技术领域
[0001] 本
发明涉及氯乙酸的检测方法，具体涉及一种应用超高效液相色谱-串联质谱检测氯乙酸的方法。
背景技术
[0002] 随着社会的发展和科技的进步。人类对健康重视程度越来越高，而医药在保证人类健康方面起到了举足轻重的作用。因此，医药行业成为了社会最为重要的领域之一。如何准确快速地检测药物
试剂中潜在的限量要求低的有害物质是目前医药行业面临的挑战。应用先进的现代仪器分析技术来应对这一挑战，对于促进药物的安全性评价和提高药物的商业价值具有重要意义。
[0003] 仪器分析作为现代检测主要手段，广泛应用于化学、药物、食品、
化妆品及
农用化学品等领域的检测。仪器分析能够通过测量物质的一些物理化学性质、参数及其变化来确定物质的组成、各成分含量及化学结构。随着仪器分析科学技术的进步，越来越多先进的仪器分析技术被广泛应用于各检测领域，其中质谱检测技术就是其中一个。质谱检测是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同质荷比的带电离子，经
加速电场的作用，形成离子束后，进入
质量分析器，质量分析器检测到质谱
信号后经
电子转换在计算机
软件上形成可见谱图供科学研究技术人员进行分析研究工作。为结合色谱分离的优点，质谱一般与色谱联用，形成色谱-质谱联用技术。色谱-质谱联用技术兼具色谱和质谱技术的优点，即选择性好、灵敏度高、试验用量少、易于操作、分析速度快、重现性好、误差小、准确可靠等。根据色谱技术的不同，色谱-质谱联用技术有分为液相色谱-质谱联用LC-MS和气相色谱-质谱联用GC-MS。本发明中所使用的超高效液相色谱-串联质谱联用UPLC-MS/MS是液相色谱-质谱联用LC-MS的一种，该方法采用串联质谱作为质谱检测器，它由三级质谱串联而成，能够有效提高对目标离子的选择性、降低噪音干扰，从而进一步提高
信噪比和降低检出限，而UPLC则有分离效能高、分离速度快、使用试剂少等优点。鉴于UPLC-MS/MS技术的巨大优势，该技术已广泛应用于药物、化学、食品科学及化妆品等领域。
[0004] 氯乙酸是一种毒性物质。被人体吸入后，会导致支气管炎、
肺水肿及
皮肤损害，严重时出现嗜唾、呼吸深，咳嗽、恶心、呕吐，最终危及生命安全。因此，为保证药物的安全性，氯乙酸在药物试剂中的残留量必须严格控制。
[0005] 由于氯乙酸的沸点低、分子量小、紫外吸收弱且含
碳氢比例少，很难用常用的检测方法GC-FID、HPLC-UV、GC-MS检测试样中氯乙酸低浓度限量。
[0006] 目前，缺乏一种检测灵
密度高、简单、快速、易于操作的超高效液相色谱-串联质谱联用法来有效检测药物中残留的氯乙酸。
发明内容
[0007] 本发明的目的是克服
现有技术的
缺陷，提供一种选择性好、检测灵敏度高、快速的一种应用超高效液相色谱-串联质谱检测氯乙酸的方法。
[0008] 实现本发明目的的技术方案是：一种应用超高效液相色谱-串联质谱检测氯乙酸的方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤(1)，取待测样品置于容量瓶中，加入乙腈-水1:1～9:1定容到10～50ml，涡旋混合5～15min，超声提取5～15min，过0.22μm滤膜，进样对样品中氯乙酸进行检测；
[0010] 步骤(2)，采用超高效液相色谱-串联质谱联用仪UPLC-MS/MS作为检测仪器对氯乙酸进行检测。
[0011] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的
数据采集方式为选择反应检测SRM，选择质荷比m/z＝93→93、m/z＝93→77作为定性定量离子对。
[0012] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的色谱柱是以-NH2键合
硅胶为固定相的高效液相色谱柱：
氨基柱柱长100～150mm，柱径4.6mm，填料粒径3.5μm。
[0013] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的流速为0.2～1.0ml/ml。
[0014] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的柱温为25～45℃。
[0015] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的进样体积为2～20μL。
[0016] 进一步地，步骤(2)中，所述超高效液相色谱-串联质谱联用仪的质谱条件为HESI离子源，毛细管
电压为2800～3800v，毛细管
温度为250～380℃，离子源温度为130～250℃，雾化气为氮气，鞘气压
力为30～100psi，辅助气压力为0～10psi，离子传输电压为-40～-90v，碰撞气为氩气，碰撞气压力为1.0～2.0mtorr，碰撞
能量分别为-5v到-30v，扫描时间为
0.1～1.0秒。
[0017] 进一步地，步骤(1)中，所述待测样品为0.1～0.5g，精确到0.01mg。
[0018] 采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：
[0019] 本发明的检测方法具有选择性好、灵敏度高、简单、快速等优点。本发明中通过使用UPLC-MS/MS能快速、高效地对
原料药、药物制剂及其他试样中的氯乙酸进行限量测试；能够有效提高氯乙酸的检测灵敏度，有效避免基质干扰，降低氯乙酸的检出限，最低检出限为91ng/mL；定量限为227ng/mL；在227ng/mL～911ng/mL浓度范围内表现出良好的线性，线性相关系数为0.999。
附图说明
[0020] 为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体
实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0021] 图1是本发明的氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0022] 图2是本发明的氯乙酸标准品的质谱图；
[0023] 图3是本发明的空白
溶剂的定性定量离子色谱图；
[0024] 图4是本发明的空白溶剂的质谱图；
[0025] 图5是本发明的空白样品提取液的定性定量离子色谱图；
[0026] 图6是本发明的空白样品提取液的质谱图；
[0027] 图7是本发明的样品加标的定性定量离子色谱图；
[0028] 图8是本发明的样品加标的质谱图；
[0029] 图9是本发明的91ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0030] 图10是本发明的91ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0031] 图11是本发明的227ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0032] 图12是本发明的227ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0033] 图13是本发明的328ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0034] 图14是本发明的328ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0035] 图15是本发明的455ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0036] 图16是本发明的455ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0037] 图17是本发明的683ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0038] 图18是本发明的683ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0039] 图19是本发明的911ng/mL氯乙酸标准品的定性定量离子色谱图；
[0040] 图20是本发明的911ng/mL氯乙酸标准品的质谱图；
[0041] 图21是本发明的线性实验的标准曲线图。
具体实施方式
[0042] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
[0043] (实施例1)
[0044] 本发明提供一种应用超高效液相色谱-串联质谱检测氯乙酸的方法，包括如下步骤：
[0045] 步骤(1)，取待测样品置于容量瓶中，加入乙腈-水1:1～9:1定容到10～50ml，涡旋混合5～15min，超声提取5～15min，过0.22μm滤膜，进样对样品中氯乙酸进行检测；
[0046] 步骤(2)，检测条件：采用超高效液相色谱-串联质谱联用仪UPLC-MS/MS作为检测仪器对氯乙酸进行检测。
[0047] 在步骤(1)中，取待测品为0.185g，精确到0.01mg，置于空容量瓶中，加入乙腈-水9:1定容到20ml，涡旋混合15min，超声提取5min，过0.22μm滤膜。
[0048] 在步骤(2)中，超高效液相色谱-串联质谱联用仪的数据采集方式为选择反应检测SRM，选择质荷比m/z＝93→93、m/z＝93→77作为定性定量离子对；超高效液相色谱-串联质谱联用仪的色谱柱是以NH2键合硅胶为固定相的高效液相色谱柱：氨基柱柱长150mm，柱径4.6mm，填料粒径3.5μm；超高效液相色谱-串联质谱联用仪的流速为0.4ml/ml；超高效液相色谱-串联质谱联用仪的柱温为30℃；超高效液相色谱-串联质谱联用仪的进样体积为5μL；
超高效液相色谱-串联质谱联用仪的质谱条件为HESI离子源，毛细管电压为2800～3800v，毛细管温度为250～380℃，离子源温度为130～250℃，雾化气为氮气，鞘气压力为40psi，辅助气压力为5psi，离子传输电压为-40～-90v，碰撞气为氩气，碰撞气压力为1.0～
2.0mtorr，碰撞能量分别为-5～-20v，扫描时间为0.5秒。
[0049] 以下测试样品由柯菲平医药有限公司提供。
[0050] 空白试验和专属性试验：
[0051] 如图1至图2所示，称取约185mg氯乙酸标准品于10ml容量瓶中，用乙腈-水9:1溶解并定容至刻度。用乙腈-水9:1将该氯乙酸标准品溶液稀释至227ng/mL后，取1.5ml于进样小瓶中进样分析，得氯乙酸标准品色谱图。如图3至图4所示，为乙腈-水9:1溶剂的色谱图。取1ml乙腈-水9:1溶剂进样分析。查看目标峰
位置有无干扰峰。
[0052] 如图5至图6所示，分别称取约183mg利伐沙班固体粉末于20ml容量瓶中，加适量乙腈-水9:1，涡旋混合15min，超声提取5min，用乙腈-水9:1定容至刻度，混匀。取2ml过0.22μm滤膜后进样分析。查看目标峰位置有无干扰峰。
[0053] 通过将空白溶剂色谱图、空白样品色谱图于氯乙酸标准品色谱图进行比较可以看出，乙腈-水9:1空白溶剂和样品空白基质在目标峰位置2.5～3.5min无干扰峰；因此，可以认为溶剂和样品基质对氯乙酸检测不存在干扰。
[0054] 线性实验：
[0055] 如图11、图13、图15、图17、图19所示，称取氯乙酸标准品约185mg于10ml容量瓶中，用乙腈-水9:1溶解并定容至刻度。用乙腈-水9:1将该氯乙酸标准品溶液稀释配制成一系列标准溶液，进样分析。峰面积对浓度作图，得到线性结果。得到的实验数据见下表1，表1为标准序列实验测定数据：
[0056] 表1
[0057]
[0058] 如图21所示，为线性实验的标准曲线图。氯乙酸仪器响应值在227ng/mL～911ng/mL内表现出良好的线性关系，线性相关系数为：0.999，满足检测的要求。
[0059] 检出限和定量限如图9和图11所示，91ng/mL氯乙酸标准品色谱图及质谱图；其在2.5～3.5min处信噪比为20达到S/N>3的检出限要求。227ng/mL氯乙酸标准品色谱图及质谱图；其在2.5～3.5min处信噪比为50达到S/N>10的定量限要求。
[0060] 精密度：
[0061] 选取一个氯乙酸浓度点进行6次重复实验，实验中选取455ng/mL作为精密度实验用氯乙酸标准溶液浓度。具体数据见下表2，表2为氯乙酸精密度实验数据：
[0062] 表2
[0063]
[0064] 如表2所示数据可以看出，实验的精密度可达到检测要求。
[0065] 加标回收实验：
[0066] 实验中选取了三个加标浓度分别进行了三次平行试验，加标浓度分别为：24.8mg/kg、49.7mg/kg、74.6mg/kg即227ng/mL、455ng/mL、683ng/mL。实验数据见下表3，表3为氯乙酸加标回收实验数据。
[0067] 表3
[0068]
[0069]
[0070] 如表3为氯乙酸加标回收实验数据，可以看出回收率都在80～120％之间，满足试验要求。
[0071] 实施例2
[0072] 实施例2与实施例1的区别在于：在步骤(1)中，加入乙腈-水8:1定容到25ml，涡旋振荡10min，超声提取6min，过0.22μm滤膜，进样对样品中氯乙酸进行检测；取待测品为0.229g，精确到0.01mg，置于空容量瓶中，加入乙腈-水8:1定容到25ml，涡旋混合10min，超声提取6min。
[0073] 实施例3
[0074] 实施例3与实施例1的区别在于：在步骤(1)中，加入乙腈-水6:1定容到50ml，涡旋振荡10min，超声提取8min，过0.22μm滤膜，进样对样品中氯乙酸进行检测；取待测品为0.458g，精确到0.01mg，置于空容量瓶中，加入乙腈-水6:1定容到50ml，涡旋混合10min，超声提取8min。
[0075] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
