β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用
阅读：467发布：2020-05-08
专利汇可以提供β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传 真菌 病害 中的应用。本发明通过向 土壤 中添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物，能够诱导土壤中链霉菌数量增加，并且同时诱导土壤中β-葡聚糖酶、几丁质酶、 纤维 素酶等 水 解 酶活 力 增加，通过链霉菌和多种水解酶的联合作用，能够对多种土传病原真菌病害产生有效防控。本发明所需原料来源广、操作简单、效果优于单独使用一种多糖，并且环境相容性好。，下面是β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用专利的具体信息内容。
1.β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
按β-葡聚糖和琥珀酰聚糖的质量比为1:0.1～1:2.0，将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物添加至土壤中。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-葡聚糖选自酵母葡聚糖、昆布多糖、香菇多糖或裂殖菌多糖。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的琥珀酰聚糖的结构通式为：
其中，n＝10～1000；Succ为琥珀酰；Pyr为丙酮酰。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖的质量比为1:0.5～1:2.0。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物添加量为土壤质量的0.01％～0.5％。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物添加量为土壤质量的0.05％～0.25％。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物的添加方式是直接加入固体粉末或是制备成混合物溶液进行喷洒。
β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 土传病害是指病原体来源于土壤，从植物的根部或茎部开始侵害植物的一类病害，具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久等特点，对植物具有极大危害性。通过生物方法防控土传病害是一类环境风险较小的技术。其中，通过外源添加环境无害的诱导剂进行生物防控主要依靠土壤微生物种群自身的竞争性生长、拮抗、重寄生等作用，对生态环境的破坏极小，具有较高的可行性。选择合理的诱导剂，通过诱导作用富集土壤中对病原真菌具有拮抗作用的微生物，同时诱导能够降解病原真菌细胞壁的水解酶系活力增加，对降低土传病害有十分重要的意义。
[0003] 放线菌是最早发现有生物防治作用的一类微生物，放线菌种类繁多，代谢功能各异，其中链霉菌(Streptomyces)在防控植物病害中作用明显。例如，农用链霉素可以用于防控十字花科软腐病菌、黄瓜角斑病、菜豆疫病菌、番茄溃疡病菌等多种植物病源菌。放线菌活体制剂Mycostop，主要用来防治腐霉菌、镰孢菌、疫霉菌及丝核菌等常见的土传病原菌。但是上述制剂均是通过规模化生产然后添加到土壤中，对土壤环境的适应能力有限。
[0004] β-葡聚糖是一类天然合成的非淀粉多糖，其主要特征是多糖主链含有较高比例的β-1,3-葡萄糖苷。β-葡聚糖作为细胞壁的重要组成成分，广泛存在于微生物、植物、动物界中，同时部分微生物也具有分泌胞外β-葡聚糖的能力。琥珀酰聚糖是一类由根瘤菌等固氮微生物分泌的胞外多糖，其主要特征是每个多糖重复单元含有1个或者2个琥珀酰修饰基团。琥珀酰聚糖在根瘤菌与植物根系共生过程中发挥重要作用。研究发现，β-葡聚糖和琥珀酰聚糖均具有较高的生理活性，并且对环境友好。目前β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在土传病害防治方面均有一定的报道，研究表明单独使用β-葡聚糖或是琥珀酰聚糖对植物生长都有促进作用。但是由于二者作用机制不同。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用。发明人首次发现将作用机制不同的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖联用，通过控制二者的比例关系，能够进一步富集土壤中的链霉菌，提高土壤水解酶活力以及防治土传病原真菌。
[0006] 实现本发明目的的技术方案为：
[0007] β-葡聚糖和琥珀酰聚糖在防控土传真菌病害中的应用，具体步骤如下：
[0008] 按β-葡聚糖和琥珀酰聚糖的质量比为1:0.1～1:2.0，将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物添加至土壤中。
[0009] 本发明中，所述的β-葡聚糖为本领域常规使用的β-葡聚糖，可以是酵母葡聚糖、昆布多糖、香菇多糖或裂殖菌多糖，优选为酵母葡聚糖或昆布多糖。
[0010] 本发明中，所述的琥珀酰聚糖的结构通式为：
[0011] 其中，n＝10～1000；Succ为琥珀酰；Pyr为丙酮酰。
[0012] 本发明中，优选地，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖的质量比为1:0.5～1:2.0。
[0013] 本发明中，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物添加量为土壤质量的0.01％～0.5％，优选为土壤质量的0.05％～0.25％。
[0014] 本发明中，所述的β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物的添加方式可以是直接加入固体粉末或是制备成混合物溶液进行喷洒。
[0015] 与现有的生物防治的技术相比，本发明具有以下优点：
[0016] (1)β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物对链霉菌具有较好的选择性富集作用，同时又能诱导土壤中β-葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶等水解酶活力显著增加，二者协同增强，混合物防控土传真菌病害的效果明显优于单独添加β-葡聚糖或琥珀酰聚糖。
[0017] (2)通过调控β-葡聚糖和琥珀酰聚糖的比例关系，能够进一步促进混合物防控土传真菌病害的效果。
[0019] 图1是实施例1中加入不同浓度的混合多糖后，恩施州原始林地土壤中链霉菌的相对丰度随时间变化趋势图。
[0020] 图2是实施例1中加入不同浓度的混合多糖后，南京市轮耕地土壤中链霉菌的相对丰度随时间变化趋势图。
[0022] 图4是实施例1中加入不同浓度的混合多糖后，昆明市烟草连作地土壤中链霉菌的相对丰度随时间变化趋势图。
[0023] 图5是实施例2中加入不同浓度的混合多糖后，土壤的β-葡聚糖酶活力随时间变化趋势图。
[0024] 图6是实施例2中加入不同浓度的混合多糖后，土壤的纤维素酶活力随时间变化趋势图。
[0025] 图7是实施例2中加入不同浓度的混合多糖后，土壤的几丁质酶活力随时间变化趋势图。
[0026] 图8是实施例3中加入不同浓度的混合多糖后，土壤中可培养真菌的数量统计图。
[0027] 图9是实施例3中加入不同浓度的混合多糖后，土壤中致病疫霉的相对含量图。
[0028] 图10是实施例4中密旋链霉菌对尖孢镰刀菌的抑制作用效果图。
具体实施方式
[0029] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
[0030] 下述实施例中采用的琥珀酰聚糖结构通式为：
[0031] 其中，n＝10-1000；Succ为琥珀酰；Pyr为丙酮酰。琥珀酰聚糖的获取参考文献[Marczak Mazur Andrzej,KoperPiotr,
Kamil,Skorupska Anna.Synthesis of Rhizobial Exopolysaccharides and Their Importance for Symbiosis with Legume Plants.[J].Genes,2017,8(12).]。
Kamil,Skorupska Anna.Synthesis of Rhizobial Exopolysaccharides and Their Importance for Symbiosis with Legume Plants.[J].Genes,2017,8(12).]。
[0032] 实施例1
[0033] 典型土壤中链霉菌相对丰度测定结果
[0034] 分别选择湖北省恩施州原始林地、江苏省南京市轮耕地、山东省滕州市马铃薯连作地、云南省昆明市烟草连作地作为测试区。将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖(昆布多糖:琥珀酰聚糖＝1:1w/w)混合物粉末添加至所选土壤表层，使用量分别为0％，0.05％，0.25％。然后，每隔15d取样一次，至60d时结束。所取样土壤采用Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒(生工生物(上海))提取土壤总DNA并进行土壤宏基因组测序。根据测序结果，对链霉菌属序列在土壤微生物区系中相对丰度进行分析。图1-图4分别为上述4种土壤中链霉菌相对丰度随时间的变化趋势。由图可知，添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物后，4种土壤中链霉菌相对丰度均随时间明显增加。提高混合物的添加量能够进一步提高链霉菌在土壤中的含量。结果表明，β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物具有富集土壤中链霉菌的作用。
[0035] 实施例2
[0036] 土壤中β-葡聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶活力变化情况
[0037] 选取江苏省南京市轮耕地作为测试土样，将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖(酵母葡聚糖:琥珀酰聚糖＝1:10w/w)混合物粉末添加至所选土壤表层，使用量分别为0％，0.05％，
0.25％。然后，每隔15d取样一次，至60d时结束。分别以昆布多糖、羧甲基纤维素钠和几丁质胶体作为底物，在pH5.5测定土壤浸出液的水解酶活力，反应温度为35℃，反应时间为24h。
图5-图7为土壤中3种水解酶活力随时间的变化趋势。由图可知，添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物后，3种酶活力均随时间和混合物添加量明显上升。结果表明添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物有助于提高土壤中水解酶活力。
0.25％。然后，每隔15d取样一次，至60d时结束。分别以昆布多糖、羧甲基纤维素钠和几丁质胶体作为底物，在pH5.5测定土壤浸出液的水解酶活力，反应温度为35℃，反应时间为24h。
图5-图7为土壤中3种水解酶活力随时间的变化趋势。由图可知，添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物后，3种酶活力均随时间和混合物添加量明显上升。结果表明添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物有助于提高土壤中水解酶活力。
[0038] 实施例3
[0039] 土壤真菌含量测定结果
[0040] 选取山东省滕州市马铃薯连作地作为土样，将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖(香菇多糖:琥珀酰聚糖＝1:0.2w/w)混合物配制成浓度为25g/L的溶液，然后喷洒至所选土壤表层，使用量分别为0％，0.05％，0.25％。然后，每隔15d取样一次，至60d时结束。然后采用稀释涂平板计数法测定土壤中可培养真菌的丰度变化过程：取1g土壤样品稀释到10mL无菌磷酸盐缓冲液中，剧烈震荡30min使土壤均匀分散于缓冲液中，然后进行梯度稀释，最后选择合适的浓度涂布到PDA平板，30℃培养48h后计数。图8所示，土壤中真菌含量随添加时间和多糖浓度的增加而逐渐降低。混合多糖含量为0.25％的土壤中可培养真菌数量在60天时降为1×
104CFU/g。
104CFU/g。
[0041] 另外，通过对土壤中致病疫霉相对含量的分析发现(图9)，加入混合多糖后其相对含量明显下降，60天时混合多糖添加量为0.25％的土壤中致病疫霉与对照组相比相对量从0.97下降到了0.63。结果表明，添加β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物能够有效降低土传真菌相对丰度。
[0042] 实施例4
[0043] 链霉菌对尖孢镰刀菌的抑制作用
[0044] 选取云南省昆明市烟草连作地作为测试土样，将β-葡聚糖和琥珀酰聚糖(裂殖菌多糖:琥珀酰聚糖＝1:10w/w)混合物配制成浓度为25g/L的溶液，然后喷洒至所选土壤表层，使用量0.5％，至60d时取样。采用察氏培养基分离土样中的链霉菌，得到一株纯化后的菌株，经16S rDNA序列比对为Streptomyces pactum(密旋链霉菌)。然后用该菌株对尖孢镰刀菌进行抑菌试验。如图10所示，共培养4d后有Streptomyces pactum贴片的培养皿中始终存在对尖孢镰刀菌的抑菌圈。结果表明，采用β-葡聚糖和琥珀酰聚糖混合物富集的链霉菌对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用。
[0045] 实施例5
[0046] 添加β-葡聚糖(昆布多糖)和琥珀酰聚糖混合物与单独添加β-葡聚糖(昆布多糖)或琥珀酰聚糖的作用对比
[0047] 选取实施例1所述的江苏省南京市轮耕地土样，并按照实施例1所述的方法进行处理。分别在30d和60d时测定土壤中链霉菌相对丰度、β-葡聚糖酶活力、尖孢镰刀菌相对丰度，结果见表1和表2。
[0048] 表1混合多糖添加浓度为0.05％时测定结果对比
[0049]
[0050]
[0051] 表2混合多糖添加浓度为0.25％时测定结果对比
[0052]
[0053] 对比可知，β-葡聚糖和琥珀酰聚糖联合使用时，关键数据的指标优于β-葡聚糖或琥珀酰聚糖单独使用时的效果。同时，当β-葡聚糖:琥珀酰聚糖比例在1:0.5～1:2范围内时，效果最优。
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