眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法
专利汇可以提供眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种眼镜蛇毒神经生长因子将骨髓间充质干细胞诱导分 化成 软骨细胞的方法，它包括：从眼镜蛇毒中分离纯化NGF；从SD乳鼠的四肢骨髓中分离出间充质干细胞；将一定数目的干细胞悬液加入到含有NGF的培养基中进行诱导培养，诱导7、14、21天后，通过免疫组化、糖胺多糖定量检测以及聚合酶链式反应等技术手段研究自提取的蛇毒NGF对大鼠骨髓间充质干细胞的软骨诱导作用。实验结果表明眼镜蛇毒NGF能促进该细胞向软骨方向分化，说明眼镜蛇毒NGF是一种有潜 力 的 治疗 软骨缺损的生长因子，经本发明方法的诱导，所产生的软骨细胞可用于大规模的体内移植治疗软骨缺损，有利于软骨组织工程的临床推广和应用。，下面是眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法专利的具体信息内容。
1.一种眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征是：
（1）从眼镜蛇毒中分离并纯化神经生长因子NGF；
（2）采用PC12神经细胞株进行NGF的活性鉴定；
（3）用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行NGF的纯度鉴定；
（4）无菌条件下，从SD乳鼠的四肢骨头的骨髓中分离出大鼠骨髓间充质干细胞，放入含有15%FBS、1%青链霉素的α-MEM培养基中；
（5）体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；
（6）选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24孔板中，
4
浓度为每孔2×10个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度，即3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml的NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天；阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子β1、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% 胎牛血清；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS；
（7）诱导7、14、21天后，通过免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达情况，苏木精-伊红染色观察各组细胞形态，DNA检测考察细胞增殖情况，利用二甲基亚甲基蓝检测细胞分泌的糖胺多糖含量，通过实时聚合酶链式反应检测软骨特异蛋白的表达量，从而鉴定自提取的蛇毒神经生长因子冻干粉对rBMSCs的软骨诱导作用。
2.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：
所述步骤（1）是称量眼镜蛇毒2g，在4℃环境下完全溶于10ml 1% 乙酸，12000 转/分钟，4℃，离心10分钟，收集上清液；将收集的上清液缓慢通过准备好的葡聚糖凝胶G-75凝胶柱中，层析仪设置流速1ml/分钟，每管10分钟，用1%HAC溶液进行洗脱，收集具有NGF活性的各峰段洗脱液，得到55ml；将得到的洗脱液透析过夜，期间换3-4次蒸馏水； 将透析后液体通过准备好的CM Sepharose CL-6B离子胶，1mol/L NaCl和0.025mol/L、pH为5.8的NaAC-HAC混合液进行线性洗脱，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。
3.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：
所述步骤（2）是将各峰冻干品配成2.0µg/ml并作用于PC12细胞；24小时后，可见第三个峰样品组细胞长出多个神经纤维样突触，有长有短，突触数目不等，有部分甚至交织成网状，其他各峰样品组PC12细胞体积缩小，呈球形，无突起；表明第三峰为目的蛋白；
步骤（2）的结果显示所提蛋白呈单一条带，说明所提的神经生长因子纯度较高。
4.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：
所述步骤（3）是将出生3-7天的SD乳鼠，无菌条件下取下乳鼠胫骨和股骨，在无菌培养皿中切除两端干骺端, 显露骨髓腔；然后用1ml无菌注射器吸取含15%FBS、1%青链霉素的α-MEM基础培养基，将骨中的骨髓冲出，直至骨头发白；
然后将含骨髓的培养基吹打均匀，分到培养瓶中。
5.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：
所述步骤（4）是将细胞培养瓶放入37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，2~3天换液一次；细胞长至80%左右融合度，采用胰蛋白酶进行消化传代。
6.如权利要求1所述的采用眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法，其特征在于：
所述步骤（5）诱导液可按分组进行配置，分组：空白组；阳性对照组，用含TGF-β1的软骨诱导液培养；NGF浓度组包括：N1组，NGF终浓度3μg/ml； N2组，NGF终浓度6μg/ml和N3组，NGF终浓度12μg/ml；
N1、N2、N3组中的NGF都配制成各自浓度的诱导液，除TGF-β1外，其他成分和软骨诱导液相同；每隔三天换液一次，7、14、21天后分别收集细胞。
眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法
技术领域
背景技术
发明内容
(2)采用PC12神经细胞株进行NGF的活性鉴定；
(3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行NGF的纯度鉴定；
(4)无菌条件下，从SD乳鼠的四肢骨头的骨髓中分离出大鼠骨髓间充质干细胞，放入含有15%FBS、1%青链霉素的α-MEM培养基中；
(5)体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；
(6)选用细胞状态良好的第三代rBMSCs，消化收集细胞并计数，接种细胞于24孔板中，
4
浓度为每孔2×10个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度，即3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml的NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天；阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子β1、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% 胎牛血清；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS；
(7)诱导7、14、21天后，通过免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达情况，苏木精-伊红染色观察各组细胞形态，DNA检测考察细胞增殖情况，利用二甲基亚甲基蓝检测细胞分泌的糖胺多糖含量，通过实时聚合酶链式反应检测软骨特异蛋白的表达量，从而鉴定自提取的蛇毒神经生长因子冻干粉对rBMSCs的软骨诱导作用。
附图说明
图3 PC12细胞检测NGF活性（分别采用NGF浓度a:2μg/ml，b:4μg/ml，c:6μg/ml，d:8μg/ml 对PC12细胞进行活性检测）
图4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测NGF冻干品的纯度
图5 HE染色图片
图6Ⅱ型胶原免疫组化图片
图7 DNA检测结果
图8 GAG检测结果
图9 Real-time PCR结果。
具体实施方式
（2）rBMSCs的培养及扩增：体外培养rBMSCs并扩增至所需的数目；将细胞培养瓶放入
37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，2~3天换液一次；细胞长至80%左右融合度，采用胰蛋白酶进行消化传代。
4
浓度为每孔2×10个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度（3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml）NGF、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物（ITS）、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10%胎牛血清（FBS），每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天14天和21天。阳性对照组采用的诱导液为：10ng/ml 转化生长因子β1（TGF-β1）、50mg/mL胰岛素/转铁蛋白/硒混合物 ITS、100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS；阴性对照组采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS。
1ml/分钟，每管10分钟，用1%HAC溶液进行洗脱，收集具有NGF活性的各峰段洗脱液，得到55ml。将得到的洗脱液透析过夜，期间换3-4次蒸馏水；将透析后液体通过准备好的CM Sepharose CL-6B离子胶，1mol/L NaCl和0.025mol/L NaAC-HAC（PH5.8）混合液进行线性洗脱，收集得到各峰洗脱液，再分别进行透析除盐和冻干。经sephadex G-75凝胶柱分离后，目的蛋白在第II峰，见图1。经CM Sepharose CL-6B离子胶分离，目的蛋白在第III峰，见图2。
中，浓度为每孔2×10个细胞，待细胞贴壁后，加入含有诱导液的高糖DMEM培养基进行诱导培养，诱导液含有：分别加入三种浓度NGF（分为三组：N1组，NGF终浓度3μg/ml； N2组，NGF终浓度6μg/ml和N3组，NGF终浓度12μg/ml）、50mg/mL ITS、100nmol/L地塞米松、
50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS，每隔24小时更换上述培养基一次，分别诱导7天，14天和21天。阳性对照组(T组)采用的诱导液为：10ng/ml TGF-β1、50mg/mL ITS、
100nmol/L地塞米松、50μg/ml 抗坏血酸、1%青链霉素、10% FBS；阴性对照组(K组)采用高糖DMEM培养基加1%青链霉素、10% FBS。
2~3小时；去掉一抗，PBS洗3次，3分钟/次；滴加二抗，室温孵育30分钟，PBS洗3次，3分钟/次；滴加现配的3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶液，显微镜下观察显色3~5分钟；
蒸馏水洗3次，3分钟/次，苏木素复染15秒，自来水返蓝，干燥，最后用中性树胶封片。检测各组Ⅱ型胶原的表达情况。诱导7天的各组，均未见Ⅱ型胶原阳性表达。而诱导14天，空K组Ⅱ型胶原免疫组化为阴性，表明未表达Ⅱ型胶原；TGF-β1组及各NGF处理组，均有Ⅱ型胶原阳性表达，其中TGF-β1组及N2浓度组表达较为显著。诱导21天后，空白组II型胶原表达较低，而TGF-β1组及各NGF处理组，均有Ⅱ型胶原阳性表达，其中TGF-β1组及N2浓度组表达较为显著。见图6。
525nm检测光密度（OD）值，对应浓度，绘出标准曲线。②样品GAG检测：吸掉24孔板中培养基，PBS洗一次，胰蛋白酶消化，离心收集细胞。弃去上清液后，加1mlPBS重悬细胞。然后加入5μl 20mg/ml 蛋白酶K，58℃水浴过夜。取100μl 样品，加2.5ml DMMB，混合均匀后，加入96孔板中，每组做4个复孔，525nm检测OD。结合CS标准曲线，计算出各组GAG的含量。每组测定5个样品的DNA和GAG总量，计算出单位DNA的GAG含量，用SPSS统计软件进行数据结果分析，P值小于0.01为特别显著差异（用**表示），小于0.05为显著差异（用*表示）。诱导7天、14天、21天，相比空白组，NGF各浓度组和TGF-β1组细胞分泌的GAG含量均有所提高（p<0.01），其中TGF-β1组变化最为显著，N2-7组其次。见图8。
0.05为显著差异（用*表示）。诱导7天后，各组中均检测不到COL II、COL X，而Acan、SOX9和COL I均有表达，T组最高，N2组其次。诱导14天后，各组仍然未检测到COL X的表达；
除K组外，其他各组均检测到COL II的表达，N2组与T组表达最高；Acan、SOX9和COL I的表达，T组最高，N2组其次。诱导21天后，各组仍然未检测到COL X的表达；K组COL II的表达极低，T组最高，N2组其次；Acan、SOX9和COL I的表达，T组最高，N2组其次。见图
9。
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