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一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

阅读：534发布：2021-04-14

专利汇可以提供一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以短须裂腹鱼心脏组织为材料，采用组织块法和两酶消化法，在含有胎牛血清和细胞生长因子，pH值为7.0-7.2 的M199培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、操作简便；2、降低了纯组织块法对心脏细胞的损伤；3、构建的短须裂腹鱼心脏细胞系形态为成纤维样，生长状态良好，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；4、该构建方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。，下面是一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其特征在于该方法的步骤如下：
（1）制备PBS消毒液和细胞培养液
PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；
基础培养液：向M199培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；
原代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为150IU/ml，链霉素浓度为
150µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；
传代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml；
调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；
（2）原代培养
以75%的酒精消毒1龄健康短须裂腹鱼鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗心脏组织3次后，用无菌器械剪成组织小块，然后用2ml 0.2%胰蛋白酶-EDTA消化6 min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反应，1000rpm离心收集心脏组织块，再在心脏组织块中加入2ml 0.1%Ⅳ型胶原酶消化1h，1200rpm离心收集心
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脏组织块及细胞，原代培养液重悬，并将其接种于25 cm细胞培养瓶中，于18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，以除去未贴壁的组织和死细胞；
（3）传代培养
原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1 ml，消化1 min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2进行传代，于18 ℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；
（4）细胞冻存与复苏
（a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括M199培养液，胎牛血清和DMSO，按5:4.5:0.5的体积比混合，现用现配；
（b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心6
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min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存保护液，重悬，使细胞的浓度为1×10个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；
（c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1200 rpm离心6 min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18 ℃培养箱中培养，
5天细胞即长成单层。
（5）各步骤中所用百分比均为体积百分比。

说明书全文

一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。背景技术：

[0002] 鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今形成了一套包括培养基、抗生素、原代培养和传代培养方法等相对完善的细胞培养体系，截止目前，已建立了280余株细胞系。我国鱼类细胞培养历经30余年，也只建立了50余株鱼类细胞系，涉及的种类有约30种，主要以海洋种类为主。从以上事例可以看出，一套成熟的细胞培养技术流程并不是一株细胞系建立成功的必备条件，成熟的技术流程并不能使细胞培养获得成功，细胞培养仍然需要从提供原代细胞物种本身的生物学特性入手，经过艰苦的野外调查和大量的室内实验，对细胞培养体系的培养条件进行调整，找到最优的培养条件，才能使细胞培养获得成功。云南土著淡水鱼类近600种，占中国淡水鱼类的50%，因此，云南土著鱼类种质资源保存显得尤为重要，但细胞培养研究鲜见报道。

[0003] 短须裂腹鱼Schizothorax wangchiachii（Fang，1936）隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)，俗名，面鱼、细甲鱼，主要分布在乌江、金沙江及雅砻江。短须裂腹鱼为底栖鱼类，一般生活在水流较急的峡谷河流之中，在支流多见于急流冲击的深潭中，是当地名贵的野生鱼类，近年调查结果显示，虽在其分布区还有一定数量，但其产量已大大降低。2007年云南水产研究所人工繁殖成功，但存在的主要问题是：鱼苗鱼种十分容易感染小瓜虫病和水霉病，而且一旦感染就迅速蔓延，尤其是小瓜虫病极其难治愈，由此导致苗种大量死亡。同时，野外引种个体需要一段时间才能适应塘养环境，而此适应阶段是各种疾病的爆发期，造成引种个体死亡。因此，病害防治是短须裂腹鱼人工养殖的关键问题，而细胞生物学是研究病毒作用机理的有效手段。另一方面，由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量。因此，需要研究一种短须裂腹鱼细胞系的构建方法，建立短须裂腹鱼细胞系。

[0004] 经文献检索，未见与本发明的相同报道。发明内容：

[0005] 本发明的目的是提供一种操作简便易行的短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，以满足对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究的需要。

[0006] 本发明的短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：

[0007] （1）制备PBS消毒液和细胞培养液

[0008] PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；

[0009] 基础培养液：向M199培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；

[0010] 原代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为150IU/ml，链霉素浓度为150µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；

[0011] 传代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml；

[0012] 调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；

[0013] （2）原代培养

[0014] 以75%的酒精消毒1龄健康短须裂腹鱼鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗心脏组织3次后，用无菌器械剪成组织小块，然后用2ml 0.2%胰蛋白酶-EDTA消化6 min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反应，1000rpm离心收集心脏组织块，再在心脏组织块中加入2ml 0.1%Ⅳ型胶原酶消化1h，1200rpm离心收2
集心脏组织块及细胞，原代培养液重悬，并将其接种于25 cm细胞培养瓶中，于18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，以除去未贴壁的组织和死细胞；

[0015] （3）传代培养

[0016] 原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1 ml，消化1 min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2进行传代，于18 ℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；

[0017] （4）细胞冻存与复苏

[0018] （a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括M199培养液，胎牛血清和DMSO，按5:4.5:0.5的体积比混合，现用现配；

[0019] （b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心6 min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存保护液，重悬，使细胞的浓度6
为1×10个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；

[0020] （c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1200 rpm离心6 min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18 ℃培养箱中培养，5天细胞即长成单层。

[0021] 本发明的各步骤中所用百分比均为体积百分比

[0022] 本发明的显著效果在于：

[0023] 1、操作简便易行。

[0024] 2、降低了纯组织块法对心脏细胞的损伤。

[0025] 3、构建的短须裂腹鱼心脏细胞系形态为成纤维样，生长状态良好，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；

[0026] 4、该构建方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。具体实施方式：

[0027] 本实施例的短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：

[0028] （1）制备PBS消毒液和细胞培养液

[0029] PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；

[0030] 基础培养液：向M199培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；

[0031] 原代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为150IU/ml，链霉素浓度为150µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；

[0032] 传代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml；

[0033] 调节上述培养液的pH值为7.0或7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；

[0034] （2）原代培养

[0035] 以75%的酒精消毒1龄健康短须裂腹鱼鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗心脏组织3次后，用无菌器械剪成组织小块，然后用2ml 0.2%胰蛋白酶-EDTA消化6 min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反应，1000rpm离心收集心脏组织块，再在心脏组织块中加入2ml 0.1%Ⅳ型胶原酶消化1h，1200rpm离心收2
集心脏组织块及细胞，原代培养液重悬，并将其接种于25 cm细胞培养瓶中，于18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，以除去未贴壁的组织和死细胞；原代培养中；

[0036] （3）传代培养

[0037] 原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1 ml，消化1 min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2进行传代，于18 ℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；

[0038] （4）细胞冻存与复苏

[0039] （a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括M199培养液，胎牛血清和DMSO，按5:4.5:0.5的体积比混合，现用现配；

[0040] （b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心6 min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存保护液，重悬，使细胞的浓度6
为1×10个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；

[0041] （c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1200

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