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Production of para hydroxybenzoic acid

阅读:610发布:2021-07-31

专利汇可以提供Production of para hydroxybenzoic acid专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且PURPOSE: To inexpensively produce para hydroxybenzoic acid by converting para cresol into para hydroxybenzoic acid with a microorganism in an energy- saving state, which acid having heretofore been synthesized by high temperature/ high pressure chemical reaction.
CONSTITUTION: The method for producing para hydroxybenzoic acid comprises converting para cresol with a microorganism Pseudomonas.eruginosa KS-0181 strain into para hydroxybenzoic acid. The method for producing para hydroxybenzoic acid comprises e.g. multiplying the cells, adding para cresol and subsequently continuing the culture, or adding para cresol at the starting point of the multiplication and subsequently culturing the cells, or multiplying, recovering the cells, and subsequently converting para cresol into para hydroxybenzoic acid with the cells.
COPYRIGHT: (C)1993,JPO&Japio,下面是Production of para hydroxybenzoic acid专利的具体信息内容。

【特許請求の範囲】
  • 【請求項1】微生物Pseudomonas aeruginosa(シュードモナス・エルギノーザ)KS−0181株を用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換することを特徴とするパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
  • 【請求項2】前記微生物の菌体を、パラクレゾールを添加した培地で培養する請求項1に記載のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
  • 【請求項3】前記微生物を培養して増殖させた後、パラクレゾールを添加して培養を継続し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する請求項1に記載のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
  • 【請求項4】前記微生物を培養して増殖させた後、菌体を回収して、該菌体を用いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する請求項1に記載のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
  • 【請求項5】Pseudomonas aeruginosa(シュードモナス・エルギノーザ)KS−0181株であることを特徴とする微生物。
  • 说明书全文

    【発明の詳細な説明】

    【0001】

    【産業上の利用分野】本発明は、パラクレゾールを生物を用いて変換しパラヒドロキシ安息香酸を製造する方法に関する。 さらに詳しく述べると、本発明は、新規な微生物シュードモナス・エルギノーザKS−0181株(Pseudomonas aeruginosa) 菌株を培養し、培養液に通常、防腐剤として使用される化学品パラクレゾールを添加して、培養液中で変換生成され蓄積したパラヒドロキシ安息香酸を採取することからなる、パラヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。

    【0002】

    【従来の技術】従来、パラヒドロキシ安息香酸の製造は、フェノールを原料とし、そのカリウム塩に二酸化炭素を高温・高圧下で作用させるコルベ・シュミット法による化学合成法が一般に行われてきた。 しかし、反応条件として高温・高圧を要するためにエネルギー消費量が大きく、またアルカリ塩を多量に使用するなどの問題があった。

    【0003】一方、常温・常圧で進行する微生物によるパラヒドロキシ安息香酸の製造法は、エネルギー的に有利なことが期待される。 しかし、これまでの微生物転換法は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)
    (UBC814)の菌体抽出酵素による安息香酸からの変換(Reddy,CC & Vaidyanathan,CS;Biochim.Bioph
    ys.Acta 384, 46-57) や、パラキシレンを唯一の炭素源とするシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas ae
    ruginosa) のパラキシレン代謝経路でパラクレゾールやパラヒドロキシ安息香酸を検出している例(大森など、
    Agri.Biol.Chem.Vol 31, 1337(1967))が知られている程度で、しかもいずれの反応も安息香酸からの生成や代謝分解中間体としてパラヒドロキシ安息香酸を検出して、
    パラキシレンの分解がパラヒドロキシ安息香酸を経て進行することを明らかにしているに過ぎない。 また、パラクレゾールを原料として与え、これを変換してパラヒドロキシ安息香酸を生成させて培地中に著量蓄積させて採取することは示唆されていない。

    【0004】

    【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温・常圧で進行する経済的な微生物転換法を利用して、パラヒドロキシ安息香酸を製造する新規な方法を提供することである。

    【0005】

    【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学的合成法よりも省エネルギー的である微生物の物質変換能に着目した。 すなわち、微生物に増殖を支える基質を与えて増殖させ、この培養液にパラクレゾールを共存させて、これを酸化・変換させるコ・オキシデーション(Co
    -oxidation) の方法によってパラヒドロキシ安息香酸を生成させ、これを分解させることなく著量蓄積させる方法を完成することを目的とした。 そこで、本発明者らはコ・オキシデーションによりパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸を生成する能を持つ微生物を各地の土壌から検索した結果、シュードモナス属に属する細菌菌株に、パラクレゾールのみをパラヒドロキシ安息香酸に変換する菌株を見いだし、本発明を完成した。

    【0006】すなわち、本発明は、微生物シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) KS−0
    181株(微工研菌寄第12881号)を培養し、これにパラクレゾールを添加して培養を継続し、培養液から転換生成物であるパラヒドロキシ安息香酸を分離するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。 さらに、該微生物を培養して増殖させた後、菌体を回収して、該菌体および該菌体の静止菌体を用いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換させて生成物であるパラヒドロキシ安息香酸を分離するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。 なお、
    本発明の発明者らは、千葉県千葉市の土壌から下記の方法により目的とする微生物を分離した。

    【0007】分離の方法は、千葉県千葉市の土壌から得られた標本土1gに滅菌10mlを加えて懸濁し、得られた懸濁液を1白金取り、通常の細菌用培地を用いた寒天平板に接種し、28℃で1日間静置培養し、得られたコロニーの内の1つを1白金耳取り、再び前記と同じ平板培地に移植した。 この継代培養を数回繰り返して、本発明の目的とする微生物を得た。

    【0008】(作用)本発明において利用する上記菌株の菌学的性質は次の通りである。 シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) KS−0181株の菌学的性質 (a)形態 1. 細胞の形と大きさ : 桿菌、約0.6〜1.0×
    2〜3μm 2. 運動性の有無と鞭毛の着生状態 : 有り、極鞭毛(1本) 3. 細胞の多形性および胞子の有無 : 共になし 4. グラム染色性 : 陰性 (b)各種培地における成育状態 1. 肉汁寒天平板培養: (1)不定形、灰白色 (2)円形、なめらかなコロニー、淡黄褐色(植継時) 2. 肉汁寒天斜面培養:成育良好、淡黄褐色、コロニーの外側に透明帯 3. 肉汁液体培養:成育良好 4. 肉汁ゼラチン穿刺培養:液化しない 5. リトマス・ミルク:リトマスを還元、アルカリ性化(微弱)

    【0009】(c)生理学的性質 1. 硝酸塩の還元:陽性 2. 亜硝酸塩の還元:陰性 3. MRテスト:陰性 4. VPテスト:陰性 5. インドールの生成:陰性 6. 硫化水素の生成:陰性(TSI培地) 7. 澱粉の加水分解:陰性 8. 脱窒反応:陽性 9. プロトカテキン酸の開裂:陽性 10. アルギニンジヒドロラーゼ:陽性 11. 色素:生成せず 12. リパーゼ:± 13. ウレアーゼ:陰性 14. カタラーゼ:陽性 15. オキシダーゼ:陽性 16. 成育範囲 温度:12〜42℃ PH:6.0〜9.5 17. グルコン酸の酸化:微陽性 18. アセトアミドの加水分解:陰性 19. 酸素に対する態度:好気的 20. O−Fテスト:酸化的 21. 糖類からの酸の生成(Hugh−Leifson
    法): L−アラビノース + D−キシロース + D−グルコース + D−マンノース + D−フラクトース + D−ガラクトース + 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − D−マンニット + グリセリン + 澱粉 − トレハロース − イノシット − 22. ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積: − 23. 炭素化合物の資化性(飯塚・駒形法) L−アラビノース + D−キシロース − D−グルコース + D−マンノース + D−フラクトース + D−ガラクトース + 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − D−マンニット + グリセリン + 澱粉 − トレハロース + ソルビトール − D−ソルボース − イノシット + 酢酸 + セロビオース − 酒石酸 − meso−エリスリトール + マロン酸 + 安息香酸 + ベタイン + プロピオン酸 + フマル酸 + クエン酸 + β−アラニン + L−リンゴ酸 + L−オルニチン + ニコチン酸 − L−フェニルアラニン + L−アラニン + L−トリプトファン + L−アルギニン + エタノール + グリシン − 2−プロパノール + 1−プロパノール + サリシン − 1−ブタノール + α−ケトグルタル酸 +

    【0010】本発明者らは、パラクレゾールに対して、
    微生物学的コ・オキシデーション作用を示す上記細菌菌株について、その菌学的性質に基づき、バージース・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology),V
    ol. ,140〜220(1984)に記載の基準に従って公知の菌株との異同を検討した。 その結果、シュードモナス・エルギノーザ種に属する新規な菌株と認め、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonasaerug
    inosa) KS−0181株と命名した。

    【0011】この菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、平成4年3月17日付けで、Pseudo
    monas aeruginosa KS−0181という識別のための表示で寄託・保管されており、その寄託番号は微工研菌寄第12881号(FERMP−12881)である。
    この細菌菌株は、上述したように、コ・オキシデーション作用によりパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換生成することができることを知見し本発明に至った。

    【0012】本発明の製造方法は、微生物のコ・オキシデーション作用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質を共存させ、微生物の増殖は、変換させたい出発物質とは別の増殖に必要な炭素源、窒素源で行い、増殖した微生物が培養液中に共存させた出発物質を酸化変換させること、あるいは、増殖した微生物を分離・回収した後、微生物菌体を懸濁した反応液を調整して、変換反応に必要なエネルギー源、例えば、グルコース、グリセリンなどを供給しながら、微生物の酸化能を利用して出発物質を酸化変換させることである。 本発明では、微生物シュードモナス属を用いて工業的規模でパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化することができる。 特に、シュードモナス・エルギノーザKS−
    0181を用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化することである。

    【0013】本発明の製造方法は、微生物を増殖させる工程および微生物を利用してパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程を包含する。 また、微生物を増殖させる工程(増殖工程)と微生物を利用してパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程(変換工程)は、別々の工程であっても、同時に行われる工程であってもよい。

    【0014】本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖する(増殖工程)ための培地としては、通常の細菌用培地を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる培地で、かつ微生物変換反応を進行させるものであれば、いかなる組成の培地も使用できる。 この時に用いる培地は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機塩などを含有しうる。 また、本発明の変換工程に使用する培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いてもよく、また異なる培地を用いてもよい。 また、菌体を増殖させた後、菌体の変換作用を維持できる溶液、0.85重量%
    生理食塩水や各種緩衝液のような溶液を培地の代わりに用いてもよい。 培地成分に、前記菌体を増殖するための培地に含まれる成分と同じ成分を含み得る。

    【0015】炭素源としては、本発明の菌株が利用できる任意の炭素源が使用できる。 かかる炭素源として利用できる有機物には、上記の菌学的性質において示したように、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、オリーブ油、大豆油などの脂質、メタノール、エタノールなどのアルコール、コーンスティープリカー、廃糖蜜などの農産物抽出・精製残渣、あるいはマロン酸、クエン酸などの有機酸が例示できる。 菌体増殖用の培地の場合には、上述したような本発明の菌株が利用し得る1種または2種以上の炭素化合物を任意に炭素源として利用できる。 また、変換培養用の培地の場合には、増殖用に使用した全ての炭素源が利用できるが、グルコース、グリセリンなど本菌体の利用しやすい有機化合物や単糖類が好ましい。 炭素源の含有量は、炭素源の種類によっても異なるが、培地中2重量%以上であるのが好ましい。

    【0016】窒素源としては、特に限定されないが、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、およびペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などの有機窒素源が利用できる。 有機窒素化合物を用いた場合、
    これには炭素も含まれているので、別の炭素源を新たに加えることは増殖用培地の場合には必ずしも必要でない。

    【0017】無機塩類としては、各種の硫酸塩、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが使用できる。 さらに、微量の重金属類(例えば、鉄塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩、モリブデン塩、コバルト塩など)を培地に含有させてもよい。

    【0018】培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌培養法などの方法により行うことができる。 培養温度は、20〜37℃、PHは中性付近、攪拌80〜40
    0rpm、培養日数は反応の進行に応じて決めることができるが、通常は菌体増殖に1〜2日、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するのに、1〜2日が適当である。 2日を超えると、副生物を生じることや若干の変換物質の分解を生じるので好ましくない。 さらに、菌体の増殖とパラクレゾールの変換の工程は、合計で2〜3日であるのが適当である。 この時に変換の原料となるパラクレゾールは水に難溶性であるために、ポリオキシエチレンソルビタンなどの各種の界面活性剤を培地に添加することも可能である。 また、必要に応じて、
    脂肪酸エステル系、シリコン系などの消泡剤を添加してもよい。

    【0019】本発明の製造方法に用いるパラクレゾールは、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、また、菌体の増殖培養後添加してもよい。 さらに、増殖培養時および増殖培養後の両方に添加してもよい。

    【0020】また、菌体の増殖培養後添加する場合、パラクレゾールを添加する時期は、菌体濃度が、660n
    mの吸光度で、1.0〜10.0の時に添加するのが好ましい。 パラクレゾールの添加方法としては、一度に、
    あるいは少量づつ添加してもよいし、その添加の時期は、菌体増殖の開始点で加えてもよく、また、経時的に添加する場合、増殖後1日目、2日目に等量に分割して添加してもよい。 さらに、パラクレゾールが0.1〜
    0.2重量%となるように連続的に添加してもよい。 添加するパラクレゾールの培養液中の濃度は、3重量%以下、特に1重量%以下であるのが好ましく、さらに0.
    2〜0.5重量%であるのが好ましい。 3重量%超では、微生物が十分に作用しなくなるので好ましくない。
    パラクレゾールを添加する時期を、菌体の増殖前にするのと増殖後にするのとでは、菌体の増殖後に添加した方が5〜10%変換率が高い。

    【0021】さらに、増殖工程および変換工程を、パラクレゾールを添加する時期の組み合わせで考えると、以下の組み合わせが例示される。 1)パラクレゾールを、増殖工程の開始点で加え、増殖工程と変換工程を同時に行う。 2)微生物を増殖させた後パラクレゾールを加えて、変換工程を行う。 パラクレゾールの添加は、変換工程の途中、または開始点と途中の両方で添加する。 3)パラクレゾールの添加を増殖工程と変換工程とに各々少なくとも1回以上行い、増殖工程の後に菌体を培地から分離して変換工程の培地に移植する。 上述の変換工程の培地は、増殖工程に用いた培地と同様の培地であってもよく、また、本発明の菌体が有する変換作用を妨げない溶液、例えば、生理食塩水のような溶液であってもよい。 また、前記2)の方法では、菌体を増殖後、パラクレゾールを添加して培養を継続することが含まれる。

    【0022】変換反応終了後、生成したパラヒドロキシ安息香酸の培養液からの分離・精製は、一般の有機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者に周知の手段を適宜組合わせることにより行なうことができる。 たとえば、培養液から固体を遠心分離によって除いた後、
    上清を濃縮し、次いで酸性化してパラヒドロキシ安息香酸を沈殿させて固液分離する方法、あるいは上記上清を酸性化した後、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒による溶媒抽出で生成物を分離する方法がある。 また、パラヒドロキシ安息香酸が生成沈殿している場合は、溶媒抽出による回収が有効な方法である。 得られた粗製物を各種のカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法によって精製することができる。

    【0023】本発明の方法により製造されるパラヒドロキシ安息香酸は、防腐剤として使用される他、医薬品、
    農薬、染料、液晶などの原料として有用である。

    【0024】

    【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

    【0025】(実施例1)本実施例は、本発明の方法によるパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸への微生物による変換を例示する。 使用した培地は下記組成のものであった。 培地組成 リン酸2ナトリウム 3.0g リン酸1カリウム 2.0g 尿素 2.0g 硫酸マグネシウム・7水塩 0.2g 炭酸ナトリウム 0.1g 塩化カルシウム・2水塩 0.01g 硫酸鉄・7水塩 0.005g グリセリン 2.0g 酵母エキス 1.0g イオン交換水 1.0L PH 6.8 (PH調整後、120℃、1.2kg/cm 2 、20分間滅菌して使用)

    【0026】上記培地100mLにシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) KS−0181
    株の菌株1白金耳を接種し、30℃で1夜振盪培養した。 得られた培養液の10mLを、前記と同様の培地1
    00mLを仕込んだ300mL容フラスコに接種して1
    日間振盪培養を行った。 培養条件は、温度30℃、PH
    6.8、180rpmであった。 培養開始1日後および2日後にパラクレゾールを各々0.1gづつ添加して合計3日間の培養を行った。 培養終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧下で20mLに濃縮し、20mLの酢酸エチルで3回抽出を行った。 酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、粗結晶を得た。 粗結晶をエタノール:キシレンの1:1混合溶媒により再結晶させて、0.23
    g(95.5%)の精製物を得た。 得られた物質は、元素分析およびNMR測定によって、パラヒドロキシ安息香酸と確認された。 元素分析値(C7,H6,O3) 計算値:C 60.87%、H 4.38% 実測値:C 60.86%、H 4.37% 13 C−NMR(δppm、DMSO−d 6中のTMS) カルボニルC: 169.1 フェニレンC: 115.4、121.3、132.
    1、161.8

    【0027】(実施例2)実施例1で使用したものと同じ組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾールを添加した培地100mLで実施例1と同様にシュードモナス・エルギノーザ・KS−0181株を1白金耳接種して培養した前培養液10mLを、同様にパラクレゾール0.2%を添加した培地100mLを仕込んだ300
    mL容フラスコに接種して2日間、実施例1と同じ培養条件で培養を行った。 2日後の培養液中のパラヒドロキシ安息香酸の生成量は0.22gであった。 培養液からのパラヒドロキシ安息香酸の分離・精製は遠心分離によって菌体を除き、上清に硫酸を加えてPHを1とした後、この酸性溶液よりクロロホルムでパラヒドロキシ安息香酸を抽出分離し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を得た。 この粗結晶を実施例1と同様にエタノール:キシレンの1:1混合溶媒より再結晶することによって白色針状結晶0.21g(89.2%)を得た。

    【0028】(実施例3)実施例1で使用したものと同じ組成の培地100mLを仕込んだ300mL容三フラスコ6本を使用し、シュードモナス・エルギノーザ・
    KS−0181株を各々のフラスコに1白金耳接種し、
    30℃、180rpmで振盪培養した。 得られた培養液600mLを母菌として、前記と同じ滅菌した7Lの培地を仕込んだ10L容のジャー・ファーメンターに接種し、同時に基質としてパラクレゾール15gを添加して培養を行なった。 1日後にさらに、パラクレゾール12
    gを添加して培養を継続し、合計3日間の培養を行なった。 培養条件は、温度30℃、PH7.0、攪拌300
    rpm、通気量0.5容量/容量/分であった。 培養終了後、10,000×Gで20分間遠心分離することによって菌体を除き、硫酸によりPH1とした後、実施例2と同様に処理してパラヒドロキシ安息香酸31.4g
    (91.0%)を得た。

    【0029】(実施例4)実施例1で使用したものと同じ組成の培地に対して0.2重量%のパラクレゾールを添加した培地3.5Lで5L容ジャーファーメレターを用いて、実施例3と同じ培養条件で2日間培養を行った。 2日後に菌体を10,000×Gで、20分の遠心分離によって集菌した。 菌体収量は、105℃、2時間乾燥で4.2g/Lであった。 集菌した生菌体全量をグリセリン0.1%を含有する0.2%の生理食塩水50
    0mLに懸濁し、これにパラクレゾール1.5gを添加して30℃で弱く攪拌しながら1時間反応させた。 反応終了後、実施例3と同じ方法によりパラヒドロキシ安息香酸を抽出し、精製して再結晶によりパラヒドロキシ安息香酸1.75gを得た。 収率は91.1%であった。

    【0030】

    【発明の効果】本発明の方法により、従来は高温・高圧の反応で化学合成されていた防腐剤、医薬品、農薬、染料、液晶などの原料として有用なパラヒドロキシ安息香酸をエネルギーをほとんど要せずに微生物酸化によってパラクレゾールから安価に製造することができた。

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