用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用
阅读：294发布：2020-05-08
专利汇可以提供用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于抑制/瓦解 生物 被膜的 抑制剂 及其应用。具体地，本发明提供了PslG蛋白及其编码序列在抑制/瓦解生物被膜方面的应用。本发明还提供了含有所述的PslG蛋白作为抑制/瓦解生物被膜的活性成分的组合物和制品。实验表明，PslG蛋白可有效抑制和/或瓦解假单胞菌的生物被膜，因而在医药与环境保护方面等多方面具有广阔的应用前景。，下面是用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种PslG蛋白或其编码序列的用途，其特征在于，用于(i)制备抑制、瓦解或降解生物被膜的制剂；和/或(ii)制备抗菌药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物被膜包括假单胞菌属生物被膜。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白为重组蛋白。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂选自下组：生物被膜清除剂、医用导管清洁剂、医用插管清洁剂、医用仪器管道清洁剂、医用器具消毒剂、人工关节清洁剂、抑菌剂、杀菌剂、医用导管护理剂、医用仪器护理剂、或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂包括微生物被膜抑制剂。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白为具有SEQ ID NO.: 2所示氨基酸序列的蛋白。
7.如权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白的编码序列选自：
(a) 编码如SEQ ID NO.:2或所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b) 序列如SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；
(e) 与(a)-(b)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的pslG蛋白或其编码序列来源于铜绿假单胞菌。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PslG蛋白是由重组细胞产生的。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述重组细胞选自：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂或所述的抗菌药物用于选自下组的一种或多种用途：
(1) 抑制假单胞菌生物被膜的形成；
(2) 瓦解和/或降解假单胞菌已经形成的生物被膜；
(3) 抑制假单胞菌的生长。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的假单胞菌为假单胞属(Pseudomonas)微生物。
13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的制剂或药物还含有抗生素。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的抗生素选自下组：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
15.一种体外非治疗性的抑制和/或瓦解生物被膜的方法，其特征在于，在需要施用的场合，施用PslG蛋白，从而抑制和/或瓦解生物被膜。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的施用浓度为5-100nM。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的施用浓度为10-50nM。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述施用的剂量为0.0001-10g/每平方米。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述施用的剂量为0.001-1g/每平方米。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物被膜为假单胞属(Pseudomonas)微生物的生物被膜。
21.一种对单胞菌属菌株生物被膜的形成能力进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一单胞菌属的出发菌株；
(b)向所述出发菌株中导入外源的PslG蛋白编码序列，从而获得含有所述PslG蛋白编码序列的重组菌株；
(c) 测定上一步骤的所述重组菌株的生物被膜形成能力和/或产生PslG蛋白的能力，从而选出生物被膜形成能力低于和/或所述产生PslG蛋白能力高于所述出发菌株的重组菌株。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的“高于”是指，所述改造后重组菌株的PslG蛋白的表达量是改造前的出发菌株的1.5倍以上(≥)。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的“低于”是指，所述改造后重组菌株的生物被膜的产生量是改造前出发菌株的1/2以下(≤)。
用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] “生物被膜”(biofilm)一般是指微生物依附某载体形成的膜性聚合物，是其在自然界中的一种主要的生存方式。生物被膜中的微生物比单细胞微生物具有更强的环境适应性，它的形成给人类带来了严重的危害。如在医药领域，据研究表明，约65％的人类细菌性感染疾病与生物被膜有关，生物被膜中微生物对抗生素的耐药性比浮游状态时高成百甚至上千倍，大大增加了临床治疗的难度。
[0003] 而细菌产生耐药性的原因，除去原菌在抗菌素的胁迫压力下产生的适应性变异之外，另一方面是因为在正常情况下，致病菌会形成细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)，为其提供了保护屏障。实为细菌吸附于惰性物体(如生物医学材料或生物机体黏膜表面)后，分泌出的胞外多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将自身菌落聚集缠绕其中形成的膜样物，使细菌可以停留在一个适宜的微环境中而不会被冲散；胞外基质还可吸附药物或影响药物渗透到细菌群落中，因而大多数药物只能杀灭生物被膜表面的微生物，而生物被膜内部的微生物则是产生变异的主要原因。因而生物被膜的这种特殊结构可以作为一种屏障保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主免疫系统的清除，而成为潜在的感染源，导致难治性临床生物被膜的相关感染。
[0004] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种条件致病菌，其很容易感染烧伤患者和免疫缺陷病人，也是医院内感染的典型菌株之一。一旦被该菌感染之后，极易形成生物被膜，从而造成治疗的困难。临床上，它能引起血病、耳、眼、皮肤及软组织、骨及关节、心内膜和呼吸系统等感染，是人类的三大致病菌之一。它也是引起肺炎的首要致病菌。由于其具有形成生物被膜等多重耐药机制，耐药率高，经常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。
[0005] 因此，本领域迫切需要开发能够有效抑制或瓦解铜绿假单胞菌等微生物的生物被膜的制剂和方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供了有效抑制或瓦解铜绿假单胞菌等微生物的生物被膜的制剂和方法。
[0007] 本发明的第一方面提供了一种PslG蛋白或其编码序列的用途，所述PslG蛋白或其编码序列用于(i)制备抑制、瓦解或降解生物被膜的制剂；和/或(ii)制备抗菌药物。
[0008] 在另一优选例中，所述的生物被膜包括假单胞菌属生物被膜。
[0009] 在另一优选例中，所述的生物被膜为铜绿假单胞菌的生物被膜。
[0010] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白为重组蛋白。
[0011] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白为分离纯化的重组蛋白。
[0012] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白为成熟形式的PslG蛋白。
[0013] 在另一优选例中，所述制剂选自下组：生物被膜清除剂、医用导管清洁剂、医用插管清洁剂、医用仪器管道清洁剂、医用器具消毒剂、人工关节清洁剂、抑菌剂、杀菌剂、医用导管护理剂、医用仪器护理剂、或其组合。
[0014] 在另一优选例中，所述制剂包括微生物被膜抑制剂。
[0015] 在另一优选例中，所述制剂包括导管细菌生物被膜抑制剂、条件性感染相关微生物的生物被膜抑制剂。
[0016] 在另一优选例中，所述的生物被膜位于一种或多种选自下组的物品：医药仪器、导管、或医用器具。
[0017] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白选自：
[0018] (i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的蛋白；
[0019] (ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、具有对生物被膜形成产生抑制和/或降解能力的由(i)衍生的蛋白；
[0020] (iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，增强蛋白对生物被膜形成产生抑制或降解能力的蛋白。
[0021] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白的编码序列选自：
[0022] (a)编码如SEQ ID NO.:2或所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0023] (b)序列如SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；
[0024] (c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的核苷酸序列；
[0025] (d)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的核苷酸序列；
[0026] (e)与(a)-(d)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0027] 在另一优选例中，所述的编码序列编码上述选自(i)、(ii)或(iii)的PslG蛋白。
[0028] 在另一优选例中，所述的pslG蛋白或其编码序列来源于铜绿假单胞菌。
[0029] 在另一优选例中，所述的PslG蛋白是由重组细胞产生的。
[0030] 在另一优选例中，所述的重组细胞包括原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞。
[0031] 在另一优选例中，所述重组细胞选自：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
[0032] 在另一优选例中，所述的制剂或所述的抗菌药物用于选自下组的一种或多种用途：
[0033] (1)抑制假单胞菌生物被膜的形成；
[0034] (2)瓦解和/或降解假单胞菌已经形成的生物被膜；
[0035] (3)抑制假单胞菌的生长。
[0036] 在另一优选例中，所述的假单胞菌为假单胞属(Pseudomonas)微生物。
[0037] 在另一优选例中，所述的假单胞菌选自下组：铜绿假单胞菌、斯氏假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、或其组合。
[0038] 在另一优选例中，所述假单胞菌为铜绿假单胞菌。
[0039] 在另一优选例中，所述的制剂或药物被施用于人或动物的伤口或创面。
[0040] 在另一优选例中，所述的施用为体表施用。
[0041] 在另一优选例中，所述施用的浓度为5-100nM，较佳地10-50nM；或者所述施用的剂量为0.0001-10g,较佳地为0.001-1g。
[0042] 在另一优选中，所述的施用方式包括：涂抹、涂覆、喷洒伤口，使用含有效浓度或数量的PslG的包扎材料对伤口进行包扎。
[0043] 在另一优选例中，所述的伤口或创面包括烧伤、创伤、手术、插管等引起的创面和/或伤口，尤其适用于施用于易受微生物(尤其是假单胞菌属、更尤其是铜绿假单胞菌)的感染和/或表面或内部易形成生物被膜(尤其是假单胞菌属、更尤其是铜绿假单胞菌生物被膜)的创面和/或伤口。
[0044] 在另一优选例中，所述的制品或药物的剂型为固体剂型、液体剂型或半固体剂型。
[0046] 在另一优选例中，所述制剂或药物为液体。
[0047] 在另一优选例中，所述制剂或药物为粉剂。
[0048] 在另一优选例中，所述的制剂或药物还含有抗生素。
[0049] 在另一优选例中，所述的抗生素选自下组：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
[0050] 在另一优选例中，所述的制剂为外用制剂，并且还含有选自下组的一种或多种任选成分：表面活性剂、芳香剂、消毒剂。
[0051] 本发明第二方面提供了一种生物被膜抑制剂，包括：
[0052] (a)抑制有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激动剂；
[0053] (b)载体；
[0054] (c)任选的助剂。
[0056] 在另一优选例中，所述的载体包括药学上可接受的载体。
[0057] 在另一优选例中，所述的助剂选自下组：表面活性剂、缓冲剂、pH调节剂、或其组合。
[0058] 在另一优选例中，所述抑制剂还包括抗生素。
[0059] 在另一优选例中，所述的抗生素选自下组：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
[0060] 在另一优选例中，所述的抑制剂用于抑制假单胞菌的生物被膜。
[0061] 在另一优选例中，所述的抑制剂用于治疗或辅助治疗与假单胞菌感染相关的疾病。
[0062] 在另一优选例中，所述的抑制剂用于非治疗性的、杀灭或辅助杀灭环境中假单胞菌。
[0063] 本发明第三方面提供了一种用于抑制生物被膜的药物组合物，包括：
[0064] (a)安全有效量的PslG蛋白、其活性片段和/或其激动剂；
[0065] (b)药学上可接受的载体。
[0066] 在另一优选例中，所述的药物组合物中，PslG蛋白或其活性片段的含量为0.0001-99wt％，较佳地为0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，按组合物的总重量计。
[0067] 在另一优选例中，所述药物组合物还包括抗生素。
[0068] 在另一优选例中，所述的抗生素选自下组：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
[0069] 在另一优选例中，所述的药物用于抑制假单胞菌的生物被膜。
[0070] 在另一优选例中，所述的药物用于治疗或辅助治疗与假单胞菌感染相关的疾病。
[0071] 本发明第四方面提供了一种体外非治疗性的抑制和/或瓦解生物被膜的方法，在需要施用的场合，施用PslG蛋白或本发明第二方面所述的生物被膜抑制剂，从而抑制和/或瓦解生物被膜。
[0072] 在另一优选例中，所述的施用浓度为5-100nM，较佳地，施用浓度为10-50nM。
[0073] 在另一优选例中，所述施用的剂量为0.0001-10g/每平方米,较佳地为0.001-1g/每平方米。
[0074] 在另一优选例中，所述生物被膜为假单胞属(Pseudomonas)微生物的生物被膜。
[0075] 在另一优选例中，所述生物被膜为铜绿假单胞菌的生物被膜。
[0076] 在另一优选例中，所述抑制剂含有水和/或水性溶剂。
[0077] 本发明第五方面提供了一种对单胞菌属菌株生物被膜的形成能力进行改造的方法，包括步骤：
[0078] (a)提供一单胞菌属的出发菌株，
[0079] (b)向所述出发菌株中导入外源的PslG蛋白编码序列，从而获得含有所述PslG蛋白编码序列的重组菌株；
[0080] (c)测定上一步骤的所述重组菌株的生物被膜形成能力和/或产生PslG蛋白的能力，从而选出生物被膜形成能力低于和/或所述产生PslG蛋白能力高于所述出发菌株的重组菌株。
[0081] 在另一优选例中，所述的“高于”是指，所述改造后重组菌株的PslG蛋白的表达量是改造前的出发菌株的1.5倍以上(≥)，较佳地2倍以上。
[0082] 在另一优选例中，所述的“低于”是指，所述改造后重组菌株的生物被膜的产生量是改造前出发菌株的1/2以下(≤)，较佳地1/3以下。
[0083] 本发明第六方面提供了一种用于抑制或瓦解生物被膜的制品，所述制品含有(a)医学上可接受的基材，和(b)涂覆于或附着于所述基材上的PslG蛋白。
[0084] 在另一优选例中，所述的制品包括用于包扎伤口的制品。
[0085] 在另一优选例中，所述的伤口包括烧伤、创伤、手术、插管等引起的创面和/或伤口等。
[0086] 在另一优选例中，所述制品包括人用或兽用的产品
[0087] 在另一优选例中，所述制品还包括(c)涂覆于或附着于所述基材上的抗生素。
[0088] 在另一优选例中，所述的抗生素选自下组：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
[0089] 在另一优选例中，所述的制品中含有为0.0001-10wt％，较佳地为0.001-5wt％，更佳地0.01-2wt％，按制品的总重量计。
[0090] 在另一优选例中，所述PslG蛋白与所述抗生素的重量比为1:1000至1000：1，较佳地为1:100至100：1；更佳地为1:10至10：1。
[0092] 图1显示了铜绿假单胞菌PAO1中过表达PslG抑制PAO1菌株生物被膜的形成；
[0093] 图2显示了外加PslG抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成；
[0094] 图3显示了1nM PslG对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解；
[0095] 图4显示了50nM PslG对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解；
[0096] 图5显示了PslG(WT)及其突变蛋白E156Q和E276Q对生长6个小时的铜绿假单胞菌生物被膜处理30分钟后的结果，其中，E156和E276是PslG蛋白的关键活性位点。
[0097] 图6显示了PslG蛋白的三维晶体结构(催化区域)。
[0098] 图7显示了50nM PslG对丁香假单胞菌生物被膜的抑制效果。
[0099] 图8显示了冻干的PslG蛋白对生物被膜的抑制效果。
[0100] 图9显示了PslG处理的菌细胞与浮游菌细胞对抗生素敏感性的效果比较图。其中，图9(a)、9(c)为浮游菌液对TOB、CIP的MIC值测定结果；图9(b)、9(d)为经PslG处理后从生物被膜上游离出的菌细胞对TOB、CIP的MIC值测定结果。
[0101] 图10显示了PslG与抗生素联合使用对铜绿假单胞菌的抑制效果。其中，图10(a)为PslG+TOB与单独使用TOB的效果对比图；图10(b)为PslG+CIP与单独使用CIP的效果对比图。
[0102] 图11显示了PslG蛋白的三维晶体结构。
[0103] 图12显示了PslG对结肠上皮细胞和巨噬细胞均没有细胞毒性作用。
[0104] 其中，图12A显示，PslG处理12小时后，MTT实验检测其对上皮细胞HT-29和Caco2的细胞毒性；图12B显示，PslG对巨噬细胞无细胞毒性作用。
[0105] 图13显示了PslG增强生物被膜对巨噬细胞的敏感性。
[0106] 将培养于玻璃盖玻片上的24小时PAO1生物被膜经PslG处理并与巨噬细胞共孵育后，刮下并重悬在1毫升生理盐水中做菌落形成单位计数(CFU)。图中所示为三次重复实验所得CFU的平均值及SD值并对不同实验组进行了T检验。(*,P<0.01.)
[0107] 图14显示了小鼠植入物感染模型。体内植入物上的PAO1生物被膜经PslG、妥布霉素单处理或共处理后的每毫升菌落形成单位。水平虚线代表实验的检测极限，图示为5只小鼠体内生物被膜计数的平均值。*P<0.01。
[0108] 图15显示了线虫液体杀伤实验等量游离菌细胞和PslG解离下的生物被膜细胞与四龄线虫共孵育后的死活线虫比例。图示为三次重复实验的平均值±SD值。
具体实施方式
[0110] 具体地，实验表明，来自铜绿假单胞菌PAO1中的PslG蛋白居然可有效抑制铜绿假单胞菌形成生物被膜。内源性的或外源添加的PslG蛋白，都能够抑制和瓦解铜绿假单胞菌形成的生物被膜。经本发明生物被膜抑制剂处理后，生物被膜的生物量至少下降50％，最优条件下可达80％。
[0111] 本发明的进一步实验获得了PslG蛋白的三维晶体结构，揭示了与生物被膜瓦解功能相关的PslG蛋白的活性位点，并且还初步揭示了PslG蛋白可以降解纯化的胞外多糖PSL，说明它是通过降解胞外多糖来抑制和瓦解生物被膜的。
[0112] 本发明进一步实验表明，将PslG与抗生素联用，不仅不影响抗生素的抗菌活性，还具有显著优于单用抗生素的协同杀菌效果。
[0113] 假单胞菌属和铜绿假单胞菌
[0114] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是假单胞菌属的一种，为条件致病菌，其很容易感染烧伤患者和免疫缺陷病人，是医院内感染的典型菌株之一。一旦被该菌感染之后，极易形成生物被膜，从而造成治疗的困难。
[0115] 铜绿假单胞菌依赖胞外多糖、胞外蛋白以及胞外DNA来维持其生物被膜结构，因此，开发针对这三种基质的降解酶从而抑制或者瓦解生物被膜的形成一直都是人们研究的热点。
[0117] 生物被膜
[0118] 如本文所用，术语“生物被膜”指微生物依附某载体形成的膜性聚合物，是其在自然界中的一种主要的生存方式。
[0119] 生物被膜中的微生物比单细胞微生物具有更强的环境适应性，它的形成给人类带来了严重的危害。如在医药领域，据研究表明，约65％的人类细菌性感染疾病与生物被膜有关，生物被膜中微生物对抗生素的耐药性比浮游状态时高成百甚至上千倍，大大增加了临床治疗的难度。又如在工业领域，生物被膜会污染给排水管道系统，造成一系列与生物污垢有关的工业问题，如管道内壁的生物被膜可造成水质污染、生物被膜的腐蚀作用缩短管道设施的使用寿命等。
[0120] 医学上，生物被膜是由保护性表多糖(也称为胞外多糖)基质包被的的高度有机的微生物细胞群，菌细胞经所述的基质附着至无活性膜表面和活的动植物细胞表面，即为固着的群。
[0121] PslG蛋白和PslG编码基因
[0122] 如本文所用，术语“本发明蛋白”、“PslG蛋白”、“PslG多肽”、“PslG酶”之间可以互换使用，均指来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PslG基因编码的功能未知的蛋白或其他类似微生物的同源蛋白。应理解，该术语还包括该PslG蛋白的野生型和突变型，包括该PslG蛋白的全长形式(如SEQ ID NO.:2中的第1-442位)或成熟形式(如SEQ ID NO.:2中的第31-442位)，以及包括该PslG蛋白的活性片段或衍生蛋白。在本发明中，这些野生型或突变型的、全长或成熟形式的蛋白、或活性片段或衍生蛋白都保留抑制和/或瓦解生物被膜(尤其是假单胞菌属生物被膜)的功能。此外，应理解，该术语不仅包括来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的蛋白，还包括来自假单胞菌属或其他属微生物的同源蛋白(通常，这些来自其他物种的同源蛋白与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的相同性(identity)≥约60％，更佳地≥70％，≥80％，≥90％，或最佳地≥95％)。此外，应理解，该术语包括了含有或不含有起始氨基酸(Met)的蛋白形式。
[0123] 在本发明的优选例中，PslG全长基因核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，克隆到大肠杆菌表达载体的pslG为从第91个核苷酸开始的序列。
[0124] 纯化的PslG蛋白(31-442)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2。PslG(31-442)的三维晶体结构如图6所示。
[0125] 在本发明的一个优选例中，所述的PslG蛋白源自铜绿假胞单菌P.aeruginosa PAO1菌株，全长含有442个氨基酸，含有一信号肽(第1-30位)。去除了信号肽(1-30)后的PslG的成熟形式的长度为411个氨基酸。
[0126] 无论是全长形式还是成熟形式的PslG，都可常规方法进行表达和纯化。一种常用的表达体系是采用大肠杆菌(E.coli)进行表达。
[0127] 本发明实验表明，PslG不仅能够瓦解假单胞菌所产生的生物被膜，还能抑制假单胞菌形成生物被膜。
[0128] 本发明首次揭示了PslG对假单胞菌的生物被膜具有抑制、瓦解作用。
[0129] 生物被膜抑制剂
[0130] 如本文所用，“微生物被膜抑制剂”和“生物被膜抑制剂”可互换使用，一般其主要通过抑制微生物之间的交流或相互连接从而抑制生物膜结构的目的，而并不对微生物本身进行杀灭，因此，不会对微生物的生存产生胁迫压力，因而并不导致新的“耐药性”产生。
[0131] 如本文所用，术语“本发明的生物被膜抑制剂”、“本发明制剂”可互换使用，均指含有PslG蛋白、其活性片段和/或其激动剂作为活性成分，从而能够抑制、瓦解或降解假单胞菌生物被膜的组合物或混合物。
[0132] 在本发明中，提供了一种生物被膜抑制剂(也可称为生物被膜瓦解剂)，该抑制剂含有本发明蛋白作为抑制和/或瓦解生物被膜的有效成分。
[0133] 本发明的“生物被膜抑制剂”包括：
[0134] (a)PslG蛋白、其活性片段和/或其激动剂；
[0135] (b)载体和/或助剂。
[0136] 本发明的生物被膜抑制剂通过抑制微生物的生物被膜，使病原微生物丧失保护，增加对普通药物的易感性，从而实现对多种致病菌的有效控制，有着普通抗生素手段无法比拟的技术优势。
[0137] 此外，本发明的生物被膜抑制，还可同选自下组其他物质(如抗生素)联用。代表性的抗生素例子包括(但并不限于)：阿奇霉素、弗洛沙星、环丙沙星、妥布霉素、或其组合。
[0138] 实验表明，将PslG蛋白与抗生素联用，不仅不影响抗生素的抗菌活性，其杀菌效果比单独使用抗生素更好。
[0139] 本发明的生物被膜抑制剂，可有效地和/或特异性地抑制微生物的生物被膜，代表性的微生物包括(但并不限于)：假单胞菌属微生物，尤其是铜绿假单胞菌、斯氏假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌。
[0140] 本发明的生物被膜抑制剂，可用于各种不同应用和场合。代表性的例子包括(但并不限于)：医疗设备、机构管道生物被膜的清除和清洁、导管生物被膜的清除、医用导管和其他管道的微生物被膜的抑制。
[0141] 在本发明中，本发明蛋白或生物被膜抑制剂的有效施用浓度或剂量没有特别限制，可以根据菌种类、施用场合等情况而确定。优选的浓度范围为5-100nM，较佳地为10-50nM；或者所述施用的(剂)量为0.0001-10g,较佳地为0.001-1g(如对于每1或10平方米)。
[0142] 本发明的实验表明，本发明的生物被膜抑制剂可抑制、瓦解或降解假单胞菌的生物被膜。
[0143] 药物组合物和施用方法
[0144] 本发明提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的PslG蛋白、、其活性片段和/或其激动剂以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成注射剂或粉剂，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法或用冷冻干燥的方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如注射剂、粉剂、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与抗生素一起使用。
[0145] 使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明PslG蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地，该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0146] 抑制和/或瓦解生物被膜的方法
[0147] 本发明还提供了一种通过施用本发明蛋白、本发明的生物被膜抑制剂或本发明的药物组合物，从而抑制、瓦解或降解生物被膜的方法。
[0148] 在另一优选例中，所述生物被膜抑制剂的施用浓度为5-100nM，较佳地，为10-50nM。
[0149] 在另一优选例中，所述的生物被膜为细菌生物被膜或微生物被膜。
[0150] 在另一优选例中，所述的生物被膜包括导管细菌生物被膜和/或机会性感染相关微生物的生物被膜。
[0151] 在另一优选例中，所述生物被膜为假单胞属(Pseudomonas)的生物被膜。
[0152] 在另一优选例中，所述生物被膜为铜绿假单胞菌的生物被膜。
[0153] 本发明的方法可以用于预防、治疗等医药用途，还可用于非治疗性的非医药用途(如用于辅助杀灭环境中的微生物)。代表性的应用方法包括(但并不限于)：
[0154] (1)治疗不同人种、不同年龄或不同地区的感染铜绿假单胞菌的烧伤患者和免疫缺陷病人。
[0155] (2)医疗设备、机构管道生物被膜的清除和清洁、导管生物被膜的清除、医用导管和其他管道的微生物被膜的抑制。
[0156] 本发明提供了一种PslG蛋白及其编码序列的抑制、瓦解或降解微生物的生物被膜(biofilm)中的应用。本发明的主要优点包括：
[0157] (a)本发明首次发现PslG蛋白对铜绿假单胞菌的生物被膜具有抑制、瓦解作用。所述的生物被膜抑制剂能够特异性抑制或瓦解铜绿假单胞菌的生物被膜。
[0158] (b)本发明首次解析了PslG蛋白的晶体结构，揭示了PslG蛋白的功能。
[0159] (c)本发明首次发现PslG蛋白的2个关键活性位点。
[0160] (d)与单独使用抗生素相比，PslG蛋白与抗生素联用不仅可以抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成，而且有望彻底清除铜绿假单胞菌。
[0161] 因此，本发明具有潜在的广阔应用前景，例如有望开发成抗菌药物，消除铜绿假单胞菌的耐药性。
[0162] 下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0163] 本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，铜绿假单胞菌PAO1见参考文献(Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen.Nature 2000,406:959-964.)
[0164] 实施例1 铜绿假单胞菌PAO1中表达PslG抑制PAO1菌株生物被膜的形成
[0165] 含有PslG可被阿拉伯糖(arabinose)诱导表达质粒(pHERD20T-PslG)的铜绿假单胞菌于Jensen液体培养基中37℃培养过夜后，以1％接种量分别接至含有不同浓度阿拉伯糖的Jensen培养液中，于96孔板中30℃静止培养24小时。
[0166] 采用结晶紫法检测生物被膜的生物量：弃去孔中游离的菌体后，洗三次。接着用0.1％的结晶紫对生物被膜进行染色，洗三次后，用30％的醋酸溶解结合在生物被膜上的结晶紫，利用分光光度计检测其OD560的值(即结晶紫的浓度)，通过其大小来衡量生物被膜菌的生物量。其中，以不合成PSL多糖的PAO1，Δpsl菌株为负对照，PSL多糖可诱导表达(阿拉伯糖为诱导剂)的PAO1，PBAD-psl菌株为阳性对照。
[0167] 结果如图1所示，随着阿拉伯糖浓度的增加，即PslG表达的增大，PAO1的生物被膜生物量逐渐降低。0.5％以上的阿拉伯糖浓度使PAO1的生物被膜降低到Δpsl菌株的水平。
[0168] 结果表明，PslG的过量表达抑制了PAO1菌株生物被膜的形成。
[0169] 实施例2 外加PslG蛋白抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成
[0170] 接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌于LBNS液体培养基中，在37度下200转/分钟震荡培养12小时。然后以1％接种量接在Jensen培养基中，同时，添加不同浓度的PslG蛋白，于96孔板中在30度静止培养24小时后，弃去游离的菌体，用结晶紫对生物被膜进行染色并检测生物被膜的生物量(具体操作可参照实施例1中的步骤)。
[0171] 结果如图2所示。从中可以看出，PslG蛋白在1nM时其抑制率可达50％。10nm-50nm浓度时，可以明显抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。
[0172] 实施例3 1nM PslG蛋白对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解作用
[0173] 接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌于LBNS液体培养基中，在37度下200转/分钟震荡培养12小时。然后以1％接种量接在Jensen培养液中，于96孔板中30度静止培养24小时后，弃去游离的菌体，用0.8％生理盐水洗3次后添加100μl含有1nM PslG的Jensen培养液，作用5或30分钟分钟后，用结晶紫染色法检测处理后的生物被膜的生物量(结晶紫染色法具体操作步骤参照实施例2)。
[0174] 同时，以未加PslG的Jensen培养液为对照组。
[0175] 结果如图3所示。从中可以看出，1nM PslG蛋白处理5分钟，对铜绿假单胞菌生物被膜的生物量没有影响。而处理30分钟后生物被膜的生物量降低了50％。
[0176] 实施例4 50nM PslG蛋白对已形成的铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解
[0177] 接LBNS平板上新鲜单克隆铜绿假单胞菌于LBNS液体培养基中，在37度下200转/分钟震荡培养12小时。然后以1％接种量接在Jensen培养液中，于96孔板中30度静止培养24小时后，弃去游离的菌体，用0.8％生理盐水洗3次后添加100μl含有50nM PslG的Jensen培养液，不同时间处理后，用结晶紫染色法检测处理后的生物被膜的生物量(结晶紫染色法具体操作步骤可参照2)。
[0178] 同时以未加PslG的Jensen培养液为对照组。
[0179] 结果如图4所示，50nM PslG蛋白处理5分钟，已明显降低铜绿假单胞菌生物被膜的生物量；处理10分钟后生物被膜的生物量降低了50％；处理30分钟后，生物被膜生物量降低至类似不能采PSL多糖菌株的水平。30分钟以上的处理并未有更显著的降低。
[0180] 以上结果说明，50nM PslG 30分钟处理足以清除依赖于PSL多糖的生物被膜。
[0181] 实施例5 E156和E276是PslG蛋白的关键活性位点
[0182] 发明人经过多次比对分析发现，E156和E276可能是其关键的催化位点。PslG蛋白晶体结构分析提示E156和E276可能是其关键活性位点。
[0183] 如图5所示，突变蛋白PslG(E156Q)和PslG(E276Q)均丧失了对已形成铜绿假单胞菌生物被膜的瓦解能力。
[0184] 实施例6 PslG蛋白对丁香假单胞菌生物被膜的抑制作用
[0185] 方法同实施例2，PslG浓度为50nM。
[0186] 如图7所示，结果表明，PslG不仅能抑制多株铜绿假单胞菌的生物被膜，对丁香假单胞菌也有同样的抑制效果。
[0187] 实施例7 冻干的PslG蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制作用
[0188] 将PslG通过冷冻抽干获得粉剂，重溶于灭菌无菌水后进行生物被膜抑制实验，以未经冷冻抽干的原PslG溶液做对照组。方法同实施例2，PslG浓度为50nM。
[0189] 如图8所示，结果表明，冻干的PslG与PslG溶液均对铜绿假单胞菌的生物被膜有抑制作用。
[0190] 实施例8 PslG处理的菌细胞与浮游菌细胞对抗生素敏感性的比较
[0191] 在LBNS液体培养基中，震荡培养铜绿假单胞菌24小时，用PslG处理生长24h的铜绿假单胞菌的生物被膜，分别取浮游菌液和从PslG处理的菌中解离的菌液各0.2毫升，将其均匀涂布于LBNS平板上，在这些平板中央放置测MIC的试纸条，37度培养16小时后读取MIC值。
[0192] 对照组：如图9(a)、9(c)所示，浮游菌液对TOB、CIP的MIC值测定。
[0193] 实验组：如图9(b)、9(d)所示，经PslG处理后从生物被膜游离出的菌细胞对TOB、CIP的MIC值测定。
[0194] 如图9所示，结果表明，与浮游菌细胞相比，PslG处理的菌细胞对妥布霉素(TOB)和环丙沙星(CIP)更为敏感，其MIC值也更低。
[0195] 实施例9 PslG蛋白与抗生素联用不影响抗生素的抗菌活性
[0196] 用37℃震荡培养24h的铜绿假单胞菌液，取0.2毫升菌液涂布于LBNS平板上，将不同处理的滤纸片置于平板中，如图10所示，37℃培养24h后测量抑菌圈。
[0197] 实验一：
[0198] 如图10(a)所示，设置4个实验组，分别为单用缓冲液；单用50nM PslG；单用TOB(妥布霉素)；联合用TOB+PslG。
[0199] 实验二：
[0200] 如图10(b)所示，设置4个实验组，分别为单用缓冲液；单用50nM PslG；单用CIP(环丙沙星)；联合用CIP+PslG。
[0201] 结果表明(图10)，与单独使用抗生素的抑菌圈大小相比，PslG与抗生素联用的抑菌圈大小没有显著变化，因此，PslG与抗生素联用不影响抗生素的抗菌活性；单独使用PslG不产生抑菌圈，表明PslG不杀菌。
[0202] 实施例10 PslG与氟罗沙星(FLX)联合抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成[0203] 根据微量稀释法(娄永新、王金良，实用临床细菌学检验与进展，1993:247)测得铜绿假单胞菌对FLX的最低抑菌浓度(MIC)，用常规方法测定PslG的IC50值。
[0204] 将1/2IC50的PslG分别与1/4MIC、1/2MIC的弗洛沙星(FLX)联用，测定它们对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果。
[0205] 结果表明，与单独使用1MIC弗洛沙星(FLX)相比，PslG与弗洛沙星(FLX)联用对铜绿假单胞菌的杀菌效果更为显著。
[0206] 实施例11 PslG蛋白的晶体结构与功能分析
[0207] 对全长PslG蛋白晶体结构进行分析，结果表明该蛋白具有独特的催化结构域与多糖结合结构域(图11)，并且初步实验结果显示该蛋白有水解多糖的功能，可能参与Psl多糖单元聚合或已聚合多糖菌表的释放。
[0208] 实施例12 PslG对哺乳动物上皮细胞和免疫细胞没有细胞毒性
[0209] 采用人类结肠上皮细胞系Caco2及HT-29检测PslG的细胞毒性。
[0210] 结果如图12A和图12B所示，四唑MTT细胞毒性试验显示，PslG对两种结肠上皮细胞的活力几乎没有影响。并且，PslG对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)也未显示任何毒性作用。
[0211] 实施例13 经PslG处理后的生物被膜菌细胞更易被巨噬细胞清除
[0212] PAO1生物被膜于玻璃盖玻片上培养24小时，经PslG处理1小时后，再与巨噬细胞一起孵育2小时，剩余生物被膜用刀片刮下并重悬于1毫升生理盐水中做菌落计数(CFU)。
[0213] 结果如图13所示。结果显示，与未经PslG处理的对照组相比，经PslG与巨噬细胞共处理后的生物被膜剩余菌数最少。结果表明，PslG能够增强生物被膜对巨噬细胞清除作用的敏感性。
[0214] 因此，PslG对宿主细胞没有细胞毒性且可以增强生物被膜对巨噬细胞的敏感性，由此提示了PslG在治疗生物被膜相关感染中的潜在应用价值。
[0215] 实施例14 小鼠植入感染模型显示PslG可促进体内生物被膜的清除作用
[0216] 将经铜绿假单胞菌生物被膜包被的植入物插入小鼠腹膜并局部进行下列处理：-1 -1
50nM PslG单处理；50mg kg 妥布霉素单处理；50nM PslG+50mg kg 妥布霉素共处理。经24小时体内培养后，将小鼠处死，移出植入物经均化作用后在LB平板上做细菌计数。将植入物上的铜绿假单胞菌数以CFU/ml的数据形式制表。
50nM PslG单处理；50mg kg 妥布霉素单处理；50nM PslG+50mg kg 妥布霉素共处理。经24小时体内培养后，将小鼠处死，移出植入物经均化作用后在LB平板上做细菌计数。将植入物上的铜绿假单胞菌数以CFU/ml的数据形式制表。
[0217] 结果如图14所示。结果显示，与未经任何处理的对照组相比，经PslG或妥布霉素单处理及PslG和妥布霉素共处理后植入物上的菌数均显著降低。具体地，对照组的菌数(CFU/mL)＞104，经PslG单处理后的菌数(CFU/mL)≈103，经妥布霉素单处理后的菌数(CFU/mL)≈102.8，经PslG和妥布霉素共处理后，有4组样品的菌数(CFU/mL)达到了101，因此，从图中可以看出，PslG与妥布霉素联用的效果最好。
[0218] 结果表明，PslG和抗生素可同时使用来治疗临床生物被膜(如铜绿假单胞菌生物被膜)的相关感染。
[0219] 实施例15 PslG解离下的生物被膜菌细胞的毒力没有明显变化
[0220] 采用秀丽隐杆线虫作为宿主模型进行液体杀伤实验。
[0221] 设置两个实验组，分别为实验组1和实验组2。
[0222] 实验组1：富集等量PslG处理后菌膜(铜绿假单胞菌生物被膜)解离下来的游离菌细胞与四龄线虫共孵育。
[0223] 实验组2：收集生长24小时的液体游离菌细胞与四龄线虫共孵育。
[0224] 将实验组1和实验组2分别放置于96孔板，在25℃共孵育48小时后，用体视显微镜观察死活线虫的比例。每组三个重复，结果以平均值±SD值表示。
[0225] 结果如图15所示。结果表明，PslG解离的菌细胞(实验组1)与游离菌细胞(实验组2)相比，其毒力没有明显差异。
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