一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法
专利汇可以提供一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种畜禽原代 肝细胞 分离、培养与鉴定的方法，将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca2+与Mg2+，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。本发明能有效提高分离到的原代畜禽肝细胞数量、活率和纯度，并可适用于畜禽各类动物，所获得的原代肝细胞损伤少，易贴壁，活性好，能广泛应用于畜禽肝细胞的生理功能调节、代谢性 疾病 ，药理和毒理学机制，建立 病毒感染 细胞模型，以及理化和毒物因素影响等领域的研究。，下面是一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法专利的具体信息内容。
1.一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，其特征在于将螯合法与原位两步灌
2+ 2+
流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca 与Mg ，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。
2.如权利要求1所述畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，其特征在于操作步骤是：
一、畜禽原代肝细胞的分离
畜禽手术前禁食，自由饮水过夜，颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物；
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上，该手术台放在大瓷盘上，用75%酒精擦拭全身，转入超净工作台内；
无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管，然后松开流向肝脏的一端；
进行灌流分离，首先进行消化前灌流，又分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA，待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉，持续20min，然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O，持续5min；
待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶，并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉，使灌流液缓慢流出，15min后肝脏逐渐被消化；
触动肝脏表面呈现组织比较松软后，开始将其摘取并放入一无菌平皿中，加入50ml预冷的威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；
用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛，所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液清洗2次，再在4℃ 500rpm离心5min；
-6
用贴壁培养液，该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生牛血清、10 M人胰-6
岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数；
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×10 cell/ml，在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ，接种密度为1×10 cell /cm，在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养，4h细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h，此后，用无血清培养液、10µg/ml维生素C、
0.15% BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含-7
5×10 M地塞米松、1×SITE (这是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine) 的缩写，也可写成ITES，Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)，以后每24h更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况；
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h（接种后第3 d）的肝细胞进行糖原染色鉴定，具体操作步骤如下：
吸去培养液，加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液，加入95%酒精，5 min；
弃液，加入70%酒精15 min后弃液，加入质量百分比为0.8%的过碘酸酒精溶液氧化，10 min；
蒸馏水洗2 min后，加入Schiff’s酒精混合液，10 min；
弃液后，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液，2 min后蒸馏水再洗2 min；
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核，20 min；
以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化10 min；
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min；
二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察。
一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法
技术领域
背景技术
活率低。螯合法是用可结合Ca 、Mg 的螯合剂(如EDTA)去除Ca 依赖性黏附因子，使细胞间桥粒断裂而分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法与胰蛋白酶消化法等。酶消化法是利用酶来破坏肝细胞之间的桥连，使肝细胞分离的一种方法。酶消化法的通常做法是，将组织剪碎后加入适量浓度的消化酶，放入37℃水浴摇床消化适当时间。但是，对于肝脏来说，采用组织块消化法通常分离得到的细胞活性较低，而且肝组织块内大量红细胞很难去除。进行酶消化法时，对酶的浓度及其作用时间要求十分严格，尤其是胰蛋白酶为一种强蛋白质消化酶，对肝细胞膜损伤严重，易造成肝细胞死亡。1972年，Seglen首次采用原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞成功取得高活率，因为采用胶原酶消化法分离原代肝细胞，对肝细胞损伤较小，且肝细胞膜在消化过程中所受到损害可在培养后得到修复。此后，众多研究者对该方法进行了一定改进，并用于不同物种肝细胞的分离。如Fraslin等改良原位两步灌流法用于成年鸡肝细胞的分离；Douaire等以Williams’ medium E作为基础培养液建立成年鸡肝细胞无血清培养体系；中国专利申请(200410084625.7)报道了一种生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法；中国专利申请(200610050853.1)用Dispase-胶原酶灌流法获高活率的新鲜原代猪肝细胞等。但以上分离方法均一定的局限性，主要表现为：一方面是原代肝细胞得率与纯度不高，活力不强，过程较繁琐；另一方面为有血清培养体系，无法为部分肝功能研究提供生物学材料。
发明内容
鉴定的方法，将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca 与Mg ，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。
畜禽手术前禁食，自由饮水过夜，颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物；
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上，该手术台放在大瓷盘上，用75%酒精擦拭全身，转入超净工作台内；
无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管，然后松开流向肝脏的一端；
进行灌流分离，首先进行消化前灌流，又分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA，待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉，持续20min，然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O，持续5min；
待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶，并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉，使灌流液缓慢流出，15min后肝脏逐渐被消化；
触动肝脏表面呈现组织比较松软后，开始将其摘取并放入一无菌平皿中，加入
50ml预冷的威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；
用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛，所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液清洗2次，再在4℃ 500rpm离心5min；
用贴壁培养液，该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生牛血清、10-6 M人-6
胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数；
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×10 cell/ml，在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ，接种密度为1×10 cell /cm，在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养，4h细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h，此后，用无血清培养液、10µg/ml维生素C、
0.15% BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含-7
5×10 M地塞米松、1×SITE (这是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine) 的缩写，也可写成ITES，Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)，以后每24h更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况；
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h（接种后第3 d）的肝细胞进行糖原染色鉴定，具体操作步骤如下：
吸去培养液，加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液，加入95%酒精，5 min；
弃液，加入70%酒精15 min后弃液，加入质量百分比为0.8%的过碘酸酒精溶液氧化，10 min；
蒸馏水洗2 min后，加入Schiff’s酒精混合液，10 min；
弃液后，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液，2 min后蒸馏水再洗2 min；
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核，20 min；
以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化10 min；
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min；
二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察。
灌流时，灌注含5mM EDTA的无Ca 、Mg HEPES缓冲液，方法改进后获得的肝细胞分散程度及纯度均为更高，且细胞活率可达90%以上。其机理是灌流液中含有的EDTA可螯合血液及
2+ 2+
肝细胞间液中的Ca 、Mg ，一方面起抗凝作用，更好地将红细胞冲洗出来，另一方面可去除
2+
肝细胞间的Ca 依赖性黏附因子，促进肝细胞的分离。
具体实施方式
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上，该手术台放在大瓷盘上，用75%酒精擦拭全身，转入超净工作台内；
无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管，该管是输液管钝性去针头部分，然后松开流向肝脏的一端；
进行灌流分离，首先进行消化前灌流，又分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA，待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉，持续20min，然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O，持续5min；
待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ，该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶，并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉，使灌流液缓慢流出，15min后肝脏逐渐被消化；
触动肝脏表面呈现组织比较松软后，开始将其摘取并放入一无菌平皿中，加入
50ml预冷的威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；
用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛，所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液清洗2次，再在4℃ 500rpm离心5min；
-6
用贴壁培养液，该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生牛血清、10 M人-6
胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数；
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×10 cell/ml，在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ，接种密度为1×10 cell /cm，在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养，4h细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h，此后，用无血清培养液、10µg/ml维生素C、0.15% -7
BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含5×10 M地塞米松、1×SITE (Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)，以后每24h更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况；
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h（接种后第3 d）的肝细胞进行糖原染色鉴定，具体操作步骤如下：
吸去培养液，加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液，加入95%酒精，5 min；
弃液，加入70%酒精15 min后弃液，加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化，10 min；
蒸馏水洗2 min后，加入Schiff’s酒精混合液，10 min；
弃液后，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液，2 min后蒸馏水再洗2 min；
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核，20 min；
以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化10 min；
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min；
二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察。
内Ca 与Mg ，使之尽量多地释放出原代肝细胞；并改进了无血清培养体系，拓展了所获原代肝细胞的科学用途；此外，该发明与以往方法相比缩短了操作时间，有效地提高了原代畜禽肝细胞的数量、活率和纯度，且损伤少，易贴壁，细胞特性完好，分离效果良好。
选取7日龄健康长白仔猪1头，术前自由饮水并禁食过夜，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉；
采用75%酒精浸泡后的纱布擦拭仔猪全身，将麻醉仔猪仰卧位保定在小动物手术台上(手术台放在大瓷盘上)，转入超净工作台内；
无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，适度结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管(输液管钝性去针头部分)，然后将插管与静脉绑紧形成通路；
进行灌流分离：第一步为消化前灌流，分为两部分：第一部分以1400IU/kg剂量肝素钠吸入50ml注射器，并混入灌流液 （含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA）注入肝脏组织进行血液抗凝，然后第二部分以37℃预热的灌流液 按 50ml/min的速率灌注，待肝脏稍为鼓胀时剪开下腔静脉胸段，持续大约15min(以流出物无或少红细胞为宜)，接着以同样速率灌注37℃预热的灌流液 （含10mM HEPES、
137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O），持续5min(以肝脏变成黄白，且组织较为松散为宜)；
待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 （含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶），并用止血钳适当夹住已剪开的下腔静脉胸段，使灌流液经肝脏组织循环后缓慢流出，15min后肝脏逐渐被消化；
轻微触动肝脏被膜，表现比较松软后，开始摘取肝脏，去除胆囊，放入一无菌平皿中，加入50ml预冷的基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；
用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛，所得肝细胞悬液用基础培养液清洗2次
10
(4℃ 500rpm离心5min)，台盼蓝拒染法检测细胞活率为96%，细胞总数(3.2±1.8)×10 ；
用贴壁培养液【含10%新生牛血清、1×SITE(Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml牛-8 -6 -6
胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10 M人胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml 维生素C、双抗(100IU/ml青霉素及100IU/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液】重悬，稀释到实验所需细胞浓度接种。
细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为3×10 个/ml，在6孔板中接种2ml；96孔板中接种100µl，置于37℃、5%CO2与饱和湿度的条件下的细胞培养箱内培养。4h细胞贴壁后，用生长培养液(含5%新生牛血清及100IU/ml双抗的基础培养液)全量换液，尽-7
量去除死细胞与组织碎片，继续培养20h。此后，用无血清培养液(含5×10 M地塞米松、-8
1×SITE(Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10µg/ml维生素C、0.15%BSA和100IU/ml双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液，以后每24h更换培养液，定时进行倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况，并拍照记录。
吸去培养液，加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液，加入95%酒精，5 min；
弃液，加入70%酒精15 min后弃液，加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化，10 min；
蒸馏水洗2 min后，加入Schiff’s酒精混合液，10 min；
弃液后，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液，2 min后蒸馏水再洗2 min；
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核，20 min；
以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化10 min；
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min；
二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察。
选取健康青年岭南黄鸡1羽，术前禁食3h，翅静脉注射1750IU/kg剂量肝素钠抗凝，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉动物；
将麻醉鸡只仰卧位保定在小动物手术台上(手术台放在大瓷盘上)，75%酒精擦拭鸡只全身，转入超净工作台内，无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体左侧，暴露肠系膜静脉，在其中一条直接汇入肝门静脉的肠系膜后静脉中插管(5号头皮针去掉针头)，结扎另一条流向肝脏的静脉；
第一步为消化前灌流，分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液（含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA），待肝脏稍鼓胀时剪开后腔静脉，持续9min，第二部分以同样速率灌注37℃预热的灌流液 （含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O），持续3min；待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 （含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶），并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉，使灌流液缓慢流出，用37℃温热的无菌纱布覆盖肝脏，并轻轻揉动肝脏以利于消化，15min后肝脏逐渐消化，压下凹陷不易恢复；
摘取肝脏，放入一无菌平皿中，加入50ml预冷的含0.2%BSA的基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分，用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及500目(30μm)细胞筛；
将所得肝细胞悬液用基础培养液清洗2次(4℃ 500rpm离心2min)，用贴壁培养-6 -6
液(含10%新生牛血清、10 M人胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及100µg/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液)重悬，台盼
8
蓝拒染法检测细胞活率为94%，细胞总数(4.3±0.7)×10。
细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为5×10 个/ml，在直径为60mm的平皿中
5 2
接种4ml (接种密度为1×10 个/cm)，在37℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养。4h细胞贴壁后，用生长培养液(含7%新生牛血清及双抗的基础培养液)全量换液，继续培养20h。
-7
此后，用无血清培养液(含5×10 M地塞米松、1×SITE(Sigma-Aldrich公司，含10µg/ml-8
牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10µg/ml维生素C、
0.15%BSA和双抗的基础培养液)全量换液，以后每24h更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况。
弃液，加入95%酒精5min，70%酒精15min回水；
弃液，加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化10min，蒸馏水速洗；
加入Schiff’s酒精混合液(量取2.9ml Schiff’s试剂、0.125ml 1N HCl和7ml
100%酒精混合，用前现配)作用10min进行糖原染色；
弃液，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液去色2min，用自来水和蒸馏水先后速洗；
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核20min，以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化
10min；
95%酒精及100%酒精分别脱水1min，二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察并拍照。
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