诸如咽炎、支气管炎和/或用在此提到的任何微生物进行的感染可例如通过分析(例如鉴定)微生物来鉴定。
[0434] 微生物组中的变化还可例如通过鉴定微生物来分析(例如检测),并且以举例的方式,确定怀孕患者的微生物组中的变化可用于鉴定怀孕期间处于具有早产或过早产出的风
险增加的那些患者。
[0435] 此外,从粘膜中取出的各种分析物(例如,生物标志物分析)可用于鉴定不同免疫学失调(例如,哮喘、过敏)以及鉴定癌症和/或癌前期状态。
[0436] 如图30所进一步展示,使用棉签从各种粘膜得到的分析物的代谢组学分析可有用于鉴定许多临床失调。例如,过敏可例如通过鉴定炎性介导物(类花生酸)诸如前列腺素
(PGD2)、白三烯、组胺等来鉴定。炎症(诸如咽炎、咽峡炎等)可例如通过鉴定来自细菌(诸如链球菌属、葡萄球菌属、嗜血杆菌属等)的微生物(例如,细菌)次级代谢物、脂质等来鉴定。
过早产出还可例如通过鉴定健康(例如包括稳定的乳酸杆菌环境,该乳酸杆菌环境包括例
如主要的卷曲乳杆菌、主要的惰性乳杆菌和/或加氏乳杆菌混合物等)或不健康粘液膜(例
如包括病原体的过度生长,这些病原体包括例如大肠杆菌、阴道阿托波氏菌、消化链球菌属和 /或拟杆菌属等)来鉴定。
[0437] 根据各种实施例,粘膜诊断使得能够在临床护理时从患者中对粘液膜进行非入侵直接取样。
[0438] 根据各种实施例,可使用例如标准医学棉签从粘膜中获得分析物。
[0439] 对于临床分析,可将棉签在被感染区域上方或进入其中擦拭,例如以便取样富含微生物的体液(诸如腐液)和/或粘液膜。然后可将棉签放置到含有用于储存的缓冲溶液的
无菌管中,之后该管被送去实验室进行分析。接收该管的实验室可将涂片内容物擦拭在培
养基诸如琼脂板上。然后可孵育培养基以允许所存在的生物体生长。然后可在显微镜下进
行微生物鉴定。存在于样品中的任何生物体还可例如通过序列分析(例如,细菌的16S基因
测序)和/ 或通过使用基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)质谱和/或离子迁移谱并且然后将质谱和/ 或离子迁移谱与可商购的数据库比较来鉴定。
[0440] 图31展示了微生物鉴定工作流程,并且示出使用棉签取样311分析物,然后将棉签运送312到专业实验室以用于微生物培养313和进一步分析。如图31所示,这种基于培养的
分析可包括使用显微镜314和/或基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)质谱(“MS”)315成像,接着统计分析316等。16s rRNA测序317是培养非依赖性分析方法。
[0441] 虽然易于处理,但是当前出于诊断目的对医学棉签进行的分析是培养依赖性的并且涉及相对耗时和相对昂贵的工作流程。因此,病原体相关疾病的诊断和适当的治疗与较
长时间延迟相关。此外,大约95%的细菌不能被培养用于分析。
[0442] 在下文中更详细地描述的各种实施例提供例如通过鉴定粘膜样品中的微生物和/或特定临床失调的生物标志物特征来研究来自粘膜的临床样品的快速而直接的方法,从而
容许更快速地诊断和治疗患者。
[0443] 各种实施例涉及使用环境质谱和/或离子迁移谱来实时快速而直接分析例如存在于棉签上的分析物。可采用基于环境电离质谱和/或离子迁移谱的技术来直接分析样品表
面。样品可在其天然状态下被分析,其中极少或完全没有先前样品制备。
[0444] 具体地,解吸电喷雾电离(“DESI”)已被发现是用于实时快速而直接分析例如存在于棉签上的那些分析物的特别有用和方便的方法。解吸电喷雾电离(“DESI”)允许直接快速分析表面而不需要先前样品制备。在本文的其他地方对DESI进行描述。
[0445] 解吸电喷雾电离(“DESI”)技术允许在几乎没有样品制备的情况下在大气压力下环境电离痕量样品。解吸电喷雾电离(“DESI”)技术例如允许直接分析处于其天然状态的生物化合物(诸如脂质、代谢物和肽)而不需要任何预先的样品制备。
[0446] 在此所述的一些实施例涉及使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱来直接地分析医学棉签。根据各种实施例,棉签表面上的特定微生物(例如,细菌)和/或生物标志物的化学特征标记鉴定在相对短的时间段内是可能的。
[0447] 各种具体实施例涉及快速诊断例如与早产(过早产出)相关的感染和/或生态失调(并且这些结果可任选地与标准微生物测试比较)。
[0448] 另外的实施例涉及使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱的实时快速医学棉签分析,以揭示致病性和/或炎性代谢物组标志物。
[0449] 各种实施例涉及非入侵床旁检测诊断技术的开发,其针对疾病的检测,特别强调感染、生态失调、癌症和/或炎性疾病、和/或在本文的其他地方提到的任何其他疾病的检
测。
[0450] 临床研究已显示阴道微生物(例如细菌)的多样性与特定阴道粘膜代谢物相关。例如,在健康怀孕期间,阴道粘液膜主要被乳酸杆菌物种占据。然而,重要地,怀孕期间向阴道生态失调的转变可能是早产的诱因。
[0451] 使用在此披露的基于环境电离质谱和/或离子迁移谱的技术允许评估曾有过自发性早产的女性(例如,妇女)并且与对照比较以便鉴定可用于预测早产的生物标志物。此外,可使用在此披露的基于环境电离质谱和/或离子迁移谱的技术来分析孕期女性的阴道粘液
膜,以分析(例如,诊断或预测)(自发性)早产的风险。
[0452] 阴道粘液膜的谱分析可使得能够基于阴道粘液膜中的微生物(例如细菌)多样性来早期鉴定女性(例如,怀孕期间处于感染风险的妇女)。此外,这实现了靶向治疗反应策
略。
[0453] 考虑了各种实施例并且其包括:(i)鉴定与特定微生物(例如,细菌群落)相关的阴道粘液膜代谢物生物标志物,任选地如使用测序微生物组分析所确定;(ii)健康怀孕期间
阴道粘膜分析,其中可详细地表征健康怀孕期间排泄的微生物(例如,细菌特异性代谢物和特征标记);以及(iii)鉴定来自具有不良怀孕结局(例如早产)的阴道粘膜的诊断和预后代
谢特征标记。
[0454] 将了解的是,各种实施例提供用于非入侵快速分析来自医学棉签表面的粘膜代谢物组分布图的新解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱设置。已成功显示这种安排以能够区分动物(例如,人类)粘膜模型并且实现微生物鉴定。
[0455] 因为解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱允许保存样品表面材料的主要内容物的破坏性较小的分析方法,所以根据各种实施例,医学棉签可任选地在解吸电喷
雾电离 (“DESI”)分析之后直接送到微生物实验室以用于进一步培养和微生物鉴定/证实。
[0456] 各种实施例提供新的床旁检测粘膜筛选诊断方法,其使用标准医学棉签作为用于粘膜获取的取样探针和用于解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱分析的电离探针。在数据获取之后,可将所获得的谱与在数据库中收集的谱比较以例如在若干秒内对患
者提供快速诊断。
[0457] 各种实施例涉及应用解吸电喷雾电离(“DESI”)技术来从标准医学棉签表面中直接代谢组学特征分析特定粘液模型(鼻、阴道、咽、支气管、食管的)。各种实施例涉及用于疾病的快速床旁检测诊断方法,这些疾病任选地选自在此提到的任何疾病,例如像在免疫学
病症中的炎性和病原体相关的疾病、微生物群落生态失调(其可以例如指示怀孕期间早产
的风险)、微生物(例如细菌)感染、或癌症或癌症前状态的检测。动物(例如,人类)粘膜的代谢组学特征分析接着详细的统计分析容许以有益于床旁检测诊断方法的快速有力的方式
鉴定疾病特异性代谢分布图和/或分类单元特异性微生物(例如细菌)标志物。
[0458] 如图39所示,根据各种实施例,在棉签上取样391的样品的解吸电喷雾电离(“DESI”) 谱分析390可经受统计分析392以便提供诊断393(或预后)。
[0459] 另外地或可替代地可通过快速蒸发电离质谱(“REIMS”)394或任何其他环境电离质谱和/或离子迁移谱方法来分析样品。
[0460] 考虑了其中可对同一棉签(或另一个棉签)应用多种不同分析技术以便另外地进行依赖于培养165的分析(诸如DNA提取和PCR分析),例如以产生补充16S rRNA微生物组数
据的实施例。
[0461] 如图39所示,任何一种或多种或全部另外的分析可用于验证基于解吸电喷雾电离 (“DESI”)的诊断393。
[0462] 在此所述的各种实施例还涉及快速蒸发电离质谱(“REIMS”)分析棉签的方法,其中棉签上的样品经受快速蒸发电离质谱(“REIMS”)分析。然而,这种方法对棉签是破坏性的,并且在双极模式下电极的触点闭合受限制。
[0463] 当通过快速蒸发电离质谱分析棉签时,则可将棉签蘸入、浸泡或以另外的方式浸入流体 (诸如水)中,之后受到快速蒸发电离质谱(“REIMS”)分析。
[0464] 如上所讨论,使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱来分析提供在医学棉签上的样品的具体益处是可进行同一样品(即同一棉签)的多种不同分析。
[0465] 进行同一样品的多种不同分析或对同一样品进行多种不同分析使得能够以特别方便和有效的方式获得关于同一样品的不同组信息。这是特别有可能的,因为解吸电喷雾
电离 (“DESI”)质谱和/或离子迁移谱是相对非破坏性分析技术,并且还因为各种商业分析技术 (诸如培养技术和核酸测序技术例如16S rRNA测序技术)被优化成使用提供在医学棉
签上的样品。
[0466] 因此,在棉签上获得单个样品之后,可使用多种不同分析技术来分析棉签上的样品多次,其中至少一种技术(例如所使用的第一技术)包括解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱
和/或离子迁移谱。
[0467] 如实例16所示,通过解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱和/或离子迁移谱来分析医学棉签。
[0468] 如实例19和图54-56所示,通过本发明的方法分析健康粘液膜下层和GI息肉。在粘液膜下层和粘膜层的快速蒸发电离质谱指纹图谱之间观察到明显差异。这可任选地被开发
作为用于介入外科手术例如内窥镜检查的潜在安全功能。
[0469] 与纯粹地诊断程序相比,涉及电烙术的结肠镜检查程序与穿孔风险增加9倍相关。还已报道溃疡病灶的内粘膜切除(“EMR”)处于更高的穿孔风险。任选地,本发明的方法可在 GI外科手术中使用REIMS以分析外科手术(诸如息肉切除术或内粘膜切除)期间是否存在粘
膜下层缺口。因此,外科手术的方法可涉及使用在此所述的REIMS技术来分析外科手术 (诸如息肉切除术或内粘膜切除)期间是否存在粘膜下层缺口。
[0470] 因此,该方法有利地帮助降低穿孔率和与这种并发症相关的严重发病率。
[0471] 可向电外科工具的使用者提供实时和/或滞后信息,该信息可包括谱信息和/或组织分类信息。还可提供反馈装置和/或警报和/或警告,以便向电外科工具的使用者提供来
自不希望的靶区域或范围的分析物正被分析仪分析或电外科工具正在不希望的靶区域或
范围中操作和/或位于不希望的靶区域或范围的反馈和/或警报和/或警告。
[0472] 该方法可任选地用于分析粘液膜中的癌症,如实例20中所展示。
[0473] 微生物和/或微生物组的分析
[0474] “微生物(microbe)”(又称为微生物(micro-organism))是太小而不能被裸眼所见的生物体,即是用显微镜可见的。微生物可选自细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒。
虽然术语细菌、真菌、古生菌、藻类、原生动物和病毒在学术上指代复数形式,但也使用它们来指代单数形式是常见的做法。因此,术语“细菌(bacteria)”和“细菌(bacterium)”在此可互换使用;术语“真菌(fungi)”和“真菌(fungus)”在此可互换使用;术语“古生菌 
(archaea)”和“古生菌(archaeum)”在此可互换使用;术语“原生动物(protozoa)”和“原生动物(protozoum)”在此可互换使用;以及术语“病毒(viruses)”和“病毒(virus)”在此可互换使用。
[0475] 在微生物的情况下,分析可任选地在任何分类学层次上,例如在界、门或部、纲、目、科、属、种和/或株层次。
[0476] “分类学”是生物体的分类,并且每个分类层次可被称为“分类单元(taxon)”(复数:分类单元(taxa))。生物体可按越来越具体的顺序分类成以下分类单元:界、门或部、纲、目、科、属、种和株。可存在每个分类单元的进一步细分。必须了解,在广大的科学界内,在一些分类学分类内存在一些不符合之处。还可能缺乏关于某些微生物命名的共识,从而导致特定微生物具有多于一种名称或两种不同微生物具有相同名称。
[0477] 作为速记,使用术语微生物的“类型”是指在任何分类学层次下与另一种微生物不同的微生物。
[0478] 在一些实施例中,微生物可选自细菌、真菌、古生菌、藻类和原生动物。在一些实施例中,它可选自细菌和真菌。在一些实施例中,它可选自细菌。
[0479] 微生物可以是单细胞的或多细胞的。如果微生物是真菌,它可任选地是丝状的或单细胞的,例如酵母。
[0480] 真菌可任选地是酵母。它可任选地选自曲霉属、节束酵母属、酒香酵母属、假丝酵母属、隐球酵母属、德巴利酵母属、地霉属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、毛孢子菌属和长双头有孢圆酵母属(Zygotorulaspora)。
[0481] 其可任选地选自物种Arthroascus schoenii、异酒香酵母菌(Brettanomyces bruxellensis)、白色假丝酵母、C.ascalaphidarum、C.amphixiae、南极假丝酵母、
C.argentea、大西洋假丝酵母、大气假丝酵母(C.atmosphaerica)、蟑螂假丝酵母
(C.blattae)、C.bromeliacearum、嗜果实假丝酵母(C.carpophila)、C.carvajalis、
C.cerambycidarum、C.chauliodes、延胡索假丝酵母(C.corydali)、C.dosseyi、杜氏假丝酵母、C.ergatensis、C.fructus、光滑假丝酵母、发酵假丝酵母、吉利蒙假丝酵母、希木龙假丝酵母、C.insectamens、昆虫假丝酵母、中间假丝酵母、C.jeffresii、乳酒假丝酵母、
C.keroseneae、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母菌、 C.lyxosophila、麦牙糖假丝酵母、海洋假丝酵母、膜醭假丝酵母、梅林假丝酵母菌、莫格假丝酵母、橄榄假丝酵母菌、
C.oregonensis、近平滑假丝酵母、桔假丝酵母、皱褶假丝酵母、清酒假丝酵母、休哈塔假丝酵母、假诺卡氏菌(C.temnochilae)、纤细假丝酵母、C.theae、 C.tolerans、热带假丝酵母、C.tsuchiyae、C.sinolaborantium、酱油假丝酵母(C.sojae)、 C.subhashii、维斯假丝酵母(C.viswanathii)、产朊假丝酵母菌、C.ubatubensis、C.zemplinina、新型隐球菌、指甲隐球酵母、卡森德巴利酵母、头状地霉菌、阿氏丝孢酵母、粘性丝孢酵母、墨汁丝孢酵母、酿酒酵母、金合欢毕赤酵母(Pichia  acaciae)、异常毕赤酵母、荚膜毕赤酵母(Pichia 
capsulata)、粉状毕赤酵母、吉利蒙毕赤酵母、斯巴达克毕赤酵母、奥默毕赤酵母、胶黏红酵母(Rhodotorula glutinous)、粘质红酵母、布拉迪酵母、酿酒酵母和/或 Zygotorulaspora florentinus。
[0482] 原生动物可选自以下各项的组:变形虫、鞭毛虫、纤毛虫或孢子虫。其可选自棘阿米巴属、巴贝虫属、肠袋虫属、隐孢子虫属、双核阿米巴属、内阿米巴属、贾第虫属、利什曼原虫属、耐格里属、疟原虫属、草履虫属、毛滴虫属、锥虫属、Typanosoma、弓形虫属。
[0483] 原生动物可具有物种结肠小袋纤毛虫、痢疾内变形虫、兰伯贾第虫(又称为肠贾第虫或十二指肠贾第虫)、杜氏利什曼原虫、热带利什曼原虫、巴西利什曼原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、亚种疟原虫、P.gaboni、墨西哥疟原虫、佛罗里达疟原虫、布氏锥虫、伊氏锥虫、罗得西亚锥虫、克氏锥虫、刚地弓形虫。
[0484] 细菌可任选地选自门产水菌门(Aquficae)、热袍菌门、热脱硫杆菌门、异常球菌-栖热菌门、产金菌门、绿弯菌门、热微菌门、硝化螺菌门、脱铁杆菌门、蓝细菌门、绿菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、浮霉菌门、衣原体门、螺旋体门、纤维杆菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、疣微菌门、网团菌门、芽单胞菌门(Gemmatomonadetes)和黏胶球形菌门。
[0485] 细菌可任选地选自放线菌纲、α-变形菌纲、芽孢杆菌纲、β-变形菌纲、梭菌纲、δ-变形菌纲、ε-变形菌纲、黄杆菌纲、梭杆菌纲、γ-变形菌纲、Mikeiasis纲、柔膜菌纲或Negativicutes 纲。
[0486] 细菌可任选地具有气单胞菌目、放线菌目、芽孢杆菌目、拟杆菌目、双歧杆菌目、伯克氏菌目、弯曲菌目、柄杆菌目、心杆菌目、梭菌目、肠杆菌目、黄杆菌目、梭杆菌目、乳杆菌目、微球菌目(Micrococcales)、奈瑟菌目、巴斯德氏菌目、假单胞菌目、根瘤菌目、红螺菌目、Selenomonadales目、弧菌目、黄色单胞菌目。
[0487] 细菌可任选地选自醋杆菌科、产碱菌科、芽胞杆菌科、拟杆菌科、伯克氏菌科、柄杆菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、梭杆菌科、诺卡氏菌科、普雷沃氏菌科、紫单胞菌科、假单胞菌科、理研菌科、根瘤菌科、萨特氏菌科。
[0488] 细菌可任选地具有选自以下各项的属:例如,营养缺陷菌属、无色杆菌属、食酸菌属、不动杆菌属、放线杆菌属、马杜拉放线菌属、放线菌属、气球菌属、气单胞菌属、厌氧球菌属(Anaerococcus)、红孢子虫属、芽胞杆菌属、拟杆菌属、巴尔通氏体属、双歧杆菌属、博代氏菌属、疏螺旋体属、短波单胞菌属、布鲁氏菌属、伯克氏菌属、弯曲杆菌属、二氧化碳噬纤维菌属、衣原体属、柠檬酸杆菌属、嗜衣体属、金黄杆菌属、梭状芽胞杆菌属、丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、柯克斯体属、贪铜菌属、代尔夫特菌属、皮杆菌属、埃立克体属、肯菌属、肠杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、丹毒丝菌属、费克蓝姆菌属(Facklamia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、孪生球菌属、戈登氏菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、微球菌属、莫拉氏菌属、摩根氏菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟氏菌属、诺卡氏菌属、东方体属、潘多拉菌属(Pandoraea)、巴斯德菌属、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、消化链球菌属、邻单胞菌属、卟啉单胞菌属、假单胞菌属、普氏菌属、变形杆菌属、丙酸杆菌属、红球菌属、罗尔斯通菌属、拉乌尔菌属、立克次体属、罗思氏菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、坦纳菌属、密螺旋体属、脲原体属、弧菌属或耶尔森菌属。
[0489] 细菌可任选地具有选自以下物种:例如,软弱贫养菌、木糖氧化无色杆菌、燕麦食酸菌、西瓜嗜酸菌、Akkermansia muciniphila、炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、汉氏巴尔通体、五日热巴尔通体、百日咳博德特菌、伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、基因组型伯克霍尔德菌(Burkholderia genomovars)、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、克氏柠檬酸杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、极小棒状杆菌、模拟棒状杆菌(C.imitans)、无枝菌酸棒状杆菌、代尔夫特食酸菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、具核梭杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、圣地罗西钩端螺旋体、韦氏钩端螺旋体、野口钩端螺旋体、伊氏李斯特菌、单核细胞增多性李斯特菌、滕黄微球菌、摩氏摩根菌、卡他莫拉菌、禽结核分枝杆菌、偶发分枝杆菌、麻风分枝杆菌、
M.peregrium、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟氏菌、乳糖奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟菌、星形诺卡菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、马红球菌、嗜吡啶红球菌、立氏立克次体、伤寒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、索氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌。
[0490] 病毒可任选地是DNA病毒和RNA病毒或逆转录病毒。它可任选地是单链(ss)或双链 (ds)病毒。更具体地,它可任选地是ssDNA、dsDNA、dsRNA、ssRNA(正链)、ssRNA (负链)、ssRNA(逆转录)或dsDNA(逆转录)病毒。
[0491] 它可任选地选自以下各项中的一种或多种:疱疹病毒科,任选地选自单纯疱疹病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、淋巴潜隐病毒和/或猴疱疹病毒(Rhadinovirus);
腺病毒科,任选地选自腺病毒和/或乳腺腺病毒;乳头瘤病毒科,任选地选自α乳头瘤病毒、β乳头瘤病毒、γ乳头瘤病毒、μ乳头瘤病毒和/或ν乳头瘤病毒;多瘤病毒科,任选地选自多瘤病毒;痘病毒科,任选地选自软疣病毒、正痘病毒和/或副痘病毒;指环病毒科,任选地选自α细环病毒、β细环病毒和/或γ细环病毒;真菌DNA病毒科(Mycodnaviridae),任选地选自 Gemycircular病毒;细小病毒科,任选地选自红病毒、依赖病毒和/或博卡病毒;呼肠病毒科,任选地选自科罗拉多壁虱热病毒、轮状病毒和/或东南亚十二节段RNA病毒
(Seadornavirus);冠状病毒科,任选地选自α冠状病毒、β冠状病毒和/或环曲病毒;星状病毒科,任选地选自星状病毒;杯状病毒科,任选地选自诺如病毒和/或沙波病毒;黄病毒科,任选地选自黄病毒、肝炎病毒和/或Pegivirus;小RNA病毒科,任选地选自心病毒、
Cosavirus、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒属、罗沙病毒(Rosavirus)和/或
Salivirus;披膜病毒科,任选地选自甲病毒和/或风疹病毒;弹状病毒科,任选地选自狂犬病毒和/或水泡性病毒。丝状病毒科,任选地选自埃博拉病毒和/或马尔堡病毒;副粘液病毒科,任选地选自亨尼帕病毒、 Heffalumpvirus、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒和/或肺炎病毒;沙粒病毒科,任选地选自沙粒病毒;布尼亚病毒科,任选地选自汉坦病毒、内罗病毒、正布尼亚病毒 (Orthobunyavirus)和/或白蛉病毒;正粘病毒科,任选地选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和/或托高土病毒;逆转录病毒科,任选地选自γ逆转录病毒、δ逆转录病毒、慢病毒、泡沫病毒;嗜肝DNA病毒科(Epadnaviridae),任选地选自正嗜肝DNA病毒;肝炎病毒;和/或丁型肝炎病毒。
[0492] 微生物可任选地是致病性或非致病性。致病性微生物(其又可称为“病原体”)可被定义为能够在宿主(诸如植物或动物)中引起疾病的微生物。病原体可任选地是专性病原体或机会病原体。
[0493] 微生物引起疾病的能力取决于其内在的毒力因子和宿主击退微生物的能力两者。因此,非病原体与机会病原体之间的区别还不清楚,因为例如免疫低下的宿主将易受可能
不会感染具有健康免疫系统的宿主的微生物所引起的感染。
[0494] 例如,淋病奈瑟氏菌是专性病原体,铜绿假单胞菌和白色假丝酵母通常被称为机会病原体,并且嗜酸乳杆菌和双歧杆菌通常被认为是非病原体,并且可被称为“共生体”。
[0495] 药物(诸如抗微生物药物和/或抗炎性药物)也可形成其中微生物将作为机会病原体活跃的环境。因此,使用药物可改变微生物组。因此,该方法可任选地涉及分析微生物组(例如,粘膜微生物组)以分析对药物的响应。
[0496] 致病性微生物可任选地通过一种或多种毒力因子(即允许或促进宿主感染的因子)的表达来表征。毒力因子可任选地选自介导细胞粘附、细胞生长、绕过或战胜宿主防御机制的能力和/或产生毒素的因子。毒素可选自外毒素和内毒素。该方法可任选地涉及分析一种或多种毒力因子。
[0497] 共生微生物是作为人类或动物天然菌群的一部分并且处于平衡状态不会引起疾病的那些。
[0498] 在特定环境中的微生物群落可被称为“微生物组”。因此,微生物组包括居住于人类或非人类动物身体(例如人类身体)的微生物群落。人类和非人类动物已与微生物共同进化为共生系统。微生物群落的复杂反应影响健康和疾病。
[0499] 微生物组可以是数量庞大且种类繁多的不同微生物的复杂混合物。估计GI微生物组包括超过100万亿个微生物,这些微生物代表至少几百或甚至超过一千多种不同的物种。
健康人类肠道菌群被拟杆菌门和厚壁菌门主导,而例如变形菌门、疣微菌门、放线菌门、梭杆菌门和蓝细菌门通常以少量的比例存在。
[0500] 微生物组可在相同人类或动物体内的一个环境与另一个环境之间变化,所以人的胃肠 (GI)微生物组可不同于人的鼻微生物组。GI微生物可进一步被分成不同的GI区,诸如胃、十二指肠、空肠、回肠和/或结肠。管腔微生物组也可与粘膜微生物组不同。每个微生物组也可在一个个体与另一个个体之间变化。正常微生物组的混乱可被称为“生态失调”。生态失调可引起疾病(诸如在此提到的任何疾病)或与其相关。该方法可任选地涉及微生物组
的分析以分析失调。GI微生物组还可被称为“肠道菌群”。
[0501] 微生物组可在怀孕期间改变,所以女性或雌性(人类或动物)微生物组的分析可允许对怀孕的分析。怀孕中的生态失调与诸如早产风险增加的并发症相关。
[0502] 生态失调可涉及一种或多种类型的微生物的存在,该一种或多种类型的微生物通常或先前不存在于特定微生物组中。然而,更常见地,生态失调可涉及一种或多种特定微生物的比例相对增加和/或一种或多种特定微生物的比例相对减小。
[0503] 如上所提到,粘液膜包括粘液层。微生物(诸如细菌)可粘附到和/或部分或完全地渗透粘液层。微生物粘附和/或增殖可受以下各项影响:存在于粘蛋白上的碳水化合物改
性;抗微生物剂,诸如宿主来源的抗微生物肽;药物;和/或毒素,诸如由(致病性)微生物产生的毒素。
[0504] 在至少约80%的健康人类中,粘液层下面的粘膜(上皮)表面不含微生物。粘液层的厚度和其扩散可例如变化,它们可随着炎症的严重性增加而减小。在某些情况下,例如,在疾病中,微生物可渗透和/或粘附到粘液层、上皮和/或LP。例如,细菌可通常存在于来自具有溃疡性结肠炎、SLC和/或急性阑尾炎的受试者的活检标本的粘液内。粘液层内的微生
物浓度可与白细胞数负相关。
[0505] 在此使用术语“粘膜微生物组”指代与粘液膜相关的微生物组,其包括已渗透粘液膜的微生物组和与粘液层相关(例如,通过粘附或部分或完全渗透)的微生物组。
[0506] 该方法可任选地涉及靶标的分析以检测、鉴定和/或表征微生物。例如,该方法可用于分析靶标是否是无菌或非无菌的;所存在的任何微生物是否是致病的或共生的;所存
在的任何微生物是否是感染的病因;和/或存在于靶标本中的任何微生物是否存在于提供
该标本的受试者中,或微生物是否代表标本污染。例如,当取得血液样品时,通常存在血液变成被存在于针插入的部位处或周围的微生物污染的风险,这可导致微生物存在于将以另
外的方式不含有所述微生物的血液样品中并且因此检测血液样品中的微生物。因此,该方
法可任选地用于确定存在于靶标中的任何微生物的重要性;和或确定标本来源于其中的受
试者是否应当接受抗微生物治疗。
[0507] 该方法可任选地涉及感染的分析,例如感染的诊断,引起感染的微生物的基因型或表型的分析,监测感染的进展和/或监测响应于感染的治疗。
[0508] 该方法可任选地涉及接种疫苗的分析。这可例如涉及分析在接种疫苗前后的靶标。任选地,受试者可在用接种疫苗旨在对抗的微生物进行的接种疫苗之后被攻击,并且然后可分析适合的靶标以确定是否存在微生物或微生物以何种水平存在。微生物的存在或水
平可指示接种疫苗的成功,例如不存在或存在低水平的微生物可指示接种疫苗成功,而存
在微生物或存在高水平的微生物可指示疫苗不足或无效。
[0509] 粪便或体液标本分析
[0510] 粪便或体液标本的分析可提供关于疾病和/或微生物组,任选地粘膜微生物组和/或GI 管腔的微生物组的信息。因此,任选地,该方法可涉及粪便和/或体液标本的分析。例如,可分析粪便和/或体液标本的细胞、化合物和/或微生物的存在。
[0511] 该方法可任选地允许分析不同病症之间的代谢差异,这些病症可任选地选自在本文的其他地方列出的任何病症,例如肠道易激综合症、结肠直肠癌和/或炎症性肠病。通过鉴定分类学特异性生物标志物,该方法可任选地允许分析(例如,诊断)微生物感染和/或混合微生物群落。
[0512] 该细胞可例如是哺乳动物细胞、白细胞、红细胞、胎儿细胞和/或癌细胞。
[0513] 该化合物可例如包括生物分子、有机化合物和/或无机化合物或由其组成。任选地,它可以是胆汁、血红蛋白或任何其衍生物。
[0514] 任选地,可分析粪便和/或体液标本的微生物的存在和/或对其分析微生物组。在本文的其他地方提供微生物和/或微生物组的分析的细节。
[0515] 任选地,可分析除了血液以外的粪便和/或体液标本的血液存在。例如,尿液中的血液存在可指示感染或其他疾病。例如,粪便标本中的血液存在可任选地用于分析GI道和/或肛门中的出血。任选地,出血可指示例如选自以下各项的疾病:肛裂、憩室病、炎性疾病、血管发育不良和/或在本文的其他地方提到的任何疾病。
[0516] 任选地,可分析粪便和/或体液标本的胆汁或其衍生物的存在,例如以分析肝脏和/或肾脏疾病和/或在本文的其他地方提到的任何疾病。
[0517] 任选地,可分析粪便和/或体液标本的化合物的存在和/或水平,例如包括以下各项或由其组成的化合物:脂质,诸如糖脂或磷脂;碳水化合物;DNA;RNA;蛋白质;多肽,诸如核糖体肽或非核糖体肽;寡肽;脂蛋白;脂肽;氨基酸;和/或化学分子,任选地是有机化学分子。任选地,该化合物可以是内源性的(即由受试者产生)或外源性的(即给予、摄取或以另外的方式引入受试者中)。
[0518] 任选地,该化合物可以是治疗性药物、违禁药物、或治疗性或违禁药物的代谢物或衍生物。
[0519] 它可任选地例如选自在此提到的任何药物或药剂,和/或墨斯卡灵、PCP(苯环利定)、裸盖菇素、LSD、海洛因、吗啡、可待因、右旋苯丙胺、安非他酮、卡西酮、二甲磺酸赖右苯丙胺、阿洛巴比妥、苯烯比妥(5-烯丙基-5-苯基巴比妥酸)、异戊巴比妥、阿普比妥、溴烯比妥、丁巴比妥、布他比妥、环己巴比妥、甲苯比妥、甲基苯巴比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥和/或硫喷妥钠。雷尼替丁、苯丙氨酸 PKU、二甲基戊胺、可卡因、安定、雄烯二酮、豆固酮、雄甾酮半琥珀酸酯、5α-雄甾烷-3β,17β- 二醇-16-酮、雄甾酮葡糖苷酸、表睾酮、6-脱氢胆甾烯酮、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、西他马喹(sitamaquine)、特非那定、哌唑嗪、美沙酮、阿米替林、去甲替林、哌替啶、DOPA、麻黄碱、布洛芬、普洛尔、阿替洛尔、醋氨酚、bezethonium、西酞普兰、右啡烷、紫杉醇、氯胍、辛伐他汀、舒尼替尼、替米沙坦、维拉帕米、阿米替林、帕唑帕尼、它莫西芬、伊马替尼、环磷酰胺、伊立替康、多西他赛、拓扑替康、酰基肉碱 (C2-C18)、烟碱、可替宁、反式-3’-羟基可替宁、新烟碱、安非他明、安非他明样兴奋剂、甲基苯丙胺、MDA、MDMA、MDEA、吗啡、Δ9-THC、他克莫司、苯乙铵、氨甲丙二酯、 O-去甲基-顺式-曲马多、卡立普多、曲马多、去甲西泮、EDDP、norhydrocodone、氢吗啡酮、可待因、羟基安定、去甲羟考酮、阿普唑仑、羟考酮、丁丙诺啡、去甲丁丙诺啡、芬太尼、丙氧芬、6-单乙酰吗啡、咖啡因、卡巴多司、卡马西平、异羟基洋地黄毒苷、地尔硫卓、苯海拉明、心得安、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑、噻苯咪唑、氯胺酮、去甲氯胺酮、BZE、 AMP、MAMP和/或6-MAM。
[0520] 粪便标本的分析可任选地涉及使用基于钳子的REIMS,其中粪便标本的样品可在钳子之间取得并且然后探针可聚集一起。
[0521] 成像
[0522] 根据在此的各种实施例,离子成像可用于产生靶标的一种或多种特性的图像或图谱。这可通过以下方式来实现:使用第一装置以从靶标的多个不同区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气;使起源于不同区域的烟雾、气溶胶或蒸气中的分析物电离以产生分析物离子(或来源于此的离子,例如碎片离子);并且然后分析分析物离子(或来源于此的离子)以获得针对靶标的每个区域的谱数据。将谱数据与其相关的靶标的区域(即烟雾、气溶胶或蒸气从其中产生,谱数据起源于其中)相互关联以便产生图像或图谱数据。然后可基于图像或图谱数据产生靶标的图像或图谱。例如,靶标的每个区域的一种或多种特性可从谱数据中确定,并且这可包括在图像或图谱数据中,因此映射为靶标内位置的函数。然后可向使用者展示图像
或图谱数据。
[0523] 第一装置可安排在靶标的多个间隔开的区域之间,以便从靶标的不连续区域产生气溶胶、烟雾或蒸气。可替代地,多个装置可用于从靶标的不连续区域产生气溶胶、烟雾或蒸气,任选地同时。这些多个装置可以不在靶标上移动,但可移动成与靶标接合和不接合。
因此可进行靶标的空间分析(例如,其不会进行连续映射)。可替代地,第一装置可在靶标上或穿过靶标连续移动,以便从靶标的不同区域中产生气溶胶、烟雾或蒸气。第一装置或多个装置的任何移动可以是自动的并且受机器控制。
[0524] 可分析对于每个区域的谱数据并且转化为代表靶标中的所述区域处的材料的类型、病症或成分的数据。
[0525] 然后可将代表性数据展示为图像或图谱,该图像或图谱示出了靶标中作为位置函数的材料的类型、病症或成分。
[0526] 例如,代表性数据可指示以下各项的类型、水平、存在和/或不存在:靶标中每个区域处的患病材料;癌性材料和/或坏死材料。例如,谱数据可用于鉴定和/或展示靶标中患病组织、癌性组织和/或坏死组织的边限的位置。这些组织类型(诸如肿瘤组织)可很类似正常组织并且可具有模糊的界限,从而难以确定肿瘤在哪里结束以及正常组织在哪里开始。本发明的方法使得能够鉴定此类组织边限的位置。
[0527] 另外地或可替代地,谱数据可用于鉴定和/或展示所关注的一种或多种细胞或组织类型的位置和/或边限。例如,所关注的细胞或组织类型可包括靶标中患病和/或癌性和/或坏死组织或细胞;和/或所关注的细胞或组织类型可包括健康组织或细胞。
[0528] 代表性数据可指示靶标中不同类型的细胞或成分。
[0529] 另外地或可替代地,代表性数据可指示靶标内一种或多种类型的微生物的存在和/或分布。
[0530] 另外地或可替代地,代表性数据可指示靶标内一种或多种类型的化合物的存在和/或分布。
[0531] 另外地或可替代地,代表性数据可指示靶标中生物标志物的类型或水平,并且可鉴定和 /或展示靶标内生物标志物的类型或水平的分布。
[0532] 可实时产生和/或展示离子成像和图谱数据。这可例如有用于确定外科手术期间进行的行为。第一装置和/或另一个工具的至少一部分相对于靶标的位置可例如实时展示
在图像或图谱上。例如,外科手术工具(诸如用于切除或消融组织的工具)的位置可展示在
靶标的图像上。这使得外科医生能够基于在图像或图谱中展示的代表性数据而选择性地切
除或消融组织。
[0533] 离子成像质谱和/或离子迁移谱技术(诸如DESI-MS和/或REIMS技术)可任选地用于获得对于靶标的不同区域的谱数据。REIMS技术装置可任选地在切割和/或指向模式下使
用。
[0534] 离子成像展示在实例18中,并且示例性细节还提供在实例21中。
[0535] 这种离子成像分析可任选地与另外的标本分析组合。另外的分析方法和工具的细节在本文的其他地方提供。任选地,质谱和/或离子迁移谱成像的结果可与另外的分析的结果相互关联。
[0536] 例如,任选地该方法可用于成像以在肿瘤、基质和/或健康组织之间区分。
[0537] 治疗相关的方法
[0538] 本发明的方法可任选地用于监测疾病的进展。
[0539] 在治疗期间或继治疗之后,本发明的方法可任选地用于监测疾病的进展以评价治疗的有效性或监测治疗的进展。
[0540] 任选地,对靶标变化的连续(周期性)分析可用于评价治疗是否有效;治疗有效的程度;疾病在受试者中是否复发或进展;和/或评价复发或进展带来的疾病可能的临床结局(预后)。
[0541] 任选地,该方法可用于主动监测尚未受到治疗的受试者,例如以监测未治疗的受试者中的疾病进展。任选地,对靶标变化的连续(周期性)分析可用于评价疾病是否进展或
进展的程度,因此例如允许做出关于治疗性干预是否必要或明智的更合理的决定。
[0542] 此种监测可任选地在健康个体(例如被认为处于发展具体疾病风险的个体)上进行,以便获得所述疾病的早期和理想地临床前指征。具体实例是宫颈涂片测试以分析宫颈
的癌症或癌前生物标志物。
[0543] 技术人员将了解,在此提供的任何方法可任选地与在此提供的其他方法中的一种或多种和/或与一种或多种另外的方法组合。
[0544] 例如,提供了作为与在此披露的方法中的两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种)的组合的方法。在此披露的诊断、预后、预测、评价、监测和/或分层方法中的两种或更多种可以任何组合进行组合。当对方法进行组合时,每种方法可被称
为步骤。在此提供的关于本发明的方法的详情需在细节上作必要的修改来适用于这些步
骤。
[0545] 因此,提供了评价疾病的发作和病程的方法,所述方法包括选自以下各项的至少两个步骤:诊断疾病步骤、监测疾病进展步骤、预测疾病对治疗响应的可能性的步骤、分层步骤、预后步骤和评价对治疗的响应的步骤。任选地,所述方法包括这些步骤中的至少3个、
4个、 5个或6个。任选地,任何这些步骤可进行多于一次。例如,监测疾病进展步骤可任选地在治疗前后进行。
[0546] 任选地,在此提供的任何方法还可包括确定受试者是否应当接受治疗的步骤。适合的治疗在本文的其他地方进行讨论。具体地说,如果该方法涉及确定受试者患有疾病、疾病已发展、疾病已进展、预后不良、疾病可能响应于治疗和/或疾病已响应于治疗,则该方法可包括确定受试者应当接受适当治疗的步骤。
[0547] 任选地,在此提供的任何方法还可包括确定正接受或已接受治疗的受试者是否应当改变或中止治疗的步骤。例如,该方法可任选地包括确定治疗剂量和/或频率应当增加还是减少的步骤。具体地说,如果该方法涉及确定疾病的一种或多种生物标志物增加、随时间推移增加或响应于治疗尚未减少(或未明显减少),则该方法可任选地包括确定治疗剂量
和/或频率应当增加的步骤;而如果该方法涉及确定疾病的一种或多种生物标志物未增加、随时间推移减少或响应于治疗减少,则该方法可任选地包括确定治疗剂量和/或频率应当
减少或可以中止治疗的步骤;或反之亦然。
[0548] 该方法可包括确定具体治疗应当被另一种治疗替代,例如一种药物应当用另一种药物替代的步骤。具体地说,如果该方法涉及确定疾病的一种或多种生物标志物增加、随时间推移增加或响应于治疗尚未减少(或未明显减少),则该方法可包括确定治疗应当被另一
种治疗替代的步骤;而如果该方法涉及确定疾病的一种或多种生物标志物未增加、随时间
推移减少或响应于治疗减少,则该方法可包括确定治疗不应当被另一种治疗替代的步骤;
或反之亦然。
[0549] 任选地,在此提供的任何方法还可包括向所述受试者给予治疗的步骤。然后,该方法可例如被称为以下各项的方法:诊断和治疗;监测和治疗;预后和治疗;预测和治疗;或分层和治疗。
[0550] 任选地,在此提供的任何方法可连同任何其他已知的方法一起使用,具体地已知的对疾病的诊断、预后、预测和/或监测方法。
[0551] 治疗和药剂
[0552] 癌症治疗和抗癌剂
[0553] 治疗可任选地是抗癌治疗,例如,如果检测到癌症。在此提及“抗癌治疗”包括用于治疗癌症的任何治疗/药剂。术语“药物治疗”、“药物”和“药剂”在此可互换使用。治疗可任选地涉及外科手术、辐射和/或药物。药物治疗可任选地涉及化疗。任选地,治疗可以是其中同时、分开或依次使用2种或更多种不同治疗剂的组合治疗。
[0554] 外科手术可任选地选自例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术。
[0555] 药物可任选地选自例如使用例如它莫西芬或芳香化酶抑制剂的激素疗法。药物治疗可任选地涉及例如对由癌细胞表达的受体特异的抗体,其可任选地缀合到化疗药物或放
射性粒子。
[0556] 抗体可任选地例如选自HER-2/neu特异性单克隆抗体,诸如曲妥珠单抗(赫赛汀);阿德木单抗、阿仑单抗、布利莫单抗、贝伐单抗、卡妥索单抗、西妥木单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和/或替伊莫单抗。
[0557] 药物治疗可任选地涉及例如抗血管生成剂。
[0558] 药物治疗可任选地涉及例如细胞生长抑制剂,任选地选自烷化剂、交联剂、嵌合剂、核苷酸类似物、纺锤体形成抑制剂和/或拓扑异构酶I和/或II的抑制剂。
[0559] 更具体地,其可任选地选自例如放线菌素D、BCNU(卡莫司汀)、卡铂、CCNU、喜树碱(CPT)、斑蝥素、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、道诺霉素、多西他赛、阿霉素、DTIC、表柔比星、依托泊苷、吉非替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、离子霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利铂、紫杉醇(紫杉酚)、PARP-1抑制剂、多西他赛、替莫唑胺(TZM)、替尼泊苷、拓扑替康、苏消安、长春瑞滨、长春新碱、长春花碱、5-氮胞苷、5,6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。
[0560] 抗微生物治疗
[0561] 该治疗可任选地是抗微生物治疗,例如,如果检测到微生物感染或失衡。
[0562] 术语“抗微生物剂”包括针对任何类型的微生物起作用的任何药剂。因此,抗微生物剂可任选地选自抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。更具体地,它可任选地选自氨基糖苷、β-内酰胺抗生素、氯霉素、氟喹诺酮、糖肽、林可胺、大环内酯、多粘菌素、利福平、链阳菌素、磺胺、四环素和/或二氨基嘧啶。
[0563] 氨基糖苷可任选地选自庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、链霉素、卡那霉素。β-内酰胺抗生素可任选地选自盘尼西林,诸如甲氧西林、盘尼西林、阿莫西林、氨比西林、羧苄青霉素、苯唑西林或萘夫西林;头孢菌素,诸如头孢菌素、头孢羟唑、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮或头孢曲松钠;碳青霉烯,诸如亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南;或单菌霉素,诸如氨曲南。氟喹诺酮可任选地选自恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、二氟沙星、依巴沙星、马波沙星、普多沙星和奥比沙星。糖肽可任选地选自万古霉素、替考拉宁和阿伏帕星。林可胺可任选地选自林可霉素、克林霉素和吡利霉素。大环内酯可任选地选自红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、替米考星和托拉霉素。多粘菌素可任选地选自多粘菌素B和粘菌素(多粘菌素E)。利福平可任选地选自利福平、利福布汀和利福喷汀。链霉杀阳菌素可任选地选自维及霉素。磺胺可任选地选自磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺多辛。四环素可任选地选自金霉素、土霉素、去甲金霉素、罗利环素、赖氨四环素、氯莫环素、甲烯土霉素、强力霉素和米诺环素。二氨基嘧啶可任选地选自甲氧苄氨嘧啶、艾地普啉、巴喹普林和/或奥美普林。
[0564] 益生菌治疗
[0565] 该治疗可任选地是益生菌治疗,例如,如果检测到微生物失衡,或在治疗胃肠病症中,诸如在此提到的任何那些胃肠病症。
[0566] 益生菌可包括一种或多种活细菌和/或酵母。任选地,它还可包括一种或多种益生元,其是用作益生菌的食物的碳水化合物并且是不被人类消化的。
[0567] 胃肠和/或抗炎性治疗
[0568] 该治疗可任选地涉及外科手术和/或药物。
[0569] 药物治疗可任选地涉及例如抗体,该抗体例如选自阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利昔单抗和/或那他珠单抗。
[0570] 药物治疗可任选地涉及例如抗炎性药物。
[0571] 抗炎性药物可任选地选自例如类固醇、双氯芬酸、布洛芬、萘普生、塞来昔布、甲灭酸、依托考昔、吲哚美辛和/或阿司匹林。
[0572] 放射性示踪剂的分析
[0573] 正电子发射计算机断层扫描(PET)是放射性示踪剂成像技术,其中用正电子发射放射性核素标记的示踪剂化合物被注射到研究的受试者中。然后这些放射性示踪剂化合物
可用于体内追踪生物化学和生理学过程。对于PET在医学研究和实践中的重要性的主要原
因之一是诸如碳、氮、氧和氟的元素存在正电子发射同位素,这些同位素可被处理以形成一系列类似于身体中天然存在的物质的放射性示踪剂化合物。
[0574] 任选地,放射性示踪剂可以是用11C、13N、15O和/或18F标记的化合物。任选地,它可选自以下表格中列出的化合物。
[0575]
[0576]
[0577] 因此,例如,如果所选择的生物活性分子是氟脱氧葡萄糖(FDG)(葡萄糖的类似物),示踪剂的浓度将指示组织代谢活性,因为它对应于区域葡萄糖摄取。使用这种示踪剂来探究癌症转移(即,扩散到其他部位)的可能性是标准医学护理中最常见类型的PET扫描
(当前扫描的90%)。
[0578] 任选地,受试者和/或标本可以暴露于放射性示踪剂中,并且该方法可用于分析放射性示踪剂的位置和/或浓度。因此,该方法可任选地用于分析用正电子发射放射性核素标记的化合物的代谢。
[0579] 异种移植物
[0580] 细胞和/或组织可任选地被异种移植到宿主生物体中持续适合的时间周期,例如,至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或24小时和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23或24天。例如,从人类肿瘤获得的细胞或组织可被异种移植到宿主动物中。任选地,该方法可涉及制备异种
移植物和/或从宿主生物体中去除异种移植物或其样品。任选地,该方法可对所提供的异种移植物进行。
[0581] 任选地,异种移植物可包括肿瘤细胞或由其组成。可任选地分析异种移植物标本例如以分析宿主环境对异种移植物细胞的影响。任选地,可在异种移植前后分析细胞群和/或组织,和/或可将异种移植物标本与未异种移植的细胞群或组织进行比较。
[0582] 另外的定义
[0583] 在此使用术语“靶实体”是指在靶标内希望分析的实体。因此,对“靶标”的任何提及应当被解释为意指包含一种或多种不同靶实体的靶标。因此,靶实体可例如是细胞、微生物和/或化合物。例如,靶标可以是组织并且靶实体可以是癌细胞。
[0584] 在此使用术语“分析(analysis或analysing)”和这些术语的派生词来涵盖任何以下内容:检测靶实体;鉴定靶实体;表征靶实体;确定靶实体的位置;确定状况例如疾病状况;和/ 或确定两种不同疾病或组织类型等之间的边限。
[0585] 应当理解,在此对“分析”靶标的任何提及旨在意指基于谱数据分析靶标。因此,例如,通过措辞诸如“分析谱数据以便鉴定细胞类型”意指细胞类型的身份基于谱数据来确定。
[0586] 该分析可以是定性的和/或定量的。因此,任选地,任何类型的分析可涉及确定靶实体的浓度、百分比、相对丰度等。例如,可分析组织内癌细胞的百分比、靶标中微生物的相对丰度和/或化合物的浓度。任选地,可分析靶实体的增加或减少。
[0587] 术语“检测(detection或detecting)”和这些术语的派生词在此可互换使用以意指确定靶实体或其生物标志物的存在或不存在。
[0588] 术语“鉴定(identify或identification)”和这些术语的派生词在此可互换使用以意指获得关于靶实体或其生物标志物的身份的信息。这可任选地是确定身份和/或证实
身份。这可任选地包括关于靶实体或其生物标志物的精确身份的信息。然而,它可替代地包括允许靶实体鉴定为落入具体分类的信息,如在本文的其他地方所讨论。
[0589] “鉴定”微生物意指获得关于身份的至少一些信息,这可例如在任何分类学层次下。
[0590] “鉴定”细胞意指获得关于细胞类型的至少一些信息。“鉴定”患病细胞意指确定或证实细胞患病。
[0591] “鉴定”化合物意指获得关于化合物的结构和/或功能的至少一些信息,例如该信息可任选地允许化合物鉴定为包括选自在此披露的任何类型的化合物或由其组成,和/或
鉴定为通过在此披露的一种或多种官能团来表征。
[0592] 在此所使用的术语“诊断(diagnosis或diagnosing)”和这些术语的派生词是指确定受试者是否正患有疾病。任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种做出受试者是否正患有具体疾病的诊断:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;
检测靶实体减少。
[0593] 增加或减少可通过参考适合的参考物、比较物或对照来确定。例如,已知有多少炎性细胞或炎性分子通常存在于健康个体的组织中,所以靶标中炎性细胞或炎性分子的增加可简单地通过将其与健康对照比较来确定。
[0594] 在此所使用的术语“监测”和这个术语的派生词是指确定是否发生/已发生任何变化。通常,确定是否随时间推移发生任何变化,即自之前的时间点起。该变化可例如是疾病(诸如所提到的任何疾病)的发展和/或进展。任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种监测受试者或疾病:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0595] 在此所使用的术语“预后”和这个术语的派生词是指疾病严重性或与疾病相关的可能病程和临床结局的风险预测。因此,在此所使用的术语“预后的方法”是指技术人员可通过其评估和/或确定将出现给定结局的可能性的方法。预后相关的结局可以是发病和/或
死亡。具体地,预后可与“无疾病进展生存期”(PFS)相关,其是在具有疾病但不具有疾病进展的情况下受试者生存的时间长度。因此,PFS可例如是从治疗开始至疾病进展日期的时
间,或从治疗结束至疾病进展日期的时间。
[0596] 任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种做出诊断:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0597] “进展(progressing或progression)”和这些术语的派生词意指疾病恶化,即严重性增加。例如,在癌症的情况下,可意指肿瘤负荷增加,例如肿瘤大小和/或重量增加;癌症变成恶性的或更恶性的;和/或转移发展或转移发生率和/或速率增加。
[0598] 预后可与总生存期相关。“总生存期”(OS)意指在具有疾病但在死亡出现之前受试者生存的时间长度。总生存期可例如被定义为从诊断疾病的时间;治疗开始的时间;或治疗完成直到死亡的时间。总生存期通常表达为“总体存活率”,其是研究或治疗组中在诊断具有疾病、或对于疾病开始治疗或完成治疗后仍活一定时间周期的人的百分比。总体存活率可例如被规定为五年存活率,其为研究或治疗组中在诊断或开始或完成治疗后活五年的人
的百分比。
[0599] 关于具有特定类型疾病的受试者的平均值(例如中值、平均值或众值)的OS和PFS的统计信息是本领域技术人员可获得的。因此,可做出受试者是否具有或可能具有与此种
平均值比较得到的增加或减少的OS或PFS的确定。
[0600] 确定PFS和/或总生存期的可能性和/或长度减少意指预后不良或不利。术语“不良”和“不利”在此可互换使用。“不良”预后可被定义为比对于受试者的参考预后更差的预后,所以它还可被称为“更差”预后,而“良好”或“非不利”预后可被定义为比对于受试者的参考预后更好的预后,所以它还可被定义为“更好”预后。技术人员将了解,对于“参考预后”,应当使用具有相同类型疾病(任选地相同时期疾病)的受试者。“参考预后”可以是由任何其他适合的方法确定的平均预后或典型预后。
[0601] 不利或更差预后可被定义为更短总生存期或更短总生存期的可能性增加和/或更短PFS 或更短PFS的可能性增加。
[0602] “消退(regressing或regression)”意指疾病改善,即严重性减小。例如,在癌症或肿瘤的情况下,可意指肿瘤负荷减小,例如肿瘤大小和/或重量减小,或变成不可检测的;癌症变成较不恶性的;和/或转移发生率和/或速率减小。
[0603] 对治疗的响应可包括进展、消退、进展性和消退性元素的组合、或不存在任何进展或消退。因此,例如,在癌症的情况下,对治疗的响应可包括选自以下各项的一种或多种标准的变化:肿瘤大小、肿瘤重量、肿瘤数、恶性和转移。
[0604] “发展”意指疾病发作。
[0605] 如在此所使用的术语“预测(prediction或predicting)”是指确定具体结局的可能性。
[0606] 如在此所使用的术语“分层(stratification或stratifying)”是指基于规定的标准将群体分成亚群。更具体地,它是指基于特定标准将一组受试者分成至少两组,在本发明的背景下该特定标准包括分析方法的结果或由其组成。任选地,受试者可被分层为可能响
应于具体治疗的那些受试者和不可能响应的那些受试者;和/或可基于其诊断、预后和/或
呈现出对治疗的响应来分层受试者。
[0607] 任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种分层受试者:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0608] 如在此所使用的术语“治疗(treatment或treating)”是指旨在为受试者带来医学益处的行为过程。治疗可以是预防性或治疗性。
[0609] “预防性”意指治疗是预防性,即在疾病发作之前应用。“治疗性”意指治疗在疾病发作之后应用。
[0610] 任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种确定受试者应当或不应当接受具体治疗:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0611] 任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种确定受试者已响应或尚未响应具体治疗:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0612] 任选地,该方法可涉及分析靶标,并且基于以下内容中的一种或多种向受试者给予具体治疗:检测靶实体;鉴定靶实体;检测靶实体增加;检测靶实体减少。
[0613] 任选地,该方法可另外地涉及以下步骤中的一个或多个,具体地在诊断的背景下:
[0614] 任选地,该方法可另外地涉及以下步骤中的一个或多个,具体地在诊断的背景下:a)确定疾病的一种或多种症状的存在;b)血液测试;c)骨髓测试;d)骨扫描;e)计算机断层 (CT)扫描;f)x射线;m)MRI;n)正电子发射计算机断层(PET)扫描;o)超声扫描; p)活组织检查分析;q)代谢组学,即存在于生物标本中的整组小分子代谢物的研究。
[0615] 谱数据的分析
[0616] 本发明的任何方法可任选地涉及谱数据的分析;更具体地,来自靶标(例如,第一靶位置)的谱数据的分析。术语“谱数据(spectral data和spectrometric data)”在此可互换使用。
[0617] 靶标的分析可单独地基于谱数据的分析,或它可任选地涉及一种或多种另外的分析工具,这些分析工具的细节在本文的其他地方进行讨论。
[0618] 在一些实施例中,谱数据可任选地提供关于靶标或靶实体的直接信息。
[0619] 例如,如果特定细胞类型具有特殊谱信号图案,则从靶标中获得这种信号图案提供关于所述细胞类型的存在、身份和/或特征的直接信息。
[0620] 例如,如果特定微生物具有特殊谱信号图案,则从靶标中获得这种信号图案提供关于所述微生物的存在、身份和/或特征的直接信息。
[0621] 例如,如果特定化合物具有特殊谱信号图案,则从靶标中获得这种信号图案提供关于所述化合物的存在、身份和/或特征的直接信息。这可以例如是针对由细胞和/或微生
物分泌的化合物、或针对药剂诸如药物或其代谢物的情况。
[0622] 然而,在其他实施例中,谱数据可任选地提供关于靶标或靶实体的间接信息。这可以是例如针对由细胞和/或微生物产生但不是分泌的化合物的情况。这种化合物的存在可任选地通过检测作为含有所述化合物的细胞和/或微生物的特征的谱信号图案来间接地检
测。
[0623] 从靶标(例如,第一靶位置)中获得的谱数据可任选地与一种或多种其他谱数据进行比较,该一种或多种其他谱数据在此可方便地称为“参考”、“对照”或“比较物”谱数据。
[0624] 如在本文的其他地方所解释,分析谱数据可任选地包括分析一种或多种样品谱以便对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类。这可包括使用一种或多种参考样品谱来开发分类
模型或库,或可包括使用现有的库。
[0625] 任选地,可进行分析以确定从靶标中获得的谱数据是否匹配或足够地对应于“参考”、“对照”或“比较物”谱数据以做出正性确定。任选地,如果谱数据对一个库条目比任何其他库条目更接近对应,可做出正性确定。
[0626] 在此使用术语“参考”谱数据意指谱数据来自已知的细胞类型、微生物或化合物。参考谱数据可任选地是公共可用的,或技术人员可产生参考谱数据的库。该方法可任选地
涉及将谱数据与一个或多个参考谱数据进行比较。如果从靶标中获得的谱数据匹配或足够
地对应于参考谱数据,则任选地可做出正性确定。如果从靶标中获得的谱数据并非匹配或
足够地对应于参考谱数据,则任选地可做出负性确定。
[0627] 在此使用术语“比较物”谱数据意指从第二靶位置中获得的谱数据。第一靶位置和第二靶位置可位于不同靶标中,或处于相同靶标的不同位置处。该方法可任选地涉及将谱数据与一个或多个比较物谱数据进行比较。如果从靶标中获得的谱数据匹配或足够地对应
于比较物谱数据,则任选地可做出正性确定。如果从靶标中获得的谱数据并非匹配或足够
地对应于比较物谱数据,则任选地可做出负性确定。
[0628] 在此使用术语“对照”谱数据意指在更早的时间点下从第一靶标中获得的谱数据。对照谱数据可例如在监测例如手术、疾病、细胞培养物、组织培养物和/或微生物培养物时使用。任何方法可任选地涉及将谱数据与一个或多个对照谱数据进行比较。如果从靶标中
获得的谱数据匹配或足够地对应于对照谱数据,则任选地可做出正性确定。如果从靶标中
获得的谱数据并非匹配或足够地对应于对照谱数据,则任选地可做出负性确定。
[0629] “正性确定”意指确定特定细胞类型、微生物和/或化合物的存在、身份和/或特征。例如,正性确定可涉及确定存在具体分类的靶实体;靶实体具有某种特征;和/或存在特定化合物。
[0630] 例如,在微生物靶实体的情况下,正性确定可例如涉及确定存在特定分类学级别的微生物;特定微生物具有某种特征,诸如对特定药物的抗性;和/或特定化合物由微生物产生。
[0631] 例如,在细胞靶实体的情况下,正性确定可例如涉及确定存在癌细胞或淋巴细胞;和/ 或细胞具有某种特征,诸如它表达特定细胞表面标志物。
[0632] 例如,在化合物靶实体的情况下,正性确定可例如涉及确定存在特定类型的化合物;和 /或化合物具有某种特征,诸如特定糖基化形式。
[0633] 因此,例如,如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于参考谱数据,则可任选地证实在对应于从其中获得参考谱数据的实体的靶实体的第一样品中的存在。如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于参考谱数据,则存在于第一样品中的靶实体可任选地被鉴定
为对应于从其中获得参考谱数据的实体的身份。如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应
于参考谱数据,则存在于第一样品中的靶实体可任选地被表征为具有对应于从其中获得参
考谱数据的实体的特征的一种特征。如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于参考谱数
据,则可任选地做出以下确定:存在于第一样品中的靶实体产生由从其中获得参考谱数据
的实体产生的化合物。
[0634] 如在本文的其他地方所解释,确定或证实微生物或细胞的“身份”意指获得关于身份的至少一些信息,这可例如在任何分类学层次下。因此,例如,如果参考谱数据来自白色假丝酵母,则在一个实施例中,匹配或足够的对应可任选地用于将第一微生物鉴定为术语假丝酵母属,而在另一个实施例中,匹配或足够的对应可任选地用于将第一微生物鉴定为
术语白色假丝酵母物种。
[0635] 作为另一个实例,如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于比较物谱数据,则可任选地证实在对应于从其中获得比较物谱数据的实体的靶实体的第一样品中的存在。如
果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于比较物谱数据,则存在于第一样品中的靶实体可
任选地被鉴定为对应于从其中获得比较物谱数据的实体的身份。如果第一样品的谱数据匹
配或足够地对应于比较物谱数据,则存在于第一样品中的靶实体可任选地被表征为具有对
应于从其中获得比较物谱数据的实体的特征的一种特征。如果第一样品的谱数据匹配或足
够地对应于比较物谱数据,则可任选地做出以下确定:存在于第一样品中的靶实体产生由
从其中获得比较物谱数据的实体产生的化合物。
[0636] 换言之,匹配或足够的对应于相应地参考或比较物谱数据可用于证实相应地第一靶实体和参考或比较物实体具有相同身份,而缺乏匹配或足够的对应于相应地参考或比较
物谱数据可用于证实相应地第一靶实体和参考或比较物实体不具有相同身份。
[0637] “负性确定”意指确定特定靶实体的不存在;和/或确定靶实体不具有特定身份和/或特征。
[0638] 例如,负性确定可涉及确定不存在特定靶实体;特定靶实体不具有某种特征;和/或不存在特定化合物。
[0639] 例如,在微生物靶实体的情况下,负性确定可例如涉及确定不存在特定分类学级别的微生物;特定微生物不具有某种特征,诸如对特定药物的抗性;和/或不产生特定化合物。
[0640] 例如,在细胞靶实体的情况下,负性确定可例如涉及确定不存在癌细胞或淋巴细胞;和 /或细胞不具有某种特征,诸如它不表达特定细胞表面标志物。
[0641] 例如,在化合物靶实体的情况下,负性确定可例如涉及确定不存在特定类型的化合物;和/或化合物不具有某种特征,诸如特定糖基化形式。
[0642] 因此,例如,如果第一样品的谱数据不匹配或足够地对应于参考谱数据,则可任选地证实在对应于从其中获得参考谱数据的实体的靶实体的第一样品中的不存在或不足够存在。如果第一样品的谱数据不匹配或足够地对应于参考谱数据,则存在于第一样品中的
靶实体可任选地被鉴定为不对应于从其中获得参考谱数据的实体的身份。如果第一样品的
谱数据不匹配或足够地对应于参考谱数据,则存在于第一样品中的靶实体可任选地被表征
为不具有对应于从其中获得参考谱数据的实体的特征的一种特征。如果第一样品的谱数据
不匹配或足够地对应于参考谱数据,则可任选地做出以下确定:存在于第一样品中的靶实
体不产生或不足够地产生由从其中获得参考谱数据的实体产生的化合物。
[0643] 作为另一个实例,如果第一样品的谱数据匹配或足够地对应于对照谱数据,则可做出没有发生变化或没有发生明显的变化的确定,而如果第一样品的谱数据不匹配或足够
地对应于对照谱数据,则可做出发生变化任选地明显的变化的确定。变化的实例可例如是
存在污染或浸润细胞、微生物和/或化合物;或细胞或微生物的行为或其环境变化,诸如细胞或微生物的生长速率、呼吸速率的变化;化合物(诸如分泌的化合物)的产生速率;环境温度、pH、养分可利用性等。
[0644] 如在本文的其他地方所提到,该方法可任选地涉及生物标志物的分析。
[0645] 如果靶实体或疾病状况的生物标志物是已知的(例如,从现有技术或从在此披露的工作中),则该方法可任选地涉及分析靶标的所述生物标志物的谱信号的存在。任何生物标志物的谱信号可任选地在文献、数据库中查出,或如果必要,它可简单地通过实验来确
定。
[0646] 例如,如在此所示,C26:1硫苷脂(C50H94NO11S)是正常脑组织的生物标志物,其中 m/z的谱信号为约916.655。当分析脑靶标以尝试在健康与患病脑组织之间区分时,该方法可任选地涉及分析该靶标的约916.655的m/z谱信号的存在。
[0647] 如在本文的其他地方所提到,产生特定谱数据(例如,特定m/z)的分析物可任选地例如使用MS-MS来进一步表征。因此,质谱中的离子物质可任选地基于精确质量测量(例如
具有质量偏差<3ppm)和/或MS/MS碎片化图案来鉴定。
[0648] 具有不同头部基团的等压脂质可任选地通过离子迁移率来区分。
[0649] 因此,任选地,该方法可涉及分析靶标的一种或多种生物标志物的谱信号的存在,该一种或多种生物标志物任选地选自在此提到的任何生物标志物。
[0650] 可任选地例如通过将由正常细胞获得的谱信号从由患病细胞获得的谱信号中扣除以得出对患病细胞特异的谱信号来确定患病细胞的生物标志物。
[0651] 任选地,产生特定m/z和/或离子迁移谱信号的分析物可任选地例如使用MS/MS来进一步表征。因此,质谱和/或离子迁移谱中的离子物质可任选地基于诸如使用离子迁移漂移时间的技术和/或精确质量测量(例如具有质量偏差<3ppm)和/或MS/MS碎片化图案和/或
来鉴定。
[0652] 因此,任选地,该方法可涉及分析靶标的一种或多种生物标志物的谱信号的存在,该一种或多种生物标志物任选地选自在此提到的任何生物标志物。
[0653] 谱数据可包括一种或多种样品谱。获得谱数据可包括获得一种或多种样品谱。分析谱数据可包括分析一种或多种谱。获得一种或多种样品谱可包括分箱处理以针对一种或
多种样品谱衍生一组时间强度对和/或一组样品强度值。分箱过程可包括对一组复数个箱
中的离子检测和/或强度值进行累加或作直方图。分箱处理中的每个箱子可对应于特定范
围的时间或基于时间的值,诸如质量、质荷比和/或离子迁移率。分箱处理中的箱子各自可具有等于选自由以下各项组成的组的范围内以Da或Th(Da/e)计的宽度的一种宽度:(i)<或
>0.01;(ii) 0.01-0.05;(iii)0.05-0.25;(iv)0.25-0.5;(v)0.5-1.0;(vi)1.0-2.5;(vii)
2.5-5.0;以及(viii)<或> 5.0。已鉴定具有宽度等于在0.01-1Da或Th(Da/e)范围内的宽度的箱子可提供用于对一些气溶胶、烟雾或蒸气样品(诸如从组织中获得的样品)进行分类的
特别有用的样品谱。箱子可以或可以不全部具有相同的宽度。分箱处理中箱子的宽度可根
据箱宽度函数而改变。箱宽度函数可随时间或基于时间的值(诸如质量、质荷比和/或离子
迁移率)而改变。箱宽度函数可以是非线性的(例如,基于对数或基于幂,诸如基于平方或平方根)。箱宽度函数可考虑以下事实:离子飞行时间可以不与其质量、质荷比和/或离子迁移率直接成比例。例如,离子飞行时间可与其质量和/或质荷比的平方根直接成比例。
[0654] 谱库
[0655] 术语“谱库”和“谱数据库”在此可互换使用。
[0656] 技术人员可使用任何公共可用的谱数据作为参考谱数据。有用的数据库的实例是: LipidMaps、LipidBlast和LipidXplorer,这些数据库的细节提供在以下出版物中:
Kind等人“tandem mass spectrometry database for lipid identification”[“用于脂质鉴定的LipidBlast经由电脑模拟的串联质谱数据库”],Nat Methods.[自然方法]2013年
8月;10(8):755-758; Herzog等人“LipidXplorer:A Software for Consensual Cross-Platform Lipidomics” [“LipidXplorer:一种用于交感跨平台脂质组学的软件”]PLoS ONE 7(1):e29851;以及Fahy 等人“Lipid classification,structures and tools”[“脂质分类、结构和工具”],Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell 
Biology of Lipids[生物化学与生物物理学报-脂质的分子和细胞生物学],第1811卷,第
11期,2011年11月,第637-647页,Lipidomics and Imaging Mass Spectrometry[脂质组学和成像质谱],还参见http://www.lipidmaps.org/。
[0657] 可替代地或另外地,技术人员可通过从一种或多种样品中获得谱数据来构建谱库,该一种或多种样品在微生物的情况下可任选地包括模式培养物菌株和/或临床和/或环
境微生物分离物;在细胞或组织的情况下,该一种或多种样品可任选地包括细胞系、细胞培养物、组织样品等;在化合物的情况下,该一种或多种样品可任选地购买或合成。
[0658] 模式培养菌株和细胞系可任选地从培养物保藏所中获得,诸如美国典型培养物保藏中心 (ATCC)(10801University Boulevard,马纳萨斯,弗吉尼亚州20110,美国)。
[0659] 本发明人们使用超过1500个微生物菌株来产生谱库,这些微生物菌株包括临床分离物和来自ATCC的模式培养物菌株,涵盖细菌和真菌的约95个属和约260个种。为了加快谱库的产生,诸位发明人设立高通量培养、自动菌落成像、菌落挑取和REIMS分析。
[0660] 本发明的诸位发明人还使用组织和/或细胞系来产生谱库,这些组织和/或细胞系的细节在本文的其他地方提供,包括在实例中。
[0661] 从微生物、细胞系和/或组织中产生谱库可任选地基于本文的其他地方讨论的任何另外的分析工具而与另外的分析(例如,分类学分类和/或组织学)组合。例如,该工具可以是 DNA分析。这可涉及DNA测序,任选地在该DNA测序之前使用例如PCR进行DNA分离和/或扩增。对于细菌,测序16S rRNA基因的全部或部分是特别适合的,而对于真菌,测序内转录间隔区(ITS)区域的全部或部分是特别适合的。
[0662] 分析样品谱
[0663] 分析谱数据的步骤可包括分析一种或多种样品谱以便对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类。
[0664] 分析一种或多种样品谱以便对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类可包括非监督分析一种或多种样品谱(例如,用于降维)和/或监督分析一种或多种样品谱(例如,用于分
类)。
[0665] 分析一种或多种样品谱可包括非监督分析(例如,用于降维)接着监督分析(例如,用于分类)。
[0666] 可如在本文的其他地方所讨论来分析一种或多种样品谱。
[0667] 旨在落入本发明的范围内的分析技术的列表在以下表格中给出:
[0668]
[0669]
[0670] 还可以使用上述分析方法的组合,诸如PCA-LDA、PCA-MMC、PLS-LDA等。
[0671] 分析样品谱可包括用于降维的非监督分析接着是用于分类的监督分析。
[0672] 以举例的方式,现在将更详细地描述许多不同的分析技术。
[0673] 多变量分析-开发分类模型
[0674] 以举例的方式,现在将描述使用复数参考样品谱的多变量分析来建立分类模型的方法。
[0675] 图40示出了使用多变量分析来建立分类模型的方法1500。在本实例中,该方法包括获得对于参考样品谱的复数组强度值的步骤1502。然后该方法包括非监督主成分分析
(PCA) 的步骤1504接着监督线性判别分析(LDA)的步骤1506。这种方法在此可被称为PCA-
LDA。可使用其他多变量分析方法,诸如PCA-MMC。然后在步骤1508中,输出PCA-LDA模型例如以便存储。
[0676] 诸如这种多变量分析可提供允许使用从气溶胶、烟雾或蒸气样品中获得的一种或多种样品谱分类气溶胶、烟雾或蒸气样品的分类模型。现在将参考简单的实例更详细地描
述该多变量分析。
[0677] 图41示出了从两类已知的参考样品中获得的一组参考样品谱。这些类别可以是在此描述的靶标的类别中的任何一种或多种。然而,为了简单,在本实例中,这两种类别将被称为左侧类别和右侧类别。
[0678] 每个参考样品谱已被预处理以便针对所述参考样品谱中的相应质荷比衍生一组三个参考峰-强度值。虽然仅示出三个参考峰-强度值,但是将了解,可针对每个参考样品谱中的相应质荷比数量衍生更多个参考峰-强度值(例如,大约100个参考峰-强度值)。在其他实施例中,参考峰-强度值可对应于以下各项:质量;质荷比;离子迁移率(漂移时间);和/或操作参数。
[0679] 图42示出了具有由强度坐标轴定义的三维的多变量空间。每个维度或强度坐标轴对应于特定质荷比下的峰-强度。再次,将了解,在多变量空间中可存在更多个维度或强度坐标轴(例如,大约100个维度或强度坐标轴)。多变量空间包括复数参考点,其中每个参考点对应于参考样品谱,即每个参考样品谱的峰-强度值为多变量空间中的参考点提供坐标。
[0680] 该组参考样品谱可由参考矩阵D来表示,该参考矩阵D具有与相应参考样品谱相关的行、与相应质荷比相关的列、以及作为相应参考样品谱的相应质荷比的峰-强度值的矩阵元素。
[0681] 在许多情况下,多变量空间和矩阵D中的大量维度可使得难以将参考样品谱分组成类别。因此,PCA可在矩阵D上进行,以便计算定义PCA空间的PCA模型,该PCA空间具有由主成分坐标轴定义的减少数量的一个或多个维度。主成分可以被选择为包括或“解释”矩阵D中的最大方差并且累积地解释矩阵D中方差的阈值量的那些主成分。
[0682] 图43示出了累计方差可如何作为PCA模型中的主成分数n的函数增加。方差的阈值量可根据需要选择。
[0683] 可使用非线性迭代偏最小二乘(NIPALS)算法或奇异值分解从矩阵D中计算PCA模型,该算法的细节是技术人员已知的并且因此将不在此详细地描述。可使用计算PCA模型的其他方法。
[0684] 所得到的PCA模型可通过PCA得分矩阵S和PCA负载矩阵L来定义。PCA还可以产生误差矩阵E,其包含由PCA模型不能解释的方差。D、S、L与E之间的关系可以是:
[0685] D=SLT+E  (1)
[0686] 图44示出了对于图41和图42的参考样品谱的所得到的PCA空间。在本实例中,PCA 模型具有两个主成分PC0和PC1并且因此PCA空间具有由两个主成分坐标轴定义的两个维度。
然而,可根据需要在PCA模型中包括更少或更多数量的主成分。通常希望主成分数是比多变量空间中的维度数少至少一个。
[0687] PCA空间包括复数转化的参考点或PCA得分,其中每个转化的参考点或PCA得分对应于图41的参考样品谱并且因此对应于图42的参考点。
[0688] 如图44所示,PCA空间的减少的维度使得更简单地将参考样品谱分组成两个类别。还可鉴定任何异常值并且将其从此时期下的分类模型中去除。
[0689] 然后在PCA空间中可进行另外的监督多变量分析诸如多类别LDA或最大边限标准 (MMC),以便定义类别并且任选地进一步减少维度。
[0690] 如将由技术人员所了解,多类别LDA寻求使类别间的方差与类别内的方差比率最大化 (即,以便得到最紧凑类别可能之间的最大可能距离)。LDA的细节是技术人员已知的
并且因此将不在此详细地描述。
[0691] 所得到的PCA-LDA模型可通过转化矩阵U来定义,该转化矩阵U可衍生自PCA得分矩阵S和通过解决广义复特征值问题包含在其中的每个转化谱的类别分配。
[0692] 然后可通过以下得到来自原始PCA空间的得分S向新LDA空间的转化:
[0693] Z=SU  (2)
[0694] 其中矩阵Z包含转化到LDA空间中的得分。
[0695] 图45示出了具有单个维度或坐标轴的PCA-LDA空间,其中在图44的PCA空间中进行LDA。如图45所示,LDA空间包括复数进一步转化的参考点或PCA-LDA得分,其中每个进一步转化的参考点对应于图44的转化的参考点或PCA得分。
[0696] 在本实例中,PCA-LDA空间的进一步减少的维度使得甚至更简单地将参考样品谱分组成两个类别。PCA-LDA模型中的每个类别可通过其转化的类别平均值和协方差矩阵或 
PCA-LDA空间中的一种或多种超平面(包括点、线、面或更高级超平面)或超曲面或Voronoi 单元来定义。
[0697] PCA负载矩阵L、LDA矩阵U以及转化的类别平均值和协方差矩阵或超平面或超曲面或Voronoi单元可被输出到数据库以稍后用于对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类。
[0698] 对于类别g的LDA空间V’g中的转化协方差矩阵可通过以下得到:
[0699] V’g=UTVgU  (3)
[0700] 其中Vg是PCA空间中的类别协方差矩阵。
[0701] 对于类别g的转化类别平均值位置zg可通过以下得到:
[0702] sgU=zg  (4)
[0703] 其中sg是PCA空间中的类别平均值位置。
[0704] 多变量分析-使用分类模型
[0705] 以举例的方式,现在将描述使用分类模型以对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类的方法。
[0706] 图46示出了使用分类模型的方法2100。在本实例中,该方法包括获得对于样品谱的一组强度值的步骤2102。然后该方法包括将对于样品谱的该组强度值投射到PCA-LDA模
型空间中的步骤2104。可使用其他分类模型空间,诸如PCA-MMC。然后在步骤2106中基于投射位置对样品谱进行分类,并且然后在步骤2108中输出该分类。
[0707] 现在将参考上述简单的PCA-LDA模型更详细地描述气溶胶、烟雾或蒸气样品的分类。
[0708] 图47示出了从未知气溶胶、烟雾或蒸气样品中获得的样品谱。样品谱已被预处理以便针对相应质荷比衍生一组三个样品峰-强度值。如上所提到,虽然仅示出三个样品峰-
强度值,但是将了解,可在样品谱的更多个相应质荷比下衍生更多个样品峰-强度值(例如,大约100 个样品峰-强度值)。同样,如上所提到,在其他实施例中,样品峰-强度值可对应于以下各项:质量;质荷比;离子迁移率(漂移时间);和/或操作参数。
[0709] 样品谱可由样品向量dx来表示,其中向量的元素是对于相应质荷比的峰-强度值。对于样品谱的转化PCA向量sX可如下获得:
[0710] dxL=sx  (5)
[0711] 然后,对于样品谱的转化PCA-LDA向量zX可如下获得:
[0712] sxU=zx  (6)
[0713] 图48再次示出了图45的PCA-LDA空间。然而,图48的PCA-LDA空间进一步包括投射的样品点,其对应于转化PCA-LDA向量zx、衍生自图47的样品谱的峰强度值。
[0714] 在本实例中,投射的样品点是往关于右侧类别的类别间超平面的一侧,并且因此气溶胶、烟雾或蒸气样品可被分类为属于右侧类别。
[0715] 可替代地,可使用LDA空间中的离类别中心的马氏距离(Mahalanobis distance),其中离类别g中心的点zx的马氏距离可通过以下的平方根来得到:
[0716] (zx-zg)T(V’g)-1(zx-zg)  (8)
[0717] 并且数据向量dx可被分配到此距离最小的类别。
[0718] 另外,将每个类别处理为多变量高斯分布,可计算数据向量与每个类别的从属关系的概率。
[0719] 基于库的分析-开发分类库
[0720] 以举例的方式,现在将描述使用复数个输入参考样品谱来建立分类库的方法。
[0721] 图49示出了建立分类库的方法2400。在本实例中,该方法包括获得复数个输入参考样品谱的步骤2402和从每个类别的样品的复数个输入参考样品谱中衍生元数据的步骤
2404。然后该方法包括将每个类别的样品的元数据存储为单独的库条目的步骤2406。然后
在步骤 2408中,输出分类库例如以便电子存储。
[0722] 诸如这种分类库允许使用从气溶胶、烟雾或蒸气样品中获得的一种或多种样品谱分类气溶胶、烟雾或蒸气样品。现在将参考实例更详细地描述基于库的分析。
[0723] 在本实例中,分类库中的每个条目从代表类别的复数个预处理参考样品谱中创建。在本实例中,根据以下程序预处理类别的参考样品谱:
[0724] 首先,进行重新分箱处理。在本实施例中,将数据重新取样到具有横坐标的对数网格上:
[0725]
[0726] 其中Nchan是所选择的值并且 指代低于x的最近整数。在一个实例中,Nchan是212或 4096。
[0727] 然后,进行背景扣除处理。在本实施例中,然后构建具有k个节点的三次样条以使得每对节点之间数据的p%位于曲线下方。然后将这个曲线从数据中扣除。在一个实例中,k是 32。在一个实例中,p是5。然后从每个强度中扣除对应于强度扣除数据的q%分位数的常数。保留正值和负值。在一个实例中,q是45。
[0728] 然后,进行归一化处理。在本实施例中,数据被归一化成具有平均值 在一个实例中,
[0729] 然后库中的条目由以谱中值μi和谱中每个Nchan点的偏差值Di的形式的元数据组成。
[0730] 第i个通道的可能性通过以下得到:
[0731]
[0732] 其中1/2≤C<∞并且其中Γ(C)是γ函数。
[0733] 以上方程式是广义柯西分布(Cauchy distribution),其对于C=1还原到标准柯西分布并且当C→∞时变成高斯(正态)分布。参数Di控制分布宽度(在高斯极限中Di=σi是简单地标准偏差),而总值C控制尾部大小。
[0734] 在一个实例中,C是3/2,其位于柯西分布与高斯分布之间,使得可能性变成:
[0735]
[0736] 对于每个库条目,参数μi被设定为输入参考样品谱第i个通道中的值列表的中值,而偏差Di取为这些值除以√2的四分位距。这种选择可确保第i个通道具有与输入数据相同的四分位距的可能性,其中使用分位数提供对异常数据的一些保护。
[0737] 基于库的分析-使用分类库
[0738] 以举例的方式,现在将描述使用分类库以对气溶胶、烟雾或蒸气样品进行分类的方法。
[0739] 图50示出了使用分类库的方法2500。在本实例中,该方法包括获得一组复数个样品谱的步骤2502。然后该方法包括使用分类库中的类别条目的元数据来计算每个类别样品
的该组复数个样品谱的概率或分类得分的步骤2504。然后在步骤2506中对样品谱进行分
类,并且然后在步骤2508中输出该分类。
[0740] 现在将参考上述分类库更详细地描述气溶胶、烟雾或蒸气样品的分类。
[0741] 在本实例中,未知样品谱y是一组复数个样品谱的中值谱。取中值谱y可在通道间基础上对异常数据进行保护。
[0742] 得到输入数据的可能性Ls,然后库条目s通过以下得到:
[0743]
[0744] 其中μi和Di分别是库中值和通道i的偏差值。可能性Ls可被计算为数字安全的对数可能性。
[0745] 然后在所有候选类别′s′上归一化可能性Ls以得到概率,假定类别上的现有概率一致。所得到的对于类别 的概率通过以下得到:
[0746]
[0747] 指数(1/F)可使概率缓和,这些概率可以原本是太确定的。在一个实例中,F=10。例如在用户界面上,这些概率可表达为百分比。
[0748] 可替代地,RMS分类得分Rs可使用来自库的相同中值样品和偏差值来计算:
[0749]
[0750] 再次,在所有候选类别′s′上归一化得分Rs。
[0751] 然后可将气溶胶、烟雾或蒸气样品分类为属于具有最高概率和/或最高RMS分类得分的类别。
[0752] 另外的分析工具
[0753] 本发明的任何方法可任选地包括使用一种或多种另外的分析工具的步骤。此种工具可例如选自显微镜检查;核酸分析,例如使用限制性内切酶、杂交、聚合酶链反应(PCR)扩增和/或测序;和/或对抗原进行测试。此类工具是本领域熟知的,但下文提供了简要细节。
[0754] 可在没有任何另外的帮助(诸如显微镜)的情况下,通过目视检查标本。
[0755] 显微镜检查可例如任选地是光学显微术和/或电子显微术。
[0756] 核酸分析可任选地涉及DNA和/或RNA的分离和纯化。
[0757] 通过PCR扩增的核酸分析可例如任选地涉及适合的基因的全部或部分的扩增。例如,在微生物的情况下,基因可以是细菌16S rRNA基因,并且可使用通用引物和/或物种特异性引物。可任选地被替代地或另外地分析的适合的微生物基因的其他实例包括例如微生
物物种特异性基因或毒力基因,例如志贺毒素(stx)、紧密黏附素(eae)、鞭毛H-抗原基因
fliC-fliA、 hsp65、rpoB和/或recA。对于真菌,PCR扩增内转录间隔区(ITS)的全部或部分是特别适合的。当分析人类或动物细胞时,PCR可例如用于扩增疾病特异性和/或组织特异
性的基因。
[0758] 任选地,PCR可以是实时PCR或定量PCR。任选地,逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR) 可用于分析RNA表达。
[0759] 使用限制性内切酶的核酸分析可例如任选地涉及限制性片段长度多态性(RFLP)分析。 RFLP是探究同源DNA序列长度变化的技术。RFLP分析可涉及限制酶切消化,即用适合的限制性内切酶诸如BamHI、HindIII或EcoRI孵育DNA。每种限制性内切酶可识别并且切割
特定短的核酸序列。然后可例如通过琼脂糖凝胶电泳,由长度来分离所得到的DNA片段。凝胶中的DNA片段可任选地例如用溴化乙锭染色,并且可确定不同长度的片段的图案。
[0760] 任选地,DNA片段可通过DNA印迹法转移到膜。然后膜可暴露于标记的DNA探针中以允许发生杂交。标记可例如是或包括放射性同位素或地高辛(DIG)。然后可洗掉任何未杂交的探针。然后可检测标记并且可确定已杂交到标记的探针的片段图案。
[0761] 测序可例如任选地涉及二脱氧或链终止方法。在这个方法中,DNA可被用作模板以产生一组由于单碱基而彼此长度不同的片段。然后这些片段可通过大小分离,并且可鉴定
端部的碱基,从而重新创建DNA的原始序列。
[0762] 杂交分析可例如任选地包括将来自第一细胞或微生物的一种或多种所选择的DNA片段、基因或全基因组DNA至标记的DNA探针的DNA-DNA杂交以确定第一细胞或微生物与已
知或比较物细胞或微生物之间的遗传相似性。杂交分析可例如涉及如上所述的通过 DNA印
迹法、标记和检测来将DNA转移到膜。
[0763] 核酸分析可任选地涉及例如变性梯度凝胶电泳(DGGE)和/或温度梯度凝胶电泳 (TGGE)。
[0764] 细胞或微生物的脂肪酸分析可例如任选地使用偶联到火焰电离检测器的气相色谱法 (GC-FID)或高效液相色谱法(HPLC)来进行。
[0765] 关于微生物菌落形态,可例如任选地检查以下各项中的一种或多种:大小;整个菌落形状,其可例如是圆形、不规则形或根状;菌落边缘,其可例如是光滑、丝状或波状;隆起,其可例如是平坦、凸起、凸面或漏斗状;表面,其可例如是起皱、粗糙、蜡状或闪亮的;混浊度,其可例如是透明、半透明或不透明;色素沉着;颜色,其可例如是红色、黄色或白色;和/或水溶性
[0766] 关于单独微生物的形态,这可例如任选地被确定为球菌(球形)、杆菌(杆状)、螺旋菌 (螺旋状)或多形菌。球菌可任选地是单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌或葡萄球菌。杆菌可任选地是单杆菌、双杆菌、链杆菌或球杆菌。螺旋菌可任选地是弧菌、螺旋状菌或螺旋体。
[0767] 关于哺乳动物细胞的形态,这可例如任选地被确定为成纤维细胞的、上皮样、成淋巴细胞样和/或具有或不具有轴突的神经元的。
[0768] 基于培养筛选营养物需求可任选地涉及将细胞或微生物接种到一种或多种不同生长培养基上、在一种或多种不同生长培养基上接种细胞或微生物、将细胞或微生物接种
到一种或多种不同生长培养基中,并且观察培养基中/上的细胞或微生物生长发生和不同
培养基之间生长不同的程度。
[0769] 基于培养筛选抗微生物灵敏度可任选地涉及将微生物接种到一种或多种不同生长培养基上,这可例如通过将微生物划线或铺放到含有适合营养物琼脂的有盖培养皿上来
完成。然后可加入抗微生物剂,这可例如通过将用抗微生物剂浸渍的滤纸圆盘放置到生长
培养基上来完成。各自含有不同抗微生物剂的若干个圆盘可加入到单个有盖培养皿上。然
后可做出关于生长抑制地区是否出现在该一个或多个圆盘中的任何周围的确定,并且如果
这样的话,这个地区有多大。
[0770] 免疫组织化学分析可涉及使组织样品与一种或多种标记的药剂(诸如抗体)接触。因此,可任选地通过使用特异性抗体来测试具体地在细胞或微生物的细胞表面上的特异性
抗原存在。测试抗原还可被称为按血清型分类。抗体可以是多克隆或单克隆的。如果抗体对特定细胞类型特异,则可评价所述类型的细胞数。测试可任选地涉及简单地检测凝聚(即形成细胞 /微生物和抗体的复合体)的存在或不存在。可替代地或另外地,抗体可被标记并且测定可涉及例如酶联免疫吸附测定(“ELISA”)和/或荧光激活细胞分选术(“FACS”)。
[0771] 抗体可任选地选自例如CD3或CD8抗体。
[0772] 流式细胞术可任选地用于分析样品或标本中的细胞或微生物的特性,例如细胞/微生物数、活细胞/微生物百分数、细胞/微生物大小、细胞/微生物形状、和/或细胞/微生物表面上的特定抗原的存在。
[0773] 蛋白质印迹杂交可任选地用于分析蛋白质和/或肽。
[0774] 任选地,可任选地使用阵列形式进行标记的探针与组织、微生物和/或细胞的原位杂交。该方法可以是荧光原位杂交(FISH),其可例如用于分析染色体异常和/或绘制基因图谱。
[0775] 实例
[0776] 实例1-人类乳腺癌活检物的DESI-MS分析
[0777] 染色活检组织切片的人工组织学评估已是提供乳腺癌诊断时的黄金标准方法。然而,这种基于形态的组织诊断的准确性通常因为依赖于病理学家的解释而受到损害,从而
导致给定受试者的不良预后。
[0778] DESI-MSI使得技术人员能够在组织切片上可视化脂质物质的空间分布,从而允许与组织学特征的直接相关。因此,使用DESI-MSI来分析乳腺癌组织以获得脂质组学数据。已在正离子和负离子模式下分析约45种样品,包括II级浸润性导管癌(IDC)。
[0779] 各单独的乳腺样品受到非监督主成分分析(PCA)以可视化不同组织类型之间的差异(数据用颜色表示并且因此未示出)。在正离子和负离子模式两者下,在几乎所有样品中
观察到基质与肿瘤组织之间的明显不同(图5a和图6a)。递归最大边限标准(RMMC)分析用于
监督分类(图5b和图6b)。每种样品中的组织类型和其空间分布由独立的组织病理学家基于
H&E染色光学图像来确定。基于这个信息,从整合的MS离子图像中选择少量的每种组织的代表性质谱以建立用于分类不同组织类型中的所有像素的样品特异性RMMC模型。使这个数据
受到交叉验证,该数据对于在负离子和正离子模式两者下在所有样品中的所有组织类型通
常准确性超过95%(图7a和图7b)。
[0780] 该方法在以下组织标本之间区分:恶性组织、肿瘤切片纤维状部分、肿瘤切片脂肪细胞组织、肿瘤切片腺组织和坏死组织。因此,该方法可任选地用于在一种或多种组织类型之间分析(例如鉴定或区分),该一种或多种组织类型任选地选自例如恶性组织、纤维状肿瘤组织、脂肪细胞肿瘤组织、腺肿瘤组织和/或坏死组织。
[0781] 实例2用于组织学水平癌症诊断的空间分辨鸟枪脂质组学方法的开发
[0782] 已分析了具有不同上皮性癌(子宫内膜样、浆液性和透明细胞癌)、交界性肿瘤以及健康卵巢和输卵管的卵巢癌数据集。收集总共109份人类样品并且通过正离子和负离子
模式下的DESI-MS来获得质谱数据。
[0783] 对该数据集进行初步预处理,并且在各单独样品的数据集上进行多变量统计分析以便汇编组织学真实的脂质组学分布图数据库。由合格组织病理学家指定所关注的形态区
域,并且自动与质谱成像(MSI)数据集配准并且比对。
[0784] 使用主成分分析(PCA),观察到相同样品内的不同组织类型示出不同的脂质分布图。例如,正常卵巢包含宫体和基质组织,而在PCA中这些是完全分离的。在交界性样品和癌症样品中,也可区分出2种不同的组织类型(肿瘤细胞和在其脂质组学分布图中呈现较大差
异的周围基质细胞)。当应用监督最大边限标准(MMC)分析和根据MMC成分的彩色图谱时,可能产生反映组织学图像中鉴定的不同组织类型的组织图谱。
[0785] 这个分布图数据库还用于在多种样品上进行比较分析。PCA用于基于脂质组学分布图在不考虑组织学指定的情况下进行非监督组织分割。然后进行监督分析并且计算相应
的每个受试者组织的留一交叉验证。
[0786] PCA示出正常卵巢、浆液性癌和浆液性癌相关基质之间的一定分离(图8)。监督MMC 分析示出所有三种组织类型之间的良好分离,具有六个异常值。有趣地,所有四种被错误分类的正常样品是分类为正常卵巢但取自远离取样区的具有肿瘤的卵巢的样品。这表明这个组织的生物化学性质改变,即使这在形态检查中不能被检测到。在排除异常值情况下重复
MMC 分析,并且进行每个受试者区域留一交叉验证,从而示出正常增长的完全分离并且总
体准确性为85%。
[0787] 还检查了不同类型样品之间的方差。例如,评估了负离子模式DESI-MSI如何能够分离癌症组织、交界性和健康卵巢(图9)。达到总体分类准确性为95.6%。
[0788] 所进行的另外的分析是在数据集中在不同类型的上皮性癌之间比较:子宫内膜样癌和浆液性癌。使用负离子模式数据,可在总体准确性为90%情况下对健康卵巢、浆液性癌和子宫内膜样癌进行分类(参见图10)。
[0789] 还检查基于所创建的模型,是否可能预测盲样的不同组织类型。所分析的浆液性癌的数量提供使用负离子模式数据进行这种验证的有力模型(参见图11)。
[0790] DESI数据允许很好地预测存在于样品中的两种组织类型,即卵巢基质和卵巢癌症。区分了浆液性癌、浆液性癌相关的基质、正常卵巢基质以及背景。基于在这个分析之后进行的组织学注释来进行交叉验证并且达到几乎100%的分类准确性。
[0791] 实例3-使用REIMS技术的离体乳腺癌诊断
[0792] 获得并且分析来自肿瘤、正常和纤维腺瘤人类组织的约227种样品。样品的分布在表 3.1中示出。对样品进行组织学验证。
[0793] 表3.1
[0794]
[0795]
[0796] 如果组织的量允许,在使用切割或凝固模式的单独文件中的透热疗法或等离子刀进行测量情况下发生取样。如果所收集的组织较小,透热疗法切割模式是优选的方法。无论使用透热疗法还是等离子刀,并且无论使用切割模式还是凝固模式,每种样品都被正确地
鉴定为正常、肿瘤或纤维腺瘤(对于数据的提取参见表3.2)。
[0797] 表3.2
[0798]
[0799]
[0800]
[0801]
[0802] 对于在切割模式和凝固模式下运行的样品已单独地完成主成分分析和线性判别分析与交叉验证。参见图12和图13。
[0803] 实例4经由REIMS技术得到的离体乳腺癌肿瘤边限
[0804] 已获得三次肿瘤边限测试,其中在整个正常和肿瘤人类组织的样品上进行测量,并且使用GoPro设置获得视频以匹配谱。这个数据提供关于肿瘤边限上脂质分布图的见解。
因此,可通过分析组织样品来离体分析肿瘤边限。结果在图14中示出。
[0805] 实例5经由REIMS技术进行的胃肠癌分析
[0806] 如表5.1中所示,从102位人类受试者中收集242份样品。
[0807] 表5.1
[0808]受试者总数 102
样品总数 242
正常 90
肿瘤 62
腺瘤性息肉 21
阑尾 26
肌肉 20
粘液膜下层 14
分类的样品总数 175
[0809] 对样品进行组织学验证并且通过质谱来分析(表5.2)。
[0810] 表5.2
[0811]
[0812]
[0813]
[0814]
[0815] 实例6使用REIMS技术进行的卵巢癌分析
[0816] 在这项离体数据研究中,分析总共146份样品(表6.1)。
[0817] 表6.1
[0818]样品总数 146
卵巢癌 67
正常(卵巢15份、腹膜15份、输卵管15份) 45
交界性卵巢肿瘤 15
良性卵巢病灶 14
非卵巢肿瘤 4
具有不确定恶性潜力的非卵巢平滑肌肿瘤(STUMP) 1
[0819] 对样品进行组织学验证并且通过质谱来分析。使用监督线性判别分析的统计分析示出癌症和正常组织边限上的癌症和交界性组织的良好分离。还在包括良性病灶时可见良
好分离。参见图15。
[0820] 实例7-神经外科手术
[0821] 使用超过199份体内样品和超过207份离体样品来分析神经外科手术的至少28个术中病例。实例数据组在表7.1中示出。
[0822] 表7.1
[0823]
[0824]
[0825] 还分析了血管母细胞瘤标本。将组织学数据与先前病例和标本测量匹配。
[0826] 实例8-使用REIMS技术进行的脑癌分析
[0827] 如参考图16所讨论,在患有多形性成胶质细胞瘤(“GBM”)的受试者上进行分析。
[0828] 图16的左侧部分示出了已用实时超声图像覆盖的受试者脑部的3D图像。在外科手术期间用REIMS技术探针取得六个取样点,并且还在图16所示的图像上描绘出。
[0829] 图16还示出了记录的六个对应质谱,每个质谱对应于不同的取样点。
[0830] 图16还示出了在外科手术期间取得的所有取样点的3D PCA图。3D PCA图由神经病理学家标记。
[0831] 在图16所示的PCA图上示出了所有体内和离体取样点。从图16中显而易见的是,正常的灰质和白质两者与癌性样品分离地分组并且彼此分离地分组。
[0832] 因此,该方法可任选地用于在一种或多种脑组织类型之间分析(例如鉴定或区分),该一种或多种脑组织类型例如选自灰质、白质和/或癌症,其中癌症可例如是多形性成胶质细胞瘤。
[0833] 实例9-使用REIMS探针进行的肿瘤分型和分级
[0834] 图17示出了比较具有高级(IV级)多形性成胶质细胞瘤(例如,成胶质细胞瘤、巨细胞成胶质细胞瘤和复发性成胶质细胞瘤)和低级(II级和III级)肿瘤(例如,间变型星形细
胞瘤、少突神经胶质瘤和弥漫性星形细胞瘤)的受试者的结果。
[0835] 从图17中显而易见的是,在3D假LDA图上高级(IV级)和低级(II级和III级)肿瘤分离良好。
[0836] 具有中级III肿瘤的受试者与该空间的高级区分组在一起或与该空间的低级区分组在一起。
[0837] 因此,该方法可任选地用于在一种或多种癌症等级之间分析,例如鉴定或区分,其中癌症可例如是I级、II级、III级和/或IV级,和/或选自例如成胶质细胞瘤、巨细胞成胶质细胞瘤、复发性成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和/或弥漫性星形细胞瘤。
[0838] 实例10-使用拉曼光谱和REIMS取样两者进行的健康样品和癌性样品的分析
[0839] 受试者正患有低级(II级)星形细胞瘤。该受试者经受拉曼光谱取样和REIMS取样的组合。记录来自总共32个取样点的拉曼数据。这32个取样点中的13个与正常组织对应,这
32个取样点中的18个与癌性组织对应并且1个与背景对应。
[0840] 还在32个取样点中的14个中进行REIMS取样。
[0841] 图18a示出了来自两个取样点的REIMS质谱。取样点S4对应于具有低细胞结构的肿瘤组织。具体地,取样点S4与后内侧表面肿瘤对应。肿瘤组织的碎片具有低细胞结构和一定程度的反应性胶质化。取样点S14与具有单细胞浸润的正常白质对应。具体地,取样点S14 与后底盆(posterior base pot)对应。存在具有反应性胶质化和单细胞肿瘤浸润的白质的
多个碎片。
[0842] 图18a还示出了对应于整个外科手术取得的所有取样点的3D PCA图。
[0843] 图18b示出了来自取样点S4(肿瘤)和S14(正常白质)的相应拉曼光谱,以及来自整个外科手术取得的所有取样点的3D PCA图。
[0844] 拉曼光谱和REIMS技术谱两者都在磷脂范围内具有组织特异性“指纹图谱”。在PCA 图上观察到的主要差异是由于脂质振动区引起的。
[0845] 存在许多对脑部正常白质非常特异的硫苷脂。例如,以下硫苷脂对脑部正常白质特异:
[0846] 表10.1
[0847]
[0848]
[0849] 实例11人类结肠直肠组织标本中细菌的检测
[0850] 诸位发明人们尝试可视化人类结肠直肠组织标本中的细菌的存在和分布。已知细菌覆盖肠中的粘膜并且可最广泛地研究并且表征肠微生物群落。通过产生列于表14中的分
类学标志物的单个离子图像来进行分析。在>90%的分析的结肠直肠标本中可对细菌进行
可视化,包括健康和癌性组织标本。在癌性标本中,发现细菌很大程度上定位在通过H&E染色的组织切片的组织病理学检查而被鉴定为坏死的区域中。然而,沿着健康粘液膜也频繁
地检测到细菌。每种情况的实例将在下文进一步讨论。
[0851] 11A)坏死组织的分析
[0852] 图19示出了起源于右半结肠切除术期间解剖的肿瘤中心的癌性组织标本的组织类型分布。组织病理学检查揭示了癌性和基质组织的存在。
[0853] 坏死组织区域以及周围癌性和基质组织的质谱在图19中示出并且展示了与有活力的人类组织相比坏死区域的显著不同的磷脂组成,即甘油磷脂含量和质量范围为m/z=
500-700 中的各种更低分子量鞘脂来源的分类学标志物物种显著减少。
[0854] 当可视化这些分类标志物时,发现相应的单离子图像很大程度上展示了分类学标志物分子并且因此细菌分子的共定位。同源性分子的共定位单离子图像的阵列展示在图20
中并且可以归因于拟杆菌门。发现异C15:0取代的磷酸甘油二氢神经酰胺对紫单胞菌科(拟
杆菌门的一部分)特异,该紫单胞菌科在本研究中仅由帕拉拟杆菌(Parabacteroides)表
示,然而报道命名的化合物以高丰度存在于牙龈卟啉单胞菌中,从而表明这个科的这种标
志物的普遍适用性。在元基因组研究中报道拟杆菌门的成员可占高达50%的肠微生物群
落。然而,并未检测到脆弱拟杆菌的分类单元特异性标志物,从而表明存在的拟杆菌门菌不含有大量的机会病原体脆弱拟杆菌。
[0855] 图21示出了另外的分类学标志物的单离子图像,在那些二氢神经酰胺和相关的具有两个以上双键的化合物(或等效物)中发现这些标志物对拟杆菌门特异。发现m/z=
639.4954 下的化合物是较早提到的m/z=653.5113下的脂质物质的同系物。m/z=
566.4790下的信号指示黄杆菌纲的成员的存在。另外地发现梭菌目和梭菌属的特异性醛磷
脂物质,以及示出对肠杆菌目的特异性的奇数PE。所有这些细菌类能够在厌氧条件下生存
并且被报道为人类肠微生物组的主要组分。
[0856] 虽然拟杆菌门的成员很大程度上团簇在其中被鉴定为坏死区域的组织切片左侧周围,但是在该组织切片内的更中心处的点中另外地检测到梭菌目和梭菌属,因此证实了
并非所有细菌物种示出相同定位的预期。暂时将坏死组织区域中观察到大量细菌存在与人
体免疫应答缺乏相关,该人体免疫应答缺乏使得细菌能够很大程度上不受控制地繁殖。
[0857] 11B健康粘液膜中细菌的检测
[0858] 图22示出了起源于右半结肠切除术的健康组织标本的组织类型分布。其起源于距离肿瘤中心5cm的健康结肠组织。组织病理学检查揭示由粘膜肌层分开的健康粘液膜和粘
液膜下层。另外地,可观察到两个淋巴样聚集体(炎症)。
[0859] 图22示出在本实例中检测到的那些分类单元特异性标志物的单离子图像。通常,与坏死组织相比,观察到远没有那么强烈的信号。这暂时归因于健康免疫应答,该健康免疫应答限制如在坏死组织标本中所观察到的不受限细菌生长。然而,可仍检测到共生人类微
生物组的两种主要细菌组分,称为拟杆菌门和梭菌科的成员。
[0860] 针对这种样品进行元基因组表征,并且证实大量的拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门的存在,这些细菌在类别层次上可很大程度地分别归属于梭菌纲、拟杆菌纲和γ-变形菌纲。
[0861] 这项研究证明了分子物质在微生物脂质组与人类组织脂质组之间明显不同。各种细菌类型的分类单元特异性标志物被示为不存在于人类脂质组/或代谢组中并且因此可用
于可视化人类样品中的细菌的存在,如针对人类结肠直肠组织所示。进一步证明了由REIMS技术得到的分类学标志物可与检测脂质分布图的其他质谱电离技术(诸如DESI)一起使用。
[0862] 实例12坏死的分析
[0863] 该方法可用于分析坏死,例如检测坏死组织。在两个不同患者的人类肺组织样品中举例说明这个方法。使用鉴定100%坏死癌症组织的组织病理学来分析样品。还使用MS来分析样品并且使用MS可能在坏死与非坏死组织之间区分。
[0864] 第二PC成分使坏死与其他组织分离,这在图23中可看出。分析了腺癌、正常肺、癌症边界、鳞状细胞癌和坏死组织并且可将其清楚地区分。
[0865] 实例13卵巢癌的分析
[0866] 背景
[0867] 卵巢癌(OC)是常见的,并且对于3期或4期疾病,五年存活率分别是21.9%和5.6%,这是当60%的妇女第一次存在时的情况。术中组织鉴定通常依赖于冷冻切片组织病理学分析,其是耗时和昂贵的。目视非描述性病灶(可能是癌症)可能难以正确地在术中进
行鉴定,尤其在新辅助化疗之后。
[0868] 方法
[0869] 用柯惠医疗公司(Covidien)的透热机头切割新鲜的冷冻卵巢样品(正常、良性、交界性、OC)加上输卵管和腹膜。提取外科手术烟雾并且在沃特斯公司(Water)的Xevo G2-S 
质谱仪中电离。所得到的质谱经历预处理和用定质量进行的背景扣除。经处理的组织样
品由组织病理学家重新报道以证实组织学。这些数据用于创建真实的谱数据库,其是组织
学上批准的。用主成分分析和线性判别分析以及患者留一交叉验证来处理数据。
[0870] 从130位单独的患者中收集总共144份不同的样品(一些患者提供多于一种组织类型),其在表13.1中加以概述。对新鲜组织样品进行速冻并且储存在-80℃下。包括样品年
龄、疾病的国际妇产科联盟(International  Federation of  Gynaecology and 
Obstetrics,FIGO)时期和等级、以医学记录形式所报道的组织病理学以及样品部位的数据被记录在国立健康服务 (National Health Service,NHS)网络计算机上并且仅由临床上
授权的人员进入。
[0871] 因此从组织库中发行成批组织并且相应地登录到该研究。使样品解冻并且用偶联有改良电外科刀的Covidien ForceTriadTM能量发生器切割。使用25瓦特在切割模式下处理样品,并且用 G2-S TOF质谱仪在负离子模式下分析所得到的烟雾。
[0872] 表13.1:在研究中包括的组织类型
[0873]
[0874] 发现
[0875] 处理了144份组织样品,从而产生529个谱。可在主成分分析和线性判别分析中区分正常卵巢和OC。交叉验证产生正常卵巢与有活力OC分离的100%灵敏度和100%特异性(n
= 189)。将OC与输卵管、正常卵巢和腹膜比较的另外分析与交叉验证产生100%灵敏度和 
97.8%特异性(n=291)。结果在图24中示出。
[0876] 解释
[0877] 本研究显示正常的卵巢、腹膜和输卵管组织具有独特的谱特征标记,其可用于准确地确定组织类型。该方法可在术中(体内)使用。该方法快速确定组织类型的能力可缩短
手术并且降低发病率和死亡率,从而潜在地改进患者护理和存活。
[0878] 实例14使用REIMS进行的粪便分析
[0879] 1.取得例如10μl套圈的新鲜粪便样品,或如果冷冻,即是解冻的粪便样品。
[0880] 2.如果使用基于钳子的REIMS,在钳子之间取得少量并且将探针聚集在一起。
[0881] 3.例如使用先前描述的REIMS参数来进行REIMS分析。
[0882] 图25示出当使用REIMS来分析粪便样品时观察到的谱
[0883] 实例15血液培养物沉淀物的REIMS分析
[0884] 目的:这个方案描述了用于使用REIMS分析来分析血液培养物样品的方法的具体实例。
[0885] 最初,用单个微生物菌落接种10ml的去纤维蛋白的马血液。在37℃下使其有氧地生长24小时。接下来,用1ml过夜培养物接种1l的马血液。在37℃下有氧地生长并且在时间0和此后的每个小时移除25ml以按以下方式分析:
[0886] a.将10ml转移至50离心管中并且在3,2000g下将样品离心10min。如下文所述,使用 REIMS来分析沉淀物。
[0887] b.使用HPLC水来制备2.5%微生物级琼脂溶液并且加热直到溶液达到50℃。静置1分钟以去除气泡。接下来,将2ml的这种溶液加入8ml的上述血液培养物中并且通过移液来
轻轻地混合。倾倒进小琼脂板中并且允许静置15分钟。使用这种溶液来进行REIMS分析。
[0888] c.使用分子级水,用1ml的这种溶液制备连续稀释物至10-6,并且将100μl的每种稀释物铺板到血液琼脂板上。孵育24小时并且在计数菌落数之后确定CFU。
[0889] d.使用另外的2ml血液培养物并且在-80℃下冷冻以用于LC-MS分析。
[0890] 可在离心沉淀物和/或琼脂糖块上进行REIMS分析。
[0891] 实例16使用DESI质谱进行的粘膜标本的分析
[0892] 在非入侵程序中提取关于患者护理的化学信息的目的下,通过解吸电喷雾电离 (“DESI”)质谱来分析医学棉签。在这个背景下,解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱代表用于通过从标准医学棉签中解吸和分析分子对不同粘膜模型或粘膜(例如鼻、阴道、口腔)进行代
谢组学特征分析的快速而直接的方法。
[0893] 进行从患者中用医学人造丝棉签取样阴道粘液膜(n=25个孕期,n=25个非孕期)、鼻粘液膜(n=20)和口腔粘液膜(n=15)的研究。作为Transwab(RTM)埃米斯(MWE医学
线公司,英国威尔特郡(MWE medical wire,Wiltshire,UK))出售的医学棉签用于取样粘
膜,然后将这些粘膜转移到不具有缓冲液或储存培养基溶液的无菌管,并且在-80℃下在冷冻箱中储存。
[0894] 图32突出了用医学棉签320从泌尿生殖道、口腔和鼻腔中收集的所分析的粘膜的取样点。如图32所展示,医学棉签320的表面直接通过解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱来分析,而不需要先前的样品制备程序。
[0895] 使用Xevo  G2-S Q-TOF(RTM)质谱仪(沃特斯公司(RTM),英国曼彻斯特(Manchester, UK))进行解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱实验。解吸电喷雾电离(“DESI”)源包括与气体322、溶剂323和电源324连接的电子喷雾发射器321以及具有可调旋转速度的自
动可旋转棉签夹持装置325。
[0896] 对于解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱分析,将医学棉签320正交于入口毛细管326定位并且定位在入口毛细管326前方,该入口毛细管连接到质谱仪大气压接口327。在大约10 μL/min的流速下使用混合的甲醇:水溶液(95:5)喷雾溶剂以用于解吸样品材料。还向喷雾器320提供大约7巴的氮气和大约3.4kV的电压。
[0897] 通过轻轻地解吸具有带电有机溶剂液滴的分子来从旋转的棉签表面中吸收粘液膜,并且随后将解吸离子(例如脂质)转移到质谱仪。
[0898] 在负离子模式下记录全扫描质谱(m/z 150-1000)。然后将谱数据导入统计分析工具箱中并且对其进行处理。对于特定分子离子图案的数据分析和提取,应用非监督主成分
分析 (“PCA”)以及递归最大边限标准(“RMMC”)方法来改进监督特征提取和关于留一交叉验证(“CV”)的类别信息以确定数据集内的分类准确性。
[0899] 图33A和图33B示出了棉签的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱分析,以及在不同粘膜模型中在代谢特征标记研究中的包括主成分分析(PCA)和递归最大边限标准(RMMC)的多变量统计分析。
[0900] 图33A示出使用Xevo G2-S Q-Tof(RTM)质谱仪记录的来自阴道粘液膜、口腔粘液膜和鼻粘液膜的平均负离子模式解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱。
[0901] 图33B示出了针对在解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱情况下获取的阴道粘液膜(n=68)、口腔粘液膜(n=15)和鼻粘液膜(n=20)的主成分分析(“PCA”)和最大边限标准
(“MMC”) 得分图。
[0902] 如图33A所示,在不同粘膜模型之间观察到独特的脂质图案。阴道粘液膜和口腔粘液膜的谱主要特征在于甘油磷脂,例如具有质荷比(“m/z”)为760.4的[PS(34:1)-H]-、具有 m/z为788.5的[PS(36:2)-H]-和具有m/z为863.4的[PI(36:1)-H]-。
[0903] 如图33A所示,鼻粘液膜的主要特征在于m/z 700-900范围内的[PC(36:2)-Cl]-m/z 820.5、 [PC(34:2)+Cl]-和[PI(36:2)-H]-m/z 826.4。
[0904] 主要在阴道粘膜中观察到所关注的特征,其中m/z为465.3下的去质子化胆固醇硫酸盐峰是谱中最主要的峰。这个峰的化学归属通过串联质谱实验来证实。这个化合物是具
有调节性功能的细胞膜的重要组分,这些调节性功能包括稳定作用(例如保护红细胞不受
渗透裂解) 和调节精子获能。
[0905] 包含通过三个粘膜模型的分析而获得的谱的多变量模型的患者留一交叉验证产生高分类准确性。这表明对不同粘膜进行的基于MS的分析允许基于细菌多样性对患者的分
层。
[0906] 类似地,图34示出了在负离子模式下,在m/z 150-1000质量范围内,从医学棉签上的阴道粘液膜、口腔粘液膜和鼻粘液膜中获得的傅里叶变换质谱(“FTMS”)谱数据。再次,在每种粘膜模型中观察到不同的代谢特征标记。
[0907] 总共发现不具有同位素和加合物的300至1000种谱特征(包括小分子人类初级代谢物诸如胆固醇硫酸盐、细菌次级代谢物包括乳酸盐以及甘油磷脂)暂时通过粘膜中的精
确质量、同位素团簇分布和串联质谱实验来鉴定。
[0908] 图35更详细地示出了使用医学棉签在负离子模式下获得的关于孕期阴道粘膜的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱。发现泌尿生殖器粘液膜在m/z为465.41下产生胆固醇硫酸盐[M-H]-作为最丰富脂质物质以及不同的甘油磷脂物质诸如m/z为788.50下的甘油磷酸乙
醇胺(PE) [PE(40:7)-H]-、m/z为760.50下的甘油基磷酸丝氨酸(PS)[PS(34:1)-H]-和m/z为
863.58下的甘油基磷酸肌醇(PI)[PI(36:1)-H]-。如图35所示,胆固醇硫酸盐峰的化学归属通过串联质谱实验来证实。
[0909] 使用中值归一化、背景扣除、Savitzky-Golay峰检测、峰比对和对数转化来进一步处理图34的谱数据。在数据处理之后,对数据集应用多变量统计分析以基于其代谢分布图表征不同的粘膜模型。使用包括主成分分析(PCA)和最大边限标准(MMC)的多变量统计分析
工具来分析数据集。
[0910] 如图34所示,PCA得分图以及MMC得分图揭示了前两种成分内的不同粘膜类型的分离,其中通过留一交叉验证获得的预测准确性在92%-100%之间。
[0911] 将了解根据各种实施例的分析产生不同样品类型的特征分布图,其可例如通过使用 PCA、MMC和/或留一交叉验证分析来明显区分。这些结果示出了使用解吸电喷雾电离 
(“DESI”)质谱作为例如与16S rRNA测序相比的快速细菌鉴定方法,例如基于其由特征性细菌排泄的代谢特征标记而表征人类粘膜模型。
[0912] 考虑了可测量人类粘膜中的化学生物标志物的另外实施例,这些化学生物标志物例如在生态失调、炎性、癌性和/或感染性疾病的情况下是可靠的预测物。
[0913] 在阴道粘液膜的情况下,更详细地评估了孕期(n=22,在26周与40周之间的孕龄) 和非孕期粘膜(n=22)临床组,以便揭示怀孕期间由阴道微生物组变化引起的代谢特征标记差异。在m/z 150-1000质量范围内在负离子模式下从两个组中获得解吸电喷雾电离 
(“DESI”)质谱谱图。在阴道粘膜中检测到许多不同的代谢物。
[0914] 图36A示出了在m/z 150-1000质量范围内在负离子模式下所获得的来自孕期和非孕期组的平均解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱。图36A所示的平均谱的比较示出了非孕期与孕期粘液膜代谢分布图之间的谱差异,尤其在m/z 550-900脂质质量范围内。
[0915] 使用包括非监督PCA和RMMC分析的另外数据分析来可视化两组之间的差异。
[0916] 图36B和图36C示出了使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱来多变量统计分析孕期(n =22)和非孕期(n=22)阴道粘膜的结果。
[0917] 图36B示出了主成分分析和使用RMMC的判别分析并且图36C示出了使用留一交叉验证的分析。
[0918] 图36D示出了指示非孕期与孕期阴道粘膜之间主要在m/z 550-1000范围内的所选择峰的丰度的显著性差异的箱线图,该显著性差异由Kruskal-Wallis ANOVA获得,p<
0.005。
[0919] 如图36E所示,使用RMMC,两组在RMMC空间中分离良好,具有由患者留一交叉验证获得的根据不同代谢特征标记的高(>80%)分类准确性。
[0920] 图37A示出了根据实施例在棉签上的细菌(肺炎克雷伯菌)样品的解吸电喷雾电离 (“DESI”)质谱分析。图37A所示的数据示出了可根据各种实施例,在棉签上使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱来检测细菌样品。图37B示出了为了比较的从琼脂板中直接测量的相应细菌样品的快速蒸发电离质谱(“REIMS”)飞行时间(“TOF”)质谱数据。由星号突出的峰是使用两种电离技术检测到的。
[0921] 在六种培养的物种上进一步测试用于微生物检测的解吸电喷雾电离(“DESI”)棉签分析,这些物种包括白色假丝酵母、蒙特利假单胞菌、表皮葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌和乳杆菌。这些全部都是从怀孕患者的阴道粘膜中分离出来的重要细菌和真菌物
种,并且其通过序列分析诸如16S rRNA基因测序来鉴定。
[0922] 将棉签迅速地蘸入来自每种物种的稀释的生物质在10μL甲醇中的溶液中,接着进行棉签表面的解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱分析。
[0923] 图38A-C示出了在棉签上使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱分析的微生物分析。
[0924] 图38A示出了不同分析的微生物物种的平均解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱,这些微生物物种包括白色假丝酵母、蒙特利假单胞菌、表皮葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌和乳杆菌。
[0925] 图38B和图38C示出了PCA图,其示出前两种成分内的阴道粘液膜(孕期和非孕期组) 与微生物物种之间的分离。另外,可在不同细菌与真菌物种之间观察到分离。
[0926] 在如图38A所述的质谱中观察到独特的谱特征,这导致能够在前两种成分内的PCA得分图(图38B和图38C)中在不同微生物类别之间以及来自阴道粘膜的不同微生物类别之
间分离。
[0927] 这个结果示出了在医学棉签上使用解吸电喷雾电离(“DESI”)质谱来表征微生物(例如来自动物(例如人类粘膜)的特异性微生物的(例如细菌的)群落的细菌特异性和宿主
响应的代谢物生物标志物和特征标记)的潜力。
[0928] 实例17数据分析的实例
[0929] 将原始质谱文件转化成mzML格式并且随后作为imzML格式(REF)导入MATLAB(马萨诸塞州纳蒂克Mathworks公司;http://www.mathworks.co.uk/)中以用于数据预处理。所有 REIMS谱被线性内推至0.01Da的常见取样间隔。然后按递归细分顺序的峰比对用于在谱分
布图上去除峰位置中的小质量位移。使比对的数据经受总离子计数(TIC)数据归一化和基
于对数的转化。在Matlab或在RStudio(美国马萨诸塞州波士顿,还参见www.r-
project.com) 中进行图案识别分析和可视化。仅将m/z 150-1000的质量范围用于数据分
析。对于自鉴定实验,过滤数据集以保留减少的m/z值组:如果基于Kruskal-Wallis测试在α=0.01阈值水平下可用样品之间的差异显著不同,保留m/z值。
[0930] 质谱中的离子物质基于精确质量测量(质量偏差<3ppm)和MS/MS碎片化图案来鉴定。
[0931] 实例18对具有转移肿瘤的肝脏进行成像
[0932] 通过使用REIMS成像技术或DESI成像质谱的离子成像来分析人类肝脏肿瘤样品(如图51所示)。在第一仪器上获得切割模式快速蒸发电离质谱图像同时在飞行时间质谱仪
上获得指向模式图像。空间分辨的质谱信息与H&E图像一起共配准以将质谱定位有希望的
组织学身份。组织的监督多变量分析揭示了对于快速蒸发电离质谱成像和DESI成像数据两
者的健康与癌性组织之间的明显区别。
[0933] DESI图像由于高空间分辨率和100μm小像素大小而示出了两种组织类型之间的明显边界。切割模式快速蒸发电离质谱图像的上半部分含有引起模糊边界的混合健康和肿瘤
图案影响的像素。可能的解释是由于进行快速蒸发电离质谱切割的方向开始在健康组织处
并且朝向肿瘤区域继续。这可导致肿瘤组织片运送到健康区域中。另一种原因是非均匀组
织在看起来癌性区域的表面下方。
[0934] 假定质谱有待用作智能刀技术的参考数据,则仅具有高类别从属关系概率的像素应当用于形成多变量模型(即样品分类模型)。
[0935] 非监督主成分分析(PCA)证明了高组织内类型谱相似性与PCA空间中的健康和癌性数据点的空间不同聚类(参见图52)。
[0936] 在高空间分辨率下获得的DESI成像数据还可用于定位组织学精细结构和其相应的质谱,然后可将这些质谱与快速蒸发电离质谱数据配准。DESI和快速蒸发电离质谱数据
的配准的限制性因素是当前使用快速蒸发电离质谱平台可达到的空间分辨率。虽然在500μm像素大小下记录切割模式图像,但是指向模式图像的特征在于750μm大小的像素。在这种肝转移样品的情况下,分辨率是足够的。然而,在具有更高异质性组织的情况下,更高空间分辨率图像可以是有利的。可增加空间分辨率以减小取样探针电外科尖端的直径,这还将
伴随更低的谱强度。然而,通过将取样探针直接连接到质谱仪入口毛细管(如在上述两极钳方法中也能完成)使离子产率改进,因而克服了可能的灵敏度问题。这还允许z方向上的穿
透较小,从而降低电离意料之外的组织类型的可能性。可达到例如250μm大小像素的分辨
率。
[0937] 肝转移样品的多变量分析示出了基于其分子离子图案的组织类别的明显区别。虽然快速蒸发电离质谱和DESI展现出不同的电离机理,这些不同的电离机理产生彼此不可直
接比较的质谱图案,但是单离子的单变量生物化学比较为DESI和快速蒸发电离质谱配准提
供可比测量。对于某些化合物,两种组织类型之间的相对强度差异是在所有组织类型、电离技术和快速蒸发电离质谱分析模式(切割模式和指向模式)上类似的。这使得DESI能够用作
基于上调化合物和下调化合物的快速蒸发电离质谱的倍数变化强度的预测物,这最终代表
另外的未知组织类型鉴定的信息。DESI的更高空间分辨率允许上调离子和下调离子与某些
组织学特征配准,这些特征通过快速蒸发电离质谱可能不可分辨。如果在低分辨率快速蒸
发电离质谱中观察到单离子强度的某些变化,这提供潜在的组织组织学组成的见解。
[0938] 如图53所示,在转移肝比较的情况下,发现两种不同的磷脂酰乙醇胺(PE)物质在健康与转移组织类型之间具有相反的相对强度。代表的图像是两种PE离子物质的离子图
像。 PE(38:4)在所有四种情况下在健康组织中都具有较高丰度,其中快速蒸发电离质谱切割模式图像示出在肿瘤组织中几乎没有任何这种离子存在。然而,与其中这种脂质甚至在
肿瘤组织中也有良好丰度的DESI图像相比,强度的不存在与由快速蒸发电离质谱切割达到
-
的较低灵敏度相关。由示出肿瘤组织中的升高强度的离子[PE(36:1)-H]看出相反的行为。
[0939] 实例19健康粘液膜下层和GI息肉的分析
[0940] 在健康胃粘液膜、健康胃粘液膜下层与胃癌组织之间观察到显著的谱差异。如图54A 所示,健康胃粘液膜(n=32)和胃腺癌(n=29)的谱的特征在于m/z 600-900范围内的
磷脂,而胃粘液膜下层(n=10)的特征在于m/z 900-1000范围内的密集的甘油三酯(“TG”) 和磷脂酰肌醇(“PI”)物质。
[0941] GI道中的粘液膜下层代表含有小动脉、小静脉和淋巴管的结缔组织层。它主要由胶原纤维和弹性纤维与不同量的脂肪元件组成。假设在m/z 900-1000质量范围内观察到的
PI和甘油三酯物质与粘液膜下层内存在的这些组织学特征相关。
[0942] 观察到关于磷脂酰乙醇胺和相应的缩醛磷脂物质的丰度的感兴趣特征。虽然PE示出较高丰度,但是在肿瘤组织中缩醛磷脂贫乏,可能是由于癌细胞的过氧化物酶体功能受
损。
[0943] 图54B示出了质量范围600-900内健康组织层与癌症组织之间显著不同的许多所选择的峰。当将胃粘液膜下层与腺癌或胃粘液膜比较时,m/z 900至1000之间的所有峰都示出了显著差异。
[0944] 实例20粘液膜中的癌症的分析
[0945] 在匈牙利德布勒森大学(University of Debrecen,Hungary)使用LTQ Velos(RTM)质谱仪对从七位患者中获得的离体人类结肠腺癌(n=43)和健康结肠粘液膜(n=45)
进行分析。
[0946] 如图55A和图55B所示,还从两位患者中离体取样腺瘤性息肉(n=5),并且使用多变量统计工具来分析所得到的快速蒸发电离质谱数据。如从图55A和图55B中可看出,发现
从胃和结肠两者的健康粘液膜和腺癌中获得的谱在3维PCA空间中分离良好。如图55A所示,取样的腺瘤性息肉还证明与来自结肠的健康粘液膜和恶性组织的良好分离。
[0947] 在证明概念分析离体样品之后,还在被提到用于结肠镜检查的连续三位患者上体内测试快速蒸发电离质谱内窥镜方法。在结肠镜检查程序期间对结肠和直肠的不同区域进
行取样。第一位患者和第三位患者证明具有结肠息肉并且这些息肉被证实为良性的。第二
位患者证明具有没有可见息肉的正常结肠。粘膜层示出与解剖位置无关的统一谱图案。然
而,如图56B 所示,结肠息肉示出了与健康粘膜层明显的不同。
[0948] 在此呈现的数据证明了使用快速蒸发电离质谱技术作为内窥镜检查中的实时诊断工具的显著优势。
[0949] 对于实例19和实例20所述的实验,具有约2300mm工作长度、约2.8mm的最小通道大小、约15mm的开口直径以及约0.47mm的钢丝厚度的可商购的息肉去除勒除器(奥林巴斯公
司(Olympus)(RTM)型号SD-210U-15)被配备有另外的T形件,以便建立与1/8” OD 2mm ID 
PFTE管在组织蒸发点与质谱(Xevo G2-S(RTM)Q-TOF,沃特斯公司(RTM),英国曼彻斯特和
LTQ Velos(RTM)线性离子阱质谱仪,德国不来梅的赛默飞世尔科技公司 (Thermo Fischer Scientific(RTM),Bremen,Germany))大气入口之间的连接。
[0950] 勒除器与可商购的内窥镜(奥林巴斯公司(Olympus)(RTM),日本东京)和相关的内窥镜组套一起使用,该内窥镜组套偶联有电外科发生器(Valleylab Surgistat II(RTM))。
[0951] 在息肉去除期间产生的内窥镜卷流穿过快速蒸发电离质谱勒除器上的窗孔而捕获。然后通过内窥镜外壳并且通过PFTE管材将内窥镜卷流转移到质谱仪,该PFTE管直接偶
联到使用质谱内部真空以用于卷流捕获的质谱仪入口毛细管。
[0952] 在m/z 150-1500范围之间在负离子模式下进行高分辨率质谱。
[0953] 用于胃肠道的健康、癌性和腺瘤性息肉的分离的数据分析流程图包括组织特异性谱数据库的构建接着是已知方式下的多变量分类和谱鉴定算法。
[0954] 实例21DESI-MS成像
[0955] 使用Exactive质谱仪(德国不来梅的赛默飞世尔科技公司),使标本(诸如涂抹在标准显微镜载玻片的表面上的组织切片或微生物)经受DESI-MS成像分析。Exactive仪器参
数列于以下表格中。错误!未找到引用源。
[0956] 用于DESI-MS成像的赛默公司Exactive仪器参数
[0957]
[0958]
[0959] 甲醇/水(95:5v/v)在1.5μL/min流速下用作电喷雾溶剂。在7巴压力下将氮气N4.8 用作雾化气体。所使用的所有溶剂都为LC-MS级(色谱溶剂(Chromasolv),美国圣路易斯密苏里州西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA))。DESI喷雾器与样品表面
之间的高度距离被设定为2mm,其中该喷雾器与嗅探器之间的距离被设定为14mm。样品表面与质谱仪的入口毛细管之间的距离是<<1mm。喷雾器尖端与样品表面之间的角度被设定在
80°下。入口毛细管与样品之间的收集角度被设定为10°。
[0960] 使用DESI MS的潜在成像方法的一般原则在于除了逐点取样,通过以一定速度移动自动取样平台来在标本表面上进行水平线扫描,该速度覆盖质谱仪完成一次扫描(获得
一个质谱)所需的时间下确定为像素(空间分辨率)的区域。这产生所得到图像的每行的每
一个文件(行数通过样品高度除以空间分辨率来确定)。
[0961] 为了图像分析,使用imzML转化器1.1.4.5版(www.maldi-msi.org)将单独的水平线扫描转化成imzML文件。使用具有线性插值(1阶)和0.005Da箱大小的MSiReader 0.05
(146) 版来产生单离子图像和RGB图像。
[0962] 表1:生物标志物:磷脂和其谱信号的表格
[0963] 对于所有分析的微生物物种,在质量范围m/z=600-900内检测的鉴定的磷脂。包括仅具有相对丰度>5%的磷脂和仅最丰富的酰基链组合。在括号内给出细菌在其上生长的
固体生长培养基。当脂质组成作为总碳数而不是单独酰基链给出时ID仅基于精确质量。
[0964]
[0965]
[0966]
[0967] *信号强度不足以获得有意义的MS/MS数据;
[0968] 缩写:PG=磷脂酰甘油,PE=磷脂酰乙醇胺,CBA=哥伦比亚血液琼脂,LB=溶原性肉汤琼脂,MCC=麦康凯琼脂。
[0969] 表2-生物标志物:心磷脂及其质谱信号的表格
[0970] 对于表皮葡萄球菌ATCC 12228鉴定的心磷脂物质。
[0971]
[0972]
[0973] 表3生物标志物:霉菌酸及其质谱信号的表格
[0974] 如在不同棒状杆菌物种中所检测的鉴定的霉菌酸。
[0975]
[0976] 表4生物标志物:霉菌酸及其质谱信号的表格
[0977] 如在红球菌物种中所检测的鉴定的霉菌酸。
[0978]
[0979]
[0980] 表5生物标志物:霉菌酸及其质谱信号的表格
[0981] 如在诺卡氏菌物种中所检测的鉴定的霉菌酸。
[0982]
[0983]
[0984] 表6生物标志物:霉菌酸及其质谱信号的表格
[0985] 如在不同分枝杆菌物种中所检测的鉴定的霉菌酸。
[0986]
[0987] 表7生物标志物:鞘脂及其质谱信号的表格。
[0988] 在拟杆菌门成员中的鉴定的鞘脂物质
[0989]
[0990]
[0991] 表8生物标志物:群体感应分子及其质谱信号的表格
[0992] 在铜绿假单胞菌中的鉴定的群体感应分子。
[0993]
[0994]
[0995] 表9生物标志物:鼠李糖脂及其质谱信号的表格
[0996] 通常由铜绿假单胞菌菌株产生的鼠李糖脂物质。
[0997]
[0998] 表10生物标志物:表面活性素及其质谱信号的表格。
[0999] 对于枯草芽孢杆菌在正离子模式和负离子模式下检测的表面活性素物质。
[1000]
[1001] 表11生物标志物:地衣素及其质谱信号的表格
[1002] 在地衣芽孢杆菌中检测的地衣素化合物。
[1003]
[1004]
[1005] 表12生物标志物的表格
[1006] 示出与细胞系(NCI60)数据集的ugcg基因表达强烈正相关的质谱信号。
[1007]
[1008] 表13支原体的生物标志物的表格
[1009] 在HEK和HeLa两个细胞系中,与无支原体的样品相比在支原体感染的样品中显著更高的m/z峰的列表。第2列展示了相应的分箱峰,第2列突出了假定的同位素峰,而第4列示出了分箱峰的试验注释。用粗体书写作为主要支原体成分的磷脂酰甘油和鞘磷脂物质。
[1010]
[1011]
[1012] 表14:生物标志物:微生物分类单元特异性生物标志物的表格
[1013] 对于不同微生物获得的分类单元特异性标志物。没有标志物是计算出来的,其中样品组的大小是不足够的。
[1014]
[1015]
[1016]
[1017]
[1018]
[1019]
[1020]
[1021]
[1022]
[1023]
[1024]
[1025]
[1026] 表16.在门层次下所确定的分类单元特异性标志物。
[1027]
[1028]
[1029]
[1030] 表17.在纲层次下所确定的分类单元特异性标志物。
[1031]
[1032]
[1033] 表18.在目层次下所确定的分类单元特异性标志物。
[1034]
[1035]
[1036]
[1037]
[1038] 表19.在科层次下所确定的分类单元特异性标志物。
[1039]
[1040]
[1041]
[1042]
[1043]
[1044]
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