[0001] 本发明涉及止血海绵制备技术领域，更具体地，涉及一种乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵及其制备方法和应用。

[0002] 生物医用材料作为一种新型的止血材料，是被认为局部外伤止血最有效的材料之一，具有可吸收、高效、经济以及无毒等优点，随着救治过程中对局部外伤止血的要求越来越高，其止血功效就显得越来越重要。它主要是通过自身材料的特征与优势，吸附血液，凝聚血小板，堵塞血管，促进凝血酶产生或激活凝血因子，从而达到止血作用。

[0003] 目前较为成熟的生物止血材料主要有海藻酸盐海绵、壳聚糖海绵、胶原蛋白海绵以及一些复合海绵等。这些材料由于成分不同，止血机制、止血效果和生物相容性等也各有特点。

[0004] 比如说壳聚糖是来源广泛的甲壳素脱乙酰化的天然高分子，生物相容性好，通过作用于红细胞，使其发生聚集而使血液凝固。但是不能激活凝血因子Ⅻ，其止血作用有限。胶原蛋白海绵利用大面积结构破坏血小板促进凝血，但一般来说动物源性胶原蛋白的生物相容性较差。海藻酸盐海绵高吸湿性的特点，其生物相容性不如壳聚糖海绵；现有技术中的发明专利所述的胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵虽然解决了止血海绵在生物相容性、吸湿性、启动凝血因子等方面的问题，但由于这几种材料的止血作用都不及乌贼墨全面，相关文献有提到，经过临床观察，现已证实乌贼墨是一种很好的全身性止血药，对妇科、内科的许多出血性疾病有显著疗效。乌贼产量高，分布广，药源充足，成本低廉，有无副作用。因此该复合海绵还存在止血作用不够全面的缺点。

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的生物相容性差、止血时间较长、吸收渗血效果不佳，创伤修复能力较弱、止血作用不够全面、毒副作用或者刺激性强、制备时间较长上述缺陷，提供一种乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵。

[0006] 本发明的第二个目的是提供所述乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的制备方法。

[0007] 本发明的第三个目的是提供所述乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的应用。

[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

[0009] 一种乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的制备方法，是将0.4～0.8mg/mL乌贼墨多糖溶液缓慢加入1.5～3.5%壳聚糖溶液中，混匀后，加入2～6%氯化钙溶液，待形成凝胶后，将凝胶冻结，再进行冷冻干燥即得。

[0010] 本发明所制备方法中用到壳聚糖，壳聚糖在作为药用材料发挥止血优势的同时，由于其具有一定的黏度，便于混合液形成水凝胶，使海绵产品外形美观，吸附性良好，大大增强了海绵产品止血时封堵伤口，吸附渗血的能力。乌贼墨多糖的主要作用是提供强大而全面的止血功效，弥补壳聚糖不能激活凝血因子Ⅻ的不足之处。氯化钙则主要提供交联作用，使得海绵产品网状结构整齐，孔隙分布均匀，质地松软，韧性良好。

[0011] 在海绵的制备过程中，冷冻干燥的效果决定了海绵产品的质量。经过查阅对比，本发明中整个止血海绵的制备工艺所耗时间比现有大部分类似研究都要短，既减少了耗能，又提高了生产效率。

[0012] 优选地，所述乌贼墨多糖溶液与壳聚糖溶液的体积比为1：2～1：3。

[0013] 优选地，所述冷冻干燥的时间为16～20h。

[0014] 本发明采用星点设计-效应面法来优选制备止血海绵的最优处方，以壳聚糖浓度、乌贼墨多糖浓度和氯化钙浓度作为考察因素；以海绵产品的外观质量综合评分和吸水倍数作为考察指标，运用Design-Expert.V8.0.6软件生成星点设计实验结果表，并对实验结果进行方差分析，得出效应面图，通过分析效应面图，从而得出最优处方，最后利用软件给出的最优处方制备海绵产品与预测指标值比较，最终得到的乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵质量良好。最优处方为壳聚糖浓度2.29%、乌贼墨多糖浓度0.55mg/ml、氯化钙浓度2.82%。

[0015] 因此，作为一种具体的实施方式，本发明所述乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的制备方法，是将0.55 mg/ml的乌贼墨多糖溶液缓慢加入2.29%的壳聚糖溶液中，混匀后，再加入2mL 2.82%的氯化钙溶液，待形成凝胶后，转到-20℃冻结12h，再进行冷冻干燥 16h即得；所述0.55 mg/ml的乌贼墨多糖溶液与2.29%的壳聚糖溶液的体积比为1：3。

[0016] 本发明还提供上述方法制备得到的乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵。

[0017] 本发明还提供所述乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的应用。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0019] 本发明提高了一种乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵的制备方法，是将0.4～0.8mg/mL乌贼墨多糖溶液缓慢加入1.5～3.5%壳聚糖溶液中，混匀后，加入2～6%氯化钙溶液，待形成凝胶后，将凝胶冻结，再进行冷冻干燥即得；采用星点设计-效应面法来优选制备止血海绵的最优处方，以壳聚糖浓度、乌贼墨多糖浓度和氯化钙浓度作为考察因素；以海绵产品的外观质量综合评分和吸水倍数作为考察指标，运用Design-Expert.V8.0.6软件生成星点设计实验结果表，并对实验结果进行方差分析，得出效应面图，通过分析效应面图，从而得出最优处方，最后利用软件给出的最优处方制备海绵产品与预测指标值比较，最终得到的乌贼墨多糖/壳聚糖止血海绵质量良好。壳聚糖在作为药用材料发挥止血优势的同时，由于其具有一定的黏度，便于混合液形成水凝胶，使海绵产品外形美观，吸附性良好，大大增强了海绵产品止血时封堵伤口，吸附渗血的能力。乌贼墨多糖的主要作用是提供强大而全面的止血功效，弥补壳聚糖不能激活凝血因子Ⅻ的不足之处。氯化钙则主要提供交联作用，使得海绵产品网状结构整齐，孔隙分布均匀，质地松软，韧性良好。附图说明

[0020] 图1为乌贼墨多糖浓度和氯化钙浓度对止血海绵外观质量综合评分的响应面分析。

[0021] 图2为乌贼墨多糖浓度和壳聚糖浓度对止血海绵外观质量综合评分的响应面分析。

[0022] 图3为氯化钙浓度、乌贼墨多糖浓度、壳聚糖浓度对止血海绵吸水倍数的响应面分析。

[0023] 图4为本发明制备得到的止血海绵的产品图；图4A为产品正面图，图4B为产品侧面图，图4C为产品电镜图；图4D为产品吸水效果图。

[0024] 下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

[0025] 一、外观质量综合评分细则

[0026] 外观质量从制得止血海绵的外观、表面特征和电镜图三方面进行评分，共50分，具体评分细则如下：

[0027] 1、外观（满分20分）

[0028] 从海绵的形状（占10分）和颜色（占10分）两个方面进行打分。海绵的形状如果为平整的圆形，则为最高分10分，若不成圆形，有部分凹陷或者翘起，则会扣掉相应的得分，最低分为1分；颜色均匀、雪白则为最高分10分，若颜色偏黄或不均匀则根据颜色越黄扣除更多分数，最低分为1分。

[0029] 2、表面特征（满分10分）

[0030] 海绵的表面如果疏密一致、呈海绵状、且质地轻、富有弹性、手感好，则为最高分10分，若出现明显裂缝、表面孔隙粗细不一、弹性差，则会扣掉相应的得分，最低分为1分。

[0031] 3、电镜图（满分20）

[0032] 从海绵表面撕下一小块薄层，用光学显微镜观察其表面结构，如果为网状结构，表面呈开放性孔洞，在空间上分布均匀，则为最高分20分；若观察到海绵的网状结构不明显、孔洞分布不均匀则会扣掉相应的得分，最低分为1分。

[0033] 4、吸水倍数计算

[0034] 剪取1cm×1cm的海绵小块，称重记为W1，放入约20℃纯净水中浸泡，使其充分吸水后，用镊子轻轻夹住一角提出水面，自然沥水约30秒后称重，记为W2，精确至0.001g，计算（W2－W1）/ W1得到吸水倍数。

[0035] 实施例1

[0036] 将乌贼墨多糖溶于水，配成一定浓度的乌贼墨多糖溶液（A液）；将壳聚糖溶于1%醋酸溶液中，配成一定质量浓度的壳聚糖溶液（B液）；量取一定量的B液，置50ml烧杯中，缓慢加入一定量的A液，搅拌均匀；另取一定量的氯化钙溶液加入到上述烧杯溶液中，加速充分搅拌使之混匀，混合液倒入直径为6cm的培养皿中，观察胶凝状态，待完全形成凝胶后，培养皿转到-20℃冻结12h，再进行冷冻干燥 16～20h，制成多孔隙海绵状固体，即乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵。

[0037] （1）壳聚糖分子量对制备复合止血海绵工艺的影响

[0038] 考察壳聚糖分子量共5个水平，分别为1万、20万、40万、60万、80万，控制壳聚糖质量浓度2.5%、乌贼墨多糖浓度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化钙质量浓度4%，按照上述制备方法制备乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，考察壳聚糖分子量对制备复合止血海绵工艺的影响，实验结果见表1。

[0039]

[0040] 由表1可知，随着壳聚糖分子量的增大，海绵的外观质量综合评分会相对提高；吸水倍数方面，1万分子量壳聚糖对应复合止血海绵的吸水倍数虽然最高，但是由于其他项得分过低，且在水中极容易溶散，吸附性差，不利于贴附伤口。根据实验结果，20万分子量壳聚糖对应的止血海绵外观质量综合评分高达42分，吸水倍数为17.41倍。综合来看，20万分子量壳聚糖对应的复合止血海绵质量较优。

[0041] （2）乌贼墨多糖浓度对制备复合止血海绵工艺的影响

[0042] 考察乌贼墨多糖溶液的浓度共5个水平，分别为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml，控制壳聚糖分子量20万、壳聚糖质量浓度2.5%、配比（A液：B液）1：3、氯化钙质量浓度4%，按照上述制备方法制备乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，考察乌贼墨多糖浓度对制备复合止血海绵工艺的影响，实验结果见表2。

[0043]

[0044] 由表2可知，乌贼墨多糖浓度过高或过低都会降低其对应海绵的外观质量，和影响吸水情况。因此，分别选取乌贼墨多糖浓度为0.2mg/ml和1.0mg/ml作为星点设计中优化处方的水平范围。

[0045] （3）壳聚糖质量浓度对制备复合止血海绵工艺的影响

[0046] 考察壳聚糖质量浓度共5个水平，分别为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，控制壳聚糖分子量20万、乌贼墨多糖浓度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化钙质量浓度4%，按照上述制备方法制备乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，考察壳聚糖浓度对制备复合止血海绵工艺的影响，实验结果见表3。

[0047]

[0048] 表3可以看出：壳聚糖质量浓度低于0.5%时溶液会比较稀，不利于产品成海绵状；而当壳聚糖质量浓度高于4.5%时，壳聚糖溶液过于黏稠，最终使得产品质地过硬，吸水倍数也有所下降。因此分别选取壳聚糖浓度为0.5%和4.0%作为星点设计中优化处方的水平范围。

[0049] （4）A液：B液的比值对制备复合止血海绵工艺的影响

[0050] 考察配比（A液：B液）共5个水平，分别为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5，控制壳聚糖分子量20万、壳聚糖质量浓度2.5%、乌贼墨多糖浓度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3、氯化钙质量浓度4%，按照上述制备方法制备乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，考察配比（A液：B液）对制备复合止血海绵工艺的影响，实验结果见表4。

[0051]

[0052]  由表4可知，当乌贼墨多糖液与壳聚糖溶液配比为1:2和1:3时，海绵的外观质量评分会相对较高；而配比为1:5的产品吸水倍数最低，且浸水后海绵黏性差，不利于贴附伤口；吸水倍数方面，虽然配比为1:1和1:4对应的产品吸水倍数较高，但是由于其浸水后较易溶散，不利于伤口止血。综合来看，配比为1:3对应的产品质量较优。

[0053] （5）氯化钙浓度对制备复合止血海绵工艺的影响

[0054] 考察氯化钙质量浓度共5个水平，分别为1%、2%、4%、6%、10%，控制壳聚糖分子量20万、壳聚糖质量浓度2.5%、乌贼墨多糖浓度0.6mg/ml、配比（A液：B液）1：3，按照上述制备方法制备乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，考察氯化钙浓度对制备复合止血海绵工艺的影响，实验结果见表5。

[0055]

[0056]  由表5可知，氯化钙质量浓度过低或者过高都会降低产品的外观质量，浓度过低会使得海绵质地过硬，没有其他产品具有的松软感；浓度过高则会使得海绵入水即溶散，极不稳定。因此分别选取氯化钙质量浓度为1%和10%作为星点设计中优化处方的水平范围。

[0057] 实施例2星点设计-效应面法实验设计

[0058] 以止血海绵的外观质量综合评分和吸水倍数为考察指标，对乌贼墨多糖浓度、壳聚糖质量浓度、氯化钙质量浓度三个因素进行考察。根据星点设计-效应面法的原理，进行3因素5水平实验设计，因素及水平见表6。

[0059]

[0060]  通过Design-Expert.V8.0.6软件生成20种处方组合，实验结果见表7。

[0061]

[0062] 以Y1和Y2为因变量，运用Design-Expert.V8.0.6软件以各因变量分别对自变量进行多元线性回归、二项式、三项式拟合，并以复相关系数（R²）和置信度（P）为模型判定标准，选择较大R²值和较优P值对方程进行优化。软件显示，线性回归和二项式各拟合方程的复相关系数均较低，说明模型拟合度不高，自变量与因变量之间的线性相关性较差，因此不宜用线性和二次项模型。而多元三项式各拟合方程的复相关系数均较高，说明具体实验因素对效应值的影响不是简单的线性关系。多元三项式的拟合方程如下：

[0063] Y1=41.27+3.24A+1.19B-0.74C+0.99AB+1.12AC+1.11BC-3.25A²-2.11B²+0.29C²+0.62ABC-0.20A²B-0.13A²C-1.88AB²（R²=0.8121，P＜0.05）

[0064] Y2=10.53+0.56A-1.18B-16.77C-0.0037AB+3.62AC+1.23BC-0.78A²-0.88B²+8.46C²-0.27ABC+0.52A²B+9.84A²C-4.70AB²（R²=0.9978，P＜0.0001）

[0065] 根据三项式拟合方程，运用Design-Expert.V8.0.6软件，分别固定3个变量之一为中值，绘制Y1和Y2的三维等高线效应面图，结果见图1、图2和图3。

[0066] 外观质量综合评分的效应面图（图1、图2）：a.乌贼墨多糖浓度与氯化钙质量浓度的效应面（固定壳聚糖质量浓度=2.25%）；b.壳聚糖质量浓度与氯化钙质量浓度的效应面（固定乌贼墨多糖浓度=0.60mg/ml）；c.壳聚糖与乌贼墨多糖浓度的效应面（固定氯化钙质量浓度=2.82%）。

[0067] 吸水倍数的效应面图（图3）：a：乌贼墨多糖浓度与氯化钙质量浓度的效应面（固定壳聚糖质量浓度=2.25%）；b: 壳聚糖质量浓度与氯化钙质量浓度的效应面（固定乌贼墨多糖浓度=0.60mg/ml）；c: 壳聚糖与乌贼墨多糖浓度的效应面（固定氯化钙质量浓度=2.82%）。

[0068] 由图1和图2可以看出，当分别固定壳聚糖质量浓度、乌贼墨多糖浓度和氯化钙质量浓度的值时，曲面变化程度图c＞b＞a，表明三者对海绵外观质量综合评分的影响：氯化钙质量浓度＜乌贼墨多糖浓度＜壳聚糖质量浓度。可见，海绵的外观质量主要由壳聚糖质量浓度和乌贼墨浓度决定的。而在图3中，曲面变化程度图b＞a＞c，表明三者对海绵的吸水倍数的影响：乌贼墨多糖浓度＜壳聚糖质量浓度＜氯化钙质量浓度。

[0069] 综合分析，在一定范围内，适当增加壳聚糖质量浓度和乌贼墨浓度、减小氯化钙质量浓度，可以提高海绵外观质量综合评分以及增大海绵的吸水倍数。这可能是因为壳聚糖溶液具有一定的稠度，其浓度越大越稠，而乌贼墨多糖是水溶性的，两者混合，只有当壳聚糖稠度适中时，才能很好地形成凝胶，加上氯化钙的交联作用，从而得到外观质量好的海绵。而氯化钙质量浓度对于海绵吸水倍数的影响最为显著则可能由于其交联作用的特点。

[0070] 选择图1、图2和图3中外观质量综合评分和吸水倍数最大的区域，即可得出乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵处方中3个自变量对应的变化范围，结果见表8。运用Design-Expert.V8.0.6软件预测最优值，选取最优处方如下：壳聚糖质量浓度为2.29%；乌贼墨多糖浓度为0.55mg/ml；氯化钙质量浓度为2.82%。

[0071]

[0072] 取上述优化处方制备的乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵，对海绵外观质量综合评分以及吸水倍数进行试验考察，比较模型预测值与实测值的外观质量综合评分和吸水倍数，结果见表9。

[0073]

[0074] 按照优化处方，制备的止血海绵柔软多孔，吸水后黏度适中，在外观质量综合评分上与预测值相差不大。不过吸水倍数的实测值与预测值偏差较大，这可能是由于制定的外观质量综合评分规则不够完善，且主观性较强，表现出负相关系数不高，导致软件在分析时不能精确地反映因素间的相互影响，使得软件预测最优处方以及效应值时受到了影响，最终产生了较大的偏差。但是，吸水倍数在20左右，说明制得的乌贼墨多糖-壳聚糖止血海绵仍具有吸附渗血的功效，而且加上该海绵的其他止血优势，相信此种新型止血海绵可以发挥全面的止血功效。