恩拉霉素新产生菌及其高产突变株
阅读：929发布：2021-09-18
专利汇可以提供恩拉霉素新产生菌及其高产突变株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种恩拉霉素新产生菌及其高产突变株。本发明利用针对肽类抗生素合成基因保守区域设计的引物筛选海洋环境分离得到的链霉菌，通过同源性比对获得肽类抗生素恩拉霉素的新产生菌。本发明还利用核糖体工程技术选育出恩拉霉素产量提高的突变株。本发明为 发酵 生产恩拉霉素提供了新的菌种来源，且其突变菌株可用于工业生产。，下面是恩拉霉素新产生菌及其高产突变株专利的具体信息内容。
恩拉霉素新产生菌及其高产突变株
技术领域：
[0002] 恩拉霉素，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤放线菌Streptomyces fungicidious ATCC 21013发酵产生的一种多肽类抗生素。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。该技术后被美国先灵葆雅动物保健品有限公司收购，并用于生产饲料预混剂。 [0003] 恩拉霉素对梭状芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌具有强大的抗菌活性和优良的促生长及改善饲料利用率的作用，常作为禽、猪、鱼的抗生素促生长剂。恩拉霉素具有很高的稳定性，在制成颗粒料过程及与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。未吸收抗生素主要随粪便排出体外，故口服恩拉霉素药物残留很少。恩拉霉素为肽类抗生素，其排放到环境中，容易被环境微生物所降解，从而对环境的污染程度小。实践证明恩拉霉素是一种优良的兽用抗生素，具有用量低、低残留、不易产生抗药性及环境友好等特点。
[0004] 恩拉霉素为十七个氨基酸缩合的环肽，依据其连接的脂肪酸侧链的长度不同可分为A、B两个不同组分。对Streptomyces fungicidious ATCC 21013的研究表明，恩拉霉素生物合成基因簇包括四个非核糖体肽合酶(NRPS)基因及其它相关基因。
[0005] 本发明根据非核糖体肽合酶的保守区域设计引物对海洋来源的链霉菌进行筛选，从中发现一株暗黑微绿链霉菌具有恩拉霉素生物合成相关的NRPS基因。对该链霉菌的发酵产物的HPLC分析表明该菌株可产生恩拉霉素。后对原始菌株通过抗性诱变选育，获得了产量提高的可用于工业生产的恩拉霉素的新菌株。发明内容：
[0006] 本发明的目的在于提供一株通过基因筛选方法获得的恩拉霉素新产生菌，该菌株为暗黑微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)Z40，2009年10月23日保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.3365。 [0007] 本发明的另一目的在于提供一种前述恩拉霉素产生菌的突变菌株，该突变菌株通过核糖体工程选育，且其产量比原始菌株提高70％。该突变菌株为暗黑微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)5S102，2009年10月23日保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.3367。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及从海洋来源的链霉菌中筛选得到产生肽类抗生素恩拉霉素的菌株，该方法具体为：
[0009] 步骤一，提取待选链霉菌的基因组DNA；
[0010] 步骤二，用针对非核糖体肽类合成酶设计的兼并引物对待选菌株基因组DNA进行PCR扩增；
[0011] 步骤三，将阳性扩增的片段进行测序，并提交数据库进行比对，获得与已知化合物恩拉霉素产生菌Streptomyces fungicidicus的氨基酸序列相似性为96％的序列，其同源性比较见图1.
[0013] 步骤五，测定菌株16S rDNA序列，确定菌株的分类地位；
[0014] 获得菌株CGMCC NO.3365的16S rDNA基因片段1487bp(SEQ ID NO 1)，提交EzTaxon数据库进行比较，其与已知链霉菌Streptomyces atrovirens NRRL B-16357的相似性为99.6％。确定菌株为暗黑微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)。 [0015] 1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC [0016] 61 GATGAACCAC TTCGGTGGGG ATTAGTGGCG AACGGGTGAG TAACACGTGG GCAATCTGCC [0017] 121 CTGCACTCTG GGACAAGCCC TGGAAACGGG GTCTAATACC GGATACTGAC CCGCCTGGGC [0018] 181 ATCCAGGCGG TTCGAAAGCT CCGGCGGTGC AGGATGAGCC CGCGGCCTAT CAGCTTGTTG [0019] 241 GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC GACCGGCCAC [0020] 301 ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA [0021] 361 TGGGCGAAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG GTTGTAAACC [0022] 421 TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GAAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC GGCTAACTAC [0023] 481 GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CGAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA [0024] 541 GAGCTCGTAG GCGGCTTGTC GCGTCGGTTG TGAAAGCCCG GGGCTTAACC CCGGGTCTGC [0025] 601 AGTCGATACG GGCAGGCTAG AGTTCGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT GTAGCGGTGA [0026] 661 AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG ATCTCTGGGC CGATACTGAC [0027] 721 GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA [0028] 781 AACGGTGGGC ACTAGGTGTG GGCGACATTC CACGTCGTCC GTGCCGCAGC TAACGCATTA [0029] 841 AGTGCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC [0030] 901 GCACAAGCGG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT ACCAAGGCTT [0031] 961 GACATACACC GGAAACGTCT GGAGACAGGC GCCCCCTTGT GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC [0032] 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC [0033] 1081 TTGTCCCGTG TTGCCAGCAG GCCCTTGTGG TGCTGGGGAC TCACGGGAGA CCGCCGGGGT [0034] 1141 CAACTCGGAG GAAGGTGGGG ACGACGTCAA GTCATCATGC CCCTTATGTC TTGGGCTGCA [0035] 1201 CACGTGCTAC AATGGCCGGT ACAATGAGCT GCGATACCGC GAGGTGGAGC GAATCTCAAA [0036] 1261 AAGCCGGTCT CAGTTCGGAT TGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG [0037] 1321 TAATCGCAGA TCAGCATTGC TGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT [0038] 1381 CACGTCACGA AAGTCGGTAA CACCCGAAGC CGGTGGCCCA ACCCCTTGTG GGAGGGAGCT [0039] 1441 GTCGAAGGTG GGACTGGCGA TTGGGACGAA GTCGTAACAA GGTAACC [0040] 步骤六，对原始菌株进行核糖体工程诱变和筛选，获得产量提高的菌株； [0041] 步骤七，比较原始菌株和突变菌株的合成核糖体S12蛋白的rpsL基因，确定突变株的基因突变位点；第88位氨基酸由K变为R。
[0042] 步骤八，将原始菌株和突变菌株进行发酵，对发酵产物进行高效液相色谱分析，确定突变菌株的产量提高了70％。
[0043] 本发明获得以下有益的效果：本发明通过特定的抗生素生物合成基因筛选方法，获得一株恩拉霉素产生菌。通过16S rDNA基因序列比对，确定为暗黑微绿链霉菌(Streptomycesatrovirens)，其为一株恩拉霉素的新产生菌。本发明通过核糖体工程诱变的方法，获得链霉素抗性的突变株，其产量比原始菌株提高了70％。
[0044] 通过基因筛选的方法，预测菌株产生化合物的种类，减少了分离提取及鉴定化合物的重复工作；筛选得到已知化合物的新产生菌，在生理性状上进行改良，可能获得比已知的产生菌更利于工业生产的菌株；通过核糖体工程改造，获得比出发菌株提高70％的突变株，具有明显的工业应用价值。
附图说明
[0045] 图1为本发明与已知化合物恩拉霉素产生菌Streptomyces fungicidicus的氨基酸序列同源性比较；
[0046] 图2为突变位点示意图，示突变株rpsL基因第88位氨基酸由K变为R； [0047] 图3为突变菌株与野生型菌株发酵产物的高效液相色谱分析图；
[0048] 其中：A代表恩拉霉素组分A；B代表恩拉霉素组分B。
具体实施方式
[0049] 以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0050] 步骤一，待选链霉菌总DNA的提取
[0051] 用500μl溶菌酶溶液悬浮5mg菌丝体，在37℃温育直至细胞成为半透明状。加入50％体积的2％SDS，混合振荡约1min直到溶液的粘度显著下降，然后加入1倍体积的中性苯酚/氯仿，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见(或非常少)中间层为止，最后，加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(自然pH)和1倍体积的异丙醇，上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团，用玻棒挑出DNA沉淀团，用70％乙醇洗涤DNA沉淀团两次，最后弃去所有上清液，待乙醇挥发后，用一定量TE缓冲液溶解DNA沉淀待用。
[0052] 步骤二，肽类抗生素产生菌的筛选
[0053] 以备选菌株总DNA为PCR模板，利用引物NRPSA/NRPSB筛选具有非核糖体多肽合成酶基因的菌株，其中引物序列为NRPSA：5’-GCS TAC SYS ATS TAC ACS TCS GG-3’；NRPSB：5’-SAS GTC VCC SGT SCG GTA S-3’。该对引物扩增的标靶为非核糖体多肽合成酶所含模 块中的腺苷酰化结构域。20μL扩增反应体系为包含9μLddH2O、2μL10×PCR Buffer、1μL DMSO、引物NRPSA/NRPSB(20μM)各1μL、4μL dNTP(each 2.5mM)、1μL Taq酶(1unit/μL)、1μL总DNA。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃变性1min，55℃退火1min，
72℃延伸1min共30个循环，再72℃后延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切出扩增目的条带，用Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化。将回收后的片段送测序公司进行分析。将测序所得核酸序列翻译为氨基酸序列，氨基酸序列在ExPASy中利用Blast进行同源性比对，根据同源性比对结果判断是否为预期扩增基因的片段。用翻译所得的氨基酸序列，使用DNAMAN进行蛋白序列之间相似性的比对。菌株CGMCC NO.1扩增所得NRPS氨基酸序列与已知的恩拉霉素产生菌Streptomycesfungicidious ATCC 21013的相似性为90％，证明菌株可能产生恩拉霉素。
72℃延伸1min共30个循环，再72℃后延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切出扩增目的条带，用Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化。将回收后的片段送测序公司进行分析。将测序所得核酸序列翻译为氨基酸序列，氨基酸序列在ExPASy中利用Blast进行同源性比对，根据同源性比对结果判断是否为预期扩增基因的片段。用翻译所得的氨基酸序列，使用DNAMAN进行蛋白序列之间相似性的比对。菌株CGMCC NO.1扩增所得NRPS氨基酸序列与已知的恩拉霉素产生菌Streptomycesfungicidious ATCC 21013的相似性为90％，证明菌株可能产生恩拉霉素。
[0054] 步骤三，原始菌株发酵产物的分析
[0055] 取菌株CGMCC孢子悬液接种5ml TSB培养基，28℃，200rpm振荡培养两天后接种发酵培养基，28℃，200rpm发酵。
[0056] 第八天取发酵液，8000rpm离心10分钟收集菌体。将菌丝体沉淀按照如下步骤处理，用于HPLC分析。12g菌体沉淀→30ml去离子水洗→30ml甲醇重悬→15W超声处理2min→18℃230rpm振摇3h→2000g离心20min→35℃减压蒸干→10ml90％甲醇重悬→1M HCl调pH 4.3→2000g离心20分钟→上清用0.45mm纤维素膜过滤后使用高效液相色谱分析。色谱分析工作条件为：色谱柱：Aglilent zorbax-C18，5μm，4.6*250mm，流速
1.0ml/min；流动相含30％乙腈和70％的50mM磷酸二氢钠(pH 4.5)，检测波长：267nm；柱温25℃。利用购自美国MP公司的恩拉霉素标准样品做为对照，通过保留时间及特定的紫外吸收特征证明菌株CGMCC可以产生恩拉霉素。发酵培养基配方：可溶性淀粉3g，大豆饼粉
2g，玉米浆1g，NaCl 3g，CaCO3 0.5g，K2HPO4 0.2g，FeSO4 0.01g，水100ml。 [0057] 步骤四，产恩拉霉素菌株的分类地位的确定
1.0ml/min；流动相含30％乙腈和70％的50mM磷酸二氢钠(pH 4.5)，检测波长：267nm；柱温25℃。利用购自美国MP公司的恩拉霉素标准样品做为对照，通过保留时间及特定的紫外吸收特征证明菌株CGMCC可以产生恩拉霉素。发酵培养基配方：可溶性淀粉3g，大豆饼粉
2g，玉米浆1g，NaCl 3g，CaCO3 0.5g，K2HPO4 0.2g，FeSO4 0.01g，水100ml。 [0057] 步骤四，产恩拉霉素菌株的分类地位的确定
[0058] 以 菌 株CGMCC 的 NO.1总 DNA 为PCR 模 板，利 用 引 物27F/1492R 扩 增菌 株 的 16S rDNA。 引 物 序 列 为 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。20μL扩增反应体系为包含9μLddH2O、2μL 10×PCR Buffer、1μL DMSO、引物27F/1492R(20μM)各1μL、4μL dNTP(each 2.5mM)、1μL Taq酶(1unit/μL)、1μL总DNA。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃变性50sec，55℃退火50sec，72℃延伸1min共30个循环，72℃后延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切出扩增目的条带，用Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化。将回收后的片段送测序公司进行分析。将获得的基因序列信息提交NCBI数据库进行比对，确定菌株为暗黑微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)。
[0059] 步骤五，核糖体工程选育恩拉霉素高产突变株
[0060] 接种该菌株于高氏平板28℃培养7-10天，收集成熟的孢子，制备孢子悬液。配置GYM培养基，设置合适的链霉素浓度梯度，制备抗性平板。每个平板取100μl孢子悬液涂布，测定野生型菌株CGMCC对链霉素的最小抑制浓度(MIC)。将野生菌株孢子分别涂布5×，10×，50×MIC的链霉素抗性平板。培养15-20天后，挑取链霉素抗性菌株，并划线纯化。以枯草芽孢杆菌作制备指示平板，比较突变菌株和野生型菌株的抗菌能力，筛选获得抗菌能力提高的突变菌株。
[0061] 步骤六，分析高产突变菌株的rpsL基因突变位点
[0062] 提取野生型菌株与突变菌株的总DNA，用引物rpslF/rpslR扩增菌株的rpsL基因。20μL扩增反应体系为包含9μLddH2O、2μL10×PCR Buffer、1μL DMSO、引物rpslF/rpslR(20μM)各1μL、4μL dNTP(each 2.5mM)、1μL Taq酶(1unit/μL)、1μL总DNA。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min共
30个循环，72℃后延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切出扩增目的条带，用Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化。将回收后的片段送测序公司进行分析。将获得的碱基序列通过DNAMAN分析软件进行比较，分析rpsL基因的突变位点。 [0063] 步骤七，利用高效液相色谱对野生型菌株和突变菌株产生的恩拉霉素含量的检测将菌株CGMCC和CGMCC相同条件接种发酵培养基进行摇瓶发酵。第八天取发酵液，按照步骤四所述的方法对发酵液进行收集和样品的提取。利用高效液相色谱分析野生型菌株和突变菌株产恩拉霉素的含量。用美国MP公司的恩拉霉素标准样品做为对照。 [0064] 图2为突变株CGMCC与野生型菌株CGMCC发酵产物的高效液相色谱分析结果，检测结果表明，突变株CGMCC产恩拉霉素的量比野生型菌株高15％。
30个循环，72℃后延伸10min。PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切出扩增目的条带，用Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化。将回收后的片段送测序公司进行分析。将获得的碱基序列通过DNAMAN分析软件进行比较，分析rpsL基因的突变位点。 [0063] 步骤七，利用高效液相色谱对野生型菌株和突变菌株产生的恩拉霉素含量的检测将菌株CGMCC和CGMCC相同条件接种发酵培养基进行摇瓶发酵。第八天取发酵液，按照步骤四所述的方法对发酵液进行收集和样品的提取。利用高效液相色谱分析野生型菌株和突变菌株产恩拉霉素的含量。用美国MP公司的恩拉霉素标准样品做为对照。 [0064] 图2为突变株CGMCC与野生型菌株CGMCC发酵产物的高效液相色谱分析结果，检测结果表明，突变株CGMCC产恩拉霉素的量比野生型菌株高15％。
[0067] <110>国家海洋局第三海洋研究所
[0068] <120>恩拉霉素新产生菌及其高产突变株
[0069] <160>1
[0070] <210>1
[0071] <211>1487
[0072] <212>DNA
[0073] <213>暗黑微绿链霉菌(Streptomyces atrovirens)
[0074] <400>1
[0075] AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC 60 [0076] GATGAACCAC TTCGGTGGGG ATTAGTGGCG AACGGGTGAG TAACACGTGG GCAATCTGCC 120 [0077] CTGCACTCTG GGACAAGCCC TGGAAACGGG GTCTAATACC GGATACTGAC CCGCCTGGGC 180 [0078] ATCCAGGCGG TTCGAAAGCT CCGGCGGTGC AGGATGAGCC CGCGGCCTAT CAGCTTGTTG 240 [0079] GTGAGGTAAC GGCTCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC GACCGGCCAC 300 [0080] ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA 360 [0081] TGGGCGAAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG GTTGTAAACC 420 [0082] TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GAAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC GGCTAACTAC 480 [0083] GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CGAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA 540 [0084] GAGCTCGTAG GCGGCTTGTC GCGTCGGTTG TGAAAGCCCG GGGCTTAACC CCGGGTCTGC 600 [0085] AGTCGATACG GGCAGGCTAG AGTTCGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT GTAGCGGTGA 660 [0086] AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG ATCTCTGGGC CGATACTGAC 720 [0087] GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA 780 [0088] AACGGTGGGC ACTAGGTGTG GGCGACATTC CACGTCGTCC GTGCCGCAGC TAACGCATTA 840 [0089] AGTGCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC 900 [0090] GCACAAGCGG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT ACCAAGGCTT 960 [0091] GACATACACC GGAAACGTCT GGAGACAGGC GCCCCCTTGT GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1020 [0092] ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1080 [0093] TTGTCCCGTG TTGCCAGCAG GCCCTTGTGG TGCTGGGGAC TCACGGGAGA CCGCCGGGGT 1140 [0094] CAACTCGGAG GAAGGTGGGG ACGACGTCAA GTCATCATGC CCCTTATGTC TTGGGCTGCA 1200 [0095] CACGTGCTAC AATGGCCGGT ACAATGAGCT GCGATACCGC GAGGTGGAGC GAATCTCAAA 1260 [0096] AAGCCGGTCT CAGTTCGGAT TGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG 1320 [0097] TAATCGCAGA TCAGCATTGC TGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT 1380 [0098] CACGTCACGA AAGTCGGTAA CACCCGAAGC CGGTGGCCCA ACCCCTTGTG GGAGGGAGCT 1440 [0099] GTCGAAGGTG GGACTGGCGA TTGGGACGAA GTCGTAACAA GGTAACC 1487
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