[0001] 本发明涉及属于生物技术领域，具体而言，涉及到一株具有解难溶性无机磷功能霉菌的分离、鉴定以及解磷性能。

[0002] 在磷矿开采过程中将产生大量的磷矿尾矿，大部分尾矿采用丢弃或库存的方式进行处置。其长期堆放在尾矿库中，会给环境造成一定的影响，主要表现在：尾矿受到腐蚀时或某些可迁移元素发生化学迁移时，会对大气和水土造成严重的污染，导致土壤退化、植被破坏甚至直接威胁到人畜的生存；尾矿库区表面产生的粉尘会恶化周围地区的卫生条件；尾矿中的有关成分以及残留的选矿剂会对周边生态环境造成危害。实际上，磷矿尾矿的组分特征为w(P2O5)≤10％，w(MgO) ≥15％，若适当加以应用，可做到变废为宝。我国磷矿尾矿的综合利用研究起步较晚，现阶段磷矿尾矿的综合利用率不足40％，利用途径主要包括以下4点：

[0003] (1)磷尾矿粉的直接应用。

[0004] (2)利用化学浮选、磁选或电选等技术从磷尾矿中提取有用矿物。

[0005] (3)利用酸解法制备复合肥。

[0006] (4)制备建筑材料。

[0007] 以上方法或因其处理成本过高或因其对有效磷利用率极低，并未实现磷矿尾矿的规模化应用。

[0008] 随着应用生物技术和微生物学的发展，利用解磷微生物实现难溶性无机磷的转化成为研究热点，解磷微生物对难溶性无机磷具有显著的转化能力，可促进植物生长发育。在现有的专利和文献中，目前已知的具有解无机磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌等，其中解磷细菌的数量和种类较多，主要有产碱菌属  (Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、多硫杆菌属(Thiobacillus)等。而已报道的真菌类主要有青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)等。

[0009] 淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是一种内寄生性食线虫真菌，其不仅对根结线虫和孢囊线虫的卵具有较强寄生能力，还能侵染幼虫和成虫，使根结线虫和孢囊线虫自然衰退，被认为是最具有应用前景的线虫生防真菌，故常被作为生防菌。但也有研究发现，淡紫拟青霉能促进难溶磷酸盐的溶解，具有一定的环保效应。

[0010] 目前对淡紫拟青霉的报道大多集中于生防功能的研究，对其降解难溶性无机磷的功能虽有提及，但暂无相关文章或专利对此进行详细探究。

[0011] 有鉴于此，本发明的目的在于：提供一种具有降解难溶性无机磷功能的霉菌及其应用，以解决上述问题。

[0012] 本发明提供一种具有降解难溶性无机磷功能的霉菌，其保藏号为：CCTCC NO:M2018239。

[0013] 该菌株在PDA培养基上，于30℃下培养7d，菌落直径4.5-5.5cm，菌落呈规则圆形，菌落外圈颜色为白色，中间隆起部分为淡紫色，时间越长颜色越深；菌落不易挑起,不透明，扫描电镜观察分生孢子梗呈瓶状，梗单生或聚集成孢梗束，有轮状分枝，瓶梗基部近圆柱形，顶端细长；分生孢子无色，光滑，大小不一，椭圆形，2-8×2-4μm，串生，基部形成发散的长孢子链；

[0014] 本发明还提供一种上述淡紫拟青霉在降解难溶性无机磷中的应用。

[0015] 与现有技术相比，本发明的优点在于：该霉菌能够快速有效地降解难溶性无机磷，应用于磷矿尾矿的降解回收再利用方面，能够极大地降低回收利用成本，实现磷矿尾矿的规模化应用，避免尾矿资源的大量浪费。附图说明

[0016] 图1是菌株GZP5形态特征，注：A：培养基菌落正面；B：培养基菌落背面； C：400X镜检图；D：1000X镜检图；

[0017] 图2是GZP5的ITS序列PCR扩增电泳图，注：M：Marker；Y：阴性对照；

[0018] 图3是基于ITS序列的解磷真菌GZP5的系统发育树；

[0019] 图4是GZP5的解磷圈图；

[0020] 图5是GZP5液体培养中溶磷量的变化曲线图；

[0021] 图6是磷尾矿粉扫描电镜图，注：A:自然状态下的磷尾矿粉，B:空白对照， C：加GZP5作用后的磷尾矿粉。

[0022] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行进一步地详细描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0023] 实施例：

[0024] 本实施例提供一种淡紫拟青霉，其形态特征：该菌株在PDA培养基上，于30℃下培养7d，菌落直径4.5-5.5cm，菌落呈规则圆形，菌落外圈颜色为白色，中间隆起部分为淡紫色，时间越长颜色越深。菌落不易挑起,不透明，扫描电镜观察分生孢子梗呈瓶状，梗单生或聚集成孢梗束，有轮状分枝，瓶梗基部近圆柱形，顶端细长。分生孢子无色，光滑，大小不一，椭圆形，2-8×2-4μm，串生，基部形成发散的长孢子链。该菌株于2018年4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC NO:M2018239，名称为淡紫拟青霉菌GZP5(Paecilomyces lilacinus GZP5)。

[0025] (一)淡紫拟青霉菌GZP5(Paecilomyces lilacinus GZP5)的分离步骤：

[0026] 从贵州瓮福磷尾矿堆积场附近土壤中采集样品，称取保存的土壤样品5g，加入盛有45mL无菌生理盐水的锥形瓶中，制成稀释度为10-1的土壤悬液，置于30℃的摇床中振荡30min。将土壤悬液按10倍梯度制成10-2至10-6，取上述梯度的土壤悬液0.2mL均匀涂布在无机磷选择性固体培养基上，每个稀释度重复3次。将其倒置于30℃恒温培养箱中培养5-7d，用接种环挑取具有溶磷圈的单菌落在马铃薯葡萄糖固体培养基上进行分离纯化。将纯化后的菌种分别点接于无机磷选择性固体培养基上，在30℃条件下培养5-7d后观察溶磷圈产生情况，筛选出具有明显溶磷圈的菌株转接到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，置于4℃下保存。

[0027] (二)培养淡紫拟青霉菌采用的培养基

[0028] 分离筛选培养基

[0029] 无机磷选择性固体培养基：葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5

[0030] 保藏培养基

[0031] 马铃薯葡萄糖固体培养基：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000mL，pH 5.8-6.2

[0032] 发酵培养基

[0033] 无机磷液体培养基：葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.5g， NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5

[0034] (三)淡紫拟青霉菌GZP5的鉴定

[0035] (1)形态学鉴定

[0036] 将分离纯化的解磷菌株点种在马铃薯葡萄糖固体培养基上，30℃培养5-7d，观察单菌落特征，记录其颜色、形状、透明度、表面光泽度、边缘特征、隆起程度等特征。挑取少许孢子，于400X和1000X下观察分生孢子和分生孢子梗形态。

[0037] (2)分子生物学鉴定

[0038] 将活化后的菌种接入装有100mL马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，置于30℃，160r/min的摇床中振荡培养直至长出菌丝球后用纱布过滤，收集菌丝球，再用无菌滤纸吸干水分，用液氮研磨成粉末。按照真菌基因组DNA提取试剂盒(美国BIOMIGA公司)提取真菌DNA。将DNA测序测序结果输入美国国家生物技术信息中心NCBI(National Center of Biotechnology Information)数据库进行比对，选取同源性较高的菌株序列作为参照，用MEGA 5.05软件构建菌株系统发育树，进行菌种鉴定。将解磷菌株GZP5与其同属亲缘关系较近的模式菌株进行同源性分析并构建系统发育树，GZP5与淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)菌株聚在同一分支，其序列同源性为99％。

[0039] 实验例一.固体培养条件下解磷能力测定

[0040] 将分离纯化好的菌种点接于无机磷选择性固体培养基平板上，30℃培养7d 后观察解磷圈产生情况，通过十字交叉法测量解磷圈直径(D)和菌落直径(d)，并计算溶解磷圈直径和菌落直径的比值(D/d)。

[0041] 试验证明，GZP5菌株的(D/d)值为1.15±0.003。

[0042] 实验例二.液体培养条件下解磷能力测定

[0043] 将1mLGZP5菌株种子液加入已灭菌的装有100mL无机磷选择性液体培养基的三角瓶中。接种后置于30℃，160r/min摇床中培养7d。同时接入1mL无菌水作为空白对照，设置三组平行。每24h取样，用钼锑抗比色法测定OD700 值，根据磷含量标准曲线计算出上清液中有效磷的含量。

[0044] 结果如图5，试验证明，在72h时菌株GZP5培养液中有效磷含量升至最高，为98.09μg/mL。

[0045] 实验例三.对磷尾矿粉的降解

[0046] 将GZP5接入以磷尾矿粉为唯一磷源的无机磷选择性液体培养基中，置于 30℃，160r/min摇床中培养3d后过滤得到剩余磷尾矿粉，同时以不加菌株作为空白对照。分别对烘干后的磷尾矿粉，菌株作用3天后的磷尾矿粉以及接入无菌水作用的空白对照磷尾矿粉进行扫描电镜检测分析，结果见图3。

[0047] 自然状态下的磷矿粉(图6-A)表面呈较为明显的棱角状,呈典型的矿物状态,磷矿粉的碎小颗粒较多，具有碎屑颗粒的特征。而经GZP5分解利用后大部分小颗粒磷尾矿粉末完全消失，大颗粒的磷尾矿表面也呈现明显的蜂窝状态, 且有菌丝。而从未加菌种作用的空白对照图(图6-B)中可以看出，因摇床的震荡，很难看到大颗粒的磷尾矿，均为小颗粒，且铺满整个界面，没有磷尾矿粉末消失。大颗粒的磷尾矿表面也没有明显的蜂窝状态，仍能看出典型的矿物特征。可见，菌株GZP5对难溶性磷矿粉具有较强的溶解能力。

[0048] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。