基因表达特异性的提高
阅读：2发布：2022-03-23
专利汇可以提供基因表达特异性的提高专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 通过对准一个靶标基因的特异性表达部位来寻求提高基因表达的特异性。因此提供了一种嵌合基因，它含有可在受影响的 生物 体一个以上区域内表达的启动子。该启动子连接于一个作用因子，此因子可影响 植物 内也在该植株一个以上区域内表达的内源性基因发挥功能。选择这种启动子和作用因子，使它们的表达部位在一个或几个所需要的 位置 有重叠。这种重叠的部位可使基因表达的特异性和定向作用提高。，下面是基因表达特异性的提高专利的具体信息内容。
1.一种提高转化的植物内基因调节特异性的方法，包括：
(a)将嵌合基因导入植物的细胞内，其中该嵌合基因含有一个组织特 异性启动子和一个核酸序列，并且其中该组织特异性启动子在植物中的 一个以上，但不是所有表达位点，包括内源靶基因的多个表达位点的至 少一个位点转录核酸序列；并且
(b)从细胞再生含有嵌合基因的转化的植物，
其中嵌合基因的组织特异性表达仅在嵌合基因和靶基因都被表达的 表达位点调节转化的植物中靶基因的表达或靶基因产物的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸序列是一个编码序列或非编码 序列。
3.权利要求1的方法，其中所述靶基因的表达被上调。
4.权利要求1的方法，其中所述靶基因的表达被下调。
5.权利要求1、2或4中任何一项的方法，其中所述核酸序列是反 义取向。
6.权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述核酸是有义取向。
7.权利要求1的方法，其中核酸序列编码靶基因表达的激活因子。
8.权利要求1的方法，其中嵌合基因包含一个以上核酸序列，当所 述序列的每一个被表达时，调节一种或多种靶基因的表达。
9.权利要求1的方法，其中嵌合基因的启动子指导在靶基因的一个 以上重叠表达位点的表达。
10.权利要求1-4中任何一项的方法，其中所述的启动子是KNT1 启动子或RB7启动子。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸序列是反义取向的所述RB7 或KNT1启动子的序列或其一部分。
12.权利要求1的方法，其中启动子是诱导型的。
13.权利要求1的方法，其中核酸序列编码转录的激活因子。
14.权利要求13的方法，其中所述转录的激活因子是热休克因子。
15.权利要求1的方法，其中核酸序列调节靶基因表达或靶基因产 物活性的机制为选自下组之一：反义调节；共抑制作用；对靶基因启动 子的抑制作用；对转录的抑制作用；改变信使RNA的稳定性或降解信使 RNA，对翻译的抑制作用；对蛋白质的抑制作用；改变蛋白质的代谢； 作为辅助因子起作用，改变蛋白质-蛋白质之间的相互作用；和改变通 过生物化学途径的流出物量。
16.权利要求15的方法，其中核酸序列编码核酶。
17.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码特异性降解靶基因 的信使RNA的RNA酶的序列。
18.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码靶基因的信使RNA 的稳定剂的序列。
19.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码靶基因的信使RNA 的去稳定剂的序列。
20.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码阻遏靶基因转录的 蛋白的序列。
21.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码阻遏靶基因翻译的 蛋白的序列。
22.权利要求1的方法，其中核酸序列包含编码靶基因产物的突变 形式的序列。
23.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码靶基因产物的抑制 剂的序列。
24.权利要求15的方法，其中核酸序列包含编码结合靶基因产物的 蛋白的序列。
25.权利要求1的方法，其中所述启动子是通过线虫以外的方法诱 导而导致表达的。
26.具有转化载体pBIN05002的细胞，该载体的保藏号为NCIMB 40871。
27.权利要求26的细胞中所含有的转化载体pBIN05002。
28.一个包含质粒pATC 37010的构建物。
29.一个包含质粒pATC 37010中所含有的启动子-基因片段-终 止子盒的构建物。
技术领域
此发明是关于一种用于增强基因表达特异性的方法。特别是，本发 明涉及到应用产生高度特异性定向作用的嵌合基因，作为提供例如，但 不局限于对植物中引起疾病的病原体定向抗性的一种模式。
背景技术
以简单的方式描述基因如何构成，如何发挥功能，对于阐明本发明 是有益的(见图1，它显示了基因的结构，这种基因也可能是嵌合基因)。 可以认为基因由3种成分组成(此数目相当于图1中的数目)：1.决定 何时和何处对编码序列进行转录的启动子(P)，用于产生蛋白质的编码 序列(CS)，以及有时也可以影响编码序列转录的3′调节序列(3′)。3′ 调节序列通常被称为终止子。2.当启动子允许转录并作用于编码序列的 工作拷贝而产生信使RNA(mRNA)时(10)，基因开始表达。3.然后 mRNA被翻译(11)产生蛋白质产物。4.然后，此蛋白质产物可以同底 物或另一种蛋白质，或者调节序列相互作用，引起效应(E)。
但是应该注意到，对基因表达的调节，可以在上述表达过程的每个 阶段起作用。一些因子可以作用于启动子，作用于产生mRNA的转录机 构，以及作用于改变mRA或影响其稳定性的过程。还有一些因子可以 对蛋白质的翻译和对细胞中蛋白质的代谢起作用。另一些因子可以对蛋 白质如何与其它成分相互作用，以及如何实现其效应发生影响。
为了阐述本发明的原理，假定植物中有如下基因，基因1和基因2。 基因1在植物组织A和B中是有活性的，而基因2在植物的区域B和C中 是有活性的。二个基因的活性在区域B中重叠，这可以直观地描绘成如图2 的Venn图解形式。根据这个图解，显然共同的表达部位受到了较多的限 制，或者换句话说，此部位比二个基因独自的表达部位具有更高的特异性。
因此在本发明中，对于植物，该嵌合基因含有可在植物的一个以上 区域内表达的启动子。该启动子与一个因子相连接。此因子将影响也在 植物的一个以上的区域内表达的内源性基因的功能作用。该启动子和内 源性基因在其中受影响的区域是有活性的，并且不相同，但是在一个或 几个需要的部位它们的确可以重叠。当这种嵌合基因被转移进入植物， 该因子将只对重叠部位的靶标内源性基因起作用。
有几种途径对本发明作例证性说明，其中的一个实际例证是对植物 寄生性线虫增加了耐性或抗性。虽然我们已应用细胞破坏和雄性不育作 为例证，但是该系统也可以用于在特定部位增强基因。
已提出了几种不同的方法来达到对细胞的特异性破坏作用。最简单 的方法是应用一个嵌合基因，它含有连接于一个破坏性系统的，对靶标 组织特异性的启动子。但是，即使是特异性启动子，也可能在除了靶标 组织之外的组织内有较小程度的表达，有时这是不希望有的。
已尝试采取其它措施，通过应用二种构建物来防止这个问题，第一种 构建物包含有一个嵌合基因，此基因含有连接于一个细胞坏死系统(例如芽 孢杆菌Rnase)的组织特异性启动子，第二种构建物包含一个含有另一启动 子的嵌合基因，此启动子在除靶标区域之外的区域内有活性，并连接了个 可使此坏死系统失活的保护因子(例如芽孢杆菌RNase)。因此，借助于此 保护因子，可抑制在不同于所希望的组织内的坏死(见国际专利申请号WO 92/21757(植物遗传系统N.V)和WO 93/10251(Mogen International N.V))。
例如，应用单独一个构建物，本发明可以提供一个具有高度特异性 的细胞破坏系统。适用于本发明的其它细胞调节系统，对于本领域的技 术人员是已知的。
但是应该注意到，对基因表达的调节，可以在上述表达过程的每个 阶段起作用。一些因子可以作用于启动子，作用于产生mRNA的转录机 构，以及作用于改变mRA或影响其稳定性的过程。还有一些因子可以 对蛋白质的翻译和对细胞中蛋白质的代谢起作用。另一些因子可以对蛋 白质如何与其它成分相互作用，以及如何实现其效应发生影响。
为了阐述本发明的原理，假定植物中有如下基因，基因1和基因2。 基因1在植物组织A和B中是有活性的，而基因2在植物的区域B和C中 是有活性的。二个基因的活性在区域B中重叠，这可以直观地描绘成如图2 的Venn图解形式。根据这个图解，显然共同的表达部位受到了较多的限 制，或者换句话说，此部位比二个基因独自的表达部位具有更高的特异性。
因此在本发明中，对于植物，该嵌合基因含有可在植物的一个以上 区域内表达的启动子。该启动子与一个因子相连接。此因子将影响也在 植物的一个以上的区域内表达的内源性基因的功能作用。该启动子和内 源性基因在其中受影响的区域是有活性的，并且不相同，但是在一个或 几个需要的部位它们的确可以重叠。当这种嵌合基因被转移进入植物， 该因子将只对重叠部位的靶标内源性基因起作用。
有几种途径对本发明作例证性说明，其中的一个实际例证是对植物 寄生性线虫增加了耐性或抗性。虽然我们已应用细胞破坏和雄性不育作 为例证，但是该系统也可以用于在特定部位增强基因。
已提出了几种不同的方法来达到对细胞的特异性破坏作用。最简单 的方法是应用一个嵌合基因，它含有连接于一个破坏性系统的，对靶标 组织特异性的启动子。但是，即使是特异性启动子，也可能在除了靶标 组织之外的组织内有较小程度的表达，有时这是不希望有的。
已尝试采取其它措施，通过应用二种构建物来防止这个问题，第一种 构建物包含有一个嵌合基因，此基因含有连接于一个细胞坏死系统(例如芽 孢杆菌Rnase)的组织特异性启动子，第二种构建物包含一个含有另一启动 子的嵌合基因，此启动子在除靶标区域之外的区域内有活性，并连接了个 可使此坏死系统失活的保护因子(例如芽孢杆菌RNase)。因此，借助于此 保护因子，可抑制在不同于所希望的组织内的坏死(见国际专利申请号WO 92/21757(植物遗传系统N.V)和WO 93/10251(Mogen International N.V))。
例如，应用单独一个构建物，本发明可以提供一个具有高度特异性 的细胞破坏系统。适用于本发明的其它细胞调节系统，对于本领域的技 术人员是已知的。
发明内容
本发明的目的之一是提供一个部位特异性表达系统或靶标系统，此 系统通常适用于具有某种基因的任何一种生物体，此基因可在不同的区 域内表达，但是在这些区域内它们的表达范围是重叠的。
本发明的另一目的是只应用一个构建物来达到增强特异性的目的， 此构建物包含一个含有二个以上核酸序列的嵌合基因，该构建物被设计 成为能与生物体中的内源性基因相互作用。
本发明提供了一种方法，用于提高转化的生物体内基因调节的特异 性，此方法包括如下步骤：(a)将嵌合基因导入植物的细胞内，其中该嵌 合基因含有一个组织特异性启动子和一个核酸序列，并且其中该组织特 异性启动子在植物中的一个以上，但不是所有表达位点，包括内源靶基 因的多个表达位点的至少一个位点转录核酸序列；并且(b)从细胞再生含 有嵌合基因的转化的植物，其中嵌合基因的组织特异性表达仅在嵌合基 因和靶基因都被表达的表达位点调节转化的植物中靶基因的表达或靶基 因产物的活性。
优选地核酸序列是一个编码序列或非编码序列。
优选地可以对靶标基因的表达进行上调或下调。
优选地该生物体是植物，并因此该转化的植株或其繁殖体包含此嵌 合基因。
这种因子借以作用于基因的机制可能属于下列的任何一种。不应该 认为仅局限于所列举的项目。
1.反义作用。
2.共抑制作用。
3.对靶标基因启动子的抑制或激活作用。
4.对转录的抑制或激活作用。
5.改变信使RNA的稳定性或使mRNA降解。
6.对翻译的抑制或激活作用。
7.对蛋白质的抑制或激活作用。
8.改变蛋白质的代谢。
9.作为辅助因子起作用。
10.改变蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
11.改变通过生物化学途径的流出物量。
下面简要地对这些机理的某些实例进行论述。应该记住，为了能在 本发明的构思中有效，将被选择实现基因调节的特定机理也需要有一定 水平的部位特异性表达。
借助于作为核酸序列的嵌合基因的这种因子，可便利地实现下调作 用，此核酸序列对于整个或部分启动子，或者对于靶标基因的编码序列 或非编码序列是反义取向的。通过对靶标基因的启动子，或者编码序列 或非编码序列的共抑制作用，可便利地实现下调作用。
还可以实现对靶标基因的上调作用，例如通过导入一个靶标基因启 动子的激活因子。
还可以合并应用这些技术。
用于调节靶标基因表达的其它适合的方法对于本领域的技术人员是 已知的。
嵌合基因的作用因子可能包括一个或几个核酸序列，表达时，每一 序列完成一种特定功能。因此，仅用一个启动子，就可能获得超过一个 内源性基因的表达特异性。
一个构建物可以包含二个单独的嵌合基因作为表达盒，每个嵌合基 因含有一个启动子，一个作用因子编码序列和一个终止子。每个嵌合基 因对不同的同源性基因起作用，此基因可以在相同的靶标部位或不同的 部位表达。因此，有可能在一段时间内，按照过程，如特定的生物合成 链的顺序，使几种成分或靶标基因失去或增加效能。换句话说，可以影 响过程的时序链。按照另一种方式，每种嵌合基因都可能在二个单独的 构建物中被转移进入生物体，每个构建物含有一个表达盒，即一个嵌合 基因。
此核酸序列可能是DNA序列或RNA序列。
嵌合基因的启动子可能在内源性基因的一个以上的重叠表达部位表 达。
便利地该启动子是一种线虫-诱导性启动子，例如在此被称为KNT1 启动子或RB7的启动子。取决于将要实现的部位特异性表达调节作用， 还可以使用其它一些启动子，这些启动子可由其它一些作用于它们，在 其它的感染或生长部位起作用的因子引起表达。
便利地此核酸序列是RB7或KNT1启动子或其编码序列的反义序 列，或者此反义序列的一部分。
或者为了按照例如前面列举的机理5起作用，此核酸序列可以是核 酶，或者是降解信使RNA的定向RNA酶。还可以通过特定的营养素使 特异性RNA稳定或不稳定，例如在mRNA的情况下，铁元素对于细胞 表面蛋白质受体的转移；或者一些配体，激素和翻译产物，例如微管蛋 白二聚体对微管蛋白mRNA的作用。选择在某些部位表达或所需要的营 养素，配体，激素或翻译产物，是创造性构思所必需的。
一个转录激活剂的实例是果蝇(Drosophila)的热休克因子，它编 码一个在细胞中游离的蛋白质。在热休克时，热休克基因因子与热休克 蛋白HSP70的启动子结合，从而导致转录作用增加。在细菌、动物和植 物中都发现有热休克蛋白。技术人员可以选择适合用于本发明构思的， 具有部位特异性的激活剂来实现机理4的作用。
生物体中适合于作用机制9的辅助因子包括维生素如泛酸和维生素 B6。
最后，通过将例如cAMP-依赖性蛋白激酶蛋白质导入生物体中，使 机制10可能受到影响。cAMP-依赖性蛋白激酶通过使其磷酸化而作用于 糖原合成酶。糖原合成酶被转化成较低活性的形式，使糖原合成受到抑制。
本发明还应用若干个构建物，每个构建物嵌合基因的每个启动子- 基因片段，象每个其它的启动子-基因片段一样，在相同的靶标表达部 位具有重叠，因此在所选择的单独表达部位提供了多次重叠，这将进一 步增强此系统的特异性。该嵌合基因的其它表达部位可能与其它的启动 子-基因片段的其它表达部位相同或者不同。
附图说明
为使本发明容易理解，便于实施下面将引用例如，如下的附图和实施例，其中：
图1显示细胞中基因表达的示意图。
图2显示二个单独的基因当它们在同一植株中，其表达部位的重叠，
图3显示用于按照本发明转化植物的载体pATC 37010的结构图，
图4显示用于转化植物的对照载体pATC 37003的结构图，以及
图5显示pATC的结构图，SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6连接进 入其中将分别产生图3和图4的载体pATC 37010和pATC 37003。
在图2中部位B的细胞特异性破坏作用可以按如下方法实现。可将 来源于基因1，调节表达特异性的启动子，连接于构建物中将破坏基因2 活性的区域。当将此构建物导入植株中时，这种基因2破坏因子将在区 域A和B内表达。在部位A将没有任何效应，因为在此基因2没有活性。 在部位C也没有任何效应，因为在此构建物的启动子没有活性，因此不 能产生对基因2的破坏性因子。在部位B将存在对基因2的破坏作用， 因为在此存在基因2的破坏性因子，并且基因2在此也有活性。
本发明的另一目的是只应用一个构建物来达到增强特异性的目的， 此构建物包含一个含有二个以上核酸序列的嵌合基因，该构建物被设计 成为能与生物体中的内源性基因相互作用。
本发明提供了一种方法，用于提高转化的生物体内基因调节的特异 性，此方法包括如下步骤：(a)将嵌合基因导入植物的细胞内，其中该嵌 合基因含有一个组织特异性启动子和一个核酸序列，并且其中该组织特 异性启动子在植物中的一个以上，但不是所有表达位点，包括内源靶基 因的多个表达位点的至少一个位点转录核酸序列；并且(b)从细胞再生含 有嵌合基因的转化的植物，其中嵌合基因的组织特异性表达仅在嵌合基 因和靶基因都被表达的表达位点调节转化的植物中靶基因的表达或靶基 因产物的活性。
优选地核酸序列是一个编码序列或非编码序列。
优选地可以对靶标基因的表达进行上调或下调。
优选地该生物体是植物，并因此该转化的植株或其繁殖体包含此嵌 合基因。
这种因子借以作用于基因的机制可能属于下列的任何一种。不应该 认为仅局限于所列举的项目。
1.反义作用。
2.共抑制作用。
3.对靶标基因启动子的抑制或激活作用。
4.对转录的抑制或激活作用。
5.改变信使RNA的稳定性或使mRNA降解。
6.对翻译的抑制或激活作用。
7.对蛋白质的抑制或激活作用。
8.改变蛋白质的代谢。
9.作为辅助因子起作用。
10.改变蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
11.改变通过生物化学途径的流出物量。
下面简要地对这些机理的某些实例进行论述。应该记住，为了能在 本发明的构思中有效，将被选择实现基因调节的特定机理也需要有一定 水平的部位特异性表达。
借助于作为核酸序列的嵌合基因的这种因子，可便利地实现下调作 用，此核酸序列对于整个或部分启动子，或者对于靶标基因的编码序列 或非编码序列是反义取向的。通过对靶标基因的启动子，或者编码序列 或非编码序列的共抑制作用，可便利地实现下调作用。
还可以实现对靶标基因的上调作用，例如通过导入一个靶标基因启 动子的激活因子。
还可以合并应用这些技术。
用于调节靶标基因表达的其它适合的方法对于本领域的技术人员是 已知的。
嵌合基因的作用因子可能包括一个或几个核酸序列，表达时，每一 序列完成一种特定功能。因此，仅用一个启动子，就可能获得超过一个 内源性基因的表达特异性。
一个构建物可以包含二个单独的嵌合基因作为表达盒，每个嵌合基 因含有一个启动子，一个作用因子编码序列和一个终止子。每个嵌合基 因对不同的同源性基因起作用，此基因可以在相同的靶标部位或不同的 部位表达。因此，有可能在一段时间内，按照过程，如特定的生物合成 链的顺序，使几种成分或靶标基因失去或增加效能。换句话说，可以影 响过程的时序链。按照另一种方式，每种嵌合基因都可能在二个单独的 构建物中被转移进入生物体，每个构建物含有一个表达盒，即一个嵌合 基因。
此核酸序列可能是DNA序列或RNA序列。
嵌合基因的启动子可能在内源性基因的一个以上的重叠表达部位表 达。
便利地该启动子是一种线虫-诱导性启动子，例如在此被称为KNT1 启动子或RB7的启动子。取决于将要实现的部位特异性表达调节作用， 还可以使用其它一些启动子，这些启动子可由其它一些作用于它们，在 其它的感染或生长部位起作用的因子引起表达。
便利地此核酸序列是RB7或KNT1启动子或其编码序列的反义序 列，或者此反义序列的一部分。
或者为了按照例如前面列举的机理5起作用，此核酸序列可以是核 酶，或者是降解信使RNA的定向RNA酶。还可以通过特定的营养素使 特异性RNA稳定或不稳定，例如在mRNA的情况下，铁元素对于细胞 表面蛋白质受体的转移；或者一些配体，激素和翻译产物，例如微管蛋 白二聚体对微管蛋白mRNA的作用。选择在某些部位表达或所需要的营 养素，配体，激素或翻译产物，是创造性构思所必需的。
一个转录激活剂的实例是果蝇(Drosophila)的热休克因子，它编 码一个在细胞中游离的蛋白质。在热休克时，热休克基因因子与热休克 蛋白HSP70的启动子结合，从而导致转录作用增加。在细菌、动物和植 物中都发现有热休克蛋白。技术人员可以选择适合用于本发明构思的， 具有部位特异性的激活剂来实现机理4的作用。
生物体中适合于作用机制9的辅助因子包括维生素如泛酸和维生素 B6。
最后，通过将例如cAMP-依赖性蛋白激酶蛋白质导入生物体中，使 机制10可能受到影响。cAMP-依赖性蛋白激酶通过使其磷酸化而作用于 糖原合成酶。糖原合成酶被转化成较低活性的形式，使糖原合成受到抑制。
本发明还应用若干个构建物，每个构建物嵌合基因的每个启动子- 基因片段，象每个其它的启动子-基因片段一样，在相同的靶标表达部 位具有重叠，因此在所选择的单独表达部位提供了多次重叠，这将进一 步增强此系统的特异性。该嵌合基因的其它表达部位可能与其它的启动 子-基因片段的其它表达部位相同或者不同。
附图说明
为使本发明容易理解，便于实施下面将引用例如，如下的附图和实施例，其中：
图1显示细胞中基因表达的示意图。
图2显示二个单独的基因当它们在同一植株中，其表达部位的重叠，
图3显示用于按照本发明转化植物的载体pATC 37010的结构图，
图4显示用于转化植物的对照载体pATC 37003的结构图，以及
图5显示pATC的结构图，SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6连接进 入其中将分别产生图3和图4的载体pATC 37010和pATC 37003。
在图2中部位B的细胞特异性破坏作用可以按如下方法实现。可将 来源于基因1，调节表达特异性的启动子，连接于构建物中将破坏基因2 活性的区域。当将此构建物导入植株中时，这种基因2破坏因子将在区 域A和B内表达。在部位A将没有任何效应，因为在此基因2没有活性。 在部位C也没有任何效应，因为在此构建物的启动子没有活性，因此不 能产生对基因2的破坏性因子。在部位B将存在对基因2的破坏作用， 因为在此存在基因2的破坏性因子，并且基因2在此也有活性。
具体实施方式
实施例1
应用Venn构建物，借助于基因工程技术增强对植物寄生性线虫的耐 受性或抗性。
植物寄生性线虫如根癌线虫和孢囊线虫，对全世界的谷物产量导致 了7％-14％的损失。线虫通过侵入植物根部并形成赖以获得营养的专门 摄食部位。摄食部位的植物细胞，或者是在根癌线虫情况下的巨大多核 细胞，或者是在孢囊线虫情况下，几个融合在一起的细胞Syncitia都将 发生改变。线虫变成为固着不动，完全依赖于摄食部位获得营养。我们 的美国专利No.5,589,622论述了使植物具有抗性的一般途径，是通过 将供食细胞的特异性启动子连接于细胞死亡系统或细胞破坏系统，以便 破坏此供食细胞。供食细胞的供食功能将受到损害，以致使线虫饿死， 或者减少食物供给，使之不能够或者减弱生长和产生后代。这种方法是 上述细胞特异性破坏的最简单方法的一个实例。应用这个原理的其它专 利是造成植株不育的那些专利，例如国际专利申请号WO 89/10396(植 物基因系统N.V)。
已经鉴定了启动子KNT1，它可在供食细胞和根尖中表达，在其它 分生组织中也有较小程度的表达。其它一些研究者鉴定了在根部和巨大 细胞中表达的基因RB7(Conkling等1990，Opperman等1993)。我 们以连接于标记基因GUS的RB7启动子进行的研究表明，RB7基因在 根体而不在根尖表达。制备了一个位于含有pBIN19(Bevan，M.1984) 衍生的植物转化载体的根瘤土壤杆菌中的Venn构建物，它包含连接于RB7编码 序列的部分反义序列和nos终止子的KNT1启动子。此构建物命名为pBIN 05002，已由英国剑桥CB4 4WA 210剑桥科学园，的Advanced Techmologies(剑桥)公司，根据《国际承认用于专利程序的微生物保 藏的布达佩斯条约》，于1997年3月20日，保藏在位于Scotland Aberdeen，23 St.Machar Street的国立工业和海洋微生物保藏公司 (NCIMB)，保藏号为NCIMB 40871。以这种构建物，按照Horsch等 (1985)的方法，应用土壤杆菌介导的植物转化作用对烟草植株cv Heavy Western进行了转化。
将再生的转基因植株转移至温室中。将转基因植株和非转基因对照 植株，每株用大约100条根癌线虫Meloidogyne javanice进行感染。感染 后的第八周，测定可看见的根癌数目和它们的大小。在这段时间内，初 始的接种物具有感染，成熟并产生第二代线虫的机会，第二代线虫又可 能再感染植物的根并生长成熟。
将8株最低记分的转基因pBIN 05002植株培育产生种子。按如上所 述再次筛选来自亲本植株的后代对M.javanica线虫增加的耐受性或抗 性。除了pBIN05002植株之外，还包括来自以pBIN05101转化植株的后 代和来自未转化植株的后代作为比较对照，此pBIN05101包含有连接于 葡糖苷酸酶标记基因(GUS)(Jefferson.R.A.等1987)的KNT1启动 子。pBIN05101也于1997年3月20日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 40870。来自pBIN05002植株品系32的后代，显示出具有低虫瘿记分的 植株数目显著地增加了，如表1中所示。此结果在x方分析中具有显著 性。
表1 对于未转化的对照植株，pBIN05101对照植株和pBIN05002试验植株， 低虫瘿记分等级和高虫瘿记分等级植株的数目。
低虫瘿记分＝0-50个虫瘿/植株。
高虫瘿记分＝51个以上虫瘿/植株。
处理 具有低虫瘿 具有高虫瘿
记分的植株 记分的植株 未转化的植株 18 13 pBIN05101对照植株 13 17 pBIN05002品系32试验植株 25 7
实施例2
上述实施例中，应用细胞破坏系统增强线虫破坏作用特异性所简述 的重叠原理，同样可以很好地在例如拟南芥花中，或其它开花植物中， 以花形态或结构改变，例如雄性不育来实现。此实施例应用了在拟南芥 中发现的DNA序列。
假设花的四个要素(花萼，心皮，花瓣和雄蕊)是在三个基因控制 之下(Coen II.9和Meyero-Witz，E.M.，1991)。
改变这些基因的平衡状态将导致花形态改变。例如，基因agamous 和apetala3都必须在花的相同部位表达，以便产生植株的雄性部分雄蕊。 Aganous既可在心皮中也可以雄蕊中表达，而apetala3可在雄蕊和花瓣中 表达。
为了按照作为本发明主题的重叠原理制备一个构建物，我们需要来 自第一个基因(例如在心皮和雄蕊中有活性的agamous)的启动子，此 基因连接了第二个基因(例如在花瓣和雄蕊中有活性的apetala3)的破 坏因子，以便仅在雄蕊中发挥破坏作用。
按照已公布的程序(Thomas.C，1996)，用如下二个引物，应用 以Taq和Taq-延伸剂的聚合酶链式反应，从拟南芥菜的DNA中分离出 435个碱基对的agamous启动子片段： 引物1(SEQ.ID.No.1) ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA 引物2(SEQ.ID.No.1) ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC
此二引物是以Genbank DNA序列的基因组agamous序列的条目 ATAGAMSG中给予的序列为基础。引物1在其5′末端包含一个加入的 HindIII限制性酶切位点。引物2在其5′末端包含一个加入的BamHI限制 性酶切位点。
为了扩增部分apetala 3基因序列，根据Genbank条目ATHAPETALA 设计了如下的引物： 引物3(SEQ.ID.No.3) ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA 引物4(SEQ.ID.No.4) ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA
引物3被特定地设计在所公布的apetala 3序列的992位置开始扩 增，它是此误读框内的一个起始密码子，以便产生活性产物并消除与相 同基因家庭内其它MADS盒基因具有高度同源性序列的起始部分。引物 还包含有一个来自所公布序列的一个碱基对更换，以便除去不希望有的 SaeI限制性酶切位点。引物3在其5′端具有一个BamHI限制性酶切位点。 引物4在其5′端具有一个SacI位点。借助于PCR，用引物3和4从拟南 芥DNA扩增了一个1586bp的片段。
如下的克隆技术对本领域的任何技术人员都是熟悉的，按照 Sembrook等(1989)的方法可获得这些结果。将agamous启动子片段 作为HindIII-BamHI片段连接进入pBluescript衍生的载体(Stratagene Ltd，剑桥，英国)。将改变的apetala基因片段连接在agamous启动子 的下游，作为相同载体中的BamHI-SacI片段。此载体在作为SacI- EcoRI片段的已改变apetala 3序列的下游还含有nos终止子序列。此载 体被称为pDVM37010。制备了第二个质粒作为对照，并被称为 pDVM37003，它包含位于m-gfp-ER报导基因前面的agamous启动 子，而此报导基因是从Jim Haselhoff，MRC获得。
从pDVM37010(SEQ.ID.No.5)和pDVM 37003(SEQ.ID.No. 6)切取了启动子-基因片段-终止子盒作NotI限制性酶切片段，并被 连接进入pBIN19(Bevan，M.(1984)衍生载体pATC，构成质粒 pATC37010(结构图显示在图3中)和pATC37003(结构图显示在图4 中)。可以将这些序列克隆进入在此具有适合的限制性酶切位点的任何 其它等效的载体，即在此盒的二端具有NotI位点。pATC的结构图被显 示在图5中。同pBIN19相比较，它具有经过修饰的限制性酶切位点。在 agamous启动子的控制下，pATC37010可产生共-抑制产物，在花的发 育雄蕊中使apetala 3的功能失活。
将这些质粒转移进入根瘤土壤杆菌宿主LBA 4404，并用于按照 Bechtold等(1993)的方法转化拟南芥菜，以及应用Horsou等(1985) 的方法转化烟草cv K326。获得了8株pATC37010转基因拟南芥小植株， 和6株pATC37003转基因拟南芥小植株。将100片的三组叶用于每种构 建物转化烟草。对所有三组转基因愈伤组织生长进行了检测。
在发芽后10-14天将拟南芥小植株转移至土壤中，培育直至开花。 这些花表现出无雄蕊，而且有玫瑰红双心皮。
对于卡那霉素抗性pATC37010转基因植株，按照本领域技术人员熟 知的程序，应用引物1和4，借助于以下Taq聚合酶的PCR，进一步对 所需插入物的存在进行了筛选。实施了40个PCR温育循环，包括如下 温育步骤：94℃60秒钟，60℃30秒钟，以及72℃140秒钟。按照本 领域技术人员熟知的程序，通过在琼脂糖凝胶电泳上目视检测这些PCR 产物，鉴定PCR阳性样品。
对于pATC37003对照转基因植株，按照本领域技术人员熟知的程 度，应用引物1和7，借助于以Taq聚合酶的PCR，进一步对所需插入 物的存在进行了筛选。实施了40个PCR温育循环，包括如下温育步骤： 94℃40秒钟，60℃30秒钟，以及72℃140秒钟。按照本领域技术人 员熟知的程序，通过在琼脂糖凝胶电泳上目视检测这些PCR产物，鉴定 出PCR阳性样品。 引物7(SEQ.ID.No.7)
GAACTGGGAC CACTCCAGTG
在此二种情况下，都鉴定出含有适当构建物的转基因植株。
参考文献 Bechtold，N.，Ellis，J.，and Pelletier，G.(1993)通过渗入成熟 的拟南芥菜植株进行植物土壤杆菌介导的基因转移。C.R.Acad.Sci： Paris 316：1194-1199. Bevan，M.(1984)用于植物转化的二元土壤杆菌载体。核酸研究。 12：8711-8721。 Coen，E.S.and Meyerowitz，E.M.(1991)。防治毛轮虫：基因相互 作用控制花形成。自然353，31-37。 Conkling，M.A，Cheng，C-L，Yamamoto，Y.T.and Goodman，H.M. (1990)。从烟草中分离转录调节根特异性基因。植物生理学93，1203 -1211。 Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffmann，N.L，Eichholtz，D.， Rogers，S.G.and Fraley，R.T.(1985)。将基因转移进植物的简便的 一般方法。科学22，1229-1231。 Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.and Bevan，M.W.(1987)。GUS 融合：在高等植物中以葡糖苷酸酶作为灵敏、通用的基因融合标记。 EMBO，6，3901-3907 Opperman，C.H.，Taylor，C.G.and Conkling，M.A.(1994)。根癌 线虫定向的植物根特异性基因的表达。科学263，221-223。 Sambrook，J.，Fritsch，E.f.and Maniatis，T.(1989)分子克隆- 实验室手册。第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。 Thomas，C.(1996)植物基因分离中的“PCR技术”：原理和实践。 G.D.Foster&D.Twell editors.John Wiley&Sons Ltd.，pp 331-368。
序列表 (1)一般信息
(i)申请人：
(A)姓名： Advanced Technologies(Cambridge)Limited
(B)街道： Millbank，Knowle Green
(C)城市： Staines
(D)州： Middlesex
(E)国家： 英国
(F)邮编： TW18 IDY
(ii)发明名称： 基因表达特异性的提高
(iii)序列数： 6
(iv)通讯地址：
(A)地址： British-American Tobacco Company Limited
(B)街道： Regents Park Road
(C)城市： Southampton
(D)州： Hampshire
(E)国家： 英国
(F)邮编： SO158TL
(v)计算机可读形式：
(A)存储媒体类型： Diskette 3.50 inch
(B)计算机： Viglen P5/75
(C)操作系统： MS-DOS Windows 3.1
(D)软件： Microsoft Word 2.0
(vi)目前申请数据：
(A)申请号： 未知
(C)分类： 未知
(vii)在先申请数据：
(A)申请号： 9706381.2
(B)申请日： 27th March 1997
(viii)律师/代理人信息
(A)姓名： Mrs.M.R.Walford/Mr.K.J.H.MacLean
(C)委托书： RD-ATC-17
(ix)电讯信息：
(A)电话： 01703 777155
(B)电传： 01703 779856
(2)SEQ.ID.NO： 1信息
(i)序列特征：
(A)长度： 32
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(ix)特征：
(A)名称： Hind III限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO： 1： ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA 32
(2)SEQ.ID.NO：2信息
(i)序列特征：
(A)长度： 33
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(iv)反义： 是
(ix)特征：
(A)名称： Bam HI限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：2： ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC 33 (2)SEQ.ID.NO：3信息
(i)序列特征：
(A)长度： 32
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(ix)特征：
(A)名称： Bam HI限制位点
(B)定位： 5-10
(ix)特征：
(A)名称： 起始密码子
(B)定位： 11-13
(ix)特征：
(A)名称： 有意的碱基改变A变为G
(B)定位： 14
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：3： ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA 32 (2)SEQ.ID.NO：4信息
(i)序列特征：
(A)长度： 36
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(iv)反义： 是
(ix)特征：
(A)名称： SacI限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：4： ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA 36 (2)SEQ.ID.NO：5信息
(i)序列特征：
(A)长度： 2319
(B)类型： 核酸
(C)链型： 双链
(D)拓扑结构： 线性来源
质粒中为环形
(ii)分子类型： 质粒DNA
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(B)品系： Landsberg
(ix)特征：
(A)名称/要点： 启动子 拟南芥agamous
(Genbank ATAGAMSG)
(B)定位： 26-441
(ix)特征：
(A)名称/要点： 编码序列-拟南芥apetala 3
(Genbank ATHPETALA)
(B)定位： 448-2013
(ix)特征：
(A)名称/要点： Nos终止子
(B)定位： 2020-2286
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：5：
GCGGCCGCGA TATCGTCGAC AAGCTTCTAA ATGTACTGAA AAGAAACACC AGTTTAATTA 60
ATTATACTTT CCTCACATAT AACTATCAAC CAAGTACAAA ACTTTTGTCA ATTCTCAAAA 120
TCAACTTTCA CCACATAATT ATCTAACATG TGTATGTTCC AAAACCAGTT TAAATGAATT 180
ACTTTTCAGA AAATACATGT ATATTAACTC TATCTAATAA AGAAGAAACA CATACTTATC 240
TCATAGATTC CATTCATAAA ACTATGCTTT AGTGAGTAAG AAAACCAGTA ATCAAACACA 300
AATTGACAAG ACACTATATG GATGTAAAAA GTGGGGAAAA TATGGTGATA AATAGTAGAG 360
AAAATTAAAA AGAAAAAATA ATATTCCTTT ATAAATGTAT ATACCCATCT CTTCACCAGC 420
ACAACCTTAC CTTCCATTTT CGGATCCATG GGCTCACGGT TTTGTGTGAT GCTAGGGTTT 480
CGATTATCAT GTTCTCTAGC TCCAACAAGC TTCATGAGTA TATCAGCCCT AACACCACGT 540
ACACCATCTC TCTAAACACC ACTCTTAAAT TAAGCTAATT GAGTTGCTTT GTTTTCTTAT 600
AATTAACCAC TACTTTTTTG GTGATTTTGT TGGTTATAGA ACGAAGGAGA TCGTAGATCT 660
GTACCAAACT ATTTCTGATG TCGATGTTTG GGCCACTCAA TATGAGGTTT TTTTCCTTCT 720
TAGATCTTTC TTCTTCTTCT TGATATGTGT TTCGCTGGTT GGTTAAATTC TTGATGCGTT 780
TTGCTGCAGC GAATGCAAGA AACCAAGAGG AAACTGTTGG AGACAAATAG AAATCTCCGG 840
ACTCAGATCA AGTATTTGTT TCTTCTCTCT TCTCTTAGAT GAGGAGTTTT ACTAAAAAAA 900
ATGAGTACGG AAATATACAT ATTTTTAAAA TTGTAGGCAG AGGCTAGGTG AGTGTTTGGA 960
CGAGCTTGAC ATTCAGGAGC TGCGTCGTCT TGAGGATGAA ATGGAAAACA CTTTCAAACT 1020
CGTTCGCGAG CGCAAGGTTC TCTTCATACT TTTCCCTTAC CTAGGGTTTC AATTAATCCT 1080
ATATACCCAA GCTTCAGTTT TGAATTGAAT TATTAAAAAA TGAATTTTAT TGTTGTATAT 1140
ATGTTTTAGA AAAAGAAACA TTTTGTTTAC TGTTGGATAA TATATGTTAA TTGTATTGTA 1200
CTGTACAGTT CAAATCTCTT GGGAATCAGA TCGAGACCAC CAAAGAAAAG GTCACATCTT 1260
CTATGTCCAC TCACTTTTCC ATTTTATCAT ATTTATTTGT CTCAACAATT TTGTGACAAT 1320
TGAATTTATC AACTTACTAA AACTGTTGAT AACACTTTTC TTGGACAATT ATATTTGTGT 1380
GTGTGTGTGT GTGTGTTTAA GCTAATGGAT AAAGAAAATA CCAAGTATAC TATATAGTGA 1440
TGTCATAATA ACTTGGGTAT ATATCTTCAT AATTTTTTTG GGTGGGAATA TTTCTTCATA 1500
ATTTCTCTTG TGGTTTACAC AATTGCAGAA CAAAAGTCAA CAGGACATAC AAAAGAATCT 1560
CATACATGAG CTGGTAATAT CTCTTTCTGT TTTTCTCAAA TGTTGGTTTA GGCATAATAC 1620
ATTCATGGAA TACGGAGCCA GTTAAAAAGA TATCTAGAAA TGTAGTGTAG ATTGATCAGT 1680
CACTCTTATG TTTTCTTGTG ATTCTCTTAT CGAAATATCT CCTAGTTAAA TCATATATCA 1740
AATGTCATGT CATTTCGAAT TAATAATATT GGTTTTAGTT ATGTGGAATA TGGCTTAAAA 1800
CATGTTTTGG TGAATTAGGA ACTAAGAGCT GAAGATCCTC ACTATGGACT AGTAGACAAT 1860
GGAGGAGATT ACGACTCAGT TCTTGGATAC CAAATCGAAG GGTCACGTCG TTACGCTCTT 1920
CGTTTCCACC AGAACCATCA CCACTATTAC CCCAACCATG GCCTTCATGC ACCCTCTGCC 1980
TCTGACATCA TTACCTTCCA TCTTCTTGAA TAAGAGCTCG AATTTCACCC GATCGTTCAA 2040
ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC CGGTCTTGCG ATGATTATCA 2100
TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA CATGTAATGC ATGACGTTAT 2160
TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA CATTTAATAC GCGATAGAAA 2220
ACAAAATTAT GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC GGTGTCATCT ATGTTACTAG 2280
ATCGGGAATT CTGTTTAAAC TCGAGACTAG TGCGGCCGC 2319 (2)SEQ.ID.NO：6信息
(i)序列特征：
(A)长度： 1559
(B)类型： 核酸
(C)链型： 双链
(D)拓扑结构： 线性来源
质粒中为环形
(ii)分子类型： 质粒DNA
(ix)特征：
(A)名称/要点： 启动子-拟南芥agamous
(Genbank ATAGAMSG)
(B)定立： 26-441
(ix)特征：
(A)名称/要点： 编码序列-绿色荧光蛋白
(B)定位： 443-1258
(ix)特征：
(A)名称/要点： Nos终止子
(B)定位： 1260-1526
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：6：
GCGGCCGCGA TATCGTCGAC AAGCTTCTAA ATGTACTGAA AAGAAACACC AGTTTAATTA 60
ATTATACTTT CCTCACATAT AACTATCAAC CAAGTACAAA ACTTTTGTCA ATTCTCAAAA 120
TCAACTTTCA CCACATAATT ATCTAACATG TGTATGTTCC AAAACCAGTT TAAATGAATT 180
ACTTTTCAGA AAATACATGT ATATTAACTC TATCTAATAA AGAAGAAACA CATACTTATC 240
TCATAGATTC CATTCATAAA ACTATGCTTT AGTGAGTAAG AAAACCAGTA ATCAAACACA 300
AATTGACAAG ACACTATATG GATGTAAAAA GTGGGGAAAA TATGGTGATA AATAGTAGAG 360
AAAATTAAAA AGAAAAAATA ATATTCCTTT ATAAATGTAT ATACCCATCT CTTCACCAGC 420
ACAACCTTAC CTTCCATTTT CGGATCCAAG GAGATATAAC AATGAAGACT AATCTTTTTC 480
TCTTTCTCAT CTTTTCACTT CTCCTATCAT TATCCTCGGC CGAATTCAGT AAAGGAGAAG 540
AACTTTTCAC TGGAGTTGTC CCAATTCTTG TTGAATTAGA TGGTGATGTT AATGGGCACA 600
AATTTTCTGT CAGTGGAGAG GGTGAAGGTG ATGCAACATA CGGAAAACTT ACCCTTAAAT 660
TTATTTGCAC TACTGGAAAA CTACCTGTTC CATGGCCAAC ACTTGTCACT ACTTTCTCTT 720
ATGGTGTTCA ATGCTTTTCA AGATACCCAG ATCATATGAA GCGGCACGAC TTCTTCAAGA 780
GCGCCATGCC TGAGGGATAC GTGCAGGAGA GGACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGGAACT 840
ACAAGACACG TGCTGAAGTC AAGTTTGAGG GAGACACCCT CGTCAACAGG ATCGAGCTTA 900
AGGGAATCGA TTTCAAGGAG GACGGAAACA TCCTCGGCCA CAAGTTGGAA TACAACTACA 960
ACTCCCACAA CGTATACATC ATGGCCGACA AGCAAAAGAA CGGCATCAAA GCCAACTTCA 1020
AGACCCGCCA CAACATCGAA GACGGCGGCG TGCAACTAGC TGATCATTAT CAACAAAATA 1080
CTCCAATTGG CGATGGCCCT GTCCTTTTAC CAGACAACCA TTACCTGTCC ACACAATCTG 1140
CCCTTTCGAA AGATCCCAAC GAAAAGAGAG ACCACATGGT CCTTCTTGAG TTTGTAACAG 1200
CTGCTGGGAT TACACATGGC ATGGATGAAC TATACAAACA TGATGAGCTT TAAGAGCTCG 1260
AATTTCACCC GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC 1320
CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA 1380
CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA 1440
CATTTAATAC GCGATAGAAA ACAAAATTAT GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC 1500
GGTGTCATCT ATGTTACTAG ATCGGGAATT CTGTTTAAAC TCGAGACTAG TGCGGCCGC 1559
(2)SEQ.ID.NO：7信息
(i)序列特征：
(A)长度： 20
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成引物
(iii)初始来源：
(A)生物体： Aequorea victoria
(iv)反义： 是
(xi)序列描述：SEQ.ID.NO：7： GAACTGGGAC CACTCCAGTG 20
应用Venn构建物，借助于基因工程技术增强对植物寄生性线虫的耐 受性或抗性。
植物寄生性线虫如根癌线虫和孢囊线虫，对全世界的谷物产量导致 了7％-14％的损失。线虫通过侵入植物根部并形成赖以获得营养的专门 摄食部位。摄食部位的植物细胞，或者是在根癌线虫情况下的巨大多核 细胞，或者是在孢囊线虫情况下，几个融合在一起的细胞Syncitia都将 发生改变。线虫变成为固着不动，完全依赖于摄食部位获得营养。我们 的美国专利No.5,589,622论述了使植物具有抗性的一般途径，是通过 将供食细胞的特异性启动子连接于细胞死亡系统或细胞破坏系统，以便 破坏此供食细胞。供食细胞的供食功能将受到损害，以致使线虫饿死， 或者减少食物供给，使之不能够或者减弱生长和产生后代。这种方法是 上述细胞特异性破坏的最简单方法的一个实例。应用这个原理的其它专 利是造成植株不育的那些专利，例如国际专利申请号WO 89/10396(植 物基因系统N.V)。
已经鉴定了启动子KNT1，它可在供食细胞和根尖中表达，在其它 分生组织中也有较小程度的表达。其它一些研究者鉴定了在根部和巨大 细胞中表达的基因RB7(Conkling等1990，Opperman等1993)。我 们以连接于标记基因GUS的RB7启动子进行的研究表明，RB7基因在 根体而不在根尖表达。制备了一个位于含有pBIN19(Bevan，M.1984) 衍生的植物转化载体的根瘤土壤杆菌中的Venn构建物，它包含连接于RB7编码 序列的部分反义序列和nos终止子的KNT1启动子。此构建物命名为pBIN 05002，已由英国剑桥CB4 4WA 210剑桥科学园，的Advanced Techmologies(剑桥)公司，根据《国际承认用于专利程序的微生物保 藏的布达佩斯条约》，于1997年3月20日，保藏在位于Scotland Aberdeen，23 St.Machar Street的国立工业和海洋微生物保藏公司 (NCIMB)，保藏号为NCIMB 40871。以这种构建物，按照Horsch等 (1985)的方法，应用土壤杆菌介导的植物转化作用对烟草植株cv Heavy Western进行了转化。
将再生的转基因植株转移至温室中。将转基因植株和非转基因对照 植株，每株用大约100条根癌线虫Meloidogyne javanice进行感染。感染 后的第八周，测定可看见的根癌数目和它们的大小。在这段时间内，初 始的接种物具有感染，成熟并产生第二代线虫的机会，第二代线虫又可 能再感染植物的根并生长成熟。
将8株最低记分的转基因pBIN 05002植株培育产生种子。按如上所 述再次筛选来自亲本植株的后代对M.javanica线虫增加的耐受性或抗 性。除了pBIN05002植株之外，还包括来自以pBIN05101转化植株的后 代和来自未转化植株的后代作为比较对照，此pBIN05101包含有连接于 葡糖苷酸酶标记基因(GUS)(Jefferson.R.A.等1987)的KNT1启动 子。pBIN05101也于1997年3月20日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 40870。来自pBIN05002植株品系32的后代，显示出具有低虫瘿记分的 植株数目显著地增加了，如表1中所示。此结果在x方分析中具有显著 性。
表1 对于未转化的对照植株，pBIN05101对照植株和pBIN05002试验植株， 低虫瘿记分等级和高虫瘿记分等级植株的数目。
低虫瘿记分＝0-50个虫瘿/植株。
高虫瘿记分＝51个以上虫瘿/植株。
处理 具有低虫瘿 具有高虫瘿
记分的植株 记分的植株 未转化的植株 18 13 pBIN05101对照植株 13 17 pBIN05002品系32试验植株 25 7
实施例2
上述实施例中，应用细胞破坏系统增强线虫破坏作用特异性所简述 的重叠原理，同样可以很好地在例如拟南芥花中，或其它开花植物中， 以花形态或结构改变，例如雄性不育来实现。此实施例应用了在拟南芥 中发现的DNA序列。
假设花的四个要素(花萼，心皮，花瓣和雄蕊)是在三个基因控制 之下(Coen II.9和Meyero-Witz，E.M.，1991)。
改变这些基因的平衡状态将导致花形态改变。例如，基因agamous 和apetala3都必须在花的相同部位表达，以便产生植株的雄性部分雄蕊。 Aganous既可在心皮中也可以雄蕊中表达，而apetala3可在雄蕊和花瓣中 表达。
为了按照作为本发明主题的重叠原理制备一个构建物，我们需要来 自第一个基因(例如在心皮和雄蕊中有活性的agamous)的启动子，此 基因连接了第二个基因(例如在花瓣和雄蕊中有活性的apetala3)的破 坏因子，以便仅在雄蕊中发挥破坏作用。
按照已公布的程序(Thomas.C，1996)，用如下二个引物，应用 以Taq和Taq-延伸剂的聚合酶链式反应，从拟南芥菜的DNA中分离出 435个碱基对的agamous启动子片段： 引物1(SEQ.ID.No.1) ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA 引物2(SEQ.ID.No.1) ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC
此二引物是以Genbank DNA序列的基因组agamous序列的条目 ATAGAMSG中给予的序列为基础。引物1在其5′末端包含一个加入的 HindIII限制性酶切位点。引物2在其5′末端包含一个加入的BamHI限制 性酶切位点。
为了扩增部分apetala 3基因序列，根据Genbank条目ATHAPETALA 设计了如下的引物： 引物3(SEQ.ID.No.3) ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA 引物4(SEQ.ID.No.4) ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA
引物3被特定地设计在所公布的apetala 3序列的992位置开始扩 增，它是此误读框内的一个起始密码子，以便产生活性产物并消除与相 同基因家庭内其它MADS盒基因具有高度同源性序列的起始部分。引物 还包含有一个来自所公布序列的一个碱基对更换，以便除去不希望有的 SaeI限制性酶切位点。引物3在其5′端具有一个BamHI限制性酶切位点。 引物4在其5′端具有一个SacI位点。借助于PCR，用引物3和4从拟南 芥DNA扩增了一个1586bp的片段。
如下的克隆技术对本领域的任何技术人员都是熟悉的，按照 Sembrook等(1989)的方法可获得这些结果。将agamous启动子片段 作为HindIII-BamHI片段连接进入pBluescript衍生的载体(Stratagene Ltd，剑桥，英国)。将改变的apetala基因片段连接在agamous启动子 的下游，作为相同载体中的BamHI-SacI片段。此载体在作为SacI- EcoRI片段的已改变apetala 3序列的下游还含有nos终止子序列。此载 体被称为pDVM37010。制备了第二个质粒作为对照，并被称为 pDVM37003，它包含位于m-gfp-ER报导基因前面的agamous启动 子，而此报导基因是从Jim Haselhoff，MRC获得。
从pDVM37010(SEQ.ID.No.5)和pDVM 37003(SEQ.ID.No. 6)切取了启动子-基因片段-终止子盒作NotI限制性酶切片段，并被 连接进入pBIN19(Bevan，M.(1984)衍生载体pATC，构成质粒 pATC37010(结构图显示在图3中)和pATC37003(结构图显示在图4 中)。可以将这些序列克隆进入在此具有适合的限制性酶切位点的任何 其它等效的载体，即在此盒的二端具有NotI位点。pATC的结构图被显 示在图5中。同pBIN19相比较，它具有经过修饰的限制性酶切位点。在 agamous启动子的控制下，pATC37010可产生共-抑制产物，在花的发 育雄蕊中使apetala 3的功能失活。
将这些质粒转移进入根瘤土壤杆菌宿主LBA 4404，并用于按照 Bechtold等(1993)的方法转化拟南芥菜，以及应用Horsou等(1985) 的方法转化烟草cv K326。获得了8株pATC37010转基因拟南芥小植株， 和6株pATC37003转基因拟南芥小植株。将100片的三组叶用于每种构 建物转化烟草。对所有三组转基因愈伤组织生长进行了检测。
在发芽后10-14天将拟南芥小植株转移至土壤中，培育直至开花。 这些花表现出无雄蕊，而且有玫瑰红双心皮。
对于卡那霉素抗性pATC37010转基因植株，按照本领域技术人员熟 知的程序，应用引物1和4，借助于以下Taq聚合酶的PCR，进一步对 所需插入物的存在进行了筛选。实施了40个PCR温育循环，包括如下 温育步骤：94℃60秒钟，60℃30秒钟，以及72℃140秒钟。按照本 领域技术人员熟知的程序，通过在琼脂糖凝胶电泳上目视检测这些PCR 产物，鉴定PCR阳性样品。
对于pATC37003对照转基因植株，按照本领域技术人员熟知的程 度，应用引物1和7，借助于以Taq聚合酶的PCR，进一步对所需插入 物的存在进行了筛选。实施了40个PCR温育循环，包括如下温育步骤： 94℃40秒钟，60℃30秒钟，以及72℃140秒钟。按照本领域技术人 员熟知的程序，通过在琼脂糖凝胶电泳上目视检测这些PCR产物，鉴定 出PCR阳性样品。 引物7(SEQ.ID.No.7)
GAACTGGGAC CACTCCAGTG
在此二种情况下，都鉴定出含有适当构建物的转基因植株。
参考文献 Bechtold，N.，Ellis，J.，and Pelletier，G.(1993)通过渗入成熟 的拟南芥菜植株进行植物土壤杆菌介导的基因转移。C.R.Acad.Sci： Paris 316：1194-1199. Bevan，M.(1984)用于植物转化的二元土壤杆菌载体。核酸研究。 12：8711-8721。 Coen，E.S.and Meyerowitz，E.M.(1991)。防治毛轮虫：基因相互 作用控制花形成。自然353，31-37。 Conkling，M.A，Cheng，C-L，Yamamoto，Y.T.and Goodman，H.M. (1990)。从烟草中分离转录调节根特异性基因。植物生理学93，1203 -1211。 Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffmann，N.L，Eichholtz，D.， Rogers，S.G.and Fraley，R.T.(1985)。将基因转移进植物的简便的 一般方法。科学22，1229-1231。 Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.and Bevan，M.W.(1987)。GUS 融合：在高等植物中以葡糖苷酸酶作为灵敏、通用的基因融合标记。 EMBO，6，3901-3907 Opperman，C.H.，Taylor，C.G.and Conkling，M.A.(1994)。根癌 线虫定向的植物根特异性基因的表达。科学263，221-223。 Sambrook，J.，Fritsch，E.f.and Maniatis，T.(1989)分子克隆- 实验室手册。第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。 Thomas，C.(1996)植物基因分离中的“PCR技术”：原理和实践。 G.D.Foster&D.Twell editors.John Wiley&Sons Ltd.，pp 331-368。
序列表 (1)一般信息
(i)申请人：
(A)姓名： Advanced Technologies(Cambridge)Limited
(B)街道： Millbank，Knowle Green
(C)城市： Staines
(D)州： Middlesex
(E)国家： 英国
(F)邮编： TW18 IDY
(ii)发明名称： 基因表达特异性的提高
(iii)序列数： 6
(iv)通讯地址：
(A)地址： British-American Tobacco Company Limited
(B)街道： Regents Park Road
(C)城市： Southampton
(D)州： Hampshire
(E)国家： 英国
(F)邮编： SO158TL
(v)计算机可读形式：
(A)存储媒体类型： Diskette 3.50 inch
(B)计算机： Viglen P5/75
(C)操作系统： MS-DOS Windows 3.1
(D)软件： Microsoft Word 2.0
(vi)目前申请数据：
(A)申请号： 未知
(C)分类： 未知
(vii)在先申请数据：
(A)申请号： 9706381.2
(B)申请日： 27th March 1997
(viii)律师/代理人信息
(A)姓名： Mrs.M.R.Walford/Mr.K.J.H.MacLean
(C)委托书： RD-ATC-17
(ix)电讯信息：
(A)电话： 01703 777155
(B)电传： 01703 779856
(2)SEQ.ID.NO： 1信息
(i)序列特征：
(A)长度： 32
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(ix)特征：
(A)名称： Hind III限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO： 1： ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA 32
(2)SEQ.ID.NO：2信息
(i)序列特征：
(A)长度： 33
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(iv)反义： 是
(ix)特征：
(A)名称： Bam HI限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：2： ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC 33 (2)SEQ.ID.NO：3信息
(i)序列特征：
(A)长度： 32
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(ix)特征：
(A)名称： Bam HI限制位点
(B)定位： 5-10
(ix)特征：
(A)名称： 起始密码子
(B)定位： 11-13
(ix)特征：
(A)名称： 有意的碱基改变A变为G
(B)定位： 14
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：3： ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA 32 (2)SEQ.ID.NO：4信息
(i)序列特征：
(A)长度： 36
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成的引物
(iv)反义： 是
(ix)特征：
(A)名称： SacI限制位点
(B)定位： 5-10
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：4： ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA 36 (2)SEQ.ID.NO：5信息
(i)序列特征：
(A)长度： 2319
(B)类型： 核酸
(C)链型： 双链
(D)拓扑结构： 线性来源
质粒中为环形
(ii)分子类型： 质粒DNA
(vi)初始来源：
(A)生物体： 拟南芥菜
(B)品系： Landsberg
(ix)特征：
(A)名称/要点： 启动子 拟南芥agamous
(Genbank ATAGAMSG)
(B)定位： 26-441
(ix)特征：
(A)名称/要点： 编码序列-拟南芥apetala 3
(Genbank ATHPETALA)
(B)定位： 448-2013
(ix)特征：
(A)名称/要点： Nos终止子
(B)定位： 2020-2286
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：5：
GCGGCCGCGA TATCGTCGAC AAGCTTCTAA ATGTACTGAA AAGAAACACC AGTTTAATTA 60
ATTATACTTT CCTCACATAT AACTATCAAC CAAGTACAAA ACTTTTGTCA ATTCTCAAAA 120
TCAACTTTCA CCACATAATT ATCTAACATG TGTATGTTCC AAAACCAGTT TAAATGAATT 180
ACTTTTCAGA AAATACATGT ATATTAACTC TATCTAATAA AGAAGAAACA CATACTTATC 240
TCATAGATTC CATTCATAAA ACTATGCTTT AGTGAGTAAG AAAACCAGTA ATCAAACACA 300
AATTGACAAG ACACTATATG GATGTAAAAA GTGGGGAAAA TATGGTGATA AATAGTAGAG 360
AAAATTAAAA AGAAAAAATA ATATTCCTTT ATAAATGTAT ATACCCATCT CTTCACCAGC 420
ACAACCTTAC CTTCCATTTT CGGATCCATG GGCTCACGGT TTTGTGTGAT GCTAGGGTTT 480
CGATTATCAT GTTCTCTAGC TCCAACAAGC TTCATGAGTA TATCAGCCCT AACACCACGT 540
ACACCATCTC TCTAAACACC ACTCTTAAAT TAAGCTAATT GAGTTGCTTT GTTTTCTTAT 600
AATTAACCAC TACTTTTTTG GTGATTTTGT TGGTTATAGA ACGAAGGAGA TCGTAGATCT 660
GTACCAAACT ATTTCTGATG TCGATGTTTG GGCCACTCAA TATGAGGTTT TTTTCCTTCT 720
TAGATCTTTC TTCTTCTTCT TGATATGTGT TTCGCTGGTT GGTTAAATTC TTGATGCGTT 780
TTGCTGCAGC GAATGCAAGA AACCAAGAGG AAACTGTTGG AGACAAATAG AAATCTCCGG 840
ACTCAGATCA AGTATTTGTT TCTTCTCTCT TCTCTTAGAT GAGGAGTTTT ACTAAAAAAA 900
ATGAGTACGG AAATATACAT ATTTTTAAAA TTGTAGGCAG AGGCTAGGTG AGTGTTTGGA 960
CGAGCTTGAC ATTCAGGAGC TGCGTCGTCT TGAGGATGAA ATGGAAAACA CTTTCAAACT 1020
CGTTCGCGAG CGCAAGGTTC TCTTCATACT TTTCCCTTAC CTAGGGTTTC AATTAATCCT 1080
ATATACCCAA GCTTCAGTTT TGAATTGAAT TATTAAAAAA TGAATTTTAT TGTTGTATAT 1140
ATGTTTTAGA AAAAGAAACA TTTTGTTTAC TGTTGGATAA TATATGTTAA TTGTATTGTA 1200
CTGTACAGTT CAAATCTCTT GGGAATCAGA TCGAGACCAC CAAAGAAAAG GTCACATCTT 1260
CTATGTCCAC TCACTTTTCC ATTTTATCAT ATTTATTTGT CTCAACAATT TTGTGACAAT 1320
TGAATTTATC AACTTACTAA AACTGTTGAT AACACTTTTC TTGGACAATT ATATTTGTGT 1380
GTGTGTGTGT GTGTGTTTAA GCTAATGGAT AAAGAAAATA CCAAGTATAC TATATAGTGA 1440
TGTCATAATA ACTTGGGTAT ATATCTTCAT AATTTTTTTG GGTGGGAATA TTTCTTCATA 1500
ATTTCTCTTG TGGTTTACAC AATTGCAGAA CAAAAGTCAA CAGGACATAC AAAAGAATCT 1560
CATACATGAG CTGGTAATAT CTCTTTCTGT TTTTCTCAAA TGTTGGTTTA GGCATAATAC 1620
ATTCATGGAA TACGGAGCCA GTTAAAAAGA TATCTAGAAA TGTAGTGTAG ATTGATCAGT 1680
CACTCTTATG TTTTCTTGTG ATTCTCTTAT CGAAATATCT CCTAGTTAAA TCATATATCA 1740
AATGTCATGT CATTTCGAAT TAATAATATT GGTTTTAGTT ATGTGGAATA TGGCTTAAAA 1800
CATGTTTTGG TGAATTAGGA ACTAAGAGCT GAAGATCCTC ACTATGGACT AGTAGACAAT 1860
GGAGGAGATT ACGACTCAGT TCTTGGATAC CAAATCGAAG GGTCACGTCG TTACGCTCTT 1920
CGTTTCCACC AGAACCATCA CCACTATTAC CCCAACCATG GCCTTCATGC ACCCTCTGCC 1980
TCTGACATCA TTACCTTCCA TCTTCTTGAA TAAGAGCTCG AATTTCACCC GATCGTTCAA 2040
ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC CGGTCTTGCG ATGATTATCA 2100
TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA CATGTAATGC ATGACGTTAT 2160
TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA CATTTAATAC GCGATAGAAA 2220
ACAAAATTAT GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC GGTGTCATCT ATGTTACTAG 2280
ATCGGGAATT CTGTTTAAAC TCGAGACTAG TGCGGCCGC 2319 (2)SEQ.ID.NO：6信息
(i)序列特征：
(A)长度： 1559
(B)类型： 核酸
(C)链型： 双链
(D)拓扑结构： 线性来源
质粒中为环形
(ii)分子类型： 质粒DNA
(ix)特征：
(A)名称/要点： 启动子-拟南芥agamous
(Genbank ATAGAMSG)
(B)定立： 26-441
(ix)特征：
(A)名称/要点： 编码序列-绿色荧光蛋白
(B)定位： 443-1258
(ix)特征：
(A)名称/要点： Nos终止子
(B)定位： 1260-1526
(xi)序列描述： SEQ.ID.NO：6：
GCGGCCGCGA TATCGTCGAC AAGCTTCTAA ATGTACTGAA AAGAAACACC AGTTTAATTA 60
ATTATACTTT CCTCACATAT AACTATCAAC CAAGTACAAA ACTTTTGTCA ATTCTCAAAA 120
TCAACTTTCA CCACATAATT ATCTAACATG TGTATGTTCC AAAACCAGTT TAAATGAATT 180
ACTTTTCAGA AAATACATGT ATATTAACTC TATCTAATAA AGAAGAAACA CATACTTATC 240
TCATAGATTC CATTCATAAA ACTATGCTTT AGTGAGTAAG AAAACCAGTA ATCAAACACA 300
AATTGACAAG ACACTATATG GATGTAAAAA GTGGGGAAAA TATGGTGATA AATAGTAGAG 360
AAAATTAAAA AGAAAAAATA ATATTCCTTT ATAAATGTAT ATACCCATCT CTTCACCAGC 420
ACAACCTTAC CTTCCATTTT CGGATCCAAG GAGATATAAC AATGAAGACT AATCTTTTTC 480
TCTTTCTCAT CTTTTCACTT CTCCTATCAT TATCCTCGGC CGAATTCAGT AAAGGAGAAG 540
AACTTTTCAC TGGAGTTGTC CCAATTCTTG TTGAATTAGA TGGTGATGTT AATGGGCACA 600
AATTTTCTGT CAGTGGAGAG GGTGAAGGTG ATGCAACATA CGGAAAACTT ACCCTTAAAT 660
TTATTTGCAC TACTGGAAAA CTACCTGTTC CATGGCCAAC ACTTGTCACT ACTTTCTCTT 720
ATGGTGTTCA ATGCTTTTCA AGATACCCAG ATCATATGAA GCGGCACGAC TTCTTCAAGA 780
GCGCCATGCC TGAGGGATAC GTGCAGGAGA GGACCATCTT CTTCAAGGAC GACGGGAACT 840
ACAAGACACG TGCTGAAGTC AAGTTTGAGG GAGACACCCT CGTCAACAGG ATCGAGCTTA 900
AGGGAATCGA TTTCAAGGAG GACGGAAACA TCCTCGGCCA CAAGTTGGAA TACAACTACA 960
ACTCCCACAA CGTATACATC ATGGCCGACA AGCAAAAGAA CGGCATCAAA GCCAACTTCA 1020
AGACCCGCCA CAACATCGAA GACGGCGGCG TGCAACTAGC TGATCATTAT CAACAAAATA 1080
CTCCAATTGG CGATGGCCCT GTCCTTTTAC CAGACAACCA TTACCTGTCC ACACAATCTG 1140
CCCTTTCGAA AGATCCCAAC GAAAAGAGAG ACCACATGGT CCTTCTTGAG TTTGTAACAG 1200
CTGCTGGGAT TACACATGGC ATGGATGAAC TATACAAACA TGATGAGCTT TAAGAGCTCG 1260
AATTTCACCC GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA ATCCTGTTGC 1320
CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG TAATAATTAA 1380
CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTTTTTATG ATTAGAGTCC CGCAATTATA 1440
CATTTAATAC GCGATAGAAA ACAAAATTAT GCGCGCAAAC TAGGATAAAT TATCGCGCGC 1500
GGTGTCATCT ATGTTACTAG ATCGGGAATT CTGTTTAAAC TCGAGACTAG TGCGGCCGC 1559
(2)SEQ.ID.NO：7信息
(i)序列特征：
(A)长度： 20
(B)类型： 核酸
(C)链型： 单链
(D)拓扑结构： 线性
(ii)分子类型： 合成引物
(iii)初始来源：
(A)生物体： Aequorea victoria
(iv)反义： 是
(xi)序列描述：SEQ.ID.NO：7： GAACTGGGAC CACTCCAGTG 20
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