[0001] 本实用新型涉及生物技术领域，尤其一种层析柱。

[0002] 核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等重要的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的核酸提取方法包括： [0003] （1）硅胶为基础的提取方法：硅胶或二氧化硅为基础的提取方法已成为一种流行的核酸提取方法，其中包括使用控制的微孔玻璃，嵌入二氧化硅颗粒的滤膜，硅胶颗粒，二氧化硅构成的藻土型树脂，和玻璃纤维。基本过程为，在高浓度离液盐的存在下，DNA或RNA会粘结到硅胶树脂或膜的表面，其它污染被冲洗走，然后用水或低盐缓冲液洗脱DNA或RNA。

[0004] 以硅胶为基础的提取原理是依据在高浓度的离液盐，例如碘化钠（NaI），高氯酸钠（NaCIO4），盐酸胍（GuHCl）,和异硫氰酸胍（GuTC）等的条件下，带负电荷的DNA骨架与带正电的硅胶表面具有高度的亲和力。

[0005] 现阶段已对离子强度、温度、pH值、DNA大小和构象与核酸结合到硅胶表面上的影响进行了研究，例如，在硅胶表面的结合能力与离液盐浓度是呈线性相关的。此外，在一个给定的离液盐浓度下，pH值越低则所有类型的DNA与硅胶表面的结合能力越高。 [0006] 异硫氰酸胍（GuTC）和盐酸胍（GuHCl）是常用的将核酸与硅胶表面粘结的试剂。碘化钠（NaI）和高氯酸钠（NaCIO4）也被少量的使用。异硫氰酸胍(GuTC)在浓度为4M至6M时效果最好，而盐酸胍（GuHCl）则在6M的较高浓度下使用。在乙醇或异丙醇的条件下其结合效率显著改善。以及控制结合试剂PH值为6至7.5的醋酸钠和Tris-HCl缓冲液。而且，已知的可有效地裂解细胞并使蛋白质变性的胍盐，例如异硫氰酸胍（GuTC）的使用则免除了添加蛋白酶等变性酶的需求。

[0007] 这种层析柱常用硅胶树脂或膜作为固定相，并常用离心或真空来驱动,例如Promega公司的PureYield质粒小量提取系统和WizardPlus小量DNA制备纯化系统，来自Qiagen公司的QIAprep小量制备试剂盒，和Bioland公司的EZgene质粒小量制备纯化试剂盒。

[0008] 以硅胶为基础的DNA提取方法具有快速、简便、有效的特点，所纯化的 DNA质量高并可以用于多种下游应用。然而由于高达3倍体积的离液盐溶液被添加到1份体积的DNA或RNA样品中方可达到硅胶结合DNA所需的有效离液盐的浓度，因而对血浆等标本的起始体积受到很大限制。

[0009] （2）阴离子交换为基础的DNA提取方法：通常也使用阴离子交换树脂及膜的方法来分离核酸。这一过程中在低pH值及低盐浓度下DNA可与阴离子交换剂结合，随即可用高pH值及高浓度的盐溶液来洗脱DNA。

[0010] 其结合原理是基于DNA主链上的带负电荷的磷酸根离子与分子表面上带正电的DEAE等基团之间的相互作用，溶液中的盐浓度和pH值决定了是否结合或洗脱DNA。 [0011] 通常以微珠为基础的阴离子交换柱多是重力流动型的，例如QIAGEN公司的基因组柱试剂盒。QIAGEN公司的树脂是由多孔型硅胶微珠为基质并加有一层二乙基氨基乙醇（DEAE）官能团的涂层；其它的则包括PALL公司的AcroSep层析柱，它是由弱的阴离子交换树脂DEAE陶瓷HYPERD F微珠以及Q强阴离子交换陶瓷HYPERD F微珠组成的。

[0012] 与基于微珠柱子相比，通常使用的为离心型或真空抽吸驱动型阴离子交换膜式柱子，例如Vivapure弱阴离子交换微型D膜离心柱和Vivapure强阴离子交换Q膜离心柱，它们具有流速高、成本低、高通量的优势。

[0013] 阴离子交换柱提供了一个简单、安全、可靠的用于从各种样品中分离核酸的方法，其所制备的核酸具有相当于两次CsCl梯度离心纯化的超纯度。然而因为在洗脱液中含有高浓度的盐，洗脱的核酸是不能直接使用的，通常需要一个额外的步骤，例如，乙醇或异丙醇沉淀以去除盐。

[0014] 因此，我们研发了一种新的层析柱，用以克服前述基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，且具有成本效益，将具有非常重要的应用价值。实用新型内容

[0015] 本实用新型所要解决的技术问题在于提供一种层析柱。

[0016] 为解决上述技术问题，本实用新型的技术方案是：

[0017] 一种层析柱，包括至少两个不同的固体层，以双层层析柱为例，由第一固体层和第二固体层串联耦合组成，所述第一固体层是由阴离子交换膜或微珠组成，所述第二固体层是由硅胶膜或微珠组成。

[0018] 优选的，上述层析柱，所述阴离子交换膜或微珠为阴离子交换剂二乙胺（D或DEAE），季铵（Q）或二乙基氨基丙基（ANX）。

[0019] 优选的，上述层析柱，还包括层析柱柱体，所述层析柱柱体一端为外磨口，所述层析柱柱体另一端为内磨口，层析柱柱体内为所述串联耦合组成的 第一固体层和第二固体层。

[0020] 优选的，上述层析柱，还包括一个用于防止层析柱污染的盖子，所述盖子套于所述层析柱柱体外。

[0021] 优选的，上述层析柱，所述内磨口的口径小于所述外磨口的口径。

[0022] 优选的，上述层析柱，所述第一固体层和第二固体层设置于近内磨口一端。 [0023] 上述层析柱应用时：（1）第一固体层，当含有核酸的第一溶液流经时，其中核酸结合到此层，并在第二溶液流经时核酸被洗脱；（2）第二固体层，当第二溶液流经时，其中被洗脱的核酸可结合到此层，并在第三溶液流经时被洗脱。在溶液经过第一固体层然后通过第二固体层这种方式下，从而使得第一固体层串联耦合到第二固体层。

[0024] 本实用新型的有益效果是：

[0025] 本实用新型所述层析柱结构简单、使用方便，特别适合同時分离RNA和DNA，以及用于提取如病毒等被蛋白质包裹的核酸，和用于分离体积大而且浓度低的核酸，如血浆中提取少量的核酸；所提取的核酸可直接用于下游应用。附图说明

[0026] 图1是一个双层层析柱的示意图，在所示的例子中，1-第一固体层，2-第二固体层，其中，第一固体层是一种阴离子交换膜，例如DEAE膜；第二固体层是硅胶膜，它们是呈顺序性的串联耦合；溶液流过第一固体层，然后通过第二固体层；

[0027] 图2显示了双层层析柱内的提取过程，以DEAE膜为第一固体层和硅胶膜为第二固体层为例，箭头表示溶液流过DEAE膜，然后通过硅胶膜；双弯曲的线则代表核酸，按照第一溶液及第二溶液的顺序被结合到DEAE膜上然后被洗脱；再根据所述第二及第三溶液的顺序核酸被结合到硅胶膜上，然后被洗脱；

[0028] 图3显示了一个示例的双层层析柱，1-第一固体层，2-第二固体层，3-柱体，5-内磨口，6-外磨口，其中，第一固体层是由五张Whatman DE81片材组成的DEAE膜，而第二固体层则是的硅胶膜,直径7毫米；

[0029] 图4标示出了用1％琼脂糖凝胶来检测的所提取的1kb梯度DNA标记物及人类基因组DNA的大小，其中，泳道M是未经处理的1kb梯度DNA标记和基因组DNA混合控制物，泳道 是用不同条件下的第二溶液洗脱的1kb梯度DNA标记物和人类基因组DNA，泳道是第一溶液的滤液，泳道9至12中的1×TE洗涤缓冲液的滤液。

[0030] 图5是另一个双层层析柱的示意图，其中，1-第一固体层，2-第二固体层，3-柱体，4-盖子，5-内磨口，6-外磨口。

[0031] 实施例1

[0032] 一种层析柱，为双层层析柱，由第一固体层1和第二固体层2串联耦合组成，所述第一固体层1用DEAE阴离子交换膜作为第一阴离子交换介质，所述第二固体层2用硅胶膜作为第二硅胶介质（图1）。

[0033] 本实用新型所述层析柱在使用过程中，溶液流过第一固体层，然后通过第二固体层，可通过真空抽吸或离心来驱动溶液的流动，当含有核酸的第一溶液流过第一固体层时，核酸既结合于此层（图2）；当第二溶液流经已结合核酸的第一固体层时，即可洗脱已结合的核酸，当它流经所述第二固体层，将已洗脱的核酸结合至第二固体层。在这个意义上“串联耦合器”即第二溶液将核酸从第一固体层洗脱下来，然后将核酸结合到第二固体层上；当第三个溶液流经已结合核酸的第二固体层时可洗脱出核酸。

[0034] 此外，作为双层的组成物，第一固体层还可为其他阴离子交换膜或微珠。阴离子交换膜或微珠构成一个支承介质及一个以共价连接的阴离子交换剂。可使用弱阴离子交换剂的二乙胺（D，或DEAE），强阴离子交换剂的季铵盐（Q），以及另一个弱的阴离子交换剂二乙基氨基丙基（ANX）（表1）。

[0035] 表1第一固体层的阴离子交换剂的功能基团

[0036]

[0037] 可供选择的阴离子交换树脂微珠和膜的种类很多，包括沃特曼(Whatman)公司的DEAE阴离子交换纤维素膜（DE81纸），Vivapure DEAE阴离子交换树脂的再生纤维素膜用于Vivapure IEXD离心柱，Vivapure Q阴离子交换再生纤维素膜在vivapure IEX Q离心柱，Pall公司的野马Q阴离子交换交叉链接的Acrodisc层析单元，Pall公司的DEAE陶瓷HYPERD F微珠AcroSep系列中 使用，Qiagen公司带有硅胶珠支持矩阵的DEAE阴离子交换微珠，GE公司的DEAE琼脂糖微珠，GE的Q Sepharose微珠，GE ANX琼脂糖微珠。 [0038] 采用的沃特曼(Whatman)DEAE阴离子交换纤维素膜（DE81纸）。结合的原理是基于带负电荷的DNA主链上的磷酸根离子与表面上的带正电的基团，例如DEAE，之间的相互作用。所用溶液的盐浓度和pH值来确定是结合或者洗脱DNA。所测试样品在低盐及低pH值的条件下DNA结合到阴离子交换剂，例如用pH为7.5的含10mM Tris-HCl，1mM EDTA的盐溶液，可作为第一溶液。DNA在高盐浓度及高pH值下则被洗脱，例如4M GuTC，0.5M NaCl的20mM Tris-HCl，pH7，可作为第二溶液。

[0039] 第二固体层还可为其他硅胶膜或微珠，硅胶膜或微珠可为由受控的微孔玻璃，嵌入硅胶颗粒的过滤器，硅胶颗粒，由硅胶组成以硅藻土形式存在的树脂，以及玻璃纤维。 [0040] 采用的来自Bioland公司的EZgene质粒纯化试剂盒内的硅胶膜。其他的例子包括来自Promega公司的PureYield质粒DNA纯化系统内的硅胶微珠和膜，Promega公司的Wizard plus质粒DNA小量纯化提取系统，和Qiagen公司的QIAprep的小量提取试剂盒。结合的原理是在浓高浓度离液盐，例如4MGuTC，0.5M的NaCl，20mM Tris-HCl，pH7的条件下，带正电的硅胶表面与带负电荷的DNA主链上磷酸根离子有高度亲和性，为第二溶液。DNA是在高pH值及高浓度的盐下洗脱，比如10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH9.0，它被用来作为第三溶液。

[0041] 关于水溶性溶液，第一溶液有助于核酸结合到第一固体层，可用一个低盐浓度及低pH值的溶液，例如，pH为7.5的含10mM Tris-HCl，1mM EDTA的盐溶液；第二溶液有助于核酸从上述第一固体层被洗脱并继而被结合到第二固体层，它可能包含3M-6M GuTC、20mM Tris-HCl、pH6.0-7.5的离液盐，其他离液盐，例如盐酸胍、碘化钠或NaCIO4也可以被使用， [0042] 此外，离液盐可以在有机溶剂存在下使用，例如乙醇或异丙醇，第二个水溶液也可以包括其它的盐，如NaCl或KCl，以增加离子强度，例如，pH为7.0的4M GuTC，0.5M NaCl,20mM Tris-HCl的离液盐；第三溶液有利于核酸从所述第二固体层被洗脱，可使用在低盐浓度及高pH值的溶液，例如含10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0-9.0的盐溶液。 [0043] 此外，在第一溶液和第二溶液之间，一个水溶液BC可以用于漂洗第一固体层，其可以与作为第一溶液的组分相同而不含有核酸比如用于示例中的10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5的溶液；此外，在第二溶液和第三溶液之间可以用水溶液CD洗涤第二固体层，其成分可以与第二溶液相同，或溶液 CD可以由不同的成分组成，例如在测试实例中使用的含10mM Tris-HCl，80％乙醇，pH7.5。

[0044] 关于核酸，对1kb DNA标记和人类基因组DNA进行测试。然而核酸可以是任意DNA和RNA的可能组合，例如线性，圆形，双链和单链的任何形式。

[0045] 核酸还可以是被包裹在一个颗粒中，例如病毒。在这种情况下含有病毒的第一溶液的pH值可以调节使蛋白质带负电荷而接合到所述第一固体层，通过离心或负压吸引驱动，一个小体积的第一溶液被保留所述第一固体层上。当含有高达6M GuTC的第二溶液被添加到第一固体层时，胍盐不会被保留的小体积第一溶液稀释太多。因此浓缩的胍盐是能够溶解第一固体层上的蛋白质粒子使核酸释放，这样第一固体层的功能可作为“粘合器”，“浓缩器”和“裂解器”。由于第一固体层的“粘合器”和“浓缩器”功能，DNA和RNA可被提取。高浓度的胍盐可以使DNA和RNA有效地与第二固体层结合。如上所述由于第一固体层的“粘合器”和“浓缩器”的功能，可以在一个大体积的样品中分离出少量的核酸，例如血浆。 [0046] 实施例2

[0047] 一种层析柱，为双层层析柱，包括层析柱柱体3和用于防止层析柱污染的盖子4，所述盖子4套于所述层析柱柱体3外，所述层析柱柱体3一端为外磨口6，层析柱柱体另一端为内磨口5，所述内磨口5的口径小于所述外磨口6的口径，所述层析柱柱体内为所述串联耦合组成的第一固体层1和第二固体层2，该第一固体层1和第二固体层2近内磨口5一端设置，所述第一固体层1用DEAE阴离子交换膜作为第一阴离子交换介质，所述第二固体层2用硅胶膜作为第二硅胶介质（图5）。

[0048] 实施例3

[0049] 1、材料和方法

[0050] DNA标记，硅胶膜柱，DEAE膜

[0051] 1kb的DNA标记物是对从Biolabs公司的包含10个双链DNA片段为0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8和10千碱基（kb）。硅胶膜柱是来自Bioland公司的EZgene质粒纯化小量制备试剂盒。Whatman DE81纤维素层析纸，一种DEAE膜，则来自通用电气医疗集团。 [0052] 人类基因组DNA的制备

[0053] 根据制造商（Qiagen公司）的操作方案，使用DNeasy小量血液和组织试剂盒从血液白细胞提取基因组DNA并存储在10mM Tris-HCl（pH8.0）和1mMEDTA缓冲液中。用分光光度计在260nm处测定浓度。存储在-20℃直至使用。

[0054] 2、用于提取核酸的层析柱和方法

[0055] DEAE膜和硅胶膜双层层析柱的制备

[0056] 将Whatman DE81纸切成直径为7毫米的圆盘。五个这样的圆盘被组装在一起并安装在旋转离心柱内已存在的硅胶膜顶部（图3）。这样双层的离心柱已制备好并可用于提取核酸。

[0057] 提取1kb的DNA标记与人类基因组DNA

[0058] 使用双层层析柱测试了人类基因组DNA和1kb DNA标记物。

[0059] 200微升的第一溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）中含有2.5微克的1kb DNA标记物和2.5μg基因组DNA被转移到每一层析柱中，并在8,000rpm离心2分钟。弃去滤液。

[0060] 加入400μl的1×TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）到每一层析柱中，并在10,000rpm下离心1分钟。弃去滤液。此为洗涤。

[0061] 将600微升的第二溶液加入到每一层析柱中。所测试的四种胍盐条件如下：1）4M GuTC，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7；2）3.6M GuTC，1MNaCl，20mM Tris-HCl，pH7；3）3M GuTC，2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7；4）3.6M GuHCl，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7。将层析柱以10,000rpm离心1分钟，弃去滤液。

[0062] 将600微升洗涤缓冲液（10mM Tris-HCl，80％乙醇，pH7.5）加入到每一层析柱中加以洗涤，并在10,000rpm下离心1分钟。弃去滤液。

[0063] 将100微升的第三溶液（10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH9.0）加入到每一层析柱中，并在13,000rpm下离心1分钟。收集滤液作为产出物。

[0064] 光度分析来测量所收集DNA的量

[0065] 收集的DNA在TE缓冲液中（10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH9.0）中，用分光光度计在260nm和280nm下测定浓度（表2）。以4M GuTC，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7作为第二溶液时所收集DNA总量为最多，这显示出了胍盐条件下的效果。

[0066] 表2四种胍盐条件下的DNA回收率

[0067]

[0068]

[0069] a其含有2.5微克的1kb DNA标记物和2.5μg的基因组DNA。

[0070] b其收集在100μl的第三溶液内所含的1kb DNA标记物和基因组DNA总量，是通过分光光度计在260nm处测定的。

[0071] c其四种胍盐的条件为：1）4M GuTC，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7，2）3.6M GuTC，1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7，3）3M GuTC，2M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7，以及4）3.6M盐酸胍，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7。

[0072] 琼脂糖凝胶电泳以测量所收集DNA的大小

[0073] 将50微升用第三溶液洗脱所收集的DNA样品通过一个标准的1％琼脂糖凝胶进行电泳（图4）。为了进行比较，也将第一溶液（50％的量）和1×TE洗涤缓冲液（50％的量）的滤液加载。对凝胶用溴化乙锭染色以便用CCD相机进行紫外线摄影。与琼脂糖凝胶上未经处理的1kb DNA标记物和基因组DNA的带型相比较，经过处理的DNA在四个不同胍盐条件下其条带显示出一致的强度，这表明其高品质。

[0074] 此外，第一溶液和1×TE洗涤缓冲液的滤液没有显示任何可观察到的条带，这表明被结合到Whatman DE81纸上的1kb DNA标记物和基因组DNA不能被1×TE洗涤缓冲液所冲洗掉。

[0075] 更进一步，为了显示双层层析柱中DEAE膜的必要性，在相同的条件下对一个仅有硅胶膜的层析柱（单层）进行了测试，基本上没有在第三溶液中收集到任何的DNA。因此提取DNA需要两层均存在。

[0076] 3、实时PCR的应用

[0077] 引物的制备

[0078] 引物是由Integrated DNA Technologies公司合成的（表3）。

[0079] 表3用于PCR的引物列表

[0080]

[0081]

[0082] a例如，P53是指人P53基因（13280）,根据GenBank的记录：x54156，D，5’末端引物起始于核苷酸13280。D为下游（在转录的方向）。具体的PCR片段的大小和位置可以从含有信息的名称中得到。

[0083] 实时PCR检测

[0084] 以扩增209-bp的P53基因外显子6的区域来设计引物。每个PCR的总体积为25μl,其混合物含有：50mM KCl,10mM Tris-HCl（pH8.3），1.5mMMgCl2，200μM的每种dNTP，
0.1μM人P53基因的引物，0.1×SYBR Green I染料，TWEEN-200.02％，0.02％NP-40，50ng的总DNA，和1U的Taq聚合酶。

[0085] 用Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统来给扩增的产物定量。分析模式：SybrGreen荧光染料，基线设置：基线减去曲线拟合，阈值循环（CT）测定：单阈值，基线方法：SYBR自动计算，阈值设置：自动计算。

[0086] 热循环的详细步骤为变性94℃15秒，退火55℃30秒，和延伸72℃1分钟,共进行30个循环。在热循环前，一个94℃2分钟的步骤则用于将基因组DNA完全变性。 [0087] 在末尾的一次循环后，跟随着一步熔解曲分析既从68℃到95℃时温度增量为0.5℃并持续5秒。

[0088] 对未经实施例1所述双层层析柱提取的和四个不同条件下提取的DNA样本采用实时PCR进行了检测。扩增结果显示它们的效率相似（Ct=23±1周期）。此外，在熔解曲线分析中，仅从扩增的产物中显示了Tm为84.5±0.5℃的结果。因此提取的核酸可以直接用于扩增而无需进一步处理。

[0089] 上述参照具体实施方式对该一种层析柱进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本实用新型总体构思下的变化和修改，应属本实用新型的保护范围之内。