一种溶磷复合微生物菌剂及其应用
阅读：736发布：2021-05-18
专利汇可以提供一种溶磷复合微生物菌剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种溶磷复合 微 生物 菌剂，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、哈兹木霉(Trichoderma harzianum)以及淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。本发明将广泛适应性的高效溶磷增产细菌菠萝泛菌与高效拮抗作物病害的 真菌 有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用 土壤 磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥拮抗微 生物防治 土传病害的作用，达到了溶磷增产、抗病增产的效果，具有巨大应用价值。，下面是一种溶磷复合微生物菌剂及其应用专利的具体信息内容。
1.菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A，保藏号CGMCC NO.5568。
2.含有权利要求1所述菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的微生物菌剂。
3.权利要求1所述菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A及权利要求2所述微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病和/或白粉病。
4.一种溶磷复合微生物菌剂，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、哈兹木霉(Trichoderma harzianum)以及淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。
5.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；
其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、钾长石粉、沸石粉、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的一种或多种；
所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖；
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、动物油、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
8 8
其中，菠萝泛菌菌剂中活菌数为2×10-3×10cfu/g，寡雄腐霉菌剂中活菌数为
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1×10-1×10cfu/g，哈兹木霉菌剂中活菌数为1×10-1×10cfu/g，淡紫拟青霉菌剂中活
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菌数为1×10-1×10cfu/g。
7.根据权利要求6所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
8.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病和/或白粉病。
9.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜。
一种溶磷复合微生物菌剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物菌剂领域，具体地说，涉及一种溶磷复合微生物菌剂及其应用。
背景技术
[0002] (一)溶磷微生物菌剂发展现状
[0003] 我国90％以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知，我国磷矿资源缺乏，保有储量151.98亿吨，再过20年中高品位磷矿开采殆尽(李志宁，2003a，李志宁，2003b)，不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示，我国磷肥当季利用率仅为3.22～18％(周晓芬，马民强，1994；张李康，1997；崔正忠等，2001；周广业等，1991；李云等，2002)。磷肥施入土壤后80～90％很快被土壤固定(范丙全等，1998，2004a)，石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石(lschmidt & Nixon，1944；Murrmann & Peech，1968)，而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝(Ford，1933)。我国自20世纪70年代使用磷肥以来，土壤磷积累显著(林葆，2009)。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物有效性低。随着辚肥用量增加，磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷(来路等，2003)与高稳定性有机磷(黄庆海等，2003)。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此，增强土壤磷有效性，提高磷肥增产效益，是我国农业可持续发展的必然之路。
[0004] 溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施(Kucey，1988；Kamble & Mohite，1996；Morales等.，2007；El-Gawad等.，2009)，倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、节约磷肥、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。
[0005] 溶磷真菌(Salih等.，1989；王延秋等，1993；Vassileva，1998；Asea 等.，988；Abd-Alla & Omar，2001；程淑琴等，2003；Wakelin等.，2007；Morales等.，2007)和溶磷细菌(Rasal，等.，2004；Raychaudhuri，等.，2003；Orhan，等.，2006；)都具有显著增加土壤有效磷、提高作物产量能力，以及节约磷肥的效果(El-Lateef，1998；Suri，等.，2006)。同时，溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等，1994；Tomar等，1996；Kamble & Mohite，1996；
范丙全等，2004a)、改善作物品质的能力(Hamed，2003；El-Gawad，2009)，溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。
范丙全等，2004a)、改善作物品质的能力(Hamed，2003；El-Gawad，2009)，溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。
[0006] 以往研究涉及面非常广，为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而，长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究，使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物，难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言，可能造成了巨大浪费，由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂，而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司，如加拿大Philom Bios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌(Penicillium bilaii)(Kucey，1988，1989)生产微生物菌剂JumpStart。印度Ruchi Biochemicals公司使用生产一种溶磷微生物，推荐在全国使用。比利时以一株溶磷细菌生产菌剂Phosphorene(Ahmed 等.，999)。我国主要以巨大芽孢杆菌(Bacillus megatarium)生产溶磷微生物菌剂(葛诚，吴薇，1995；姜瑞波，2005；范丙全，2007)。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性，溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。
[0007] 因此，针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，是开发高效溶磷微生物菌剂的重要前提。
[0008] (二)土传病害防治菌剂发展现状
[0009] 我国土传病害、连作障碍日趋严重，造成大面积减产，土传病害防治是保障粮食安全的必然途径。土传病害、连作障碍发生严重已经成为我国粮食持续增产的威胁因素。尽管我国对土传病害进行了长期研究，但是土传病害、连作障碍防治技术没有得到有效的解决，尤其是防治土传病害、连作障碍的微生物防治技术依然缺乏。发展多功能微生物菌剂，是解决土传病害、连作障碍防治，确保粮食安全的重大需求。
[0010] 由于人口急剧增长和耕地数量的限制，以及人类对高产出、高收入的追求，连作栽培成为我国农业生产的常见措施。连作种植出现作物生长发育不良、土传病害频繁加重、产量和品质下降等问题，给我国农业生产造成巨大的经济损失，是农业可持续发展急需解决的重大课题。
[0011] 农业生产正在朝着无公害、有机农业方向发展，微生物制剂及其应用技术对于发展绿色农业、建立有机食品安全工程体系具有重要作用。我国蔬菜、果树、花卉已经发展到4亿亩，其中，蔬菜播种面积2.82亿亩，总产量6.37万吨。保护地蔬菜超过5000多万亩，总产量1.68亿吨，而且有机蔬菜出口基地面积急剧增加；西瓜种植约500-1000万亩，西瓜连作障碍是世界上长期存在的难题，产量和品质下降。研究显示，黄瓜、番茄、西葫芦、甜椒等作物连作3年以上，每年产量降低10％-20％，连作4-5年的作物减产40％甚至一半以上。土传病害、连作障碍对粮食作物发展造成了严重危害，我国大豆种植面积大约有1.45亿亩，由于连年种植、病害频繁并且发生面积大，引发作物减产甚至绝收。连作障碍已经成为农业生产发展的瓶颈，研究开发高效防治土传病害、消除连作障碍微生物菌剂迫在眉睫。
利用微生物菌剂提高作物产量、改善作物品质、防治作物病害、节约化肥，提高土壤的持续增产潜力有重要地位。
利用微生物菌剂提高作物产量、改善作物品质、防治作物病害、节约化肥，提高土壤的持续增产潜力有重要地位。
[0012] 做为防治土传病害的微生物菌剂产品各国非常重视，已经商品化产品如澳大利亚的K84，放射形龙杆菌菌株K84(Agrobacteriumra diobacterstrain k84)在1973年就被大规模生产，用来防治由根癌病土壤(Agrobacterium tumefaciens)引起的感染(Kerr，A，1980)；1988年Gustafson公司在美国注册生产A13的PGPR产品Kodiak，成为作物促生菌商业化生产的拓疆者，商业化最成功的产品是Agrobacterium radiobacter K84。美国研制的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex(哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德国开发的商品制剂ContansWG可以用于防治莴苣的核盘菌菌核病等等。此外还有针对粘帚霉的由美国研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂(生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病(沈寅初，2000)，我国开发的5406抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌，对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长(包建中，1998)。江苏省农科院植保所防治水稻病害的拮抗细菌(Bacillus subtilis)，大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，对纹枯病防效达
75％～85％，对稻曲病防效达63.8％～85.7％(陈志谊，2001)。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢杆菌，荧光假单孢杆菌(Pseudomonas radiobacter)防治小麦全蚀病等。
75％～85％，对稻曲病防效达63.8％～85.7％(陈志谊，2001)。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢杆菌，荧光假单孢杆菌(Pseudomonas radiobacter)防治小麦全蚀病等。
[0013] 微生物菌剂防治土传病害、连作障碍是当前主要发展方向。大棚蔬菜土壤、大豆连作农田、棉花产区农田、西瓜生产基地农田等是我国土传病害、连作障碍最为严重的地区，研制、开发和生产防治主要作物土传病害以及连作障碍，对于我国粮食增产、减少农药使用量、保障农产品品安全作用巨大。
[0014] 广适应型的溶磷生物菌种资源不仅我国缺乏，而且世界范围也未见报道，广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌剂研发未见报道。在溶磷促生的基础上，配合高效防治土传病害的菌株，在解决提供磷素营养的同时，解决防治土传病害和提高作物产量的技术瓶颈。本研究主要针对危害最为严重的真菌病害，选用了世界上防治土传病害效果最好的菌种。将广泛适应性溶磷微生物菌种与高效拮抗土传病害的微生物菌种联合使用，能够更加有效地达到溶解土壤难溶磷、提高磷肥利用率的同时，防治土传病害和提高作物产量的多个目标。因此，为我国缺磷和磷肥利用率低、土传病害严重、增产潜力下降地区的农田提供高效多功能微生物菌剂，对我国粮食持续增产、节约磷肥资源、减少作物病害和保护农田生态环境具有重要意义。
发明内容
[0015] 本发明的目的是针对我国缺磷和磷肥利用率低、土传病害严重、增产潜力下降的农田的现状，提供一种新的溶磷复合微生物菌剂及其应用。
[0016] 为了实现本发明目的，本发明提供一种首次分离自我国湖南省浏阳磷矿区土壤中的溶磷菌，菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年12月12日，保藏号CGMCC NO.5568。
[0017] 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A菌落形态为：菌落不规则，光滑，黄色；G-，杆菌，有鞭毛，运动性。
[0018] 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的微生物学特性为：苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，赖氨酸脱羧酶实验为阳性，利用丙二酸，利用卫矛醇产酸。V-P试验阴性，甲基红MR反应阳性，明胶液化反应阳性，吲哚阴性，脲酶阴性，H2S产生阴性，丙二酸利用反应阳性，柠檬酸利用阴性，硝酸盐还原反应阳性，苯丙氨酸脱氨阴性，赖氨酸脱羧酶反应阳性，精氨酸双水解酶阴性，葡萄糖产酸反应阳性，葡萄糖产气阴性，甘露醇反应阳性，卫矛醇反应阳性，肌醇反应阳性，半乳糖反应阳性，鼠李糖反应阳性，山梨醇反应阳性，阿拉伯糖反应阳性，果糖反应阳性，木糖反应阳性，海藻糖+d。
[0019] 本发明还提供含有所述菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的微生物菌剂。
[0020] 本发明还提供菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A及其微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病和/或白粉病等。
[0021] 本发明还提供一种溶磷复合微生物菌剂，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、哈兹木霉(Trichoderma harzianum)以及淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。
[0022] 优选地，其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A，保藏号CGMCC NO.5568，寡雄腐霉(Pythium oligandrum)，保藏号CCF141，哈兹木霉(Trichoderma harzianum)，保藏号ATCC20847，以及淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏号ATCC38740。
[0023] 其中，寡雄腐霉(Pythium oligandrum)保藏在捷克国家菌种保藏中心(CCF)，保藏号CCF1417；哈兹木霉(Trichoderma harzianum)，保藏在美国标准微生物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC20847；淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)保藏在美国标准微生物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC38740。
[0024] 前述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；其中，所述的添加剂为二氧化硅(200目)、高岭土、钾长石粉(200目)、沸石粉(200目)、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的一种或多种；所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等；所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、动物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的一种或多种。
[0025] 前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成：
[0026]
[0027] 优选地，前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成：
[0028]
[0029]
[0030] 其中，菠萝泛菌P41-3A菌剂中活菌数为2×108-3×108cfu/g，寡雄腐霉菌剂中活7 8 7 8
菌数为1×10-1×10cfu/g，哈兹木霉菌剂中活菌数为1×10-1×10cfu/g，淡紫拟青霉菌
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剂中活菌数为1×10-1×10cfu/g。
菌数为1×10-1×10cfu/g，哈兹木霉菌剂中活菌数为1×10-1×10cfu/g，淡紫拟青霉菌
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剂中活菌数为1×10-1×10cfu/g。
[0031] 本发明还提供前述复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病和/或白粉病等。
[0032] 本发明还提供前述复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。所述作物优选为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜及其它蔬菜或作物。
[0033] 本发明还提供前述复合微生物菌剂在活化土壤难溶磷以及降低化肥用量中的应用。适宜的土壤为黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等。
[0036] 本发明的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A，是一株高效溶磷促生菌，在使用化肥的土壤条件下，它在我国主要土壤、主要作物上都表现显著增产的作用，一般增产10-20％，甚至达到50％。以黑土增产最为显著。适用于大豆、玉米、小麦、棉花、油菜、水稻、蔬菜等主要作物。
[0037] 本发明的溶磷复合微生物菌剂中寡雄腐霉CCF1417、哈兹木霉ATCC20847、淡紫拟青霉ATCC38740防治作物病害效果显著，已有较多研究报道。
[0038] 本发明以我国主要土壤为研究对象，开展了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选，获得了大量溶磷菌株，经过研究这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力、增产效果，获得了一株广泛使用我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷菌株，适合我国南方、北方、西北、东北、西南等区域的典型土壤，为挖掘溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源提供菌种资源和技术支撑。
[0039] 本发明的溶磷复合微生物菌剂具有高效溶解难溶磷、防治多种病害和促进作物增产的作用，是一种可有效降低化肥用量、节约化肥资源、防治土传病害、提高作物产量的复合微生物菌剂，其有益效果为：
[0040] (一)溶解难溶磷、促进作物生长效果显著；
[0041] (二)防治多种作物病害，包括根腐病、枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白绢病、白粉病等；
[0042] (三)该菌剂溶磷效果不受化学肥料影响，使用化肥条件下作物持续增产；
[0043] (四)使用地域范围广，适用于我国黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等；
[0044] (五)适合提高玉米、大豆、小麦、水稻、棉花、油菜和蔬菜等主要作物的产量；
[0045] (六)使用简便，颗粒菌剂可以与大豆、玉米、棉花、小麦播种机一起使用，也可以与多元复合肥、尿素、磷酸二铵、红色钾肥等颗粒肥一起机械施用。
具体实施方式
[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0047] 实施例1菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的分离及培养
[0048] 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A分离自我国湖南省浏阳磷矿区的土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年12月12日，保藏号CGMCC NO.5568。
[0049] 溶磷促生菠萝泛菌P41-3A的培养：
[0050] (1)菠萝泛菌P41-3A培养基
[0051] 发酵液配方(kg/t发酵液)：磷酸氢二钾0.1，磷酸二氢钾0.1，氯化钠4.3，硫酸镁0.1，淀粉8.6，牛肉膏4.3，蛋白胨4.3，酵母粉4.3，蔗糖8.6，硫酸铵2.6，碳酸钙10，硫酸亚铁0.001，豆油6.8，以水配制。
[0052] (2)培养过程
[0053] 将菠萝泛菌P41-3A菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28-30℃培养48h，然后接入1000mL三角瓶，在30℃，220r/min下，培养36h。按5％接种量接入到50L种子罐中，在220r/min，pH7.5，通气量0.5VVm下，培养2d后，再按10％的接种量装入到500L的发酵罐中，在200r/min，pH7.5，通气量0.7VVm下，培养3d。发酵完成后，以1∶3-6倍比例的高岭土吸附。
[0054] 3.菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的形态及微生物学特性
[0055] 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A菌落形态为：菌落不规则，光滑，黄色；G-，杆菌，有鞭毛，运动性。
[0056] 菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A的微生物学特性为：苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，赖氨酸脱羧酶实验为阳性，利用丙二酸，利用卫矛醇产酸。V-P试验阴性，甲基红MR反应阳性，明胶液化反应阳性，吲哚阴性，脲酶阴性，H2S产生阴性，丙二酸利用反应阳性，柠檬酸利用阴性，硝酸盐还原反应阳性，苯丙氨酸脱氨阴性，赖氨酸脱羧酶反应阳性，精氨酸双水解酶阴性，葡萄糖产酸反应阳性，葡萄糖产气阴性，甘露醇反应阳性，卫矛醇反应阳性，肌醇反应阳性，半乳糖反应阳性，鼠李糖反应阳性，山梨醇反应阳性，阿拉伯糖反应阳性，果糖反应阳性，木糖反应阳性，海藻糖+d。
[0057] 实施例2高效溶磷抗病增产微生物菌剂的制备
[0058] 1.寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌的培养
[0059] 寡雄腐霉(Pythium oligandrum)保藏在捷克国家菌种保藏中心(CCF)，保藏号CCF1417；哈兹木霉(Trichoderma harzianum)，保藏在美国标准微生物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC20847；淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)保藏在美国标准微生物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC38740。
[0060] (1)培养基的组成(kg/t发酵液)
[0061] 可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，FeSO4
0.001kg，硼酸(1％)1L，pH 7.0，以水配制。
0.001kg，硼酸(1％)1L，pH 7.0，以水配制。
[0062] (2)发酵培养过程
[0063] 将寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌分别接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25-28℃培养3d。寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌分别进行发酵培养。首先将寡雄腐霉孢子转接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液体培养36h。然后按1％接种量接入到
50L种子罐中，在200r/min，pH7.0，通气量0.7VVm下，培养36h后，再按10％的接种量装入到500L的发酵罐中，在220r/min，pH7.0，通气量0.7VVm下，培养3d。依次进行哈兹木霉、淡紫拟青霉菌的发酵培养。3株丝状真菌分别发酵完成后，分别加入保活剂，按照1∶3～
6的比例二氧化硅吸附。
50L种子罐中，在200r/min，pH7.0，通气量0.7VVm下，培养36h后，再按10％的接种量装入到500L的发酵罐中，在220r/min，pH7.0，通气量0.7VVm下，培养3d。依次进行哈兹木霉、淡紫拟青霉菌的发酵培养。3株丝状真菌分别发酵完成后，分别加入保活剂，按照1∶3～
6的比例二氧化硅吸附。
[0064] 2.高效溶磷促生抗病菌剂制备
[0065] 溶磷细菌P41-3A、寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌分别发酵完成后，分别加入8 8
保活剂。菠萝泛菌P41-3A以高岭土吸附，活菌数2×10-3×10cfu/g。寡雄腐霉、哈兹木霉
7 8
和淡紫拟青霉菌分别加入保活剂，分别以二氧化硅吸附，各真菌的活菌数为1×10-1×10/g。然后，按照菠萝泛菌、寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌的体积比1∶0.5∶0.5∶0.5混合均匀。
保活剂。菠萝泛菌P41-3A以高岭土吸附，活菌数2×10-3×10cfu/g。寡雄腐霉、哈兹木霉
7 8
和淡紫拟青霉菌分别加入保活剂，分别以二氧化硅吸附，各真菌的活菌数为1×10-1×10/g。然后，按照菠萝泛菌、寡雄腐霉、哈兹木霉和淡紫拟青霉菌的体积比1∶0.5∶0.5∶0.5混合均匀。
[0066] 3.高效溶磷促生抗病菌剂造粒
[0067] 将以上吸附、混合好的菌体，加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂，用于与玉米、大豆、棉花种子一起机械播种施入土壤，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。
[0068] 实验例1菠萝泛菌P41-3A培养皿条件下溶解难溶磷的效果
[0069] 1.从我国湖南省浏阳磷矿区酸性土壤样品中，分离筛选了溶磷菌菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P41-3A，同时，分离筛选了溶磷菌株P40、P36和P40-2。在室内固体培养皿培养、液体培养基培养条件下，测定了它们的溶磷能力。
[0070] 溶磷菌株P41-3A溶磷圈与菌落直径比值达到了4.80，溶磷圈内溶解的水溶性溶(P2O5)为3.76mg；菌株P40、P36和P40-2的溶磷圈与与菌落直径比值分别为4.00、2.83和1.56，溶磷圈内的溶磷量(P2O5)分别为3.13、2.21和1.22mg，都低于菌株P41-3A(表1)。
[0071] 表1溶磷菌株在含Ca3(PO4)2培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)[0072]
[0073] 注：a、b、c表示处理组之间差异显著，ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
[0074] 2.在液体培养条件下，进行了菌株P41-3A、P36、P40和P40-2的溶磷试验。结果显示，4株溶磷菌中，以菌株P41-3A从磷酸三钙中溶解出来的有效磷最多，溶磷率最高。经过7天液体条件下培养，接种菌株P41-3A的液体培养基中有效磷达到1019.18mg/L，溶磷率为22.27％；溶磷菌株P36培养7天有效磷达到930.50mg/L，溶磷率为20.33％；溶磷菌株P40培养7天有效磷达到566.30mg/L，溶磷率为12.38％；溶磷菌株P40-2培养7天有效磷达到264.33mg/L，溶磷率仅为5.78％(表2)。
[0075] 表2液体摇瓶体条件下(7d)溶磷菌磷酸三钙的效果(磷酸三钙10.0g/L)[0076]
[0077] 注：a、b、c表示处理组之间差异显著，ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
[0078] 3.在固体培养基培养条件下，菌株P36能够溶解羟基磷灰石、磷酸锌、磷酸铁三种难溶磷，溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)在三种难溶磷培养基上分别达到了2.30、2.90和2.50；菌株P41-3A、P40、P40-2能够溶解羟基磷灰石、磷酸锌两种难溶磷，其中，菌株P40溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)在羟基磷灰石、磷酸锌培养基上分别为3.00和5.00。菌株P41-3A溶解羟基磷灰石的能力强于其他3株溶磷菌，溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)高达
4.50，而P36、P40、P40-2菌株显著低于菌株P41-3A，分别为2.30，3.00和3.80(表3)。
4.50，而P36、P40、P40-2菌株显著低于菌株P41-3A，分别为2.30，3.00和3.80(表3)。
[0079] 表3溶磷菌在三种难溶磷酸盐固体平板上的溶解圈(d/D)
[0080]
[0081] 注：a、b、c表示处理组之间差异显著，ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
[0082] 实验例2溶磷菌P41-3A在不同土壤上对玉米的溶磷促生效果
[0083] 采用五种土壤分别为黑土、黑钙土、白浆土、潮土、褐土，作物为玉米。试验包括两个处理：(1)对照(CK)不使用菌剂；(2)溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂8
P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土(不灭菌)1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种5粒发芽一致的玉米种子。第一次浇水250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。
P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土(不灭菌)1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种5粒发芽一致的玉米种子。第一次浇水250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。
[0084] 试验结果显示，使用氮磷钾化学肥料条件下，溶磷菌剂P41-3A菌株仍表现显著的增产效果(表4)。褐土、潮土、白浆土、黑土和黑钙土上玉米生物量分别增加24.3％、24.4％、7.8％、18.8％和16.9％；褐土、潮土、白浆土、黑土、黑钙土干重生物量分别增加
33.3％、18.2％、7.3％、22.2％和12.5％。溶磷菌剂适合褐土、潮土、黑土与玉米作物的配合使用，增产效果略高于白浆土和黑钙土。溶磷菌剂P41-3A的作用效果不受化肥使用的抑制，溶磷菌剂P41-3A可以在正常使用化肥条件下使用。
33.3％、18.2％、7.3％、22.2％和12.5％。溶磷菌剂适合褐土、潮土、黑土与玉米作物的配合使用，增产效果略高于白浆土和黑钙土。溶磷菌剂P41-3A的作用效果不受化肥使用的抑制，溶磷菌剂P41-3A可以在正常使用化肥条件下使用。
[0085] 表4不同土壤条件下溶磷微生物菌剂对玉米生物量的作用效果
[0086]
[0087]
[0088] 注：＜0.05表示处理间差异显著性达5％标准，＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0089] 实验例3溶磷菌P41-3A在不同土壤上对冬小麦的溶磷促生效果
[0090] 试验土壤为潮土和褐土，作物为小麦。试验包括两个处理：(1)对照(CK)不使用8
菌剂；(2)溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种8粒发芽一致的小麦种子。第一次浇水
250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。
菌剂；(2)溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种8粒发芽一致的小麦种子。第一次浇水
250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获，测定植株生物量。
[0091] 试验结果显示，在施用化肥条件下，潮土和褐土使用溶磷菌剂P41-3A能够显著提高小麦的生物量(表5)。褐土使用溶磷菌剂P41-3A，小麦鲜重和干重增分别增加11.0％和13.7％；潮土接种溶磷菌剂P41-3A增产略低于褐土，小麦鲜重和干重增加为10.2％和8.9％。溶磷菌剂P41-3A在潮土和褐土上都能够增加小麦生物量，使用化学肥料不影响其增产作用效果。因此，溶磷菌剂P41-3A适合在正常使用化肥条件下使用。
[0092] 表5不同土壤条件下溶磷微生物菌剂对小麦生物量的作用效果
[0093]
[0094] 注：＜0.05表示处理间差异显著性达5％标准，＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0095] 实验例4溶磷菌P41-3A在不同土壤上对大豆的溶磷促生效果
[0096] 试验土壤为潮土和褐土，作物为大豆。试验包括两个处理：(1)对照(CK)不使用8
菌剂；(2)溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种6粒发芽一致的大豆种子。第一次浇水
250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获。测定植株生物量。
菌剂；(2)溶磷菌剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(活菌数为3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾化学肥料，使用量分别为100mg/kg土壤、120mg/kg土壤和80mg/kg土壤(即N-P2O5-K2O：60-55-50mg/kg土壤)。化学肥料、溶磷菌剂与土壤混合均匀，播种6粒发芽一致的大豆种子。第一次浇水
250mL/盆，以后保持60-70％的田间持水量，出苗后一周追施0.2％钼酸铵2mL/盆。60d后收获。测定植株生物量。
[0097] 试验结果显示，在施用化肥条件下，使用溶磷菌剂P41-3A在潮土、黑土、水稻土3种土壤上都能够提高大豆作物的生物量。黑土上使用溶磷菌剂P41-3A的大豆生物量最高，大豆鲜重和干重分别增加19.5％和23.7％；水稻土使用溶磷菌剂P41-3A，生物量增加11.6％和10.6％；潮土接种溶磷菌剂P41-3A增产最少，大豆鲜重和干重增加仅为2.8％和
5.8％。溶磷菌剂P41-3A在黑土-大豆作物上使用可以获得更高的产量，使用化学肥料不影响溶磷菌剂的作用效果。
5.8％。溶磷菌剂P41-3A在黑土-大豆作物上使用可以获得更高的产量，使用化学肥料不影响溶磷菌剂的作用效果。
[0098] 表6不同土壤条件下溶磷微生物菌剂对大豆生物量的作用效果
[0099]
[0100] 注：＜0.05表示处理间差异显著性达5％标准，＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0101] 实验例5使用化学肥料条件下菌株P41-3A的增产效果
[0102] 采用我国9种典型土壤、5种主要栽培作物，土壤盆栽条件下进行了溶磷微生物P41-3A的溶磷促生效果研究。试验包括两个处理：(1)对照(CK)不使用菌剂；(2)溶磷菌8
剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，N、P2O5、K2O用量分别为
60mg/kg土壤、55mg/kg土壤、50mg/kg土壤。生长40天收获。
剂处理，每公斤土壤使用5g溶磷菌剂P41-3A(3×10cfu/g)，每个处理重复3次。每盆装土1kg，所有处理都使用尿素、磷酸二氢钠、氯化钾氮磷钾化学肥料，N、P2O5、K2O用量分别为
60mg/kg土壤、55mg/kg土壤、50mg/kg土壤。生长40天收获。
[0103] 作物生物量鲜重数据显示，使用溶磷菌剂P41-3A，在我国9种主要土壤、5种主要作物上都表现增产作用，增产幅度为12.8-142.1％，灰钙土上增产玉米增产54.0％，沙姜黑土上增产小麦69.4％，水稻土上增产油菜129.3％，盐潮土上增产油菜142.1％，白浆土上增产玉米14.7％，潮土上增产小麦24.7％，潮土上增产玉米85.3％，褐土上增产玉米50.5％，黑钙土上增产玉米29.0％，黑土上增产大豆85.6％，黑土上增产玉米29.9％，灰漠土上增产棉花27.03％，褐土上增产大豆12.8，灰钙土上增产玉米增产54.0％，沙姜黑土上增产小麦69.4％，水稻土上增产油菜129.3％，盐潮土上增产油菜142.1％，白浆土上增产玉米14.7％，潮土上增产小麦24.7％，潮土上增产玉米85.3％，褐土上增产玉米50.5％，黑钙土上增产玉米29.0％，黑土上增产大豆85.6％，黑土上增产玉米29.9％，灰漠土上增产棉花27.03％和褐土上增产大豆12.8。
[0104] 作物生物量干重数据显示，使用溶磷菌剂P41-3A，所有9中土壤和5种作物都能够增产，增产幅度为7.4-104.3％。灰钙土上玉米增产12.6％、沙姜黑土上增产小麦13.8％、水稻土上增产油菜95.1％、盐潮土上增产油菜7.4％、白浆土上增产玉米12.5％、潮土上增产小麦35.0％、潮土上增产玉米39.1％、褐土上增产玉米32.2％、黑钙土上增产玉米13.9％、黑土上增产大豆104.3％、黑土上增产玉米36.9％、灰漠土上增产棉花13.93％，褐土上增产大豆17.2％。
[0105] 接种溶磷菌剂P41-3A，油菜增产最高，玉米、小麦增产较高，大豆、棉花增产幅度较小。不同土壤对菌剂反应不同，黑钙土、砂姜黑土、水稻土和盐化潮土增产幅度较大，而白浆土、潮土和褐土增产幅度较小。
[0106] 表7溶磷菌株P41-3A在不同土壤条件下对作物的生物量的影响(g/盆)[0107]
[0108]
[0109] 注：＜0.05表示处理间差异显著性达5％标准，＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0110] 实验例6溶磷菌剂P41-3A田间施用对玉米的增产作用
[0111] 田间试验条件下使用溶磷菌剂P41-3A，显著提高春玉米产量。石家庄褐土试验结果显示，与不使用菌剂的对照相比，使用菌剂P41-3A每亩增加玉米255.2kg/亩，增产50.4％(表8)。
[0112] 表8溶磷菌株P41-3A田间使用对春玉米的增产效果(石家庄、石灰型褐土)[0113]
[0114] 注：＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0115] 保定市田间条件下褐土试验结果显示，使用溶磷菌剂P41-3A，显著提高夏玉米产量。与不使用菌剂的对照相比，菌剂P41-3A每亩增加玉米51.9kg/亩，增产10.2％(表9)。
[0116] 表9溶磷菌株P41-3A田间使用对夏玉米的增产效果
[0117]
[0118] 注：＜0.01表示处理间差异显著性达1％标准。
[0119] 实验例7溶磷抗病增产复合微生物菌剂的田间示范效果
[0120] 2011年在黑龙江、吉林、河北对实施例2的溶磷抗病增产复合微生物菌剂进行了田间示范，取得了比较好的结果。
[0121] (1)示范地点：黑龙江省北安市龙门农场
[0122] 示范面积200亩，每垧地(15亩)施用生物菌剂75公斤，采用与化肥一起机械播施作为种肥；对照：不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥作底肥，每垧地使用复合肥375公斤，复合肥氮磷钾含量15-15-15，示范作物为大豆。
[0123] 结果显示，使用微生物菌剂的大豆产量205kg/亩，使用菌剂大豆生育期发病轻，而对照的根腐病严重，导致减产，大豆产量平均180kg/亩。使用微生物菌剂能够提高大豆产量25公斤/亩，增产13.9％。
[0124] (2)示范地点：黑龙江省齐齐哈尔市
[0125] 示范面积100亩，生物菌剂施用量每垧75公斤，采用与化肥一起机械播施作为种肥；对照：不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥，每垧地机播复合肥370公斤，复合肥氮磷钾含量15-15-15，示范作物为大豆。
[0126] 结果显示，使用微生物菌剂的大豆产量198kg/亩，大豆生育期发没有病害发生，而对照的根腐病严重，大豆产量平均171kg/亩。使用微生物菌剂能够提高大豆产量27公斤/亩，增产15.8％。
[0127] (3)示范地点：黑龙江省伊春市
[0128] 示范面积340亩，每垧地使用生物菌剂75公斤，采用与化肥一起机械播施作为种肥；对照：不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥作底肥，每垧地使用复合肥375公斤，复合肥氮磷钾含量15-15-15，示范作物为大豆。
[0129] 结果显示，使用微生物菌剂的大豆产量221kg/亩，大豆生育期发没有病害发生，而对照的根腐病严重，大豆产量平均193kg/亩。使用微生物菌剂能够提高大豆产量28公斤/亩，增产14.71％。
[0130] (4)示范地点：吉林省公主岭
[0131] 示范面积100亩，每亩生物菌剂施用量25公斤，撒施翻入耕层作为底肥；对照：不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量复合肥作底肥，每亩使用复合肥30公斤，示范作物玉米。
[0132] 示范结果显示，使用微生物菌剂玉米产量544.7公斤，没有玉米病害发生，不使用微生物菌剂的玉米产量596.4公斤。使用生物菌剂的玉米产量提高9.49％。
[0133] (5)河北省石家庄市井陉县
[0134] 示范面积200亩，每亩生物菌剂施用量25公斤，撒施翻入耕层作为底肥；对照：不使用生物菌剂。对照和菌剂示范田都使用同量尿素化肥，每亩使用尿素25公斤，示范作物春播玉米、夏播玉米，各100亩。
[0135] 示范结果显示，使用生物菌剂春玉米产量650公斤以上，没有玉米茎腐病和黑穗病发生；而不使用生物菌剂的玉米产量518公斤，没有黑穗病发生。使用生物菌剂的玉米产量提高25.48％。使用生物菌剂夏播玉米产量558公斤以上，没有玉米茎腐病和黑穗病发生；而不使用生物菌剂的玉米产量506公斤，没有黑穗病发生。使用生物菌剂的玉米产量提高9.32％。
[0136] (6)河北省沧州市沧县
[0137] 示范面积200亩，每亩生物菌剂施用量25公斤，撒施翻入耕层作为底肥；对照：不使用生物菌剂。所有对照、菌剂示范田都使用施复合肥25kg/亩，示范作物夏玉米。
[0138] 示范结果显示，使用生物菌剂玉米产量605公斤，没有玉米茎腐病和黑穗病发生；而不使用生物菌剂的玉米产量509公斤，个别黑穗病发生。使用生物菌剂的玉米产量提高
18.86％。
18.86％。
[0139] 表10溶磷抗病增产微生物菌剂田间示范结果
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