过氧化物酶基因线虫诱导型启动子和使用方法
阅读：2发布：2021-10-19
专利汇可以提供过氧化物酶基因线虫诱导型启动子和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了具有根特异性和/或由寄生 线虫 诱导的 植物 基因启动子和调节元件。本发明的启动子可用于控制目的核酸在植物根中的表达。，下面是过氧化物酶基因线虫诱导型启动子和使用方法专利的具体信息内容。
1.启动子，其包含能够介导根偏好性或线虫诱导型表达的分离的多 核苷酸，所述多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；
b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第 2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；
c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；
e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和
f)多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的 至少50个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷 酸的片段。
2.权利要求1的启动子，其中所述分离的多核苷酸具有如SEQ ID NO：1中所述的序列。
3.权利要求1的启动子，其中所述分离的多核苷酸包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第1604至 第2085位核苷酸。
4.权利要求1的启动子，其中所述分离的多核苷酸在严格条件下与 选自由以下多核苷酸组成的组中的多核苷酸杂交：具有如SEQ ID NO：1中 所述序列的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的第1677至第2027位核苷酸的 多核苷酸和包含SEQ ID NO：1的第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸。
5.权利要求1的启动子，其中所述分离的多核苷酸与选自由以下多 核苷酸组成的组中的多核苷酸有至少70％序列同一性：具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的第1677至第2027位 核苷酸的多核苷酸和包含SEQ ID NO：1的第1604至第2085位核苷酸的多 核苷酸。
6.表达盒，其包含权利要求1的启动子。
7.权利要求6的表达盒，其还包含与所述启动子有效连接的第二多 核苷酸。
8.权利要求7的表达盒，其中所述的第二多核苷酸对植物赋予选自 以下的性状或性质：产量、胁迫条件下增加的抗性、提高的营养品质、提 高的线虫抗性、植物的增加或改良的蛋白质或油含量。
9.权利要求7的表达盒，其中所述的第二多核苷酸编码一种物质， 该物质破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，赋予或改善植物对植物 寄生线虫的抗性或对植物寄生线虫有毒性。
10.用表达盒转化的转基因植物，其中所述表达盒包含能够介导根偏 好性或线虫诱导型表达的分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸选 自由以下多核苷酸组成的组：
a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；
b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第 2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；
c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；
e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和
f)多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸 的至少50个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核 苷酸的片段。
11.权利要求10的转基因植物，其中所述表达盒还包含与所述启动 子多核苷酸有效连接的第二多核苷酸。
12.权利要求10的植物，其中所述植物是单子叶植物。
13.权利要求10的植物，其中所述植物是双子叶植物。
14.权利要求10的植物，其中所述植物选自由以下植物组成的组： 玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰 子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、 番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷心菜、 花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿、多年生草、黑麦草 和拟南芥。
15.权利要求10的植物，其中所述启动子多核苷酸具有如SEQ ID NO：1中所述的序列。
16.权利要求10的植物，其中所述启动子多核苷酸包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第1604至 第2085位核苷酸。
17.权利要求10的植物，其中所述核酸与选自以下多核苷酸的启动 子多核苷酸有至少70％序列同一性：具有如SEQ ID NO：1中所述序列的 多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的第1677至第2027位核苷酸的多核苷酸和 包含SEQ ID NO：1的第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸。
18.权利要求10的植物，其中所述启动子多核苷酸在严格条件下与 选自由以下多核苷酸组成的组中的多核苷酸杂交：具有如SEQ ID NO：1中 所述序列的多核苷酸、包含SEQ ID NO：1的第1677至第2027位核苷酸的 多核苷酸和包含SEQ ID NO：1的第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸。
19.赋予或改善植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备构建体，该构 建体包含与一种或多种多核苷酸有效连接的权利要求1的启动子多核苷 酸，b)用a)的构建体转化植物细胞，其中在植物细胞中应答线虫的刺激， 所述启动子多核苷酸诱导有效连接的多核苷酸转录；和c)再生转化的植物 细胞以产生具有线虫抗性或具有改良的线虫抗性的转基因植物。
20.权利要求19的方法，其中所述有效连接的多核苷酸编码一种物 质，该物质破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，赋予或改善植物对 植物寄生线虫的抗性或对植物寄生线虫有毒性。
21.赋予或改善植物中线虫抗性的方法，其包括a)制备如权利要求7 中所述的表达盒，所述表达盒包含与具有权利要求1的多核苷酸序列的第 二多核苷酸序列为反义互补的第一多核苷酸，b)用a)的构建体转化植物细 胞，其中所述第一多核苷酸序列破坏或下调所述第二多核苷酸序列的调节 功能；并c)再生转化的植物细胞以产生具有线虫抗性或具有提高的线虫抗 性的转基因植物。
发明领域
本发明涉及调节基因转录的启动子和调节元件，其类似于具有鉴定标 志At5g05340的拟南芥(Arabidopsis thaliana)过氧化物酶(POX)基因的启 动子和调节元件。本发明的启动子可用于控制任一目的核酸在植物根中的 转录。尤其，本发明的启动子可以用来控制编码物质的核酸转录，其中所 述的物质破坏采食部位的形成或维持、破坏植物寄生线虫的生长和/或繁 殖，赋予或改善植物对植物寄生线虫的抗性或毒害植物寄生线虫以减少作 物破坏。
发明背景
线虫是以超过2,000种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及 茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线 虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。 以造成采食部位处根瘿形成为特征的根癌线虫具有相对广泛的宿主范围并 且因此对种类繁多的作物物种致病。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有 更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。
致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙壤 土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heterodera glycines) 在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线 虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。 尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生总计约50种宿 主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。
线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而， 线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产 量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线 虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性 植物病原体侵袭。
线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在 线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30 日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当 温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出 来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。
SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命 周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维 管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调 节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态 学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体 被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取重要的营养物， 导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至 于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。
在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土 壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍与根系 统附着并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块 或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体 腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞 囊。胞囊逐渐释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞 囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直 至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在头一年中孵化，然而很多卵 也会在保护性胞囊内存活几年。
线虫可以依赖其自身力量在土壤中每年穿行仅几英寸。然而，线虫侵 染可以在多种方式下传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物， 包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，能够传播这种侵 染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地 的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。存在某些线虫可 以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些病因中的某些病因。
防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤 养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消 毒措施，如仅在处理线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田 地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染 田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁； 轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种 抗性植物品种。
已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予增加的植物寄生线虫抗性。 美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在植物采食部位内或其 附近特异性表达的植物基因的鉴定。美国专利号5,589,622和5,824,876披 露了从马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)感染的马铃薯根分离的8种 启动子；没有披露来自其他植物物种的线虫诱导型启动子。据称这些启动 子可用于指导有毒蛋白或酶特异性表达或指导针对靶基因或针对一般细胞 基因的反义RNA的表达。
美国专利号5,023,179披露命名为ASF-1的分离自CaMV启动子的 启动子增强元件，据称其增强植物基因在根中的表达。
美国专利号5,750,386披露烟草(Nicotiana tabacum)RB7根特异性启 动子的缺失片段，据称其具有线虫应答性。
美国专利号5,837,876披露从烟草分离并命名为TobRD2的根皮层特 异性基因启动子。
美国专利号5,866,777披露了推迟线虫采食结构形成的双基因方法。 第一个基因-芽孢杆菌RNA酶基因处于驱动至少在采食结构中表达的启动 子控制下。第二个基因-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因处于驱动在除所述采 食结构之外的全部植物细胞中表达的启动子控制下。美国专利号5,866,777 中披露的采食部位特异性启动子包括截短形式的Δ0.3TobRB7和rolC启 动子。
美国专利号5,955,646披露了基于源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章鱼碱合酶基因的启动子的嵌合调节区， 据称其具有线虫诱导性。
美国专利号6,005,092披露了烟草内切-1，4-β-葡聚糖酶(Ntce17)启动 子。
美国专利号6,262,344和6,395,963披露了从拟南芥分离的启动子，据 称其具有线虫诱导性。
美国专利号6,448,471披露了来自拟南芥的启动子，其对线虫采食部 位是特异性的。
美国专利号6,703,541披露了玉米过氧化物酶P7×基因及其启动子 的克隆与分离，所述启动子据称是线虫诱导型的。
美国专利号6,593,513披露了用拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cel1) 启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶转化植物以产生能够破坏线虫侵袭的植 物。
美国专利号6,906,241披露了与编码杀线虫或杀昆虫蛋白质的异源核 酸组合的Ntce17启动子。
美国专利号7,078,589披露大豆Pyk20基因和启动子的克隆与分离， 所述启动子据称将受SCN感染诱导并在维管组织中显示强烈活性。
美国专利申请公开号2003/0167507披露了大豆异黄酮合酶I启动子， 据称其是根特异性的并且在寄生虫侵袭的营养组织中可诱导。
美国专利申请公开号2004/0078841披露拟南芥TUB-1、RPL16A及 ARSK1启动子和来自豌豆(Pisum sativum)的PSMTA启动子的启动子 区，所述全部启动子区据称是根特异性的。
美国专利申请公开号2004/0029167披露了来自烟草的II类咖啡酸O- 甲基转移酶基因的启动子序列，据称所述启动子序列可应答于机械性或化 学性损伤或应答于致病体入侵而诱导。
美国专利申请公开号2005/0262585披露了大豆磷酸核糖甲酰甘氨脒 核糖核苷酸合酶的启动子及其缺失片段，据称它们应答于线虫感染。
WO 94/10320披露了来自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段及其与多 种基因一起用于线虫采食细胞特异性表达。
WO 03/033651披露了命名为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调 节型启动子序列。
WO 2004/029222及其美国同族专利-美国专利申请公开号 2005/0070697披露了来自大豆腺苷-5′-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的 调节区，用于提高植物中的线虫抗性。
上文提及的根特异性或采食部位特异性启动子目前均未用在含有抗线 虫转基因的商品种子中。虽然对这类产品的需求久已承认，然而迄今无人 成功通过重组DNA技术开发抗线虫植物。持续需求根特异性和/或线虫采 食部位特异性启动子以与编码毒害植物寄生线虫物质的转基因组合。
发明简述
本发明提供适用于驱动第二多核苷酸在易感于线虫侵袭的植物根中表 达的启动子多核苷酸。本发明的启动子多核苷酸特别用于产生抵抗线虫侵 染的农业作物植物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够介导根 偏好性或病原体诱导性表达的分离启动子核苷酸的启动子，其中所述的分 离启动子核苷酸选自由以下组成的组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列 的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第 1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与 a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；d)在严格条件 下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生 物活性部分的多核苷酸；和f)多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中 所述序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸， 或至少200个连续核苷酸的片段。
在另一个实施方案中，本发明提供通过使用本领域技术人员已知的方 法(如反义序列或RNAi序列)破坏本发明启动子核苷酸的功能而下调对于 线虫采食部位、合胞体或巨细胞的发育与维持为必需的基因的方法。
本发明也涉及包含本发明启动子核苷酸的表达盒和转基因植物，并涉 及控制作物中寄生线虫侵染的方法，其中所述方法使用了重组核酸构建体， 其包含与编码物质的核酸有效连接的本发明启动子核苷酸，其中所述物质 破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，所述构建体赋予或改善植物的 植物寄生线虫抗性或毒害植物寄生线虫以减少植物破坏。
附图简述
图1：拟南芥基因座At5g05340的POX启动子区(SEQ ID NO：1)的核 酸序列，其中TATA盒核苷酸1995-2001为粗体。
图2：大豆(Glycine max)cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：2)的核酸 序列。ORF的ATG起始密码子以粗体显示。以下划线显示的TAA终止 密码子是cDNA序列中符合可读框的ATG的5′，说明该cDNA序列是全 长的。ORF的TAA终止密码子以斜体显示。
图3：大豆cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：3)编码的氨基酸序列， 其中“＊”表示终止密码子。
图4：POX样大豆cDNA克隆59712764的微阵列数据。符号“”指 cDNA微阵列测量值的数目。“对照根”意指从与SCN接种区段相同日龄 的非感染根区段中衍生的完整根组织aRNA。“非合胞体”意指从毗邻感染 区域的SCN感染根中衍生的完整根组织aRNA(扩增的RNA)。该样品 不应当含有SCN或采食部位，而是从SCN感染的根收获。基因表达的相 对水平表述为如实施例1中所述的归一化信号强度(±标准差)。
图5：由At5g05340编码的拟南芥POX基因的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，其中“＊”表示终止密码子。
图6：大豆cDNA克隆59712764编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3) 与拟南芥At5g05340氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。
图6：大豆cDNA克隆59712764编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3) 与拟南芥At5g05340氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。
图7：双元载体pAW283在实施例4内所述的大豆毛根测定法中的β- 葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的毛根和非感染对照毛根 在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”，无GUS染色；“+”， GUS弱染色；“++”，GUS强染色。
图8：双元载体pAW283、RAW448和RAW437在实施例7内的所述 大豆毛根测定法中的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的 毛根和非感染对照毛根在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”， 无GUS染色；“+”，GUS弱染色；“++”，GUS强染色。
图9：用来获得SEQ ID NO：1的启动子的PCR引物。
优选实施方案的详述
本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及其中所包 含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领 域技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物 学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics： classical and molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Current protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编者，Current Protocols， Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley&Sons，Inc.(1998附录) 中找到。
应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)” 可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“一种细胞” 的称谓可以可以意指可以使用至少一种细胞。应当理解本发明不限于具体 核酸、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等，因为这些 当然可以变化，并且其中的众多修改与变化对于本领域技术人员是显而易 见的。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案并且不意 图是限制性的。
在本申请通篇范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及这些出 版物中引用的那些参考文献的公开内容通过引用方式完整地并入本申请， 旨在更充分地描述本发明涉及的本领域状态。用于克隆、DNA分离、扩增 及纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶反应的 标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员已知并且通常使用的那些技 术。众多标准技术在Sambrook和Russell，2001 Molecular Cloning，第三 版，Cold Spring Harbor，Plain view，New York；Sambrook等，1989 Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview， New York；Maniatis等，1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(编辑)1993 Meth.Enzymol.218，第 I部分；Wu(编辑)1979 Meth Enzymol.68；Wu等，(编辑)1983 Meth. Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编辑)1980 Meth.Enzymol.65； Miller(编辑)1972 Experiments in MolecuIar Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose， 1981 Principles of Gene Manipulation，University of California Press， Berkeley；Schleif和Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover(编辑)1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford， UK；Hames和Higgins(编辑)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press， Oxford，UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering： Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York中描述。
可以提供从其天然环境分离和/或纯化的本发明启动子核苷酸，它们处 于基本上纯的或均匀的形式，或者不含或基本上不含所述物种来源的其他 核酸。如本文中所用的“分离”核酸在通过重组技术产生时也基本上(在分离 时)不含其他细胞材料或培养基，或在化学地合成时基本上不含化学前体。 本发明的启动子核苷酸是多核苷酸。当在本文中使用时，术语“分离的” 包括全部这些可能。
术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右或处于......范围。术语 “约”与数字范围一起使用时，它通过扩张边界高于和低于所述数值而修饰 该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值，即 在该数值之上或之下(较高或较低)达10％的偏差。
如本文中所用的术语“启动子”或启动子多核苷酸指与目的核苷酸序列 连接时能够控制该目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一 般(尽管不必要)位于目的核苷酸的5′(例如上游)(例如接近结构基因的转录 起始位点)，所述目的核苷酸向mRNA转录的受所述启动子的控制，并为 用于启动转录的RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合位点。“组成 型启动子”指这样的启动子，它能够在植物整个或几乎整个发育期期间于全 部或几乎全部植物组织中表达该启动子控制的可读框或调节元件。“调节型 启动子”指不以组成型方式而以时间和/或空间方式指导基因表达的启动 子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同启动子可以指导基 因或调节元件在不同组织或细胞类型中或在不同发育期或在应答于不同环 境条件下表达。“组织特异性启动子”指不在全部植物细胞中表达而仅在特 定器官(如根或种子)、特定组织(如胚或子叶)内的一个或多个细胞类型或特 定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。“诱导 型启动子”指可以在一个或多个细胞类型中通过外部刺激如化学、光、激素、 胁迫或病原体开启的那些调节型启动子。
根据本发明，本发明的启动子多核苷酸可以与第二多核苷酸有效连接， 用于所述第二多核苷酸在植物中的根特异性和/或病原体诱导性表达以改 变该植物的表型。优选地，所述病原体是线虫。如本文中所用，术语“处于 有效连接”、“有效连接的”和“与......连接”是可互换的并且意指启动子多核 苷酸与第二多核苷酸在单个核酸片段上以如此方式功能性连接，使得所述 第二多核苷酸的转录由该启动子多核苷酸启动并介导。通常，处于有效连 接的多核苷酸是连续的。
任一的第二多核苷酸可以与本发明的启动子多核苷酸有效连接以实现 第二多核苷酸的根特异性或病原体诱导性表达。第二多核苷酸包括例如可 读框、可读框的部分、编码融合蛋白的多核苷酸、反义多核苷酸、编码双 链RNA构建体的多核苷酸、转基因等。此第二多核苷酸可以编码昆虫抗 性基因、抗细菌病基因、抗真菌病基因、抗病毒病基因、抗线虫病基因、 抗除草剂基因、影响籽粒组成或品质的基因、养分利用基因、霉菌毒素降 低基因、雄性不育基因、选择标记基因、筛选标记基因、负选择标记基因、 正选择标记基因、影响植物农学特征(如产量)的基因、环境胁迫抗性基因 (例如赋予对干旱、热、寒冷、冰冻、过度潮湿、盐胁迫或氧化胁迫抗性或 耐受性的基因)、改善淀粉特性或品质、油数量和质量、氨基酸或蛋白质组 成等的基因。
优选地，所述第二多核苷酸编码双链RNA(dsRNA)或反义多核苷酸， 其与形成或维持线虫采食部位所需的完整或部分植物基因基本上同一或同 源。所述第二多核苷酸可以备选地编码破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、 赋予或改善针对植物寄生线虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫以减少作物 破坏的物质。根据本发明，可以使用编码如此物质的任一多核苷酸，其中 所述的物质破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、赋予或改善针对植物寄生线 虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫。例如，所述第二多核苷酸可以编码与 植物寄生线虫的靶基因基本上同一的双链RNA，其中所述的靶基因对该线 虫代谢、存活、变态或繁殖是必需的。所述第二多核苷酸可以编码双链 RNA，其与植物根的采食部位中对该线虫存活必需的植物靶基因本上同 一。如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶， 术语“基本上同一”和“对应于”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基 因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％同一，更优选地，与靶基 因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％同一并且最优选与靶基因的 20个或更多个连续核苷酸至少约95-99％同一或完全同一。示例性植物寄 生线虫靶基因例如在通过引用方式并入本文的共同待决的美国专利申请号 2005/188438中描述。
或者，对于线虫控制，与本发明的启动子多核苷酸有效连接的第二多 核苷酸可以编码线虫毒性蛋白。例如，编码微生物毒素或其片段、来自昆 虫的毒素或其片段(例如在美国专利号5,457,178；5,695,954；5,763,568； 5,959,182等中所述的那些毒素或其片段)的核酸可用于本发明的这个实施 方案中。
作物植物和相应的致病线虫在《美国植物疾病索引》(美国农业部手册 第165号，1960)；《北美洲植物寄生线虫物种分布》(线虫学家学会，1985)和 《美国植物及植物产品上的真菌》(美国植物病理学会，1989)中列出。例 如，本发明所针对的植物寄生线虫包括而不限于，胞囊线虫和根癌线虫。 本发明所靶向的具体植物寄生线虫包括而不限于大豆异皮线虫、甜菜异皮 线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮 线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮 线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线 虫(G.rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线 虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M. hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结 线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫 (Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫 (Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖 啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲短体线虫 (Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘 旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodorus christiei、麦粒鳗线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫 (Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比 亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫 (Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、水平对刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫 (Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃 线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫 (Xiphinema americanum)、瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)等。
在一个实施方案中，目标线虫属于诱导采食细胞、巨细胞或合胞体细 胞的线虫科。诱导采食细胞、巨细胞或合胞体细胞的线虫科是长针线虫科 (Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heterodidae)、 根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃线虫 科(Tylenchulidae)。优选地，它们属于异皮线虫科或根结线虫科。
因此，在另一个实施方案中，目标线虫属于选自由仙人掌胞囊线虫属 (Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球异皮线虫属(Globodera)、 异皮线虫属(Heterodera)、Punctodera、长针线虫线虫属(Longidorus)或根 结线虫属(Meloidogyne)组成的组中的一个或多个属。在优选的实施方案 中，目标线虫属于选自由仙人掌胞囊线虫属、长形胞囊线虫属、球异皮线 虫属、异皮线虫属、Punctodera或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。 在更优选的实施方案中，目标线虫属于选自由球异皮线虫属、异皮线虫属 或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在甚至更优选的实施方案，目 的线虫属于选自由球异皮线虫属或异皮线虫属组成的组中的一个或两个 属。在另一个实施方案中，目标线虫属于根结线虫属。
球异皮线虫属和异皮线虫属是异皮线虫科中优选的属。因此，在一个 实施方案中，目标线虫属于选自由蕃草属球异皮线虫(Globodera achilleae)、蒿球异皮线虫(Globodera artemisiae)、Globodera hypolysi、 Globodera mexicana、Globodera millefolii、苹果球异皮线虫(Globodera mali)、马铃薯白线虫、马铃薯金线虫、烟草异皮线虫和Globodera virginiae 组成的组中的一个或多个物种。在优选的实施方案中，目标线虫属于以下 物种至少之一：马铃薯白线虫、烟草异皮线虫(Globodera tabaccum)或马 铃薯金线虫。因此，在一个实施方案中，目标线虫属于选自由燕麦异皮线 虫(Hederodera avenae)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、鹰嘴豆异 皮线虫(Heterodera ciceri)、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、 Heterodera delvii、褐藻异皮线虫(Heterodera elachista)、菲力普异皮线虫 (Heterodera filipjevi)、Heterodera gambiensis、大豆异皮线虫、豌豆异皮 线虫(Heterodera goettingiana)、荞麦异皮线虫(Heterodera graduni)、蛇麻 异皮线虫(Heterodera humuli)、大麦异皮线虫(Heterodera hordecalis)、小 麦异皮线虫(Heterodera latipons)、燕麦异皮线虫(Heterodera major)、苜蓿 异皮线虫(Heterodera medicaginis)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzicola)、 巴基斯坦异皮线虫(Heterodera pakistanensis)、酸模异皮线虫(Heterodera rosii)、甘蔗异皮线虫(Heterodera sacchari)、甜菜异皮线虫、高粱异皮线虫 (Heterodera sorghi)、车轴草异皮线虫、荨麻异皮线虫(Heterodera urticae)、 豇豆异皮线虫(Heterodera vigni)和玉米异皮线虫(Heterodera zeae)组成的 组中的一个或多个物种。在优选的实施方案中，目标线虫属于属于以下物 种至少之一：大豆异皮线虫、燕麦异皮线虫、木豆异皮线虫、豌豆异皮线 虫、车轴草异皮线虫、玉米异皮线虫或甜菜异皮线虫。在更优选的实施方 案中，目标线虫属于大豆异皮线虫或甜菜异皮线虫或属于这两个物种。在 最优选的实施方案，目的线虫属于大豆异皮线虫。
根结线虫属是根结科中的优选属。因此，在一个实施方案中，目标线 虫属于选自由高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、Meloidogyne arabica、 花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)、短尾根结线虫(Meloidogyne brevicauda)、山茶根结线虫 (Meloidogyne camelliae)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖 啡根结线虫(Meloidogyne cofeicola)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、 禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫、印度根结线虫(Meloidogyne indica)、海滨根结线 虫(Meloidogyne inornata)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、林氏根 结线虫(Meloidogyne lini)、苹果根结线虫(Meloidogyne mali)、小头根结线 虫(Meloidogyne microcephala)、小突根结线虫(Meloidogyne microtyla)、 纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、萨拉斯根结线虫(Meloidogyne salasi) 和泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)组成的组中的一个或多个物种。 在优选的实施方案中，目标线虫属于以下物种至少之一：爪哇根结线虫、 南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或哥伦比亚根结线虫。
可以由含有本发明启动子的核酸构建体保护的植物包括而不限于选自 由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属 (Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属 (Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属 (Fragaria)、拟南芥属、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属 (Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、 豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦 属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大 豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、 向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属 (Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴 草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚 麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡芦巴属(Daucus)、 萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、 天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、 Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天 门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、 天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属 (Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属 (Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组 中的属。
所述启动子多核苷酸的一些衍生物和变体优选地用在特定的植物进化 枝、科、属或植物种中。可以从一个植物物种中分离的所述启动子多核苷 酸的衍生物和变体优选地用在这样的植物中，其中所述的植物与用于分离 所述启动子多核苷酸的衍生物和变体的植物属于相同的进化枝、科、属或 种。因此，在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物，优选是禾本科 (Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae) 植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本 科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、 高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、稷属、蟋蟀草属 (Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca) 或黑麦草属植物。因此，在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍属，优选地 是玉米(Zea mays)。因此，在一个实施方案中，植物是小麦属，优选地是 普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticum speltae)或圆柱小麦 (Triticum durum)。因此，在一个实施方案中，植物是稻属，优选地是稻 (Oryza sativa)。因此，在一个实施方案中，植物是大麦属植物，优选地是 大麦(Hordeum vulgare)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦属植物， 优选地是黑麦(Secale cereale)。因此，在一个实施方案中，植物是燕麦属植 物，优选地是燕麦(Avena sativa)。因此，在一个实施方案中，植物是甘蔗 属植物，优选地是甘蔗(Saccharum officinarum)。因此，在一个实施方案 中，植物是高粱属植物，优选地是高粱(Sorghum vulgare)、两色蜀黍(Sor- ghum bicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。因此，在一个实施方案中， 植物是狼尾草属植物，优选地是御谷(Pennisetum glaucum)。因此，在 一个实施方案中，植物是狗尾草属植物，优选地是谷子(Setaria italica)。因 此，在一个实施方案中，植物是稷属植物，优选地是野生稷(Panieum miliaceum)或柳枝稷(Panieum virgatum)。因此，在一个实施方案中，植物 是蟋蟀草属植物，优选地是穇子(Eleusine coracana)。因此，在一个实施方 案中，植物是芒属植物，优选地是芒(Miscanthus sinensis)。因此，在一个 实施方案中，植物是短柄草属植物，优选地是短柄草(Brachypodium distachyon)。因此，在一个实施方案中，植物是羊茅属植物，优选是苇状 羊茅(Festuca arundinaria)、紫羊茅(Festuca rubra)或牛尾草(Festuca pratensis)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦草属植物，优选地是黑 麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum)。因此，在一个 实施方案中，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。
因此在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物，优选地是豆科 (Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科 (Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科 (Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科 (Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科 (Sterculiaceae)或芸香科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆 科、茄科或十字花科植物。因此，在一个实施方案中，所述植物是豆科， 优选属大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属 (Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵 豆属(Lens)。豆科的优选物种是大豆、豌豆、落花生(Arachis hypogea)、鹰 嘴豆(Cicer arietinum)、蚕豆(Vicia faba)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、白羽 扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、苜蓿(Medicago sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是大 豆。因此，在一个实施方案中，所述植物是茄科植物、优选属于茄属、番 茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(Solanum tuberosum)、 番茄(Lycopersion esculentum)、烟草(Nicotiana tabaccum)或黄灯笼辣椒 (Capsicum chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所 述植物是十字花科植物，优选是拟南芥属、芸苔属或萝卜属植物。十字花 科的优选物种是拟南芥、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芥菜(Brassica juncea)或芜青(Brassica rapa)。更优选欧洲油菜。 因此，在一个实施方案中，所述植物是藜科植物，优选是甜菜属植物。甜 菜属的优选物种是甜菜(Beta vulgaris)。因此，在一个实施方案中，所述植 物是菊科植物，优选是向日葵属或万寿菊属(Tagetes)植物。向日葵属的优 选物种是向日葵(Helianthus annuus)。万寿菊属的优选物种是万寿菊 (Tagetes erecta)。因此，在一个实施方案中，所述植物是锦葵科植物，优 选是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)植物。棉属的优选物种是陆 地棉(Gossypium hirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。更优选陆地 棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(Abeimoschus esculentus)。因此，在一 个实施方案中，所述植物是亚麻科植物，优选是亚麻属植物。亚麻属的优 选物种是亚麻(Linum usitatissimum)。因此，在一个实施方案中，所述植 物是大戟科植物，优选木薯属、麻风树属(Jatropa)、蓖麻属(Rhizinus)或番 薯属(lpomea)植物。木薯属的优选物种是木薯(Manihot esculenta)。麻风树 属的优选物种是麻风树(Jatropa curca)。蓖麻属(Rhizinus)的优选物种是蓖 麻(Ricinus communis)。番薯属的优选物种是甘薯(lpomea batatas)。因此， 在一个实施方案中，所述植物是蔷薇科植物，优选是蔷薇属、苹果属、梨 属、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium) 或草莓属植物。草莓属的优选物种是草莓(Fragaria×ananassa)。因此，在 一个实施方案中，所述植物是葫芦科植物，优选是甜瓜属、西瓜属(Citrullus) 或南瓜属(Cucurbita)植物。甜瓜属的优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)。 西瓜属的优选物种是西瓜(Citrullus lanatus)。南瓜属的优选物种是西葫芦 (Cucurbita pepo)。因此，在一个实施方案中，所述植物是山茶科植物，优 选是山茶属植物。山茶属的优选物种是山茶(Camellia sinensis)。因此，在 一个实施方案中，所述植物是茜草科植物，优选是咖啡属(Coffea)植物。咖 啡属的优选物种是小果咖啡(Coffea arabica)或中果咖啡(Coffea canephora) 植物。因此，在一个实施方案中，所述植物是梧桐科(Sterculiaceae)植物， 优选是可可属(Theobroma)植物。可可属的优选物种是可可树(Theobroma cacao)。因此，在一个实施方案中，所述植物是柑桔属植物，优选是密植 或种植园中栽种的柑桔属物种和杂交品种，如甜橙(Citrus sinensis)、柠檬 (Citrus limon)、桔(Citrus reticulata)、柚(Citrus maxima)等。
拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)代表拟南芥At5g05340基因的启动子 区。本发明的大豆cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：2)如实施例1中所 披露从大豆RNA分离并且在氨基酸水平上显示与At5g05340所编码蛋白 质的显著性可比对。如实施例3中所示，当所述拟南芥启动子与GUS报 道基因有效连接时，GUS基因表达在线虫感染的大豆毛根中被上调。
本发明因此体现在这样的启动子中，其包含具有如SEQ ID NO：1中所 述序列的启动子多核苷酸，或从具有如SEQ ID NO：1中所述序列的分离核 酸中衍生的最小启动子多核苷酸片段，其中所述的启动子多核苷酸或最小 启动子多核苷酸片段能够介导第二多核苷酸的根特异性或线虫诱导性表 达。本文中披露的方法可以用来分离SEQ ID NO：1中额外最小启动子多核 苷酸片段，其能够介导第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导性表达。
或者，本发明的启动子多核苷酸包含在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸杂交的分离多核苷酸，或从具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸中衍生的最小启动子多核苷酸片段。如本文中 所用的严格杂交条件是熟知的，包括例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时；随后在0.1％SDS，0.1％ SSC中于大约65℃洗涤约15-60分钟。本发明也体现在这样的分离多核 苷酸中，所述的分离多核苷酸在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1中所述 序列的第1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷 酸杂交，其中所述的启动子多核苷酸在植物根中受植物寄生线虫诱导。本 发明的启动子多核苷酸还包含这样的分离多核苷酸，所述的分离多核苷酸 与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的核酸至少50-60％或至少60-70％或 至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％，或至少95％、96％、97％、98％、 99％或更多同一或相似。序列比较的长度对于多核苷酸而言是至少50个连 续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸，直至该序列 的整个长度。
术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸序列或多肽序列环境下 指这两个序列中的这些位置，其中当所述序列在指定比较窗口范围(例如全 局比对中的整个序列或在局部比对中的相似性区域)内为最大对应进行比 对时，相同的符号对归集在一起。当序列同一性百分数用来指多肽时，可 认识到的是不同一的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基 酸残基被替换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基 并且因此没有改变分子的功能属性。当序列因保守性置换而不同时，序列 同一性百分数可以向上调整以针对所述置换的保守性本质进行修正。将因 此类保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进 行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。一般，这种方法包括将保守 性置换判定为部分匹配而非错配，因而增加序列相似性的百分数。
如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过 如此方式确定的值，即首先在全局或局部比较窗口中的两个最佳比对序列 中在每个组成位置处注明相同的核酸碱基或氨基酸残基是否在这两个序列 中出现，若出现，指定为匹配，或若不出现，则指定为不匹配。由于所述 比对通过优化匹配碱基数目而建立，与此同时允许在任一位置处的错配以 及允许引入任一大小的空位或空白区域，如此提高所述比对的显著性及质 量，因而这种计算确定了匹配条件存在的位置总数，并且随后将这个数字 除以比较窗口内的位置总数，并且最后将结果乘以100以产生序列同一性 百分数。可以使用相同原理对蛋白质序列计算“序列相似性百分数”，其中 将保守性置换计算为部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在给予相 同氨基酸评分1并且给予非保守性置换评分0的情况下，给予保守性置换 0-1之间的评分。对保守性置换的评分可以从本领域已知的氨基酸矩阵例如 Blosum或PAM矩阵中获得。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以使用数学算法实现两 个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对于蛋白质)的确定。此类数学 算法的优选、非限制性实例是Myers和Miller算法(Bioinformatics， 4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.， 48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.， 147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)： 2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.， 215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。可以使用这些数学算法 的计算机实现以比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。
本发明还体现了本发明启动子多核苷酸的“变体”或“衍生物”。具体启 动子多核苷酸序列的衍生物及其具体要素可以包括，但不限于，序列缺失、 单个或多个点突变、在特定限制性酶位点处的改变、添加功能性元件或其 他分子修饰方法。这种修饰可以或不会增强或改变所述序列的转录调节活 性。
例如，本领域技术人员可以定义序列内的功能性元件或生物活性部分 并删除任何非必需元件。可以修饰或组合功能性元件或生物活性部分，旨 在为任何具体应用增加本发明序列的效用或表达。也可以通过移去或缺失 非必需序列，但不缺失必需序列而获得本发明启动子多核苷酸的功能等同 片段。所述启动子多核苷酸序列缩小至必需的转录介导元件可以在体外通 过试错缺失突变或在计算机上利用启动子元件搜索途径实现。对启动子活 性必需的区域常常显示为成簇的某些已知启动子元件。此类分析可以使用 可获得的计算机算法如PLACE(″植物顺式作用调节性DNA元件″；Higo 1999)、BIOBASE数据库″Transfac″(Biologische Datenbanken GmbH， Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PIantCARE(Lescot 2002)进行。 尤其优选转录调节性核苷酸序列的等同片段，所述等同片段通过缺失编码 mRNA的5′-非翻译区的区域而获得，因此，仅提供(非转录的)启动子区。 所述的5′-非翻译区可以通过本领域已知的方法(如5′-RACE分析)轻易确 定。因此，本发明转录调节性核苷酸序列中的某些序列是其他序列的等同 片段。如本文中所用，术语“最小启动子”指启动子多核苷酸中能够介导第 二核酸的根特异性和/或线虫诱导性表达的生物活性部分。本发明具体的最 小启动子多核苷酸片段包括，而不限于包含如SEQ ID NO：1中所述序列的 第1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸，或 包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸， 或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。
如上所述，也可能随机制备并随后分析本发明启动子多核苷酸的缺失 突变体。采用这种策略，制备了一系列构建体，每种构建体含有所述克隆 的不同部分(亚克隆)，并且随后筛选这些构建体的活性。筛选活性的适用 方法是将含有缺失片段的缺失启动子构建体与选择标记或可筛选标记连接 并且分离表达标记基因的那些细胞。以这种方式，鉴定到众多不同的缺失 启动子构建体，它们仍保持想要的或甚至更强的活性。因而，通过比较所 选的构建体而鉴定到对活性所需要的最小区段。这种区段随后可以用于构 建表达外源基因的载体。
用于在编码任一启动子序列的DNA区段中诱变或产生缺失的方法是 本领域技术人员熟知的并且在例如通过引用方式完整并入本文的US 6,583,338中披露。调节性序列变体的一个实例是通过从较大启动子中的一 个缺失或多个缺失所形成的启动子。有时候可以缺失启动子的5′部分直至 接近转录起始位点附近的TATA盒而不消除启动子活性，如Zhu等(1995) The Plant Cell 7：1681-1689描述。除去部分DNA序列的例行方法是使用核 酸外切酶与DNA扩增的组合以产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于 此目的的商业试剂盒以商标名Exo-Size.TM.(New England Biolabs， Beverly，Mass.)出售。生物活性变体也包括例如具有一个或多个核苷酸置 换、缺失或插入的本发明天然启动子序列。
衍生物和变体也包括来自其他物种(如但不限于细菌、真菌和植物)的 同源物、旁系同源物和直向同源物。“同源物”是本领域中用来表示与参考 序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的遗传学术语。这种相关 性可以如前所述通过确定两个序列之间同一性和/或相似性的程度进行量 化。属于这个遗传学术语的是术语“直向同源物”和“旁系同源物”。“旁系同 源物”指在相同物种内功能上相似的多核苷酸或多肽。“直向同源物”指作为 另一个物种中与所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同 源基因优选地意指编码直向同源蛋白质的基因。更具体地，术语“直向同源 物”指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，其是来自不同物种的多肽或蛋白 质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
实施方案之一包括能够介导根偏好性和/或线虫诱导性表达的启动子 多核苷酸的等位变体，其中所述的启动子多核苷酸选自由以下多核苷酸组 成的组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；b)包含具有如 SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第 1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少 70％序列同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交 的多核苷酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和h) 多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50 个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片 段。如本文中所用，术语“等位变体”指这样的启动子多核苷酸，其含有导 致所述多核苷酸中核苷酸变化的多态性并且该多态性存在于天然群体中 (例如植物物种或变种)。术语“等位变体”还指这样的多核苷酸，其含有导 致由所述核苷酸编码的蛋白质中氨基酸变化的多态性并且该多态性存在于 天然群体中。此类天然等位变异一般可以导致多核苷酸中的1-5％差异或所 编码蛋白质中的1-5％差异。等位变体可以通过对众多不同植物中的目的核 酸测序而鉴定，这可以轻易地通过使用例如杂交探针来鉴定那些植物中的 相同基因遗传基因座而实施。多核苷酸中任一及全部此类核酸变异是天然 等位变异的结果，并且那些不改变所述多核苷酸的功能性活性的等位变异 将属于本发明的范围。
本发明还体现在包含本发明启动子多核苷酸的表达盒中。“表达盒”在 这里应当广义地理解为包括表达盒中所含可以影响目的多核苷酸转录及根 据需要影响其翻译的全部序列。除了本发明的启动子多核苷酸之外，本发 明的表达盒还可以包含改善启动子多核苷酸功能的调节元件、允许在原核 和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件和(在3′方向上)下游调节元件 如转录终止序列和多聚腺苷酸化序列。本发明表达盒的多种成分依次并有 效地连接在一起。
因此，本发明的表达盒可以包含能够介导根偏好性和/或线虫诱导性表 达的启动子多核苷酸，所述的启动子多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的 组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第1604至 第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列 同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷 酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和f)多核苷 酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50个连续 核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片段。在 另一个实施方案中，所述启动子在植物寄生线虫感染的植物的根中受到诱 导。植物寄生线虫感染一般导致线虫刺激。本发明的启动子多核苷酸诱导 植物细胞中有效连接的多核苷酸在应答线虫刺激时的转录，术语“根偏好性 表达”就本发明的启动子多核苷酸而言意指在根组织中，尤其在根维管组织 中表达。
可以任选地在本发明表达盒中包括的具体遗传元件包括而不限于允许 在细菌中复制的复制起点，例如来自pBR322或P15A ori的ORI区；或 农杆菌T-DNA转移所需要的元件例如，T-DNA的左边界和/或右边界。本 发明表达盒的其他成分可以包括而不限于，额外的调节元件，例如增强子、 内含子、多接头、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结 合位点等。示例性增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因 (Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis，1987)、 玉米矮缩I基因(Vasil 1989)、TMV Ω元件(Gallie，1989)和非植物性真核 生物(例如酵母；Ma 1988)的启动子的元件。示例性行植物内含子序列包括 来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)的内含子 或蔗糖合酶内含子；见：The Maize Handbook，第116章，Freeling和 Walbot编辑，Springer，New York(1994)。
病毒前导序列也可以增强本发明表达盒转录目的核酸。例如，来自烟 草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的 前导序列已经证明有效增强表达。本领域已知的其他前导序列包括，但不 限于：小RNA病毒前导序列，例如脑脊髓炎病毒(EMCV)前导序列；马铃 薯Y病毒属前导序列、烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列；MDMV(玉米矮花 叶病毒)前导序列；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列、来自苜蓿花 叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列。
本发明的表达盒也包含转录终止元件或多聚腺苷酸化信号，示例性转 录终止元件包括来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的那些转录终止元件 (Bevan，1983)、来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子以 及来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3′末端。
将待转录成RNA并且任选地表达为蛋白质的第二多核苷酸插入本发 明的表达盒以转化至生物内。根据本发明，所述第二多核苷酸置于与此第 二多核苷酸共价连接的本发明启动子的下游(即按照3′方向)和转录终止元 件的上游。优选地，所述第二多核苷酸与本发明启动子之间的距离不超过 200碱基对，更优选地不超过100碱基对，最优选地不超过50碱基对。
本发明的表达盒也可以通过将本发明的启动子插入植物基因组进行装 配。此类插入会导致与对于所述基因组为天然的目的核酸序列有效连接。 由于本发明启子的转录调节特性，此类插入使得在线虫诱导后目的核酸在 根组织中偏好性地表达或过量表达。这种插入可以是定向的或随机的。优 选地，这种插入是定向的并且例如通过同源重组实现。通过这个过程，天 然启动子可以由本发明的启动子替换，因而修饰内源基因的表达谱。
本发明的表达盒可以插入重组载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色 体)、BAC(细菌人工染色体)或适于转化至宿主细胞内的任何其他载体。优 选的宿主细胞是细菌细胞，尤其大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌和 发根农杆菌细胞和植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，所述表达盒或载 体可以插入转化植物细胞的基因组内。或者，所述表达盒或载体可以在染 色体外维持。本发明的表达盒或载体可以存在于植物细胞的细胞核、叶绿 体、线粒体和/或质体内。优选地，本发明的表达盒或载体插入植物细胞细 胞核的染色体DNA内。
本发明的表达盒可以转化至植物以产生包含与本发明启动子多核苷酸 有效连接的一个或多个多核苷酸的转基因植物。这种实施方案的转基因植 物包含启动子，其含有如SEQ ID NO：1中所述多核苷酸序列的启动子或 SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段。或者，本发明的转基因植物包 含在严格条件下与如SEQ ID NO：1中所述核酸序列或SEQ ID NO：1的最 小启动子多核苷酸片段杂交的多核苷酸。此外，本发明的转基因植物包含 与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸或SEQ ID NO：1的最小启 动子多核苷酸片段有至少70％序列同一性的启动子核苷酸。
使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法产生本发明的转基因 植物。任一方法可以用来转化重组表达载体至植物细胞内，以产生本发明 的转基因植物。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可以 在例如WO2006/024509(PCT/EP2005/009366；USSN60/6060789)中并 Sambrook等(同上)以及在其他实验手册如Methodss in Molecular Biology， 1995，第44卷，Agrobacterium Protocols，Gartland和Davey编辑， Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。
用于转化双子叶植物的一般方法也被披露，例如在美国专利号 4,940,838；5,464,763等中。用于转化特定双子叶植物例如棉花的方法在美 国专利号5,004,863；5,159,135和5,846,797中描述。大豆转化方法在美国 专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301和在EP 0301749B1中描述。其他植物转化方法在例如美国专利号4,945,050； 5,188,958；5,596,131；5,981,840等中披露。如本文中所用，术语“植物”根 据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、植物种子及其 子代。词汇“植物”也指任一植物，尤其种子植物，并且可以包括，但不限 于作物植物。植物部分包括，但不限于茎、根、嫩枝、果实、胚珠、雄蕊、 叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚 轴、子叶、花药、萼片、花粉、种子等。所述植物可以源于选自由玉米、 小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香 蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、 马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、卷 心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)、多年生草、黑麦草和拟南芥组成的组中的属。在另 一个实施方案中，所述植物可以源于选自由烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、 大豆、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷 心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿和拟南芥组成 的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物可以源于选自由玉米、小麦、 大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、菠萝、椰子、香蕉、多年生草和 黑麦草组成的组中的属。
本发明的转基因植物可以利用已知的植物育种方法与相似的转基因植 物或与缺少本发明启动子及第二核酸的转基因植物或者与非转基因植物杂 交，以制备种子。本发明转基因植物可以包含与本发明启动子多核苷酸或 与另一种启动子有效连接的一个或多个不同目的基因，或者可以与包含如 此目的基因的另一种转基因植物杂交，从而在该植物和/或其子代中产生转 基因“垛叠”。随后播种种子以获得包含目的核酸和本发明启动子的杂交的 能育转基因植物。所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物。杂交的能育 转基因植物可以具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达盒。第 二种植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明 还包括这些杂交的能育转基因植物任一种的种子。本发明的种子可以从能 育转基因植物收获并且用来培育本发明的转化植物的子孙世代(包括包含 所述DNA构建体的杂交植物系)。
“基因垛叠”也可以通过将两个或多个基因借助植物转化转移至细胞核 而实现。多个基因可以在转化期间依次地或一起导入细胞核。植物中或目 标病原体物种中的多个基因可以通过使用靶定多个连接的部分目的序列的 单个转基因借助沉默机制、尤其RNAi进行下调。在各自启动子控制下的 多个垛叠基因也可以过量表达以获得想要的单个或多个表型。也可以将含 有过量表达基因和受沉默靶标的基因垛叠的构建体导入植物，从而产生单 个或多个农学重要的表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与 目的多核苷酸序列的任一组合垛叠以产生所需表型。所述组合可以产生具 有多种性状组合的植物，所述性状组合包括，但不限于抗病性、除草剂耐 受性、产量增加、耐寒性和耐旱性。这些垛叠的组合可以由任一方法产生， 所述的任一方法包括，但不限于通过常规方法或通过遗传方法对植物进行 杂交育种。若性状通过遗传转化进行堆叠，则目的多核苷酸序列可以按照 任一顺序依次或同时组合。例如，若欲导入两个基因，则这两个序列可以 包含在独立的转化盒内或位于相同的转化盒上。所述序列的表达可以由相 同或不同的启动子驱动。
本发明还包括作物，所述的作物包括在农田中一起栽种的多种本发明 转基因植物。
本发明的转基因植物可以用于控制作物中植物寄生线虫侵染的方法 内，所述方包括以下步骤：从包含表达盒的种子培育出所述作物，其中所 述的表达盒包含与编码物质的第二多核苷酸有效连接的本发明启动子多核 苷酸，所述的物质破坏所述植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，改善植 物对所述植物寄生线虫的耐受性或对所述植物寄生线虫有毒，其中所述表 达盒稳定整合至植物细胞、植物和/或种子的基因组内。此类物质包括而不 限于，与对于线虫存活、变态或繁殖必需的植物寄生线虫的靶基因基本上 同一的双链RNA；与维持线虫采食部位所需的植物基因基本上同一的双 链RNA；反义RNA、siRNA、miRNA或其前体、干扰所述线虫代谢、存 活、变态或繁殖的蛋白质，微生物毒素、来自昆虫的毒素或干扰所述线虫 代谢、存活、变态或繁殖的任一毒素等。
以下实例不意图限制本发明权利要求书的范围，而是意图作为某些实 施方案的示例。所例举方法中技术人员想到的任一变化将属于本发明的范 围。
实施例
实施例1基因表达分析以鉴定SCN诱导的大豆基因
将大豆栽培种Williams 82(Glycine max cv.Williams 82)种子在25℃ 于1％琼脂平板上萌发3日并转移至催芽袋内，每袋1株幼苗。1日后， 每株幼苗以1000个大豆异皮线虫第3小种第二期幼体(J2)接种。将所述幼 苗维持在相同的培养条件下。根尖的位置标记在催芽袋上。在接种1日后， 取出幼苗并在水中冲洗以除去其表面上的残余线虫，并且随后转移至新的 催芽袋内，并且将根尖的位置标记在催芽袋上。
接种6日后，将两个标记之间的根部分用刀片切成长1cm的小段并且 立即在含有3份乙醇和1份冰醋酸的溶液中固定。将该溶液在400mm Hg 真空下处理2次15分钟并随后在冰上保持4-8小时。随后将根段在冰上以 10％蔗糖浸润4小时并且随后在冰上以15％蔗糖浸润4小时。在每个 浸润步骤期间，所述溶液首先在400mm Hg真空下处理15分钟。全部蔗 糖溶液经DEPC(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)处理以抑制RNA酶 活性。
随后取出根段并且在纸巾上蘸干以除去表面上的液体，并随后在 cryomold中在OCT(Optium Cutting Temperature)(Sakura Finetechnical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)中包埋，随后立即在液氮中冷冻。一旦OCT在模 具中形成整块，则它可以存贮在-80℃。
根段用Leica Cry-ostat C3050s(Leica Microsystems Nussloch GmbH， Nussloch，Germany)以10μm厚度纵向地切片。切片温度设置为-15℃。将 切片转移至PEN(P.A.L.M.MicrolaserTechnoIogies GmbH，Bernried， Germany)载玻片的膜侧面上并且存贮在-80℃。
载玻片首先在冷(4℃)的70％乙醇中固定1分钟，随后通过浸没该载 玻片于1×PBS(Mediatech Inc.，Hern-don，VA)内2分钟溶解OCT，随后在 70％、95％和100％乙醇中各脱水1分钟。载玻片随后经空气干燥并封片 于PALM(P.A.L.M.MicrolaserTechnoIogies GmbH，Bernried，Germany) 显微镜上用于观察。合胞体细胞因其独特的形态学即膨大的细胞大小、细 胞壁增厚和稠密细胞质被鉴定。将200μl微量离心管的管帽充满来自试剂 盒的20μl RNA提取缓冲液并用夹具封固在所述样品上，管帽开口端朝向 样品。使用PALM系统的计算机界面限定切割区。随后将一束激光射入穿 过载玻片并将合胞体切割成小片。与此同时，该激光束的力量将切割的小 片吹入该样品上方的RNA提取缓冲液内。一旦完成，将所述管帽从夹具 中取下并重新盖在微量离心管上，并将含有合胞体切割小片的RNA提取 缓冲液离心至该微量离心管的底部。
使用来自Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的PicoPure RNA分离试剂盒，按照制造商说明书，从激光捕获的细胞中提取并分离细 胞总RNA。
为从少量输入的总RNA中扩增RNA，按照制造商说明书使用来自 Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的RiboAmp HS RNA扩增 试剂盒，包括如用户指南中所推荐的在启动RiboAmp HS方案前添加核酸 载体至输入样品RNA内。当使用少至500pg参考RNA连同RiboAmp HS RNA扩增试剂盒中提供的载体核酸作为扩增反应中的输入时，实现成功 的扩增。
代表待研究的一组基因的大豆cDNA PCR产物在纯化和重悬于 50％DMSO中后，使用Gen III点样器(Amersham Biosciences，Piscataway， NJ)以机器人操作方式点样于化学改性的玻璃支持物(UltraGAPS，Corning Inc.，Acton，MA)上。在全部点样过程开始时包括一个由一套对照基因(12 次重复的18种基因)组成的对照PCR平板，象这样，在每个平板(panel) 的第一排中的头18个点是外部标样基因(spike基因)并且它们可以用作 QC对照和/或用来获得标准曲线，其中以所述标准曲线计算出平板中其他 克隆的归一化丰度。对照基因是基于酵母基因间区序列所设计的一套市售 人工基因(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
在微阵列方法中成套对照基因的实现允许采用基于单色的杂交方法替 代先前采用的双色杂交模式，即标记单一cDNA样品并将其与cDNA阵列 杂交，而不是处理对参考样品对。因此，可以计算并比较样品之间和不同 实验之间归一化的信号强度及因此比较原始RNA样品中每种已表达的转 录物的绝对转录物丰度，而非比例。
使用如基于随机引物的标记方案中所描述的GenisphereTM的3DNA Dendrimer技术(Genisphere，Hatfield，PA)，将扩增的RNA(aRNA)样品以 Cy 3间接地标记并且使用如制造商说明书中所述的两步杂交方案 (Genisphere，Hatfield，PA)与所述大豆cDNA阵列杂交。来自逆转录aRNA 的cDNA产物经过柱纯化并且其质量在Agilent BioAnalyzer上检验。纯化 的cDNA随后与捕获序列连接并使用标准分子生物学方案进一步予以纯化 及浓缩。为提高重复性和交叉样品可比性，对于所有样品，使用相同量(约 250ng)的纯化cDNA-捕获序列连接混合物与阵列杂交。用于对照基因的已 知量的相应cDNA预混合物在杂交和标记之前添加(spike)至样品cDNA 中。为了使伴随手工杂交的差异最小化，全部杂交在Lucidea Pro自动载 玻片处理机(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上进行。
处理的载玻片使用Gen III扫描仪(Amersham Biosciences，Piscataway， NJ)扫描。输入从Gen III扫描仪生成的.gel文件并使用来自 BioDiscovery(Los Angeles，CA)的特征提取软件ImaGene 5.1版进行分析， 在所述软件中图像被分割成像素并转化成数字密度值。还获得了与图像上 每个点相关的局部背景和其他QC值。
从ImaGene中获得的原始数据直接输入内部开发的基于SAS的微阵 列表达数据分析通道并按照以下连续步骤处理。
从数据集中剔除来自阴性点、空白点或坏点的数据。遵照软件开发商 的推荐(BioDiscovery，Los Angeles，CA)并基于经验确定的数据剔除标准 (settings for data removal)而定义阴性点、空白点或坏点。阴性点定义为对 局部背景校正后获得阴性信号值的任何点。空白点定义为对局部背景校正 后具有小于n×SD背景的信号值的任何点，其中n通常定义为2或3。而坏 点定义为具有大于经验定义值的CV信号强度的任何点，其中所述的经验定义 值是点/信号形态、杂交信号的外来污染和均匀性的度量。全部设置应当在 ImaGene软件中处理图像之前设定并且点将以非零“标签”值标记，其表明 ImaGene输出文件中QC遗漏的类型。仅保留具有“0”的“标签”值以进 一步分析。将保留的信号测量值归一化，从而每个阵列的整体基础平均值 以500定标。
作为成功开发用于控制线虫侵染的方法的前提，需要鉴定因胞囊线虫 侵染大豆根而表达的基因。这些基因包括，但不限于对合胞体形成为必需 的基因和在应答SCN感染时差异性表达的基因。
为鉴定合胞体中特异性和/或差异性表达的基因，收集三种类型的细胞 和根组织并且用于提取细胞总RNA，所述三种类型的细胞和根组织即合胞 体、称作“非合胞体”的与大豆胞囊线虫不直接接触但是来自SCN感染的 大豆根的根节段和未处理的对照根。总RNA从LCM捕获的合胞体中提 取、分离并且如上所述进行扩增。为从根节段分离总RNA，按照制造商推 荐方案，使用来自Invitrogen Life Technologies(Invitrogen Corporation， Carlsbad，California)的TRIZOL RNA分离试剂盒。使用Qiagen RNeasy Midi试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)如制造商使用指南中所述，进一步 纯化总RNA。为了更好地比较从LCM捕获的合胞体和根组织节段中生成 的表达数据，从“非合胞体”和未处理的对照根中制备的总RNA进行如上 所述的相同的两轮RNA扩增过程，从而在最终分析中比较的正是来自大 豆根的全部三种细胞/组织类型的扩增的aRNA。
表1提供在本研究中收集并分析的LCM捕获合胞体样品、“非合胞 体”和对照根组织样品列表。在该表中还包括有关RNA扩增和微阵列杂交 的信息。
表1.组织样品和实验信息
样品名称/处理 样品数 扩增的RNA数目 杂交数目 6-日合胞体 2 2 9 6-日非合胞体 2 2 11 6-日未处理的根 3 4 17
从LCM捕获的合胞体、“非合胞体”和对照根组织样品中产生的基因 表达数据的统计学分析导致鉴定到在合胞体中特异性或差异性表达的基 因。一个如此基因即59712764命名为过氧化物酶基因。图4中的表格概述 了如通过cDNA微阵列分析所测量的该基因在全部三种细胞/组织样品即 合胞体、SCN感染的非合胞体和未处理的对照根组织之间的表达数据。基 因表达的相对水平表述为归一化的信号强度(±标准差)。
如图4中所示，鉴定大豆cDNA克隆59712764在SCN感染的大豆 根的合胞体中被上调。图3描述了大豆cDNA克隆59712764的氨基酸序 列(SEQ ID NO：3)。
实施例2从拟南芥克隆SCN-诱导型启动子
拟南芥At5g05340基因基于其与实施例1中所述大豆cDNA克隆 59712764序列的相似性而选择。拟南芥(哥伦比亚(Columbia)生态型)基因 组DNA使用Qiagen DNAeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Valencia， California，US)提取。使用标准PCR扩增方案克隆紧邻ATG密码子上游 的的2085bp(SEQ ID NO：1)基因组DNA区域(推定启动子序列)，其中所 述DNA区域包括对应于拟南芥基因座鉴定标志At5g05340的5′-非翻译区。 为此，使用大约0.1μg拟南芥基因组DNA作为PCR反应中的DNA模板。 用于PCR扩增拟南芥启动子序列的引物示于图9中并且基于拟南芥基因 组序列数据库(TAIR)进行设计。由SEQ ID NO：5描述的引物序列含有便 于克隆的XmaI限制性位点。由SEQ ID NO：6描述的引物序列含有便于 克隆的AscI限制性位点。使用由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6描述的 引物序列来扩增拟南芥基因座At5g05340的启动子区。
扩增反应混合物含有以下成分：2.5μl 10X热启动缓冲液；0.15μl热 启动Taq DNA聚合酶；0.5μl 10mM dNTPs；0.5μl 10μM引物A(SEQ ID NO：5)；0.5μl 10μM引物B(SEQ ID NO：6)；1.0μl哥伦比亚拟南芥基因 组DNA(大约100ng)；19.85μl水。T3热循环仪(Biometra，Goettingen， Germany)用于扩增，利用如下设置：1个循环的：94℃，900秒；5个循 环的：94℃，30秒；52℃，30秒和72℃，120秒；30个循环的：94℃， 30秒；62℃，30秒和72℃，120秒；1个循环的：72℃，300秒。每种 PCR产物的扩增DNA片段大小通过标准琼脂糖凝胶电泳加以验证，并且 通过Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，California，US)从凝胶中提 取DNA。使用TOPO TA克隆试剂盒，按照制造商说明书(Invitrogen)，将 纯化的片段克隆至pCR2.1。使用Applied Biosystem 373A(Applied Biosystems，Foster City，California，US)自动测序仪对克隆的片段测序并且 通过使用来自序列分析工具Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad，California， US)的序列比对程序ClustalW(Euroean Bioinformatics Institute， Cambridge，UK)验证它是预期序列。对应于At5g05340的启动子区的2085 bp DNA片段显示为SEQ ID NO：1。在该序列中不包括为方便克隆而在引 物中导入的限制性位点。
实施例3用于转化和产生转基因毛根的双元载体构建
为评估克隆启动子的表达活性，将SEQ ID NO：1的第1-2085位核苷 酸克隆在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因 (Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游以产生双元载体 “pAW283”。该双元载体中的植物选择标记是来自拟南芥的受天然拟南芥 AHAS启动子(Sathasivan等，Plant Phys.97：1044-50，1991)驱动的除草剂 耐受形式的乙酰羟酸合酶(AHAS：EC 4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或 ALS)基因。使用ARSENAL(咪唑烟酸，BASF Corp，Florham Park，NJ)作 为选择剂。
在本实施例中，双元载体pAW283通过电穿孔法(Cho等，(1998)Plant Sci.138，53-65)转化至发根农杆菌(A.rhizogenes)K599菌株中。使用如下 方案，利用转化的农杆菌来诱导大豆毛根形成。在发根农杆菌接种前大约 5日，将大豆栽培种Williams 82(SCN易感性)的种子用10％漂白剂消毒10 分钟并在1％琼脂上于25℃16小时/日照下萌发。在发根农杆菌接种前大 约3日，将含有所述双元载体的发根农杆菌菌株K599的冷冻贮藏物在LB +卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并在28℃于黑暗中培育。在发根农杆菌 接种前大约1日，从该平板上挑取一个菌落并接种至液体LB+卡那霉素(50 μg/ml)。培养物在28℃振摇大约16小时。发根农杆菌在液体培养物中的 浓度被调整至OD600＝1.0。
从大豆幼苗中切下子叶并且近轴侧面用解剖刀划伤数次。将15μl发根 农杆菌混悬液接种到划伤面上，并且将子叶以近轴侧面向上方式置于1％ 琼脂平板上，于25℃，16小时/日照下持续3日。随后将子叶转移至含有 500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板 上。在选择培养基上培养所述子叶2周后，从伤口部位诱导出毛根。收获 耐受ARSENAL并在所述选择性培养基上生长的根并将其转移至相同组成 的新鲜选择培养基上并在25℃于黑暗中培育。在收集毛根并在选择培养 基上培养2周后，所述毛根在含有500μg/ml羧苄青霉素而无ARSENAL 的MS培养基上传代培养。
实施例4大豆毛根中启动子活性的检测
如实施例3中所述，将本发明的启动子之一与GUS报道基因有效连 接以确定其表达活性。GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性可以借助生色物 质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中予以检 测。
为研究在线虫感染存在和不存在下SEQ ID NO：1的启动子活性，从 pAW283的转化过程中产生几个独立的转基因系。在传代培养后大约3 周，在MS上的转基因毛根系用表面消毒的SCN第3小种J2以2000个 J2/平板的水平接种。在接种12日后(DAI)，将所述根通过移出琼脂平板而 收获并且温和地用水交替淋洗并在37℃于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色 溶液中染色16小时。在接种后的每个时间点上，来自每个系的的非接种 对照平板也在GUS染色溶液染色。在GUS染色后，将根在酸性品红中染 色并随后脱色以观察染成红色的线虫。随后在显微镜下观察根以检测GUS 表达。
对于每个转基因系，观察10个随机挑选的合胞体并对感染后12日 (DAI)的GUS表达强度进行评定。使用以下评分指标：“-”，无染色；“+”， 弱染色；“++”，强染色。使用10次计数的向上舍入平均数来确定该转基 因系的合胞体中的GUS表达水平。此外，相同转基因系中其他根组织如 愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原始组织内的GUS表达水平也使用 相同的GUS评分指标加以记录，即“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”， 强染色。在图7中显示用pAW283转化的转基因系的结果。
GUS染色的结果表明对于检测的大多数转基因系而言，pAW283中的 启动子片段显示在合胞体内于12DAI时的GUS表达。相反，在其他根部 分如根尖、维管组织和根皮层内未检测到GUS表达。
实施例5At5g05340(SEQ ID NO：1)启动子的克隆缺失
为更精确地限定At5g05340(SEQ ID NO：1)的启动子区，测试了该序列 的更短片段。使用Qiagen质粒微量制备试剂盒(Qiagen)从从大肠杆菌提取 pAW283的质粒DNA。使用pAW283中所含的现有克隆位点克隆含于 pAW283中的拟南芥基因座At5g05340启动子(SEQ ID NO：1)的1455bp 及482bp启动子缺失片段。At5g05340(SEQ ID NO：1)的1455bp启动子 缺失通过用限制性酶Pst I和Sal I消化pAW283 DNA产生。为此，5μl pAW283qcz质粒DNA(大约1微克)用10单位限制性酶Pst I和Sal I消化。 随后将pAW283的1455bp启动子片段克隆至含有AHAS选择的载体内。 随后，将GUS基因克隆至该载体内以产生RAW448。RAW448中所含的 1455bp启动子片段对应于SEQ ID NO：1中所含At5g05340启动子的第 631至第2085位碱基。482bp启动子缺失构建体通过用Xma I消化 pAW283得到。为此，5μl pAW283质粒DNA(大约1微克)用10单位限制 性酶Xma I消化。消化产物在琼脂糖凝胶上电泳以分离pAW283中的 At5g05340启动子的5′1603bp。将pAW283中不含At5g05340启动子的 5′1603bp的其余Xma I片段再次连接起来，产生RAW437。RAW437中 所含的482bp启动子片段对应于SEQ ID NO：1中所含At5g05340启动子 的第1604至第2085位碱基。
实施例6用于转化和产生转基因毛根的双元载体At5g05340启动子 缺失构建体
为评价衍生自pAW283的所克隆启动子缺失体的表达活性，将对应于 SEQ ID NO：1的第631至第2085位核苷酸和SEQ ID NO：1的第1604至 第2085位核苷酸的基因片段克隆在GUS报道基因上游，以分别产生双元 载体“RAW448”和“RAW437”。所述双元载体中的植物选择标记是来自拟 南芥的突变AHAS基因，其赋予对除草剂ARSENAL(灭草烟，BASF Cor- poration，Florham Park，NJ)的耐受性。选择标记突变的AHAS由拟南芥 AHAS启动子驱动。
双元载体pAW2803、RAW448和RAW437通过电穿孔法转化至发根 农杆菌K599菌株中。使用如下方案，利用转化的农杆菌来诱导大豆毛根 形成。在发根农杆菌接种前大约5日，将大豆栽培种Williams 82(SCN易 感性)的种子用10％漂白剂消毒10分钟并在1％琼脂上于25℃16小时/ 日照下萌发。在发根农杆菌接种前大约3日，将含有所述双元载体的发根 农杆菌菌株K599的冷冻贮藏物在LB+卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并 在28℃于黑暗中培育。在发根农杆菌接种前大约1日，从该平板上挑取 一个菌落并接种至液体LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在28℃振摇大 约16小时。发根农杆菌在液体培养物中的浓度被调整至OD600＝1-0。
从大豆幼苗中切下子叶并且近轴侧面用解剖刀划伤数次。将15μl发根 农杆菌混悬液接种到划伤面上，并且将子叶以近轴侧面向上方式置于1％ 琼脂平板上，于25℃，16小时/日照下持续3日。随后将子叶转移至含有 500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板 上。在选择培养基上培养所述子叶2周后，从伤口部位诱导出毛根。收获 耐受ARSENAL并在所述选择培养基上生长的根并将其转移至相同成分的 新鲜选择培养基上并在25℃于黑暗中培育。在收集毛根并在选择培养基 上培养2周后，所述毛根在含有500μg/ml羧苄青霉素而无ARSENAL的 MS培养基上传代培养。
实施例7大豆毛根中启动子缺失活性的检测
如实施例6中所述，将本发明的启动子与GUS报道基因有效连接以 确定它们的表达活性。GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性可以在植物内(in planta)借助生色物质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性 染色反应中予以检测。
为研究在线虫感染存在和不存在下SEQ ID NO：1的缺失片段的启动 子活性，从pAW2803、RAW448和RAW437的转化过程中产生几个独立 的转基因系。在传代培养后大约3周，在MS上的转基因毛根系用表面消 毒的SCN第3小种J2以2000个J2/平板的水平接种。在接种12日后(DAI)， 将所述根通过移出琼脂平板而收获并且温和用水交替淋洗并在37℃于含 有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中染色16小时。在接种后的每个时间 点上，来自每个转基因系的的非接种对照平板也在GUS染色溶液染色。在 GUS染色后，将根在酸性品红中染色并随后脱色以观察染成红色的线虫。 随后在显微镜下观察根以检测GUS表达。
对于每个转基因系，观察10个随机挑选的合胞体并对感染后(DAI)12 日的GUS表达强度进行评定。使用以下评分指标：“-”，无染色；“+”， 弱染色；“++”，强染色。使用10次计数的向上舍入平均数来确定该转基 因系的合胞体中的GUS表达水平。此外，相同转基因系中其他根组织如 愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原始组织内的GUS表达水平也使用 相同的GUS评分指标加以记录，即“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”， 强染色。在图8中显示用pAW2803、RAW448和RAW437转化的转基因 系的结果。
在RAW448中所含的1603bp启动子序列未显示在合胞体中的线虫 诱导的表达。在RAW437中所含的482bp启动子序列的确显示了合胞体 中的线虫诱导的表达。
实施例8启动子的PLACE分析
PLACE(日本茨城县国家农业科学院)分析结果显示了位于SEQ ID NO：1的第1995核苷酸位置至第2001核苷酸位置的TATA盒，如图1中 所示。因此，5′非翻译区始于约第2028核苷酸位置。SEQ ID NO：1所述 的序列紧邻于ATG起始密码子之前终止。SEQ ID NO：1所述启动子的潜 在核心区域是从核苷酸位置1677至核苷酸位置2027。
序列表
<110>A·威格
R·阿申齐
黄翔
S·乔杜里
R-G·甄
Y·韩
<120>过氧化物酶基因线虫诱导型启动子和使用方法
<130>PF58032(15143)
<160>6
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>2085
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(2027)
<223>启动子的潜在核心区1677-2027TATA信号1995-20015’UTR 2028-2085
<400>1
cgaagagcat aagttttgtt caaatggccc aataacaaat taaaaacatg taaagtagtc 60
agtttaaaca agcatttgca taaagtgtgg ttaatattat attaaacttc acatccaatg 120
agcattcatg taatttaaag taactgaagt taagtatcta gaagcctttt tcttctattg 180
gttattaatt tgcttaattt tctttataag ttaatttctg gttggtgtga aaatgtgacc 240
ggagaaggta tctaactttt ttttttcttt aatgaattcc actaaaattt aattctgtat 300
gtaacgcata tagtaaaatc tagaaagcga ccggcgtgcc tcctttggaa agtaatcctg 360
taaaagtaaa agccgcgtag tgtaaaagta tatgacttct tcttcccata attattttat 420
aattagtctt taatctaaat atttaaacat ataattcgtt ttacgagaaa gatcttcaca 480
ctcgattagt atacattaca tttaattccc tagttcataa aatggataac aaaaggctgt 540
gcgagattac aactgtactt gataattttg tataaatata tcctttatga atatatttta 600
gcattgatga ccgtacatgg ttaatccagt ctgcagcata acggagtatg atattaaatg 660
aacactttct gttcgtatca aatggtatcg aatattatta gagtgatcat tcagaagaaa 720
aaaagagaga gaagaaaacc tacagtgtaa acattttttt ttttgctaaa tacctacagt 780
gtaaacatga agtgctataa tttctgcaaa tagaaatcaa gaacagaaag agttgcttgg 840
aggaaaagaa atagaaaatt aagaaatcta gtgatgtaat aaatctttcc ataaaatcaa 900
atgtttggtc caaagtatta gttaaataat taggccacta ttcttgacaa ctctttttaa 960
caaactcttc tatattttct cgtggtacat atgctgaaaa agatgtatgt ctaatccata 1020
atatatctgt ataatgcgac tttcattatc tattagtacg acttctaacc tagaagataa 1080
caagcattag ctagggcatc aaaatcaacg tggaaaaacc tacgaaaagc acgaagtgat 1140
taatctgtgt aggggtggcg taagggtaaa gactaaagac tgagaatcta gggttcaagg 1200
cgtaaacttg ttctgctttt tgggtttcat tttattggcg aacaacattg atgtgtgtgg 1260
accatttggt gttcagggat tgagacaaga taatatgttt gctctcacct tctaggatta 1320
ctcgggtgct aagactcact tagtactatt gctatatcga tatactagtt cattaccaaa 1380
aaatggagtc ttcaaatttc gagttccaat atctgaaagc attgtttaaa gagatttgtt 1440
ttctccctgc acaattagtt tataacttca tatatacaca atcttatcaa tttacaacca 1500
ggtgtgtgtg aaccttcaca taatctctct tattcattca tgtatatatc caataaaagt 1560
tcgatatgtg aaattatata tctccatcta atgttagact attcccgggt cttgactata 1620
aatttaaagt attagacgag ctaattatat ttagcacaaa caatttcttc tgtaacagtg 1680
tcacgcttat cactaccaaa gaataaacac tgatctgttt taatctctta ttttctcacc 1740
catattcaaa gtcaactatt gcaagacttc gagataatta atttgatggc tatactattt 1800
acttgacatt tgggaaaata tattttcgct gataaatttg gtttttactt ctctctccga 1860
cggatataga aacaattcaa ttacatgcga aaatgataat tcaaccctat aaaccaaaac 1920
aaataacaga atgcacattt ttttcaacgc gttaggtcac ctatctttca ctttagaaca 1980
tcccttcacg tctctatata aacctcgact ctgttatcct ttgttcttca agtacaacaa 2040
tcaactctaa gtctattata ttcaagtctt tgttttaacc taaca 2085
<210>2
<211>1301
<212>DNA
<213>大豆
<400>2
agcaaacaca aacacttgaa gtactaagtt agtgtttttg agcaaactat ggcttcgttt 60
tgttctagat tgaccatttg tttggctctg tttgtcctca tattggggag tgccaatgcc 120
caactttcta caaacttcta ctaccattcg tgtccaaacc tcttctccac tgtgaaatcc 180
acagtgcaat ctgccatatc aaaggagacc cgcatgggtg cttctctcct ccgcctgttc 240
ttccacgatt gctttgtcaa tggatgtgat ggttcaattc tattggatga cacatcaagc 300
ttcaccggag agaagaacgc aaaccccaac aggaactctg ctcgtggata cgaggtcatt 360
gacaacatta aatcagccgt ggagaaagca tgtccaggag ttgtctcctg cgcagatatc 420
cttgccatag ctgccagaga ctctgttcag atccttggag gccctagttg gaatgttaaa 480
gttggaagaa gagacgctag aactgctagc caatctgctg ctaacaatgg catccctcca 540
cccacttcaa accttaacca actcatctca agattcagcg ctcttggact ttccaccaag 600
gacttggtcg ccttgtccgg tggtcacaca attggacaag caaggtgcac aaacttcaga 660
gcccgcatct acaacgagag caacatagac accgcatttg caaggacaag gcaacaaagc 720
tgcccaagaa catcagggtc aggggacaat aatcttgcaa cgcttgatct tcaaactcca 780
accgaattcg acaactacta cttcaagaat cttgttcaga agaagggtct cctccactct 840
gatcagcaac tgttcaatgg tgggtccacc gactccattg tgcgtggcta cagcaccaac 900
ccgagctcct tctcctctga cttcgccgcc gccatgatca agatgggaga cattagtcct 960
ctcactggct ccaacggaga aatcaggaag aattgtagaa ggattaacta attactaatt 1020
gagtctccaa tattaagggt cctactacac atacgcaagc aatttaattg tgtttaataa 1080
gttgttaaaa catgttttgg ttgtgttttg gattccgtgg tgggttaatt tcctagtgta 1140
gttgctgtta tcaatgccgt atacgttagt gtgtgttcta cttcccttta tttttgtctc 1200
ttttttactt ttccttgact atattgtagg aaaaaaaatc ctttatcaag aatttatcaa 1260
gaacagagtt tgcttttttg agaccgacac gcagcggccg c 1301
<210>3
<211>320
<212>PRT
<213>大豆
<400>3
Met Ala Ser Phe Cys Ser Arg Leu Thr Ile Cys Leu Ala Leu Phe Val
1 5 10 15
Leu Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ala Gln Leu Ser Thr Asn Phe Tyr Tyr
20 25 30
His Ser Cys Pro Asn Leu Phe Ser Thr Val Lys Ser Thr Val Gln Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Lys Glu Thr Arg Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu Phe
50 55 60
Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Gly Ser Ile Leu Leu Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ser Ser Phe Thr Gly Glu Lys Asn Ala Asn Pro Asn Arg Asn
85 90 95
Ser Ala Arg Gly Tyr Glu Val Ile Asp Asn Ile Lys Ser Ala Val Glu
100 105 110
Lys Ala Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala Ile Ala
115 120 125
Ala Arg Asp Ser Val Gln Ile Leu Gly Gly Pro Ser Trp Asn Val Lys
130 135 140
Val Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr Ala Ser Gln Ser Ala Ala Asn Asn
145 150 155 160
Gly Ile Pro Pro Pro Thr Ser Asn Leu Asn Gln Leu Ile Ser Arg Phe
165 170 175
Ser Ala Leu Gly Leu Ser Thr Lys Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly
180 185 190
His Thr Ile Gly Gln Ala Arg Cys Thr Asn Phe Arg Ala Arg Ile Tyr
195 200 205
Asn Glu Ser Asn Ile Asp Thr Ala Phe Ala Arg Thr Arg Gln Gln Ser
210 215 220
Cys Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly Asp Asn Asn Leu Ala Thr Leu Asp
225 230 235 240
Leu Gln Thr Pro Thr Glu Phe Asp Asn Tyr Tyr Phe Lys Asn Leu Val
245 250 255
Gln Lys Lys Gly Leu Leu His Ser Asp Gln Gln Leu Phe Asn Gly Gly
260 265 270
Ser Thr Asp Ser Ile Val Arg Gly Tyr Ser Thr Asn Pro Ser Ser Phe
275 280 285
Ser Ser Asp Phe Ala Ala Ala Met Ile Lys Met Gly Asp Ile Ser Pro
290 295 300
Leu Thr Gly Ser Asn Gly Glu Ile Arg Lys Asn Cys Arg Arg Ile Asn
305 310 315 320
<210>4
<211>324
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>4
Met Ala Ser Asn Lys Leu Ile Ser Ile Leu Val Leu Val Val Thr Leu
1 5 10 15
Leu Leu Gln Gly Asp Asn Asn Tyr Val Val Glu Ala Gln Leu Thr Thr
20 25 30
Asn Phe Tyr Ser Thr Ser Cys Pro Asn Leu Leu Ser Thr Val Gln Thr
35 40 45
Ala Val Lys Ser Ala Val Asn Ser Glu Ala Arg Met Gly Ala Ser Ile
50 55 60
Leu Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Gly Ser
65 70 75 80
Ile Leu Leu Asp Asp Thr Ser Ser Phe Thr Gly Glu Gln Asn Ala Ala
85 90 95
Pro Asn Arg Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asn Val Ile Asp Asn Ile Lys
100 105 110
Ser Ala Val Glu Lys Ala Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile
115 120 125
Leu Ala Ile Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu Gly Gly Pro Asn
130 135 140
Trp Asn Val Lys Val Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr Ala Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Asn Ile Pro Ala Pro Thr Ser Ser Leu Ser Gln Leu
165 170 175
Ile Ser Ser Phe Ser Ala Val Gly Leu Ser Thr Arg Asp Met Val Ala
180 185 190
Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Ser Arg Cys Thr Asn Phe Arg
195 200 205
Ala Arg Ile Tyr Asn Glu Thr Asn Ile Asn Ala Ala Phe Ala Thr Thr
210 215 220
Arg Gln Arg Thr Cys Pro Arg Ala Ser Gly Ser Gly Asp Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Leu Asp Val Thr Thr Ala Ala Ser Phe Asp Asn Asn Tyr Phe
245 250 255
Lys Asn Leu Met Thr Gln Arg Gly Leu Leu Hi s Ser Asp Gln Val Leu
260 265 270
Phe Asn Gly Gly Ser Thr Asp Ser Ile Val Arg Gly Tyr Ser Asn Asn
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Asn Ser Asp Phe Thr Ala Ala Met Ile Lys Met Gly
290 295 300
Asp Ile Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Glu Ile Arg Lys Val Cys
305 310 315 320
Gly Arg Thr Asn
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>At5g05340的正向引物
<400>5
cccgggcgaa gagcataagt tttgttc 27
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>At5g05340的反向引物
<400>6
ggcgcgcctg ttaggttaaa acaaagactt g 31
致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙壤 土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heterodera glycines) 在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线 虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。 尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生总计约50种宿 主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。
线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而， 线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产 量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线 虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性 植物病原体侵袭。
线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在 线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30 日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当 温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出 来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。
SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命 周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维 管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调 节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态 学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体 被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取重要的营养物， 导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至 于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。
在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土 壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍与根系 统附着并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块 或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体 腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫身体才称作胞 囊。胞囊逐渐释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞 囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直 至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在头一年中孵化，然而很多卵 也会在保护性胞囊内存活几年。
线虫可以依赖其自身力量在土壤中每年穿行仅几英寸。然而，线虫侵 染可以在多种方式下传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物， 包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，能够传播这种侵 染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地 的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。存在某些线虫可 以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些病因中的某些病因。
防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤 养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消 毒措施，如仅在处理线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田 地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染 田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁； 轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种 抗性植物品种。
已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予增加的植物寄生线虫抗性。 美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在植物采食部位内或其 附近特异性表达的植物基因的鉴定。美国专利号5,589,622和5,824,876披 露了从马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)感染的马铃薯根分离的8种 启动子；没有披露来自其他植物物种的线虫诱导型启动子。据称这些启动 子可用于指导有毒蛋白或酶特异性表达或指导针对靶基因或针对一般细胞 基因的反义RNA的表达。
美国专利号5,023,179披露命名为ASF-1的分离自CaMV启动子的 启动子增强元件，据称其增强植物基因在根中的表达。
美国专利号5,750,386披露烟草(Nicotiana tabacum)RB7根特异性启 动子的缺失片段，据称其具有线虫应答性。
美国专利号5,837,876披露从烟草分离并命名为TobRD2的根皮层特 异性基因启动子。
美国专利号5,866,777披露了推迟线虫采食结构形成的双基因方法。 第一个基因-芽孢杆菌RNA酶基因处于驱动至少在采食结构中表达的启动 子控制下。第二个基因-芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因处于驱动在除所述采 食结构之外的全部植物细胞中表达的启动子控制下。美国专利号5,866,777 中披露的采食部位特异性启动子包括截短形式的Δ0.3TobRB7和rolC启 动子。
美国专利号5,955,646披露了基于源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露氨酸合酶基因和章鱼碱合酶基因的启动子的嵌合调节区， 据称其具有线虫诱导性。
美国专利号6,005,092披露了烟草内切-1，4-β-葡聚糖酶(Ntce17)启动 子。
美国专利号6,262,344和6,395,963披露了从拟南芥分离的启动子，据 称其具有线虫诱导性。
美国专利号6,448,471披露了来自拟南芥的启动子，其对线虫采食部 位是特异性的。
美国专利号6,703,541披露了玉米过氧化物酶P7×基因及其启动子 的克隆与分离，所述启动子据称是线虫诱导型的。
美国专利号6,593,513披露了用拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cel1) 启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶转化植物以产生能够破坏线虫侵袭的植 物。
美国专利号6,906,241披露了与编码杀线虫或杀昆虫蛋白质的异源核 酸组合的Ntce17启动子。
美国专利号7,078,589披露大豆Pyk20基因和启动子的克隆与分离， 所述启动子据称将受SCN感染诱导并在维管组织中显示强烈活性。
美国专利申请公开号2003/0167507披露了大豆异黄酮合酶I启动子， 据称其是根特异性的并且在寄生虫侵袭的营养组织中可诱导。
美国专利申请公开号2004/0078841披露拟南芥TUB-1、RPL16A及 ARSK1启动子和来自豌豆(Pisum sativum)的PSMTA启动子的启动子 区，所述全部启动子区据称是根特异性的。
美国专利申请公开号2004/0029167披露了来自烟草的II类咖啡酸O- 甲基转移酶基因的启动子序列，据称所述启动子序列可应答于机械性或化 学性损伤或应答于致病体入侵而诱导。
美国专利申请公开号2005/0262585披露了大豆磷酸核糖甲酰甘氨脒 核糖核苷酸合酶的启动子及其缺失片段，据称它们应答于线虫感染。
WO 94/10320披露了来自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段及其与多 种基因一起用于线虫采食细胞特异性表达。
WO 03/033651披露了命名为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调 节型启动子序列。
WO 2004/029222及其美国同族专利-美国专利申请公开号 2005/0070697披露了来自大豆腺苷-5′-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的 调节区，用于提高植物中的线虫抗性。
上文提及的根特异性或采食部位特异性启动子目前均未用在含有抗线 虫转基因的商品种子中。虽然对这类产品的需求久已承认，然而迄今无人 成功通过重组DNA技术开发抗线虫植物。持续需求根特异性和/或线虫采 食部位特异性启动子以与编码毒害植物寄生线虫物质的转基因组合。
发明简述
本发明提供适用于驱动第二多核苷酸在易感于线虫侵袭的植物根中表 达的启动子多核苷酸。本发明的启动子多核苷酸特别用于产生抵抗线虫侵 染的农业作物植物。在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够介导根 偏好性或病原体诱导性表达的分离启动子核苷酸的启动子，其中所述的分 离启动子核苷酸选自由以下组成的组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列 的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第 1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与 a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；d)在严格条件 下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生 物活性部分的多核苷酸；和f)多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中 所述序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸， 或至少200个连续核苷酸的片段。
在另一个实施方案中，本发明提供通过使用本领域技术人员已知的方 法(如反义序列或RNAi序列)破坏本发明启动子核苷酸的功能而下调对于 线虫采食部位、合胞体或巨细胞的发育与维持为必需的基因的方法。
本发明也涉及包含本发明启动子核苷酸的表达盒和转基因植物，并涉 及控制作物中寄生线虫侵染的方法，其中所述方法使用了重组核酸构建体， 其包含与编码物质的核酸有效连接的本发明启动子核苷酸，其中所述物质 破坏植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，所述构建体赋予或改善植物的 植物寄生线虫抗性或毒害植物寄生线虫以减少植物破坏。
附图简述
图1：拟南芥基因座At5g05340的POX启动子区(SEQ ID NO：1)的核 酸序列，其中TATA盒核苷酸1995-2001为粗体。
图2：大豆(Glycine max)cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：2)的核酸 序列。ORF的ATG起始密码子以粗体显示。以下划线显示的TAA终止 密码子是cDNA序列中符合可读框的ATG的5′，说明该cDNA序列是全 长的。ORF的TAA终止密码子以斜体显示。
图3：大豆cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：3)编码的氨基酸序列， 其中“＊”表示终止密码子。
图4：POX样大豆cDNA克隆59712764的微阵列数据。符号“”指 cDNA微阵列测量值的数目。“对照根”意指从与SCN接种区段相同日龄 的非感染根区段中衍生的完整根组织aRNA。“非合胞体”意指从毗邻感染 区域的SCN感染根中衍生的完整根组织aRNA(扩增的RNA)。该样品 不应当含有SCN或采食部位，而是从SCN感染的根收获。基因表达的相 对水平表述为如实施例1中所述的归一化信号强度(±标准差)。
图5：由At5g05340编码的拟南芥POX基因的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，其中“＊”表示终止密码子。
图6：大豆cDNA克隆59712764编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3) 与拟南芥At5g05340氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。
图6：大豆cDNA克隆59712764编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：3) 与拟南芥At5g05340氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。
图7：双元载体pAW283在实施例4内所述的大豆毛根测定法中的β- 葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的毛根和非感染对照毛根 在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”，无GUS染色；“+”， GUS弱染色；“++”，GUS强染色。
图8：双元载体pAW283、RAW448和RAW437在实施例7内的所述 大豆毛根测定法中的β-葡糖醛酸糖苷酶表达模式。使大豆胞囊线虫感染的 毛根和非感染对照毛根在SCN接种12日后染色。使用以下评分指标：“-”， 无GUS染色；“+”，GUS弱染色；“++”，GUS强染色。
图9：用来获得SEQ ID NO：1的启动子的PCR引物。
优选实施方案的详述
本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及其中所包 含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领 域技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物 学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics： classical and molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Current protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编者，Current Protocols， Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley&Sons，Inc.(1998附录) 中找到。
应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)” 可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，对“一种细胞” 的称谓可以可以意指可以使用至少一种细胞。应当理解本发明不限于具体 核酸、具体细胞类型、具体宿主细胞、具体条件或具体方法等，因为这些 当然可以变化，并且其中的众多修改与变化对于本领域技术人员是显而易 见的。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案并且不意 图是限制性的。
在本申请通篇范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及这些出 版物中引用的那些参考文献的公开内容通过引用方式完整地并入本申请， 旨在更充分地描述本发明涉及的本领域状态。用于克隆、DNA分离、扩增 及纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶反应的 标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员已知并且通常使用的那些技 术。众多标准技术在Sambrook和Russell，2001 Molecular Cloning，第三 版，Cold Spring Harbor，Plain view，New York；Sambrook等，1989 Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview， New York；Maniatis等，1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(编辑)1993 Meth.Enzymol.218，第 I部分；Wu(编辑)1979 Meth Enzymol.68；Wu等，(编辑)1983 Meth. Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编辑)1980 Meth.Enzymol.65； Miller(编辑)1972 Experiments in MolecuIar Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose， 1981 Principles of Gene Manipulation，University of California Press， Berkeley；Schleif和Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover(编辑)1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford， UK；Hames和Higgins(编辑)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press， Oxford，UK以及Setlow和Hollaender 1979 Genetic Engineering： Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York中描述。
可以提供从其天然环境分离和/或纯化的本发明启动子核苷酸，它们处 于基本上纯的或均匀的形式，或者不含或基本上不含所述物种来源的其他 核酸。如本文中所用的“分离”核酸在通过重组技术产生时也基本上(在分离 时)不含其他细胞材料或培养基，或在化学地合成时基本上不含化学前体。 本发明的启动子核苷酸是多核苷酸。当在本文中使用时，术语“分离的” 包括全部这些可能。
术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右或处于......范围。术语 “约”与数字范围一起使用时，它通过扩张边界高于和低于所述数值而修饰 该范围。通常，术语“约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值，即 在该数值之上或之下(较高或较低)达10％的偏差。
如本文中所用的术语“启动子”或启动子多核苷酸指与目的核苷酸序列 连接时能够控制该目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一 般(尽管不必要)位于目的核苷酸的5′(例如上游)(例如接近结构基因的转录 起始位点)，所述目的核苷酸向mRNA转录的受所述启动子的控制，并为 用于启动转录的RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合位点。“组成 型启动子”指这样的启动子，它能够在植物整个或几乎整个发育期期间于全 部或几乎全部植物组织中表达该启动子控制的可读框或调节元件。“调节型 启动子”指不以组成型方式而以时间和/或空间方式指导基因表达的启动 子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。不同启动子可以指导基 因或调节元件在不同组织或细胞类型中或在不同发育期或在应答于不同环 境条件下表达。“组织特异性启动子”指不在全部植物细胞中表达而仅在特 定器官(如根或种子)、特定组织(如胚或子叶)内的一个或多个细胞类型或特 定细胞类型(如叶薄壁组织或种子贮藏细胞)中表达的调节型启动子。“诱导 型启动子”指可以在一个或多个细胞类型中通过外部刺激如化学、光、激素、 胁迫或病原体开启的那些调节型启动子。
根据本发明，本发明的启动子多核苷酸可以与第二多核苷酸有效连接， 用于所述第二多核苷酸在植物中的根特异性和/或病原体诱导性表达以改 变该植物的表型。优选地，所述病原体是线虫。如本文中所用，术语“处于 有效连接”、“有效连接的”和“与......连接”是可互换的并且意指启动子多核 苷酸与第二多核苷酸在单个核酸片段上以如此方式功能性连接，使得所述 第二多核苷酸的转录由该启动子多核苷酸启动并介导。通常，处于有效连 接的多核苷酸是连续的。
任一的第二多核苷酸可以与本发明的启动子多核苷酸有效连接以实现 第二多核苷酸的根特异性或病原体诱导性表达。第二多核苷酸包括例如可 读框、可读框的部分、编码融合蛋白的多核苷酸、反义多核苷酸、编码双 链RNA构建体的多核苷酸、转基因等。此第二多核苷酸可以编码昆虫抗 性基因、抗细菌病基因、抗真菌病基因、抗病毒病基因、抗线虫病基因、 抗除草剂基因、影响籽粒组成或品质的基因、养分利用基因、霉菌毒素降 低基因、雄性不育基因、选择标记基因、筛选标记基因、负选择标记基因、 正选择标记基因、影响植物农学特征(如产量)的基因、环境胁迫抗性基因 (例如赋予对干旱、热、寒冷、冰冻、过度潮湿、盐胁迫或氧化胁迫抗性或 耐受性的基因)、改善淀粉特性或品质、油数量和质量、氨基酸或蛋白质组 成等的基因。
优选地，所述第二多核苷酸编码双链RNA(dsRNA)或反义多核苷酸， 其与形成或维持线虫采食部位所需的完整或部分植物基因基本上同一或同 源。所述第二多核苷酸可以备选地编码破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、 赋予或改善针对植物寄生线虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫以减少作物 破坏的物质。根据本发明，可以使用编码如此物质的任一多核苷酸，其中 所述的物质破坏植物寄生线虫生长和/或繁殖、赋予或改善针对植物寄生线 虫的植物抗性或毒害植物寄生线虫。例如，所述第二多核苷酸可以编码与 植物寄生线虫的靶基因基本上同一的双链RNA，其中所述的靶基因对该线 虫代谢、存活、变态或繁殖是必需的。所述第二多核苷酸可以编码双链 RNA，其与植物根的采食部位中对该线虫存活必需的植物靶基因本上同 一。如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶， 术语“基本上同一”和“对应于”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基 因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％同一，更优选地，与靶基 因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％同一并且最优选与靶基因的 20个或更多个连续核苷酸至少约95-99％同一或完全同一。示例性植物寄 生线虫靶基因例如在通过引用方式并入本文的共同待决的美国专利申请号 2005/188438中描述。
或者，对于线虫控制，与本发明的启动子多核苷酸有效连接的第二多 核苷酸可以编码线虫毒性蛋白。例如，编码微生物毒素或其片段、来自昆 虫的毒素或其片段(例如在美国专利号5,457,178；5,695,954；5,763,568； 5,959,182等中所述的那些毒素或其片段)的核酸可用于本发明的这个实施 方案中。
作物植物和相应的致病线虫在《美国植物疾病索引》(美国农业部手册 第165号，1960)；《北美洲植物寄生线虫物种分布》(线虫学家学会，1985)和 《美国植物及植物产品上的真菌》(美国植物病理学会，1989)中列出。例 如，本发明所针对的植物寄生线虫包括而不限于，胞囊线虫和根癌线虫。 本发明所靶向的具体植物寄生线虫包括而不限于大豆异皮线虫、甜菜异皮 线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、水稻异皮 线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、车轴草异皮 线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线 虫(G.rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线 虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M. hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结 线虫(M.exigua)、起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫 (Ditylenchus angustus)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫 (Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、咖 啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲短体线虫 (Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘 旋线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、较小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodorus christiei、麦粒鳗线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、小麦根瘿线虫 (Subanguina radicicola)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比 亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线虫 (Hemicycliophora arenaria)、椰子细杆刃线虫(Rhadinaphelenchus cocophilus)、水平对刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫 (Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃 线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫 (Xiphinema americanum)、瘟疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)等。
在一个实施方案中，目标线虫属于诱导采食细胞、巨细胞或合胞体细 胞的线虫科。诱导采食细胞、巨细胞或合胞体细胞的线虫科是长针线虫科 (Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heterodidae)、 根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃线虫 科(Tylenchulidae)。优选地，它们属于异皮线虫科或根结线虫科。
因此，在另一个实施方案中，目标线虫属于选自由仙人掌胞囊线虫属 (Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球异皮线虫属(Globodera)、 异皮线虫属(Heterodera)、Punctodera、长针线虫线虫属(Longidorus)或根 结线虫属(Meloidogyne)组成的组中的一个或多个属。在优选的实施方案 中，目标线虫属于选自由仙人掌胞囊线虫属、长形胞囊线虫属、球异皮线 虫属、异皮线虫属、Punctodera或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。 在更优选的实施方案中，目标线虫属于选自由球异皮线虫属、异皮线虫属 或根结线虫属组成的组中的一个或多个属。在甚至更优选的实施方案，目 的线虫属于选自由球异皮线虫属或异皮线虫属组成的组中的一个或两个 属。在另一个实施方案中，目标线虫属于根结线虫属。
球异皮线虫属和异皮线虫属是异皮线虫科中优选的属。因此，在一个 实施方案中，目标线虫属于选自由蕃草属球异皮线虫(Globodera achilleae)、蒿球异皮线虫(Globodera artemisiae)、Globodera hypolysi、 Globodera mexicana、Globodera millefolii、苹果球异皮线虫(Globodera mali)、马铃薯白线虫、马铃薯金线虫、烟草异皮线虫和Globodera virginiae 组成的组中的一个或多个物种。在优选的实施方案中，目标线虫属于以下 物种至少之一：马铃薯白线虫、烟草异皮线虫(Globodera tabaccum)或马 铃薯金线虫。因此，在一个实施方案中，目标线虫属于选自由燕麦异皮线 虫(Hederodera avenae)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、鹰嘴豆异 皮线虫(Heterodera ciceri)、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、 Heterodera delvii、褐藻异皮线虫(Heterodera elachista)、菲力普异皮线虫 (Heterodera filipjevi)、Heterodera gambiensis、大豆异皮线虫、豌豆异皮 线虫(Heterodera goettingiana)、荞麦异皮线虫(Heterodera graduni)、蛇麻 异皮线虫(Heterodera humuli)、大麦异皮线虫(Heterodera hordecalis)、小 麦异皮线虫(Heterodera latipons)、燕麦异皮线虫(Heterodera major)、苜蓿 异皮线虫(Heterodera medicaginis)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzicola)、 巴基斯坦异皮线虫(Heterodera pakistanensis)、酸模异皮线虫(Heterodera rosii)、甘蔗异皮线虫(Heterodera sacchari)、甜菜异皮线虫、高粱异皮线虫 (Heterodera sorghi)、车轴草异皮线虫、荨麻异皮线虫(Heterodera urticae)、 豇豆异皮线虫(Heterodera vigni)和玉米异皮线虫(Heterodera zeae)组成的 组中的一个或多个物种。在优选的实施方案中，目标线虫属于属于以下物 种至少之一：大豆异皮线虫、燕麦异皮线虫、木豆异皮线虫、豌豆异皮线 虫、车轴草异皮线虫、玉米异皮线虫或甜菜异皮线虫。在更优选的实施方 案中，目标线虫属于大豆异皮线虫或甜菜异皮线虫或属于这两个物种。在 最优选的实施方案，目的线虫属于大豆异皮线虫。
根结线虫属是根结科中的优选属。因此，在一个实施方案中，目标线 虫属于选自由高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、Meloidogyne arabica、 花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)、短尾根结线虫(Meloidogyne brevicauda)、山茶根结线虫 (Meloidogyne camelliae)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖 啡根结线虫(Meloidogyne cofeicola)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、 禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫、印度根结线虫(Meloidogyne indica)、海滨根结线 虫(Meloidogyne inornata)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、林氏根 结线虫(Meloidogyne lini)、苹果根结线虫(Meloidogyne mali)、小头根结线 虫(Meloidogyne microcephala)、小突根结线虫(Meloidogyne microtyla)、 纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、萨拉斯根结线虫(Meloidogyne salasi) 和泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)组成的组中的一个或多个物种。 在优选的实施方案中，目标线虫属于以下物种至少之一：爪哇根结线虫、 南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或哥伦比亚根结线虫。
可以由含有本发明启动子的核酸构建体保护的植物包括而不限于选自 由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属 (Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属 (Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属 (Fragaria)、拟南芥属、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属 (Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、 豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦 属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大 豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、 向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属 (Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴 草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚 麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡芦巴属(Daucus)、 萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、 天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、 Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天 门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、 天竺葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属 (Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属 (Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组 中的属。
所述启动子多核苷酸的一些衍生物和变体优选地用在特定的植物进化 枝、科、属或植物种中。可以从一个植物物种中分离的所述启动子多核苷 酸的衍生物和变体优选地用在这样的植物中，其中所述的植物与用于分离 所述启动子多核苷酸的衍生物和变体的植物属于相同的进化枝、科、属或 种。因此，在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物，优选是禾本科 (Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae) 植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本 科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、 高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、稷属、蟋蟀草属 (Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca) 或黑麦草属植物。因此，在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍属，优选地 是玉米(Zea mays)。因此，在一个实施方案中，植物是小麦属，优选地是 普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticum speltae)或圆柱小麦 (Triticum durum)。因此，在一个实施方案中，植物是稻属，优选地是稻 (Oryza sativa)。因此，在一个实施方案中，植物是大麦属植物，优选地是 大麦(Hordeum vulgare)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦属植物， 优选地是黑麦(Secale cereale)。因此，在一个实施方案中，植物是燕麦属植 物，优选地是燕麦(Avena sativa)。因此，在一个实施方案中，植物是甘蔗 属植物，优选地是甘蔗(Saccharum officinarum)。因此，在一个实施方案 中，植物是高粱属植物，优选地是高粱(Sorghum vulgare)、两色蜀黍(Sor- ghum bicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。因此，在一个实施方案中， 植物是狼尾草属植物，优选地是御谷(Pennisetum glaucum)。因此，在 一个实施方案中，植物是狗尾草属植物，优选地是谷子(Setaria italica)。因 此，在一个实施方案中，植物是稷属植物，优选地是野生稷(Panieum miliaceum)或柳枝稷(Panieum virgatum)。因此，在一个实施方案中，植物 是蟋蟀草属植物，优选地是穇子(Eleusine coracana)。因此，在一个实施方 案中，植物是芒属植物，优选地是芒(Miscanthus sinensis)。因此，在一个 实施方案中，植物是短柄草属植物，优选地是短柄草(Brachypodium distachyon)。因此，在一个实施方案中，植物是羊茅属植物，优选是苇状 羊茅(Festuca arundinaria)、紫羊茅(Festuca rubra)或牛尾草(Festuca pratensis)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦草属植物，优选地是黑 麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum)。因此，在一个 实施方案中，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。
因此在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物，优选地是豆科 (Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科 (Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科 (Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科 (Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科 (Sterculiaceae)或芸香科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆 科、茄科或十字花科植物。因此，在一个实施方案中，所述植物是豆科， 优选属大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属 (Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵 豆属(Lens)。豆科的优选物种是大豆、豌豆、落花生(Arachis hypogea)、鹰 嘴豆(Cicer arietinum)、蚕豆(Vicia faba)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、白羽 扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、苜蓿(Medicago sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是大 豆。因此，在一个实施方案中，所述植物是茄科植物、优选属于茄属、番 茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(Solanum tuberosum)、 番茄(Lycopersion esculentum)、烟草(Nicotiana tabaccum)或黄灯笼辣椒 (Capsicum chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所 述植物是十字花科植物，优选是拟南芥属、芸苔属或萝卜属植物。十字花 科的优选物种是拟南芥、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芥菜(Brassica juncea)或芜青(Brassica rapa)。更优选欧洲油菜。 因此，在一个实施方案中，所述植物是藜科植物，优选是甜菜属植物。甜 菜属的优选物种是甜菜(Beta vulgaris)。因此，在一个实施方案中，所述植 物是菊科植物，优选是向日葵属或万寿菊属(Tagetes)植物。向日葵属的优 选物种是向日葵(Helianthus annuus)。万寿菊属的优选物种是万寿菊 (Tagetes erecta)。因此，在一个实施方案中，所述植物是锦葵科植物，优 选是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)植物。棉属的优选物种是陆 地棉(Gossypium hirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。更优选陆地 棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(Abeimoschus esculentus)。因此，在一 个实施方案中，所述植物是亚麻科植物，优选是亚麻属植物。亚麻属的优 选物种是亚麻(Linum usitatissimum)。因此，在一个实施方案中，所述植 物是大戟科植物，优选木薯属、麻风树属(Jatropa)、蓖麻属(Rhizinus)或番 薯属(lpomea)植物。木薯属的优选物种是木薯(Manihot esculenta)。麻风树 属的优选物种是麻风树(Jatropa curca)。蓖麻属(Rhizinus)的优选物种是蓖 麻(Ricinus communis)。番薯属的优选物种是甘薯(lpomea batatas)。因此， 在一个实施方案中，所述植物是蔷薇科植物，优选是蔷薇属、苹果属、梨 属、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium) 或草莓属植物。草莓属的优选物种是草莓(Fragaria×ananassa)。因此，在 一个实施方案中，所述植物是葫芦科植物，优选是甜瓜属、西瓜属(Citrullus) 或南瓜属(Cucurbita)植物。甜瓜属的优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)。 西瓜属的优选物种是西瓜(Citrullus lanatus)。南瓜属的优选物种是西葫芦 (Cucurbita pepo)。因此，在一个实施方案中，所述植物是山茶科植物，优 选是山茶属植物。山茶属的优选物种是山茶(Camellia sinensis)。因此，在 一个实施方案中，所述植物是茜草科植物，优选是咖啡属(Coffea)植物。咖 啡属的优选物种是小果咖啡(Coffea arabica)或中果咖啡(Coffea canephora) 植物。因此，在一个实施方案中，所述植物是梧桐科(Sterculiaceae)植物， 优选是可可属(Theobroma)植物。可可属的优选物种是可可树(Theobroma cacao)。因此，在一个实施方案中，所述植物是柑桔属植物，优选是密植 或种植园中栽种的柑桔属物种和杂交品种，如甜橙(Citrus sinensis)、柠檬 (Citrus limon)、桔(Citrus reticulata)、柚(Citrus maxima)等。
拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)代表拟南芥At5g05340基因的启动子 区。本发明的大豆cDNA克隆59712764(SEQ ID NO：2)如实施例1中所 披露从大豆RNA分离并且在氨基酸水平上显示与At5g05340所编码蛋白 质的显著性可比对。如实施例3中所示，当所述拟南芥启动子与GUS报 道基因有效连接时，GUS基因表达在线虫感染的大豆毛根中被上调。
本发明因此体现在这样的启动子中，其包含具有如SEQ ID NO：1中所 述序列的启动子多核苷酸，或从具有如SEQ ID NO：1中所述序列的分离核 酸中衍生的最小启动子多核苷酸片段，其中所述的启动子多核苷酸或最小 启动子多核苷酸片段能够介导第二多核苷酸的根特异性或线虫诱导性表 达。本文中披露的方法可以用来分离SEQ ID NO：1中额外最小启动子多核 苷酸片段，其能够介导第二多核苷酸的根特异性和/或线虫诱导性表达。
或者，本发明的启动子多核苷酸包含在严格条件下与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸杂交的分离多核苷酸，或从具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸中衍生的最小启动子多核苷酸片段。如本文中 所用的严格杂交条件是熟知的，包括例如，400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时；随后在0.1％SDS，0.1％ SSC中于大约65℃洗涤约15-60分钟。本发明也体现在这样的分离多核 苷酸中，所述的分离多核苷酸在严格条件下与包含如SEQ ID NO：1中所述 序列的第1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷 酸杂交，其中所述的启动子多核苷酸在植物根中受植物寄生线虫诱导。本 发明的启动子多核苷酸还包含这样的分离多核苷酸，所述的分离多核苷酸 与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的核酸至少50-60％或至少60-70％或 至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％，或至少95％、96％、97％、98％、 99％或更多同一或相似。序列比较的长度对于多核苷酸而言是至少50个连 续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸，直至该序列 的整个长度。
术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸序列或多肽序列环境下 指这两个序列中的这些位置，其中当所述序列在指定比较窗口范围(例如全 局比对中的整个序列或在局部比对中的相似性区域)内为最大对应进行比 对时，相同的符号对归集在一起。当序列同一性百分数用来指多肽时，可 认识到的是不同一的残基位置经常因保守性氨基酸置换而不同，其中氨基 酸残基被替换为具有相似化学属性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基 并且因此没有改变分子的功能属性。当序列因保守性置换而不同时，序列 同一性百分数可以向上调整以针对所述置换的保守性本质进行修正。将因 此类保守性置换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进 行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。一般，这种方法包括将保守 性置换判定为部分匹配而非错配，因而增加序列相似性的百分数。
如本文中所用，“序列同一性的百分数”或“序列同一性百分数”指通过 如此方式确定的值，即首先在全局或局部比较窗口中的两个最佳比对序列 中在每个组成位置处注明相同的核酸碱基或氨基酸残基是否在这两个序列 中出现，若出现，指定为匹配，或若不出现，则指定为不匹配。由于所述 比对通过优化匹配碱基数目而建立，与此同时允许在任一位置处的错配以 及允许引入任一大小的空位或空白区域，如此提高所述比对的显著性及质 量，因而这种计算确定了匹配条件存在的位置总数，并且随后将这个数字 除以比较窗口内的位置总数，并且最后将结果乘以100以产生序列同一性 百分数。可以使用相同原理对蛋白质序列计算“序列相似性百分数”，其中 将保守性置换计算为部分不匹配而非完全不匹配。因此，例如，在给予相 同氨基酸评分1并且给予非保守性置换评分0的情况下，给予保守性置换 0-1之间的评分。对保守性置换的评分可以从本领域已知的氨基酸矩阵例如 Blosum或PAM矩阵中获得。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以使用数学算法实现两 个序列之间同一性百分数或相似性百分数(对于蛋白质)的确定。此类数学 算法的优选、非限制性实例是Myers和Miller算法(Bioinformatics， 4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.， 48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.， 147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)： 2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.， 215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。可以使用这些数学算法 的计算机实现以比较序列来确定序列同一性或鉴定同源物。
本发明还体现了本发明启动子多核苷酸的“变体”或“衍生物”。具体启 动子多核苷酸序列的衍生物及其具体要素可以包括，但不限于，序列缺失、 单个或多个点突变、在特定限制性酶位点处的改变、添加功能性元件或其 他分子修饰方法。这种修饰可以或不会增强或改变所述序列的转录调节活 性。
例如，本领域技术人员可以定义序列内的功能性元件或生物活性部分 并删除任何非必需元件。可以修饰或组合功能性元件或生物活性部分，旨 在为任何具体应用增加本发明序列的效用或表达。也可以通过移去或缺失 非必需序列，但不缺失必需序列而获得本发明启动子多核苷酸的功能等同 片段。所述启动子多核苷酸序列缩小至必需的转录介导元件可以在体外通 过试错缺失突变或在计算机上利用启动子元件搜索途径实现。对启动子活 性必需的区域常常显示为成簇的某些已知启动子元件。此类分析可以使用 可获得的计算机算法如PLACE(″植物顺式作用调节性DNA元件″；Higo 1999)、BIOBASE数据库″Transfac″(Biologische Datenbanken GmbH， Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PIantCARE(Lescot 2002)进行。 尤其优选转录调节性核苷酸序列的等同片段，所述等同片段通过缺失编码 mRNA的5′-非翻译区的区域而获得，因此，仅提供(非转录的)启动子区。 所述的5′-非翻译区可以通过本领域已知的方法(如5′-RACE分析)轻易确 定。因此，本发明转录调节性核苷酸序列中的某些序列是其他序列的等同 片段。如本文中所用，术语“最小启动子”指启动子多核苷酸中能够介导第 二核酸的根特异性和/或线虫诱导性表达的生物活性部分。本发明具体的最 小启动子多核苷酸片段包括，而不限于包含如SEQ ID NO：1中所述序列的 第1677至第2027位核苷酸或第1604至第2085位核苷酸的多核苷酸，或 包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸， 或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。
如上所述，也可能随机制备并随后分析本发明启动子多核苷酸的缺失 突变体。采用这种策略，制备了一系列构建体，每种构建体含有所述克隆 的不同部分(亚克隆)，并且随后筛选这些构建体的活性。筛选活性的适用 方法是将含有缺失片段的缺失启动子构建体与选择标记或可筛选标记连接 并且分离表达标记基因的那些细胞。以这种方式，鉴定到众多不同的缺失 启动子构建体，它们仍保持想要的或甚至更强的活性。因而，通过比较所 选的构建体而鉴定到对活性所需要的最小区段。这种区段随后可以用于构 建表达外源基因的载体。
用于在编码任一启动子序列的DNA区段中诱变或产生缺失的方法是 本领域技术人员熟知的并且在例如通过引用方式完整并入本文的US 6,583,338中披露。调节性序列变体的一个实例是通过从较大启动子中的一 个缺失或多个缺失所形成的启动子。有时候可以缺失启动子的5′部分直至 接近转录起始位点附近的TATA盒而不消除启动子活性，如Zhu等(1995) The Plant Cell 7：1681-1689描述。除去部分DNA序列的例行方法是使用核 酸外切酶与DNA扩增的组合以产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于 此目的的商业试剂盒以商标名Exo-Size.TM.(New England Biolabs， Beverly，Mass.)出售。生物活性变体也包括例如具有一个或多个核苷酸置 换、缺失或插入的本发明天然启动子序列。
衍生物和变体也包括来自其他物种(如但不限于细菌、真菌和植物)的 同源物、旁系同源物和直向同源物。“同源物”是本领域中用来表示与参考 序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的遗传学术语。这种相关 性可以如前所述通过确定两个序列之间同一性和/或相似性的程度进行量 化。属于这个遗传学术语的是术语“直向同源物”和“旁系同源物”。“旁系同 源物”指在相同物种内功能上相似的多核苷酸或多肽。“直向同源物”指作为 另一个物种中与所述多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。直向同 源基因优选地意指编码直向同源蛋白质的基因。更具体地，术语“直向同源 物”指从一个物种中获得的多肽或蛋白质，其是来自不同物种的多肽或蛋白 质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
实施方案之一包括能够介导根偏好性和/或线虫诱导性表达的启动子 多核苷酸的等位变体，其中所述的启动子多核苷酸选自由以下多核苷酸组 成的组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；b)包含具有如 SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第 1604至第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少 70％序列同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交 的多核苷酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和h) 多核苷酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50 个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片 段。如本文中所用，术语“等位变体”指这样的启动子多核苷酸，其含有导 致所述多核苷酸中核苷酸变化的多态性并且该多态性存在于天然群体中 (例如植物物种或变种)。术语“等位变体”还指这样的多核苷酸，其含有导 致由所述核苷酸编码的蛋白质中氨基酸变化的多态性并且该多态性存在于 天然群体中。此类天然等位变异一般可以导致多核苷酸中的1-5％差异或所 编码蛋白质中的1-5％差异。等位变体可以通过对众多不同植物中的目的核 酸测序而鉴定，这可以轻易地通过使用例如杂交探针来鉴定那些植物中的 相同基因遗传基因座而实施。多核苷酸中任一及全部此类核酸变异是天然 等位变异的结果，并且那些不改变所述多核苷酸的功能性活性的等位变异 将属于本发明的范围。
本发明还体现在包含本发明启动子多核苷酸的表达盒中。“表达盒”在 这里应当广义地理解为包括表达盒中所含可以影响目的多核苷酸转录及根 据需要影响其翻译的全部序列。除了本发明的启动子多核苷酸之外，本发 明的表达盒还可以包含改善启动子多核苷酸功能的调节元件、允许在原核 和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件和(在3′方向上)下游调节元件 如转录终止序列和多聚腺苷酸化序列。本发明表达盒的多种成分依次并有 效地连接在一起。
因此，本发明的表达盒可以包含能够介导根偏好性和/或线虫诱导性表 达的启动子多核苷酸，所述的启动子多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的 组：a)具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸；b)包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的第1677至第2027位核苷酸或第1604至 第2085位核苷酸的多核苷酸；c)与a)或b)的多核苷酸具有至少70％序列 同一性的多核苷酸；d)在严格条件下与a)或b)的多核苷酸杂交的多核苷 酸；e)包含a)或b)的多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和f)多核苷 酸，其包含具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸的至少50个连续 核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸的片段。在 另一个实施方案中，所述启动子在植物寄生线虫感染的植物的根中受到诱 导。植物寄生线虫感染一般导致线虫刺激。本发明的启动子多核苷酸诱导 植物细胞中有效连接的多核苷酸在应答线虫刺激时的转录，术语“根偏好性 表达”就本发明的启动子多核苷酸而言意指在根组织中，尤其在根维管组织 中表达。
可以任选地在本发明表达盒中包括的具体遗传元件包括而不限于允许 在细菌中复制的复制起点，例如来自pBR322或P15A ori的ORI区；或 农杆菌T-DNA转移所需要的元件例如，T-DNA的左边界和/或右边界。本 发明表达盒的其他成分可以包括而不限于，额外的调节元件，例如增强子、 内含子、多接头、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结 合位点等。示例性增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因 (Ellis等，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis，1987)、 玉米矮缩I基因(Vasil 1989)、TMV Ω元件(Gallie，1989)和非植物性真核 生物(例如酵母；Ma 1988)的启动子的元件。示例性行植物内含子序列包括 来自Adh 1、bronze 1、肌动蛋白1、肌动蛋白2(WO 00/760067)的内含子 或蔗糖合酶内含子；见：The Maize Handbook，第116章，Freeling和 Walbot编辑，Springer，New York(1994)。
病毒前导序列也可以增强本发明表达盒转录目的核酸。例如，来自烟 草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的 前导序列已经证明有效增强表达。本领域已知的其他前导序列包括，但不 限于：小RNA病毒前导序列，例如脑脊髓炎病毒(EMCV)前导序列；马铃 薯Y病毒属前导序列、烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列；MDMV(玉米矮花 叶病毒)前导序列；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列、来自苜蓿花 叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列。
本发明的表达盒也包含转录终止元件或多聚腺苷酸化信号，示例性转 录终止元件包括来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因的那些转录终止元件 (Bevan，1983)、来自根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子以 及来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或Il基因的3′末端。
将待转录成RNA并且任选地表达为蛋白质的第二多核苷酸插入本发 明的表达盒以转化至生物内。根据本发明，所述第二多核苷酸置于与此第 二多核苷酸共价连接的本发明启动子的下游(即按照3′方向)和转录终止元 件的上游。优选地，所述第二多核苷酸与本发明启动子之间的距离不超过 200碱基对，更优选地不超过100碱基对，最优选地不超过50碱基对。
本发明的表达盒也可以通过将本发明的启动子插入植物基因组进行装 配。此类插入会导致与对于所述基因组为天然的目的核酸序列有效连接。 由于本发明启子的转录调节特性，此类插入使得在线虫诱导后目的核酸在 根组织中偏好性地表达或过量表达。这种插入可以是定向的或随机的。优 选地，这种插入是定向的并且例如通过同源重组实现。通过这个过程，天 然启动子可以由本发明的启动子替换，因而修饰内源基因的表达谱。
本发明的表达盒可以插入重组载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色 体)、BAC(细菌人工染色体)或适于转化至宿主细胞内的任何其他载体。优 选的宿主细胞是细菌细胞，尤其大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌和 发根农杆菌细胞和植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，所述表达盒或载 体可以插入转化植物细胞的基因组内。或者，所述表达盒或载体可以在染 色体外维持。本发明的表达盒或载体可以存在于植物细胞的细胞核、叶绿 体、线粒体和/或质体内。优选地，本发明的表达盒或载体插入植物细胞细 胞核的染色体DNA内。
本发明的表达盒可以转化至植物以产生包含与本发明启动子多核苷酸 有效连接的一个或多个多核苷酸的转基因植物。这种实施方案的转基因植 物包含启动子，其含有如SEQ ID NO：1中所述多核苷酸序列的启动子或 SEQ ID NO：1的最小启动子多核苷酸片段。或者，本发明的转基因植物包 含在严格条件下与如SEQ ID NO：1中所述核酸序列或SEQ ID NO：1的最 小启动子多核苷酸片段杂交的多核苷酸。此外，本发明的转基因植物包含 与具有如SEQ ID NO：1中所述序列的多核苷酸或SEQ ID NO：1的最小启 动子多核苷酸片段有至少70％序列同一性的启动子核苷酸。
使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法产生本发明的转基因 植物。任一方法可以用来转化重组表达载体至植物细胞内，以产生本发明 的转基因植物。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可以 在例如WO2006/024509(PCT/EP2005/009366；USSN60/6060789)中并 Sambrook等(同上)以及在其他实验手册如Methodss in Molecular Biology， 1995，第44卷，Agrobacterium Protocols，Gartland和Davey编辑， Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。
用于转化双子叶植物的一般方法也被披露，例如在美国专利号 4,940,838；5,464,763等中。用于转化特定双子叶植物例如棉花的方法在美 国专利号5,004,863；5,159,135和5,846,797中描述。大豆转化方法在美国 专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301和在EP 0301749B1中描述。其他植物转化方法在例如美国专利号4,945,050； 5,188,958；5,596,131；5,981,840等中披露。如本文中所用，术语“植物”根 据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、植物种子及其 子代。词汇“植物”也指任一植物，尤其种子植物，并且可以包括，但不限 于作物植物。植物部分包括，但不限于茎、根、嫩枝、果实、胚珠、雄蕊、 叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚 轴、子叶、花药、萼片、花粉、种子等。所述植物可以源于选自由玉米、 小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、柑桔树、菠萝、椰子、香 蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、 马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔、甜菜、卷 心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)、多年生草、黑麦草和拟南芥组成的组中的属。在另 一个实施方案中，所述植物可以源于选自由烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、 大豆、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔、甜菜、卷 心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴苣、百脉根属物种、蒺藜苜蓿和拟南芥组成 的组中的属。在另一个实施方案中，所述植物可以源于选自由玉米、小麦、 大麦、高粱、黑麦、黑小麦、稻、甘蔗、菠萝、椰子、香蕉、多年生草和 黑麦草组成的组中的属。
本发明的转基因植物可以利用已知的植物育种方法与相似的转基因植 物或与缺少本发明启动子及第二核酸的转基因植物或者与非转基因植物杂 交，以制备种子。本发明转基因植物可以包含与本发明启动子多核苷酸或 与另一种启动子有效连接的一个或多个不同目的基因，或者可以与包含如 此目的基因的另一种转基因植物杂交，从而在该植物和/或其子代中产生转 基因“垛叠”。随后播种种子以获得包含目的核酸和本发明启动子的杂交的 能育转基因植物。所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物。杂交的能育 转基因植物可以具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达盒。第 二种植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明 还包括这些杂交的能育转基因植物任一种的种子。本发明的种子可以从能 育转基因植物收获并且用来培育本发明的转化植物的子孙世代(包括包含 所述DNA构建体的杂交植物系)。
“基因垛叠”也可以通过将两个或多个基因借助植物转化转移至细胞核 而实现。多个基因可以在转化期间依次地或一起导入细胞核。植物中或目 标病原体物种中的多个基因可以通过使用靶定多个连接的部分目的序列的 单个转基因借助沉默机制、尤其RNAi进行下调。在各自启动子控制下的 多个垛叠基因也可以过量表达以获得想要的单个或多个表型。也可以将含 有过量表达基因和受沉默靶标的基因垛叠的构建体导入植物，从而产生单 个或多个农学重要的表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与 目的多核苷酸序列的任一组合垛叠以产生所需表型。所述组合可以产生具 有多种性状组合的植物，所述性状组合包括，但不限于抗病性、除草剂耐 受性、产量增加、耐寒性和耐旱性。这些垛叠的组合可以由任一方法产生， 所述的任一方法包括，但不限于通过常规方法或通过遗传方法对植物进行 杂交育种。若性状通过遗传转化进行堆叠，则目的多核苷酸序列可以按照 任一顺序依次或同时组合。例如，若欲导入两个基因，则这两个序列可以 包含在独立的转化盒内或位于相同的转化盒上。所述序列的表达可以由相 同或不同的启动子驱动。
本发明还包括作物，所述的作物包括在农田中一起栽种的多种本发明 转基因植物。
本发明的转基因植物可以用于控制作物中植物寄生线虫侵染的方法 内，所述方包括以下步骤：从包含表达盒的种子培育出所述作物，其中所 述的表达盒包含与编码物质的第二多核苷酸有效连接的本发明启动子多核 苷酸，所述的物质破坏所述植物寄生线虫的代谢、生长和/或繁殖，改善植 物对所述植物寄生线虫的耐受性或对所述植物寄生线虫有毒，其中所述表 达盒稳定整合至植物细胞、植物和/或种子的基因组内。此类物质包括而不 限于，与对于线虫存活、变态或繁殖必需的植物寄生线虫的靶基因基本上 同一的双链RNA；与维持线虫采食部位所需的植物基因基本上同一的双 链RNA；反义RNA、siRNA、miRNA或其前体、干扰所述线虫代谢、存 活、变态或繁殖的蛋白质，微生物毒素、来自昆虫的毒素或干扰所述线虫 代谢、存活、变态或繁殖的任一毒素等。
以下实例不意图限制本发明权利要求书的范围，而是意图作为某些实 施方案的示例。所例举方法中技术人员想到的任一变化将属于本发明的范 围。
实施例
实施例1基因表达分析以鉴定SCN诱导的大豆基因
将大豆栽培种Williams 82(Glycine max cv.Williams 82)种子在25℃ 于1％琼脂平板上萌发3日并转移至催芽袋内，每袋1株幼苗。1日后， 每株幼苗以1000个大豆异皮线虫第3小种第二期幼体(J2)接种。将所述幼 苗维持在相同的培养条件下。根尖的位置标记在催芽袋上。在接种1日后， 取出幼苗并在水中冲洗以除去其表面上的残余线虫，并且随后转移至新的 催芽袋内，并且将根尖的位置标记在催芽袋上。
接种6日后，将两个标记之间的根部分用刀片切成长1cm的小段并且 立即在含有3份乙醇和1份冰醋酸的溶液中固定。将该溶液在400mm Hg 真空下处理2次15分钟并随后在冰上保持4-8小时。随后将根段在冰上以 10％蔗糖浸润4小时并且随后在冰上以15％蔗糖浸润4小时。在每个 浸润步骤期间，所述溶液首先在400mm Hg真空下处理15分钟。全部蔗 糖溶液经DEPC(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)处理以抑制RNA酶 活性。
随后取出根段并且在纸巾上蘸干以除去表面上的液体，并随后在 cryomold中在OCT(Optium Cutting Temperature)(Sakura Finetechnical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)中包埋，随后立即在液氮中冷冻。一旦OCT在模 具中形成整块，则它可以存贮在-80℃。
根段用Leica Cry-ostat C3050s(Leica Microsystems Nussloch GmbH， Nussloch，Germany)以10μm厚度纵向地切片。切片温度设置为-15℃。将 切片转移至PEN(P.A.L.M.MicrolaserTechnoIogies GmbH，Bernried， Germany)载玻片的膜侧面上并且存贮在-80℃。
载玻片首先在冷(4℃)的70％乙醇中固定1分钟，随后通过浸没该载 玻片于1×PBS(Mediatech Inc.，Hern-don，VA)内2分钟溶解OCT，随后在 70％、95％和100％乙醇中各脱水1分钟。载玻片随后经空气干燥并封片 于PALM(P.A.L.M.MicrolaserTechnoIogies GmbH，Bernried，Germany) 显微镜上用于观察。合胞体细胞因其独特的形态学即膨大的细胞大小、细 胞壁增厚和稠密细胞质被鉴定。将200μl微量离心管的管帽充满来自试剂 盒的20μl RNA提取缓冲液并用夹具封固在所述样品上，管帽开口端朝向 样品。使用PALM系统的计算机界面限定切割区。随后将一束激光射入穿 过载玻片并将合胞体切割成小片。与此同时，该激光束的力量将切割的小 片吹入该样品上方的RNA提取缓冲液内。一旦完成，将所述管帽从夹具 中取下并重新盖在微量离心管上，并将含有合胞体切割小片的RNA提取 缓冲液离心至该微量离心管的底部。
使用来自Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的PicoPure RNA分离试剂盒，按照制造商说明书，从激光捕获的细胞中提取并分离细 胞总RNA。
为从少量输入的总RNA中扩增RNA，按照制造商说明书使用来自 Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的RiboAmp HS RNA扩增 试剂盒，包括如用户指南中所推荐的在启动RiboAmp HS方案前添加核酸 载体至输入样品RNA内。当使用少至500pg参考RNA连同RiboAmp HS RNA扩增试剂盒中提供的载体核酸作为扩增反应中的输入时，实现成功 的扩增。
代表待研究的一组基因的大豆cDNA PCR产物在纯化和重悬于 50％DMSO中后，使用Gen III点样器(Amersham Biosciences，Piscataway， NJ)以机器人操作方式点样于化学改性的玻璃支持物(UltraGAPS，Corning Inc.，Acton，MA)上。在全部点样过程开始时包括一个由一套对照基因(12 次重复的18种基因)组成的对照PCR平板，象这样，在每个平板(panel) 的第一排中的头18个点是外部标样基因(spike基因)并且它们可以用作 QC对照和/或用来获得标准曲线，其中以所述标准曲线计算出平板中其他 克隆的归一化丰度。对照基因是基于酵母基因间区序列所设计的一套市售 人工基因(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
在微阵列方法中成套对照基因的实现允许采用基于单色的杂交方法替 代先前采用的双色杂交模式，即标记单一cDNA样品并将其与cDNA阵列 杂交，而不是处理对参考样品对。因此，可以计算并比较样品之间和不同 实验之间归一化的信号强度及因此比较原始RNA样品中每种已表达的转 录物的绝对转录物丰度，而非比例。
使用如基于随机引物的标记方案中所描述的GenisphereTM的3DNA Dendrimer技术(Genisphere，Hatfield，PA)，将扩增的RNA(aRNA)样品以 Cy 3间接地标记并且使用如制造商说明书中所述的两步杂交方案 (Genisphere，Hatfield，PA)与所述大豆cDNA阵列杂交。来自逆转录aRNA 的cDNA产物经过柱纯化并且其质量在Agilent BioAnalyzer上检验。纯化 的cDNA随后与捕获序列连接并使用标准分子生物学方案进一步予以纯化 及浓缩。为提高重复性和交叉样品可比性，对于所有样品，使用相同量(约 250ng)的纯化cDNA-捕获序列连接混合物与阵列杂交。用于对照基因的已 知量的相应cDNA预混合物在杂交和标记之前添加(spike)至样品cDNA 中。为了使伴随手工杂交的差异最小化，全部杂交在Lucidea Pro自动载 玻片处理机(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上进行。
处理的载玻片使用Gen III扫描仪(Amersham Biosciences，Piscataway， NJ)扫描。输入从Gen III扫描仪生成的.gel文件并使用来自 BioDiscovery(Los Angeles，CA)的特征提取软件ImaGene 5.1版进行分析， 在所述软件中图像被分割成像素并转化成数字密度值。还获得了与图像上 每个点相关的局部背景和其他QC值。
从ImaGene中获得的原始数据直接输入内部开发的基于SAS的微阵 列表达数据分析通道并按照以下连续步骤处理。
从数据集中剔除来自阴性点、空白点或坏点的数据。遵照软件开发商 的推荐(BioDiscovery，Los Angeles，CA)并基于经验确定的数据剔除标准 (settings for data removal)而定义阴性点、空白点或坏点。阴性点定义为对 局部背景校正后获得阴性信号值的任何点。空白点定义为对局部背景校正 后具有小于n×SD背景的信号值的任何点，其中n通常定义为2或3。而坏 点定义为具有大于经验定义值的CV信号强度的任何点，其中所述的经验定义 值是点/信号形态、杂交信号的外来污染和均匀性的度量。全部设置应当在 ImaGene软件中处理图像之前设定并且点将以非零“标签”值标记，其表明 ImaGene输出文件中QC遗漏的类型。仅保留具有“0”的“标签”值以进 一步分析。将保留的信号测量值归一化，从而每个阵列的整体基础平均值 以500定标。
作为成功开发用于控制线虫侵染的方法的前提，需要鉴定因胞囊线虫 侵染大豆根而表达的基因。这些基因包括，但不限于对合胞体形成为必需 的基因和在应答SCN感染时差异性表达的基因。
为鉴定合胞体中特异性和/或差异性表达的基因，收集三种类型的细胞 和根组织并且用于提取细胞总RNA，所述三种类型的细胞和根组织即合胞 体、称作“非合胞体”的与大豆胞囊线虫不直接接触但是来自SCN感染的 大豆根的根节段和未处理的对照根。总RNA从LCM捕获的合胞体中提 取、分离并且如上所述进行扩增。为从根节段分离总RNA，按照制造商推 荐方案，使用来自Invitrogen Life Technologies(Invitrogen Corporation， Carlsbad，California)的TRIZOL RNA分离试剂盒。使用Qiagen RNeasy Midi试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)如制造商使用指南中所述，进一步 纯化总RNA。为了更好地比较从LCM捕获的合胞体和根组织节段中生成 的表达数据，从“非合胞体”和未处理的对照根中制备的总RNA进行如上 所述的相同的两轮RNA扩增过程，从而在最终分析中比较的正是来自大 豆根的全部三种细胞/组织类型的扩增的aRNA。
表1提供在本研究中收集并分析的LCM捕获合胞体样品、“非合胞 体”和对照根组织样品列表。在该表中还包括有关RNA扩增和微阵列杂交 的信息。
表1.组织样品和实验信息
样品名称/处理 样品数 扩增的RNA数目 杂交数目 6-日合胞体 2 2 9 6-日非合胞体 2 2 11 6-日未处理的根 3 4 17
从LCM捕获的合胞体、“非合胞体”和对照根组织样品中产生的基因 表达数据的统计学分析导致鉴定到在合胞体中特异性或差异性表达的基 因。一个如此基因即59712764命名为过氧化物酶基因。图4中的表格概述 了如通过cDNA微阵列分析所测量的该基因在全部三种细胞/组织样品即 合胞体、SCN感染的非合胞体和未处理的对照根组织之间的表达数据。基 因表达的相对水平表述为归一化的信号强度(±标准差)。
如图4中所示，鉴定大豆cDNA克隆59712764在SCN感染的大豆 根的合胞体中被上调。图3描述了大豆cDNA克隆59712764的氨基酸序 列(SEQ ID NO：3)。
实施例2从拟南芥克隆SCN-诱导型启动子
拟南芥At5g05340基因基于其与实施例1中所述大豆cDNA克隆 59712764序列的相似性而选择。拟南芥(哥伦比亚(Columbia)生态型)基因 组DNA使用Qiagen DNAeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Valencia， California，US)提取。使用标准PCR扩增方案克隆紧邻ATG密码子上游 的的2085bp(SEQ ID NO：1)基因组DNA区域(推定启动子序列)，其中所 述DNA区域包括对应于拟南芥基因座鉴定标志At5g05340的5′-非翻译区。 为此，使用大约0.1μg拟南芥基因组DNA作为PCR反应中的DNA模板。 用于PCR扩增拟南芥启动子序列的引物示于图9中并且基于拟南芥基因 组序列数据库(TAIR)进行设计。由SEQ ID NO：5描述的引物序列含有便 于克隆的XmaI限制性位点。由SEQ ID NO：6描述的引物序列含有便于 克隆的AscI限制性位点。使用由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6描述的 引物序列来扩增拟南芥基因座At5g05340的启动子区。
扩增反应混合物含有以下成分：2.5μl 10X热启动缓冲液；0.15μl热 启动Taq DNA聚合酶；0.5μl 10mM dNTPs；0.5μl 10μM引物A(SEQ ID NO：5)；0.5μl 10μM引物B(SEQ ID NO：6)；1.0μl哥伦比亚拟南芥基因 组DNA(大约100ng)；19.85μl水。T3热循环仪(Biometra，Goettingen， Germany)用于扩增，利用如下设置：1个循环的：94℃，900秒；5个循 环的：94℃，30秒；52℃，30秒和72℃，120秒；30个循环的：94℃， 30秒；62℃，30秒和72℃，120秒；1个循环的：72℃，300秒。每种 PCR产物的扩增DNA片段大小通过标准琼脂糖凝胶电泳加以验证，并且 通过Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，California，US)从凝胶中提 取DNA。使用TOPO TA克隆试剂盒，按照制造商说明书(Invitrogen)，将 纯化的片段克隆至pCR2.1。使用Applied Biosystem 373A(Applied Biosystems，Foster City，California，US)自动测序仪对克隆的片段测序并且 通过使用来自序列分析工具Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad，California， US)的序列比对程序ClustalW(Euroean Bioinformatics Institute， Cambridge，UK)验证它是预期序列。对应于At5g05340的启动子区的2085 bp DNA片段显示为SEQ ID NO：1。在该序列中不包括为方便克隆而在引 物中导入的限制性位点。
实施例3用于转化和产生转基因毛根的双元载体构建
为评估克隆启动子的表达活性，将SEQ ID NO：1的第1-2085位核苷 酸克隆在GUS报道基因(细菌β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因 (Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游以产生双元载体 “pAW283”。该双元载体中的植物选择标记是来自拟南芥的受天然拟南芥 AHAS启动子(Sathasivan等，Plant Phys.97：1044-50，1991)驱动的除草剂 耐受形式的乙酰羟酸合酶(AHAS：EC 4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或 ALS)基因。使用ARSENAL(咪唑烟酸，BASF Corp，Florham Park，NJ)作 为选择剂。
在本实施例中，双元载体pAW283通过电穿孔法(Cho等，(1998)Plant Sci.138，53-65)转化至发根农杆菌(A.rhizogenes)K599菌株中。使用如下 方案，利用转化的农杆菌来诱导大豆毛根形成。在发根农杆菌接种前大约 5日，将大豆栽培种Williams 82(SCN易感性)的种子用10％漂白剂消毒10 分钟并在1％琼脂上于25℃16小时/日照下萌发。在发根农杆菌接种前大 约3日，将含有所述双元载体的发根农杆菌菌株K599的冷冻贮藏物在LB +卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并在28℃于黑暗中培育。在发根农杆菌 接种前大约1日，从该平板上挑取一个菌落并接种至液体LB+卡那霉素(50 μg/ml)。培养物在28℃振摇大约16小时。发根农杆菌在液体培养物中的 浓度被调整至OD600＝1.0。
从大豆幼苗中切下子叶并且近轴侧面用解剖刀划伤数次。将15μl发根 农杆菌混悬液接种到划伤面上，并且将子叶以近轴侧面向上方式置于1％ 琼脂平板上，于25℃，16小时/日照下持续3日。随后将子叶转移至含有 500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板 上。在选择培养基上培养所述子叶2周后，从伤口部位诱导出毛根。收获 耐受ARSENAL并在所述选择性培养基上生长的根并将其转移至相同组成 的新鲜选择培养基上并在25℃于黑暗中培育。在收集毛根并在选择培养 基上培养2周后，所述毛根在含有500μg/ml羧苄青霉素而无ARSENAL 的MS培养基上传代培养。
实施例4大豆毛根中启动子活性的检测
如实施例3中所述，将本发明的启动子之一与GUS报道基因有效连 接以确定其表达活性。GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性可以借助生色物 质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中予以检 测。
为研究在线虫感染存在和不存在下SEQ ID NO：1的启动子活性，从 pAW283的转化过程中产生几个独立的转基因系。在传代培养后大约3 周，在MS上的转基因毛根系用表面消毒的SCN第3小种J2以2000个 J2/平板的水平接种。在接种12日后(DAI)，将所述根通过移出琼脂平板而 收获并且温和地用水交替淋洗并在37℃于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色 溶液中染色16小时。在接种后的每个时间点上，来自每个系的的非接种 对照平板也在GUS染色溶液染色。在GUS染色后，将根在酸性品红中染 色并随后脱色以观察染成红色的线虫。随后在显微镜下观察根以检测GUS 表达。
对于每个转基因系，观察10个随机挑选的合胞体并对感染后12日 (DAI)的GUS表达强度进行评定。使用以下评分指标：“-”，无染色；“+”， 弱染色；“++”，强染色。使用10次计数的向上舍入平均数来确定该转基 因系的合胞体中的GUS表达水平。此外，相同转基因系中其他根组织如 愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原始组织内的GUS表达水平也使用 相同的GUS评分指标加以记录，即“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”， 强染色。在图7中显示用pAW283转化的转基因系的结果。
GUS染色的结果表明对于检测的大多数转基因系而言，pAW283中的 启动子片段显示在合胞体内于12DAI时的GUS表达。相反，在其他根部 分如根尖、维管组织和根皮层内未检测到GUS表达。
实施例5At5g05340(SEQ ID NO：1)启动子的克隆缺失
为更精确地限定At5g05340(SEQ ID NO：1)的启动子区，测试了该序列 的更短片段。使用Qiagen质粒微量制备试剂盒(Qiagen)从从大肠杆菌提取 pAW283的质粒DNA。使用pAW283中所含的现有克隆位点克隆含于 pAW283中的拟南芥基因座At5g05340启动子(SEQ ID NO：1)的1455bp 及482bp启动子缺失片段。At5g05340(SEQ ID NO：1)的1455bp启动子 缺失通过用限制性酶Pst I和Sal I消化pAW283 DNA产生。为此，5μl pAW283qcz质粒DNA(大约1微克)用10单位限制性酶Pst I和Sal I消化。 随后将pAW283的1455bp启动子片段克隆至含有AHAS选择的载体内。 随后，将GUS基因克隆至该载体内以产生RAW448。RAW448中所含的 1455bp启动子片段对应于SEQ ID NO：1中所含At5g05340启动子的第 631至第2085位碱基。482bp启动子缺失构建体通过用Xma I消化 pAW283得到。为此，5μl pAW283质粒DNA(大约1微克)用10单位限制 性酶Xma I消化。消化产物在琼脂糖凝胶上电泳以分离pAW283中的 At5g05340启动子的5′1603bp。将pAW283中不含At5g05340启动子的 5′1603bp的其余Xma I片段再次连接起来，产生RAW437。RAW437中 所含的482bp启动子片段对应于SEQ ID NO：1中所含At5g05340启动子 的第1604至第2085位碱基。
实施例6用于转化和产生转基因毛根的双元载体At5g05340启动子 缺失构建体
为评价衍生自pAW283的所克隆启动子缺失体的表达活性，将对应于 SEQ ID NO：1的第631至第2085位核苷酸和SEQ ID NO：1的第1604至 第2085位核苷酸的基因片段克隆在GUS报道基因上游，以分别产生双元 载体“RAW448”和“RAW437”。所述双元载体中的植物选择标记是来自拟 南芥的突变AHAS基因，其赋予对除草剂ARSENAL(灭草烟，BASF Cor- poration，Florham Park，NJ)的耐受性。选择标记突变的AHAS由拟南芥 AHAS启动子驱动。
双元载体pAW2803、RAW448和RAW437通过电穿孔法转化至发根 农杆菌K599菌株中。使用如下方案，利用转化的农杆菌来诱导大豆毛根 形成。在发根农杆菌接种前大约5日，将大豆栽培种Williams 82(SCN易 感性)的种子用10％漂白剂消毒10分钟并在1％琼脂上于25℃16小时/ 日照下萌发。在发根农杆菌接种前大约3日，将含有所述双元载体的发根 农杆菌菌株K599的冷冻贮藏物在LB+卡那霉素(50μg/ml)平板上划线并 在28℃于黑暗中培育。在发根农杆菌接种前大约1日，从该平板上挑取 一个菌落并接种至液体LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在28℃振摇大 约16小时。发根农杆菌在液体培养物中的浓度被调整至OD600＝1-0。
从大豆幼苗中切下子叶并且近轴侧面用解剖刀划伤数次。将15μl发根 农杆菌混悬液接种到划伤面上，并且将子叶以近轴侧面向上方式置于1％ 琼脂平板上，于25℃，16小时/日照下持续3日。随后将子叶转移至含有 500μg/ml羧苄青霉素(以抑制发根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS平板 上。在选择培养基上培养所述子叶2周后，从伤口部位诱导出毛根。收获 耐受ARSENAL并在所述选择培养基上生长的根并将其转移至相同成分的 新鲜选择培养基上并在25℃于黑暗中培育。在收集毛根并在选择培养基 上培养2周后，所述毛根在含有500μg/ml羧苄青霉素而无ARSENAL的 MS培养基上传代培养。
实施例7大豆毛根中启动子缺失活性的检测
如实施例6中所述，将本发明的启动子与GUS报道基因有效连接以 确定它们的表达活性。GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性可以在植物内(in planta)借助生色物质如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性 染色反应中予以检测。
为研究在线虫感染存在和不存在下SEQ ID NO：1的缺失片段的启动 子活性，从pAW2803、RAW448和RAW437的转化过程中产生几个独立 的转基因系。在传代培养后大约3周，在MS上的转基因毛根系用表面消 毒的SCN第3小种J2以2000个J2/平板的水平接种。在接种12日后(DAI)， 将所述根通过移出琼脂平板而收获并且温和用水交替淋洗并在37℃于含 有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色溶液中染色16小时。在接种后的每个时间 点上，来自每个转基因系的的非接种对照平板也在GUS染色溶液染色。在 GUS染色后，将根在酸性品红中染色并随后脱色以观察染成红色的线虫。 随后在显微镜下观察根以检测GUS表达。
对于每个转基因系，观察10个随机挑选的合胞体并对感染后(DAI)12 日的GUS表达强度进行评定。使用以下评分指标：“-”，无染色；“+”， 弱染色；“++”，强染色。使用10次计数的向上舍入平均数来确定该转基 因系的合胞体中的GUS表达水平。此外，相同转基因系中其他根组织如 愈伤组织、根尖、维管结构、皮层和原始组织内的GUS表达水平也使用 相同的GUS评分指标加以记录，即“-”，无染色；“+”，弱染色；“++”， 强染色。在图8中显示用pAW2803、RAW448和RAW437转化的转基因 系的结果。
在RAW448中所含的1603bp启动子序列未显示在合胞体中的线虫 诱导的表达。在RAW437中所含的482bp启动子序列的确显示了合胞体 中的线虫诱导的表达。
实施例8启动子的PLACE分析
PLACE(日本茨城县国家农业科学院)分析结果显示了位于SEQ ID NO：1的第1995核苷酸位置至第2001核苷酸位置的TATA盒，如图1中 所示。因此，5′非翻译区始于约第2028核苷酸位置。SEQ ID NO：1所述 的序列紧邻于ATG起始密码子之前终止。SEQ ID NO：1所述启动子的潜 在核心区域是从核苷酸位置1677至核苷酸位置2027。
序列表
<110>A·威格
R·阿申齐
黄翔
S·乔杜里
R-G·甄
Y·韩
<120>过氧化物酶基因线虫诱导型启动子和使用方法
<130>PF58032(15143)
<160>6
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>2085
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(2027)
<223>启动子的潜在核心区1677-2027TATA信号1995-20015’UTR 2028-2085
<400>1
cgaagagcat aagttttgtt caaatggccc aataacaaat taaaaacatg taaagtagtc 60
agtttaaaca agcatttgca taaagtgtgg ttaatattat attaaacttc acatccaatg 120
agcattcatg taatttaaag taactgaagt taagtatcta gaagcctttt tcttctattg 180
gttattaatt tgcttaattt tctttataag ttaatttctg gttggtgtga aaatgtgacc 240
ggagaaggta tctaactttt ttttttcttt aatgaattcc actaaaattt aattctgtat 300
gtaacgcata tagtaaaatc tagaaagcga ccggcgtgcc tcctttggaa agtaatcctg 360
taaaagtaaa agccgcgtag tgtaaaagta tatgacttct tcttcccata attattttat 420
aattagtctt taatctaaat atttaaacat ataattcgtt ttacgagaaa gatcttcaca 480
ctcgattagt atacattaca tttaattccc tagttcataa aatggataac aaaaggctgt 540
gcgagattac aactgtactt gataattttg tataaatata tcctttatga atatatttta 600
gcattgatga ccgtacatgg ttaatccagt ctgcagcata acggagtatg atattaaatg 660
aacactttct gttcgtatca aatggtatcg aatattatta gagtgatcat tcagaagaaa 720
aaaagagaga gaagaaaacc tacagtgtaa acattttttt ttttgctaaa tacctacagt 780
gtaaacatga agtgctataa tttctgcaaa tagaaatcaa gaacagaaag agttgcttgg 840
aggaaaagaa atagaaaatt aagaaatcta gtgatgtaat aaatctttcc ataaaatcaa 900
atgtttggtc caaagtatta gttaaataat taggccacta ttcttgacaa ctctttttaa 960
caaactcttc tatattttct cgtggtacat atgctgaaaa agatgtatgt ctaatccata 1020
atatatctgt ataatgcgac tttcattatc tattagtacg acttctaacc tagaagataa 1080
caagcattag ctagggcatc aaaatcaacg tggaaaaacc tacgaaaagc acgaagtgat 1140
taatctgtgt aggggtggcg taagggtaaa gactaaagac tgagaatcta gggttcaagg 1200
cgtaaacttg ttctgctttt tgggtttcat tttattggcg aacaacattg atgtgtgtgg 1260
accatttggt gttcagggat tgagacaaga taatatgttt gctctcacct tctaggatta 1320
ctcgggtgct aagactcact tagtactatt gctatatcga tatactagtt cattaccaaa 1380
aaatggagtc ttcaaatttc gagttccaat atctgaaagc attgtttaaa gagatttgtt 1440
ttctccctgc acaattagtt tataacttca tatatacaca atcttatcaa tttacaacca 1500
ggtgtgtgtg aaccttcaca taatctctct tattcattca tgtatatatc caataaaagt 1560
tcgatatgtg aaattatata tctccatcta atgttagact attcccgggt cttgactata 1620
aatttaaagt attagacgag ctaattatat ttagcacaaa caatttcttc tgtaacagtg 1680
tcacgcttat cactaccaaa gaataaacac tgatctgttt taatctctta ttttctcacc 1740
catattcaaa gtcaactatt gcaagacttc gagataatta atttgatggc tatactattt 1800
acttgacatt tgggaaaata tattttcgct gataaatttg gtttttactt ctctctccga 1860
cggatataga aacaattcaa ttacatgcga aaatgataat tcaaccctat aaaccaaaac 1920
aaataacaga atgcacattt ttttcaacgc gttaggtcac ctatctttca ctttagaaca 1980
tcccttcacg tctctatata aacctcgact ctgttatcct ttgttcttca agtacaacaa 2040
tcaactctaa gtctattata ttcaagtctt tgttttaacc taaca 2085
<210>2
<211>1301
<212>DNA
<213>大豆
<400>2
agcaaacaca aacacttgaa gtactaagtt agtgtttttg agcaaactat ggcttcgttt 60
tgttctagat tgaccatttg tttggctctg tttgtcctca tattggggag tgccaatgcc 120
caactttcta caaacttcta ctaccattcg tgtccaaacc tcttctccac tgtgaaatcc 180
acagtgcaat ctgccatatc aaaggagacc cgcatgggtg cttctctcct ccgcctgttc 240
ttccacgatt gctttgtcaa tggatgtgat ggttcaattc tattggatga cacatcaagc 300
ttcaccggag agaagaacgc aaaccccaac aggaactctg ctcgtggata cgaggtcatt 360
gacaacatta aatcagccgt ggagaaagca tgtccaggag ttgtctcctg cgcagatatc 420
cttgccatag ctgccagaga ctctgttcag atccttggag gccctagttg gaatgttaaa 480
gttggaagaa gagacgctag aactgctagc caatctgctg ctaacaatgg catccctcca 540
cccacttcaa accttaacca actcatctca agattcagcg ctcttggact ttccaccaag 600
gacttggtcg ccttgtccgg tggtcacaca attggacaag caaggtgcac aaacttcaga 660
gcccgcatct acaacgagag caacatagac accgcatttg caaggacaag gcaacaaagc 720
tgcccaagaa catcagggtc aggggacaat aatcttgcaa cgcttgatct tcaaactcca 780
accgaattcg acaactacta cttcaagaat cttgttcaga agaagggtct cctccactct 840
gatcagcaac tgttcaatgg tgggtccacc gactccattg tgcgtggcta cagcaccaac 900
ccgagctcct tctcctctga cttcgccgcc gccatgatca agatgggaga cattagtcct 960
ctcactggct ccaacggaga aatcaggaag aattgtagaa ggattaacta attactaatt 1020
gagtctccaa tattaagggt cctactacac atacgcaagc aatttaattg tgtttaataa 1080
gttgttaaaa catgttttgg ttgtgttttg gattccgtgg tgggttaatt tcctagtgta 1140
gttgctgtta tcaatgccgt atacgttagt gtgtgttcta cttcccttta tttttgtctc 1200
ttttttactt ttccttgact atattgtagg aaaaaaaatc ctttatcaag aatttatcaa 1260
gaacagagtt tgcttttttg agaccgacac gcagcggccg c 1301
<210>3
<211>320
<212>PRT
<213>大豆
<400>3
Met Ala Ser Phe Cys Ser Arg Leu Thr Ile Cys Leu Ala Leu Phe Val
1 5 10 15
Leu Ile Leu Gly Ser Ala Asn Ala Gln Leu Ser Thr Asn Phe Tyr Tyr
20 25 30
His Ser Cys Pro Asn Leu Phe Ser Thr Val Lys Ser Thr Val Gln Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Lys Glu Thr Arg Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu Phe
50 55 60
Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Gly Ser Ile Leu Leu Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ser Ser Phe Thr Gly Glu Lys Asn Ala Asn Pro Asn Arg Asn
85 90 95
Ser Ala Arg Gly Tyr Glu Val Ile Asp Asn Ile Lys Ser Ala Val Glu
100 105 110
Lys Ala Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala Ile Ala
115 120 125
Ala Arg Asp Ser Val Gln Ile Leu Gly Gly Pro Ser Trp Asn Val Lys
130 135 140
Val Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr Ala Ser Gln Ser Ala Ala Asn Asn
145 150 155 160
Gly Ile Pro Pro Pro Thr Ser Asn Leu Asn Gln Leu Ile Ser Arg Phe
165 170 175
Ser Ala Leu Gly Leu Ser Thr Lys Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly
180 185 190
His Thr Ile Gly Gln Ala Arg Cys Thr Asn Phe Arg Ala Arg Ile Tyr
195 200 205
Asn Glu Ser Asn Ile Asp Thr Ala Phe Ala Arg Thr Arg Gln Gln Ser
210 215 220
Cys Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly Asp Asn Asn Leu Ala Thr Leu Asp
225 230 235 240
Leu Gln Thr Pro Thr Glu Phe Asp Asn Tyr Tyr Phe Lys Asn Leu Val
245 250 255
Gln Lys Lys Gly Leu Leu His Ser Asp Gln Gln Leu Phe Asn Gly Gly
260 265 270
Ser Thr Asp Ser Ile Val Arg Gly Tyr Ser Thr Asn Pro Ser Ser Phe
275 280 285
Ser Ser Asp Phe Ala Ala Ala Met Ile Lys Met Gly Asp Ile Ser Pro
290 295 300
Leu Thr Gly Ser Asn Gly Glu Ile Arg Lys Asn Cys Arg Arg Ile Asn
305 310 315 320
<210>4
<211>324
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>4
Met Ala Ser Asn Lys Leu Ile Ser Ile Leu Val Leu Val Val Thr Leu
1 5 10 15
Leu Leu Gln Gly Asp Asn Asn Tyr Val Val Glu Ala Gln Leu Thr Thr
20 25 30
Asn Phe Tyr Ser Thr Ser Cys Pro Asn Leu Leu Ser Thr Val Gln Thr
35 40 45
Ala Val Lys Ser Ala Val Asn Ser Glu Ala Arg Met Gly Ala Ser Ile
50 55 60
Leu Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Gly Ser
65 70 75 80
Ile Leu Leu Asp Asp Thr Ser Ser Phe Thr Gly Glu Gln Asn Ala Ala
85 90 95
Pro Asn Arg Asn Ser Ala Arg Gly Phe Asn Val Ile Asp Asn Ile Lys
100 105 110
Ser Ala Val Glu Lys Ala Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Ile
115 120 125
Leu Ala Ile Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu Gly Gly Pro Asn
130 135 140
Trp Asn Val Lys Val Gly Arg Arg Asp Ala Arg Thr Ala Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Asn Ile Pro Ala Pro Thr Ser Ser Leu Ser Gln Leu
165 170 175
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180 185 190
Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Ser Arg Cys Thr Asn Phe Arg
195 200 205
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Arg Gln Arg Thr Cys Pro Arg Ala Ser Gly Ser Gly Asp Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ala Pro Leu Asp Val Thr Thr Ala Ala Ser Phe Asp Asn Asn Tyr Phe
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275 280 285
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Asp Ile Ser Pro Leu Thr Gly Ser Ser Gly Glu Ile Arg Lys Val Cys
305 310 315 320
Gly Arg Thr Asn
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>At5g05340的正向引物
<400>5
cccgggcgaa gagcataagt tttgttc 27
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>At5g05340的反向引物
<400>6
ggcgcgcctg ttaggttaaa acaaagactt g 31
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