聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用
阅读：434发布：2021-09-19
专利汇可以提供聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种纳米载体制剂及其制备方法和应用，该纳米载体制剂采用具有三层结构的纳米载体胶束负载DNA 抗原 、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂。 聚合物 纳米载体制剂具有良好的 稳定性 和免疫原性，不但促进树突状细胞等抗原呈递细胞对抗原的摄取，还显著地诱导 机体 产生特异性的免疫反应。，下面是聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种聚合物纳米载体制剂，其特征在于，包括如下重量份数的各组分: DNA抗原 0-20份、 蛋白抗原 0-20份、 多肽抗原 0-20份、 免疫佐剂 大于零小于等于10份、以及 纳米载体胶束 ι-loo份； 且，所述DNA抗原、所述蛋白质抗原及所述多肽抗原的总重量份数大于零； 所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200 ;所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述DNA抗原、所述蛋白抗原、所述多肽抗原和免疫佐剂分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
2.如权利要求1所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述DNA抗原为编码I个或多个抗原的基因序列或所述基因序列的质粒载体。
3.如权利要求1所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述蛋白抗原为来源于微生物或组织细胞的蛋白抗原提取物或重组的蛋白抗原。
4.如权利要求1所述的聚·合物纳米载体制剂，其特征在于，所述多肽抗原为重组多肽抗原。
5.如权利要求1所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述免疫佐剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸、单磷酰脂A或胞苷酸鸟苷寡脱氧核苷酸。
6.如权利要求1所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或者氨基聚乙二醇羧酸。
7.如权利要求1所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述聚合物纳米载体制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂，所述纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm，所述水溶液针剂的Zeta电位为10mV-50mV。
8.一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-1OOmg/mL ； 在氮气保护下，将上述溶液加热至30-50°C，然后加入侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体，所述侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下恒温反应24-120小时； 加入亮氨酸环状酸酐单体，所述亮氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，所述侧链保护的聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连； 将所述包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0°C的三氟乙酸中，加入HBr体积分数为30%的HBr/HAc溶液，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸的侧链保护基团摩尔量的2-4倍，反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤 '及 将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸及聚亮氨酸所述两亲性三嵌段共聚物，其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连； 按照如下重量份数称取各组分: DNA抗原 0-20份、 蛋白抗原 0-20份、 多肽抗原 0-20份、 免疫佐剂 大于零小于等于10份、 两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及 有机溶剂 20-500份； 且，所述DNA抗原、所述蛋白质抗原及所述多肽抗原的总重量份数大于零； 将所述两亲性三嵌段共聚物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理去除有机溶剂，得到纳米载体胶束； 将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述DNA抗原、所述蛋白抗原、所述多肽抗原和免疫佐剂，振荡0.5-2小时后在3·7°C下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂。
9.如权利要求8所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜及N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
10.如权利要求1-7中任一项所述的聚合物纳米载体制剂作为免疫疫苗的应用。
11.一种树突状细胞疫苗，其特征在于，由权利要求1-7中任一项所述的聚合物纳米载体制剂与人树突状细胞在37°C、5% CO2环境下共孵育30分钟-24小时，再加入细胞成熟促进因子继续孵育24小时得到。
聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0002] 疫苗是预防和控制传染性疾病发生的重要手段。免疫佐剂(又称非特异性免疫增生剂)则是疫苗中不可或缺的组成成分，其能够有效地促进疫苗诱导的特异性免疫反应。随着疫苗研究的飞速发展，新型的基因工程疫苗正逐步取代传统的减毒活疫苗和灭活疫苗。与传统的疫苗相比，基因工程疫苗具有纯度高、特异性强、安全性好等优点，然而由于其免疫原性普遍较差，迫切需要结合有效的免疫佐剂，从而提高疫苗的免疫效力。
[0003] 随着纳米技术的发展，一系列安全可降解的纳米材料(如脂质体、聚合物纳米颗粒、纳米凝胶等)为疫苗和免疫佐剂的研制提供了全新的思路。纳米材料的作用主要包括以下几方面:1、负载多种理化性质不同的抗原，保护抗原不被降解；2、促进树突状细胞(dendritic cell, DC)等抗原呈递细胞对抗原疫苗的摄取和呈递；3、调控抗原在细胞和组织中的输运和释放；4、部分纳米材料还能诱导DC等抗原呈递细胞活化。因此，基于纳米材料的新型疫苗载体系将成为突破瓶颈的重要技术手段，推动肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗的发展与革新。
[0004] 但传统的纳米疫苗载体仍然存在许多不足，如抗原负载率低、稳定性较差、免疫原性弱，这些缺点的存在很大程度上限制了纳米疫苗载体的广泛应用。【发明内容】
`[0005] 基于此，有必要提供一种可高效负载各类蛋白或核酸抗原，具有良好的稳定性和免疫原性的聚合物纳米疫苗载体制剂及其制备方法。
`[0005] 基于此，有必要提供一种可高效负载各类蛋白或核酸抗原，具有良好的稳定性和免疫原性的聚合物纳米疫苗载体制剂及其制备方法。
[0006] 一种聚合物纳米载体制剂，包括如下重量份数的各组分:
[0007] DNA 抗原 0-20 份、
[0008] 蛋白抗原 0-20份、
[0009] 多肽抗原 0-20份、
[0010] 免疫佐剂 大于零小于等于10份、以及
[0011] 纳米载体胶束 1-100份；
[0012] 且，所述DNA抗原、所述蛋白质抗原及所述多肽抗原的总重量份数大于零；
[0013] 所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200 ;所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述DNA抗原、所述蛋白抗原、所述多肽抗原和免疫佐剂分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
[0014] 在一个实施例中，所述DNA抗原为编码I个或多个抗原的基因序列或所述基因序列的质粒载体。
[0015] 在一个实施例中，所述蛋白抗原为来源于微生物或组织细胞的蛋白抗原提取物或重组的蛋白抗原。
[0016] 在一个实施例中，所述多肽抗原为重组多肽抗原。
[0018] 在一个实施例中，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或者氨基聚乙二醇羧酸。
[0019] 在一个实施例中，所述聚合物纳米载体制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂，所述纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm，所述水溶液针剂的Zeta电位为10mV_50mV。
[0020] 一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0021] 将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-lOOmg/mL;在氮气保护下，将上述溶液加热至30-5(TC，然后加入侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体，所述侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下恒温反应24-120小时；加入亮氨酸环状酸酐单体，所述亮氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸·及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，所述侧链保护的聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；将所述包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0°C的三氟乙酸中，加入HBr体积分数为30%的HBr/HAc溶液，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸的侧链保护基团摩尔量的2-4倍，反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤；及将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸及聚亮氨酸所述两亲性三嵌段共聚物，其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；
[0022] 按照如下重量份数称取各组分:
[0023] DNA 抗原 0-20 份、
[0024] 蛋白抗原 0-20份、
[0025] 多肽抗原 0-20份、
[0026] 免疫佐剂 大于零小于等于10份、
[0027] 两亲性三嵌段共聚物1-100份、以及
[0028] 有机溶剂 20-500份；
[0029] 且，所述DNA抗原、所述蛋白质抗原及所述多肽抗原的总重量份数大于零；
[0030] 将所述两亲性三嵌段共聚物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理去除有机溶剂，得到纳米载体胶束；
[0031] 将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述DNA抗原、所述蛋白抗原、所述多肽抗原和免疫佐剂，振荡0.5-2小时后在37°C下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂。
[0033] 上述聚合物纳米载体制剂使用具有良好生物亲和性的两亲性三嵌段共聚物形成的三层结构复合体来负载DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂，相应的抗原和免疫佐剂可以分散在中间层的聚赖氨酸中，而两亲性三嵌段共聚物结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α-螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以高效负载理化性质各 异的DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂。聚合物纳米载体制剂不但促进树突状细胞等抗原呈递细胞对抗原的摄取，还显著地诱导机体产生特异性的免疫反应。
[0034] 通过使用NCA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，再将该两亲性三嵌段共聚物通过纳米自组装技术形成纳米载体胶束并负载DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂而制备聚合物纳米载体制剂，过程简单，合成效率高。
[0035] 上述两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物可以在水溶液中自组装形成纳米载体胶束，胶束中间层的带正电荷的聚赖氨酸可以很容易的吸附带负电荷的DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂，利用此特性的聚合物纳米载体制剂的制备过程简单易行，可以广泛推广应用在免疫疫苗和树突状细胞疫苗的制备领域。这种聚合物纳米载体制剂可作为新型纳米疫苗，采用皮下注射和肌肉注射等方法对机体进行免疫，用于预防或治疗感染性疾病与恶性肿瘤。
[0036] 这种聚合物纳米载体制剂也可用于树突状细胞疫苗得制备。如一种树突状细胞疫苗，其是由上述聚合物纳米载体制剂与人树突状细胞在37°C、5% CO2环境下共孵育30分钟-24小时，再加入细胞成熟促进因子继续孵育24小时制备得到。该树突状细胞疫苗可以广泛应用在预防和治疗感染性疾病和恶性肿瘤等领域。【附图说明】
[0037] 图1为一实施方式的两亲性三嵌段共聚物的结构示意图，图中线条粗细仅示区别不同物质；
[0038] 图2为由图1中两亲性三嵌段共聚物形成三层结构的纳米载体的结构示意图；
[0039] 图3为实施例5中负载紫杉醇的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
[0040] 图4为实施例6中负载阿霉素的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
[0041] 图5为实施例7负载P53基因的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
[0042] 图6为实施例8负载SiRNA基因的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
[0043] 图7为实施例9负载BSA的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；[0044] 图8为实施例10中同时负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的SEM图；
[0045] 图9为实施例10中负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
[0046] 图10为实施例11中GFP (绿色荧光蛋白)标记的细胞的电镜图；
[0047] 图11为实施例11中聚合物纳米载体制剂对GFP基因表达的影响；
[0048] 图12为实施例12中聚合物纳米载体制剂对树突状细胞摄取OVA抗原的影响；
[0049] 图13为实施例13中聚合物纳米载体制剂对小鼠抗OVA抗体的影响；
[0050] 图14为自组装多肽纳米胶束-抗原-佐剂复合疫苗(NP/PIC/0VA)治疗B16-0VA的效果图。【具体实施方式】
[0051] 下面主要结合附图及具体实施例对聚合物纳米载体制剂及相应的制备方法和应用作进一步详细的说明。
[0052] 如图1所示，一实施方式的两亲性三嵌段共聚物，其为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物(聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸)。分子量范围优选在3000-60000。其中，聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连。且该聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200。
[0053] 优选的，本实施方·式的聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇(CH3O-PEG-NH2)或者氨基聚乙二醇羧酸(NH2-PEg-COOH)。
[0054] 聚乙二醇(PEG)具有良好的生物相容性、生物可降解性并且降解产物没有毒性，在美国得到FDA的批准，并被广泛应用于生物材料领域和纳米医学领域。纳米材料经PEG表面修饰以后，可以降低其细胞粘附性，减少血清内物质的吸附性，同时减少巨噬细胞的排异吞噬，因此PEG修饰后的纳米材料可显著增加体内循环的时间。该两亲性三嵌段共聚物，即聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物(PEG-PLys-PLeu)，结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，如图2所示，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α-螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以同时有效的负载小分子疏水性药物、基因物质以及蛋白质或多肽，是一种多功能的纳米载体。
[0055] 本实施方式还提供了一种两亲性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤:
[0056] 步骤SllO:以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的线性三嵌段共聚物，其中，侧链保护的聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，侧链保护的聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200。
[0057] 具体如下:将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-lOOmg/mL，氮气保护下加热至30_50°C后加入LysZ-NCA (苄氧羰基赖氨酸的环状酸酐，一种侧链保护的赖氨酸环状酸酐)单体，LysZ-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下恒温反应24-120小时后加入Leu-NCA(亮氨酸的环状酸酐)单体，Leu-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200: 1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物。
[0058] 步骤S120:脱去侧链保护的聚赖氨酸的侧链保护基团，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸、且分子量在3000-60000的两亲性三嵌段共聚物。
[0059] 具体如下:将包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0°c的三氟乙酸中，加入一定量的HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应2_4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤，其中，加入的HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2-4倍；将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2_6小时换透析水一次，随后冻干，得到两亲性三嵌段共聚物。
[0060] 通过使用N CA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，制备过程简单，合成效率高。
[0061] 同时，本实施方式还提供了一种负载疏水性药物、基因物质、蛋白质或多肽的聚合物纳米载体制剂及其制备方法。
[0062] 该聚合物纳米载体制剂，包括如下重量份数的各组分:
[0063] 疏水性药物 0-20份；
[0064] 基因物质 0-20份；
[0065] 蛋白质或多肽 0-20份；以及
[0066] 纳米载体胶束 1-100份；
[0067] 其中，疏水性药物、基因物质与蛋白质或多肽的总重量份数大于O。
[0068] 该纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，其中，聚亮氨酸构成内层，聚赖氨酸构成中间层，聚乙二醇衍生物构成外层；疏水性药物分散在聚亮氨酸内层中。基因物质、蛋白质或多肽分散在带正电荷的聚赖氨酸中间层中。
[0069] 优选的，本实施方式的疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、顺钼、氟尿嘧啶、甲氨喋呤及喜树碱中的至少一种。基因物质选自抑癌基因、自杀基因、SiRNA、mRNA及反义核酸中的至少一种。蛋白质或多肽为血清蛋白、重组蛋白、多肽疫苗、药物蛋白分子、抗原、治疗肽、生长因子及单克隆抗体中的至少一种。有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜及N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
[0070] 该聚合物纳米载体制剂可以为冻干粉针剂或水溶液针剂。其中，纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm。若为水溶液针剂，其Zeta电位为10mV_50mV。
[0071] 该聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0072] 步骤S210:制备两亲性三嵌段共聚物:以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成包含聚乙二醇、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，侧链保护的聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，侧链保护的聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200 ;脱去侧链保护的聚赖氨酸的侧链保护基团，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸、且分子量在3000-60000的两亲性三嵌段共聚物，其中聚亮氨酸为内核，聚赖氨酸为中间层，聚乙二醇衍生物为外层；
[0073] 步骤S220:按照如下重量份数取各组分:
[0074] 疏水性药物 0-20份、
[0075] 基因物质 0-20份、
[0076] 蛋白质或多肽 0-20份、
[0077] 两亲性三嵌段共聚物 1-100份、
[0078] 有机溶剂 20-500份、
[0079] 且疏水性药物、基因物质与蛋白质或多肽的总重量份数大于O。
[0080] 步骤S230:将两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物溶于有机溶剂中形成均匀的溶液，将溶液置于透析袋中，在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时除去有机溶齐IJ，该两亲性三嵌段共聚物自组装形成具有三层结构的纳米载体胶束，在有疏水性药物存在的条件下，疏水性药物会自动被包裹在内层的聚亮氨酸中。透析过程中，每2-6小时换水一次。
[0081] 步骤S240:将纳米载体胶束制成相应的制剂，得到聚合物纳米载体制剂；或者
[0082] 将纳米载体胶束溶 于水中，加入基因物质、蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37°C下静置0.5-2小时，再将静置后得到的溶液制成所需剂型的制剂得到聚合物纳米载体制剂。
[0083] 负载疏水性小分子药物的过程可以在胶束形成过程中将疏水性小分子药物一起加入，自组装形成纳米药物载体。负载基因的过程是先将合成的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物形成阳离子纳米胶束，再按一定比例加入DNA或RNA后振荡混匀。负载蛋白质的过程是先将合成的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物形成阳离子纳米胶束，再按一定比例加入带负电荷的蛋白质后振荡混匀。同时负载疏水性小分子药物、基因和蛋白质的过程是先制备纳米药物载体，再按一定比例加入基因和蛋白质振荡混匀。
[0084] 如:负载疏水性药物的聚合物纳米载体制剂的制备方法可以参照如下:
[0085] 称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1_100份，疏水性药物1_20份，有机溶剂20-500份，将药物和聚合物按比例完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时,每2-6小时换水一次；透析结束后将透析袋中形成的载药胶束水溶液制成所需要剂型的制剂。
[0086] 负载基因物质的聚合物纳米载体制剂的制备方法可以参照如下:
[0087] 称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份，有机溶剂20-500份，将聚合物完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次；透析结束后得到胶束水溶，称取基因物质1-20份加入到胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37°C条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
[0088] 负载蛋白质的纳米载体制剂的制备方法可以参照如下:
[0089] 称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份，有机溶剂20-500份，将聚合物完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次；透析结束后得到胶束水溶，称取蛋白质1-20份加入到胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37°C条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
[0090] 同时负载疏水性药物、基因物质和蛋白质或多肽的纳米载体制剂的制备方法可以参照如下:
[0091] 称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1_100份药物1_20份，有机溶剂20-500份，将药物和聚合物按比例完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次，透析结束后得到载药胶束水溶液；称取蛋白质1-20份加入到载药胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37°C条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
[0092] 该聚合物纳米载体制剂可以同时负载小分子疏水性药物、基因物质、蛋白质或多肽，且负载效率较高，纳米载体制剂在生物体内可以完全降解，并参与代谢，可以避免免疫系统的清除，比较容易到达病灶。
[0093] 上述两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物可以在水溶液中自组装形成纳米载体的胶束，疏水性药物分散在聚亮氨酸疏水内核中，且得到的纳米胶束可以很容易的吸附带负电荷的基因物质、蛋白质或多肽至带正电荷的中间层，利用此特性的聚合物纳米载体制剂的制备过程简单易行，可以广泛推广应用。
[0094] 此外，本实施方式还提供了一种负载抗原和免疫佐剂的聚合物纳米载体制剂及其制备方法。
[0095] 该负载抗原和免疫佐剂的聚合物纳米载体制剂，包括如下重量份数的各组分:
[0096] DNA 抗原 0-20 份、·[0097] 蛋白抗原 0-20份、
[0098] 多肽抗原 0-20份、
[0099] 免疫佐剂 大于零小于等于10份、以及
[0100] 纳米载体胶束 1-100份；
[0101] 且，DNA抗原、蛋白质抗原及多肽抗原的总重量份数大于零；
[0102] 纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，聚赖氨酸的一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200 ;聚亮氨酸构成复合体的内层，聚赖氨酸构成复合体的中间层，聚乙二醇衍生物构成复合体的外层；DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂分散在中间层的聚赖氨酸中。
[0103] 其中，DNA抗原为编码I个或多个抗原的基因序列或基因序列的质粒载体。蛋白抗原为来源于微生物或组织细胞的蛋白抗原提取物或重组的蛋白抗原。多肽抗原为重组多肽抗原。免疫佐剂为聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic:polycytidylic acid, Poly 1C)、单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A7MPLA)或胞苷酸鸟苷寡脱氧核苷酸(CpGODN)。该负载抗原和免疫佐剂的聚合物纳米载体制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂，纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm，水溶液针剂的Zeta电位为10mV_50mV。[0104] 该负载抗原和免疫佐剂的聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0105] 制备两亲性三嵌段共聚物:同上；
[0106] 按照如下重量份数称取各组分:
[0107] DNA 抗原 0-20 份、
[0108] 蛋白抗原 0-20份、
[0109] 多肽抗原 0-20份、
[0110] 免疫佐剂 大于零小于等于10份、
[0111] 两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及
[0112] 有机溶剂 20-500份；
[0113] 且，DNA抗原、蛋白质抗原及多肽抗原的总重量份数大于零；
[0114] 将两亲性三嵌段共聚物溶于有机溶剂中形成均匀的溶液，将溶液进行透析处理去除有机溶剂，得到纳米载体胶束；
[0115] 将纳米载体胶束溶于水中，加入DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂，振荡0.5-2小时后在37°C下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为聚合物纳米载体制剂。
[0116] 上述聚合物纳米载体制剂使用具有良好生物亲和性的两亲性三嵌段共聚物形成的三层结构复合体来负载DNA抗`原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂，相应的抗原和免疫佐剂可以分散在中间层的聚赖氨酸中，而两亲性三嵌段共聚物结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α -螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以有效负载各类DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂。聚合物纳米载体制剂具有良好的稳定性和免疫原性，不但促进树突状细胞等抗原呈递细胞对抗原的摄取，还显著地诱导机体产生特异性的免疫反应。
[0117] 通过使用NCA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，再将该两亲性三嵌段共聚物通过纳米自组装技术形成纳米载体胶束并负载DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂而制备聚合物纳米载体制剂，过程简单，合成效率高。
[0118] 上述两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物可以在水溶液中自组装形成纳米载体胶束，胶束中间层的带正电荷的聚赖氨酸可以很容易的吸附带负电荷的DNA抗原、蛋白抗原、多肽抗原和免疫佐剂，利用此特性的聚合物纳米载体制剂的制备过程简单易行，可以广泛推广应用在免疫疫苗和树突状细胞疫苗的制备领域。
[0119] 如一种树突状细胞疫苗，其是由上述聚合物纳米载体制剂与人树突状细胞在37°C,5% CO2环境下共孵育30分钟-24小时，再加入细胞成熟促进因子继续孵育24小时制备得到。该树突状细胞疫苗可以广泛应用在预防和治疗感染性疾病和恶性肿瘤等领域。
[0120] 以下为具体实施例部分:
[0121] 实例1、聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备[0122] 将聚合管抽真空后充氮气保护，将Ig分子量为500的CH3O-PEG-NH2用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为10:1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为10:1的比例加入Leu-NCA单体，氮气保护下继续恒温反应24小时，反应结束后加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
[0123] 将上述所得的PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于(TC的三氟乙酸中，加入r体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应2时后，加入10倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2倍；将所得产物溶解于N，N- 二甲基甲酰胺，使用截留分子量为2000的透析袋在水中透析48小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为3000。
[0124] 实例2、羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
[0125] 将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.5g分子量为2000的NH2-PEG-C00H用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为20:1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为40:1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应48小时，反应结束后加入20倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
[0126] 将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于(TC的三氟乙酸中，加入HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应2时后，加入15倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2倍；将所得产物溶解于N，N- 二甲基甲酰胺，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析12小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物， 平均分子量为8300。
[0127] 实例3、羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
[0128] 将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.2g分子量为5000的NH2-PEG-C00H用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200:1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为100:1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应96小时，反应结束后加入30倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
[0129] 将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于(TC的三氟乙酸中，加入HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应4时后，加入30倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的4倍；将所得产物溶解于二甲基亚砜，使用截留分子量为8000的透析袋在水中透析48小时，每4小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为40000。
[0130] 实例4、聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
[0131] 将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.1g分子量为10000的CH3O-PEG-NH2用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200:1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200:1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应120小时，反应结束后加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。[0132] 将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于(TC的三氟乙酸，加入HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应4时后，加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的4倍；将所得产物溶解于二甲基亚砜，使用截留分子量为8000的透析袋在水中透析96小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为54600。
[0133] 实例5、负载紫杉醇的聚合物纳米载体制剂的制备
[0134] 称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，紫杉醇2mg，用IOmL 二甲基亚砜溶解，室温下超声lOmin，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在IL水中透析48小时，每2小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，如图3所示，DSL测得粒径大小分60nm，TEM照片显示载药胶束纳米颗粒的平均粒径为60nm左右，粒子呈球形，分散比较均勻。
[0135] 实例6、负载阿霉素的聚合物纳米载体制剂的制备
[0136] 称取实施例2制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物80mg，紫杉醇5mg，用IOOmLN,N- 二甲基甲酰胺溶解，室温下超声lOmin，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的N，N- 二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在2L水中透析60小时，每4小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，然后冷冻干燥得到粉末状固体。如图4所示，DSL测得粒径大小分85nm，TEM照片显示载药胶束纳米颗粒的平均粒径为80nm左右，粒子呈球形，分散比较均匀。
[0137] 实例7、负载P53基因的聚合物纳米载体制剂的制备
[0138] 称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物lmg，用4mLN，N- 二甲基甲酰胺溶解，室温下超声lOmin，·使聚合物充分溶解，将制得的N，N-二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液；量取P53基因0.05mg加入到制得的聚合物胶束水溶液中涡旋振荡2小时，37°C条件下放置I小时后负载P53基因的纳米载体制剂。如图5所示，DSL测得粒径大小分156nm，分散比较均匀。
[0139] 实例8、负载SiRNA基因的聚合物纳米载体制剂的制备
[0140] 称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，用5mL 二甲基亚砜溶解，室温下超声lOmin，使聚合物充分溶解，将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液，将其稀释到lmg/mL。量取SiRNA5y g置于离心管中，然后入到制得的聚合物胶束水溶液100 μ L涡旋振荡2小时，37°C条件下放置I小时后负载SiRNA基因的纳米载体制剂。如图6所示，DSL测得粒径大小分50nm，分散比较均匀。
[0141] 实例9、负载BSA的聚合物纳米载体制剂的制备
[0142] 称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物lmg，用4mLN，N- 二甲基甲酰胺溶解，室温下超声lOmin，使聚合物充分溶解，将制得的N，N-二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液；量取BSA蛋白0.05mg加入到制得的聚合物胶束水溶液中涡旋振荡2小时，37°C条件下放置I小时后负载BSA蛋白的纳米载体制剂。如图7所示，DSL测得粒径大小分95nm，分散比较均匀。
[0143] 实施例10、同时负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的制备
[0144] 称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，紫杉醇2mg，用5mL 二甲基亚砜溶解，室温下超声lOmin，使聚合物充分溶解，将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物载药胶束水溶液，将其稀释到lmg/mL。量取SiRNA5 μ g置于离心管中，然后入到制得的聚合物胶束水溶液100 μ L涡旋振荡2小时，37°C条件下放置I小时后负载SiRNA基因的纳米载体制剂，如图8所示。如图9所示，DSL测得粒径大小分56nm，分散比较均匀。
[0145] 实施例11
[0146] 采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)负载含有GFP (绿色荧光蛋白)的质粒DNA，制备方法参考前述实施例，观察GFP在293T细胞的表达水平。结果表明纳米颗粒显著提高了 GFP的蛋白表达，如图10和图11所示。
[0147] 实施例12
[0148] 采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)包裹抗原蛋白(OVA-FITC)，制备方法参考前述实施例，观察小鼠树突状细胞在体外对抗原的摄取。结果表明纳米颗粒显著提高了树突状细胞对抗原的摄取，如图12所示。
[0149] 实施例13
[0150] 采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)作为疫苗载体，包裹卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)制备纳米疫苗，并对小鼠进行皮下注射免疫，制备方法参考前述实施例。结果显示纳米载体显著地提 高了抗OVAIgG抗体，如图13所示。
[0151] 实施例14
[0152] 采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)作为疫苗载体，包裹卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)和Poly IC制备复合型纳米疫苗,采用腹腔给药验证其抗肿瘤效果。结果显示其可以明显地抑制B16-0VA肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存期，如图14所示，横坐标表示时间，单位••天(day);纵坐标表示肿瘤体积。
[0153] 综合实施例11-14可知，本实施方式的聚合物纳米载体制剂是一种优良的疫苗载体，利用其携带疫苗导入靶组织，能够有效地提高疫苗的免疫效力。
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