[0001] 本发明涉及一种乳杆菌特异性数据库及其应用，属于生物领域和生物信息学领域。

[0002] 多样化的微生物群落在人体健康、自然环境和发酵工业领域扮演着重要的角色。量化微生物特征是研究这些群落的基础。最近的研究中高通量基于16s rRNA测序技术广泛应用于量化微生物群落，但是由于只能从相对含量上量化微生物，不能真实反应微生物群落在时间和空间上的特征，所以准确定量方法的开发是微生物组研究的方向。另外，对微生物群体中单一微生物的定量数据能更清晰的揭示生态规律，多数高通量测序数据只能从属水平上进行量化，因此高精准度高分辨度的定量方法需要开发。

[0003] 荧光定量PCR是一种灵敏的、快速的、精确绝对定量方法，可通过选择不同的引物实现对微生物群体或者单个微生物的定量研究，并且在广泛应用于肠道、土壤、海洋、发酵食品领域。目前研究中特异性引物的设计多依靠看家基因，比如recA基因等，但是对于微生物群体来说，同属内物种的基因的相似性对设计种水平的特异引物产生了困难，尤其是针对较为复杂的微生物群体。因此针对复杂微生物群体的用来设计特异性引物的基因数据库需要被建立。

[0004] 目前已经建立针对病毒的数据库：在线数据库MRPrimerV筛选出大量的特异性基因，并提供了1818种病毒的特异性引物，解决了病毒检测定量困难的问题。但目前并没有针对细菌和真菌的数据库，原因就在于微生物种间及种内的复杂性。首先，不同微生物种间相似性较高，寻找各种独有基因非常困难；其次，微生物种内具有一定差异，寻找种内各菌株共有的且相对于其它种所独有的基因更为困难。乳杆菌是一类能产乳酸的微生物，广泛分布在人体健康、发酵工艺、自然生态，与人类发展历史息息相关，发挥重要功能。目前已被报道的乳杆菌种多达176种(截至2019年1月3日)，是最复杂的微生物群体。由于种类多，基因组比病毒基因组大，因此特异性基因的筛选极为困难。因此，建立微生物不同种的独有基因库及其引物库，对于不同微生物种荧光定量，以及微生物的特异性鉴定、筛选等具有重要意义。

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一个数据集，包含了乳杆菌的种水平的特异性基因或其特异性引物，并具体提供了在工业、农业、环境等不同领域的主要且常见的16种乳杆菌的种水平的特异性基因或其特异性引物。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种乳杆菌特异性数据库，所述数据库中至少包括2种以上不同乳杆菌的

[0007] (i)特异性基因的序列；或者

[0008] (ii)特异性基因的NCBI登录号，或者其他基因或蛋白数据库(比如genbank、KEGG、metacyc等)登录号；或者

[0009] (iii)扩增特异性基因的引物序列。

[0010] 所述2种以上乳杆菌选自如下16种乳杆菌：Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus murinus、Lactobacillus panis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri。

[0011] 所述16种乳杆菌的特异性基因，按照种名(菌株基因组)(特异性基因数量)表示如下。其中，数据库中的特异性基因可以选择NCBI登录号如下记载的特异性基因中的一个或者多个。比如，Lactobacillus plantarum的特异性基因可以选自NCBI上登录号为CCC78699.1、ACT63459.1、ACT62283.1、CCC80627.1、CCC78692.1、CCC79682.1中的任意一个或者多个。

[0012] 其中，所述特异性基因的序列为NCBI上登录号如下所示的基因的序列中的一个或者多个；该序列如果可以在其他数据库中查找得到，也可以使用其他数据库中的编号。扩增特异性基因的引物序列，可以采用常规的设计引物的方法来设计得到。

[0013] 1.Lactobacillus acetotolerans(菌株：NBRC 13120)(102)

[0014] BAQ57257.1,BAQ57150.1,BAQ56473.1,BAQ56663.1,BAQ57154.1,BAQ58028.1,BAQ56581.1,BAQ57015.1,BAQ57967.1,BAQ57829.1,BAQ57039.1,BAQ57180.1,BAQ57494.1,BAQ56679.1,BAQ56420.1,BAQ57303.1,BAQ56970.1,BAQ56470.1,BAQ56426.1,BAQ57196.1,BAQ57717.1,BAQ56427.1,BAQ57986.1,BAQ57174.1,BAQ56471.1,BAQ57182.1,BAQ57915.1,BAQ57245.1,BAQ57244.1,BAQ56574.1,BAQ56643.1,BAQ57987.1,BAQ57064.1,BAQ57503.1,BAQ57175.1,BAQ57346.1,BAQ57135.1,BAQ57988.1,BAQ57010.1,BAQ57665.1,BAQ57038.1,BAQ57247.1,BAQ56528.1,BAQ57963.1,BAQ56505.1,BAQ57936.1,BAQ56793.1,BAQ57256.1,BAQ57984.1,BAQ56709.1,BAQ57478.1,BAQ56670.1,BAQ56791.1,BAQ56682.1,BAQ58020.1,BAQ57713.1,BAQ56452.1,BAQ56479.1,BAQ57682.1,BAQ56797.1,BAQ56678.1,BAQ57194.1,BAQ57158.1,BAQ56597.1,BAQ57292.1,BAQ56974.1,BAQ57080.1,BAQ57597.1,BAQ57866.1,BAQ56664.1,BAQ56683.1,BAQ57476.1,BAQ57556.1,BAQ57475.1,BAQ57867.1,BAQ58014.1,BAQ56893.1,BAQ56705.1,BAQ56480.1,BAQ57246.1,BAQ57723.1,BAQ56440.1,BAQ57667.1,BAQ57728.1,BAQ58017.1,BAQ56694.1,BAQ57898.1,BAQ57910.1,BAQ57961.1,BAQ57173.1,BAQ56657.1,BAQ57666.1,BAQ56854.1,BAQ57657.1,BAQ57974.1,BAQ57479.1,BAQ56792.1,BAQ57132.1,BAQ57152.1,BAQ57404.1,BAQ57772.1,BAQ57922.1。

[0015] 2.Lactobacillus brevis(菌株：KB290,TMW 1.2113,TMW 1.2112,NPS-QW-145,ATCC 367)(22)

[0016] ABJ65033.1,BAN06310.1,BAN07618.1,ABJ64059.1,ABJ63238.1,ABJ65281.1,BAN05855.1,ABJ64025.1,BAN07871.1,ABJ64624.1,ABJ63636.1,ANN48415.1,ABJ64020.1,BAN05786.1,ABJ64467.1,ABJ63527.1,ABJ63707.1,ABJ64040.1,ABJ64068.1,BAN05806.1,BAN05979.1,BAN06075.1。

[0017] 3.Lactobacillus buchneri(菌株：ATCC 11577,NRRLB-30929,CD034)(18)[0018] AEB74514.1,AFR99155.1,AFR99248.1,AFR99431.1,AFR99676.1,AFS00622.1,AFS00627.1,AFS00934.1,AFS01139.1,AFS01140.1,AFS01141.1,AEB72577.1,AEB72752.1,AEB74347.1,AFR99245.1,AFR99292.1,AFR99525.1,AFR99562.1。

[0019] 4.Lactobacillus acidipiscis(菌株：ACA-DC 1533)(117)

[0020] SFV40567.1,SFV39692.1,SFV41443.1,SFV41643.1,SFV41759.1,SFV41359.1,SFV39507.1,SFV40570.1,SFV39822.1,SFV40003.1,SFV40035.1,SFV39803.1,SFV39559.1,SFV39525.1,SFV40347.1,SFV41418.1,SFV41417.1,SFV39755.1,SFV39522.1,SFV39948.1,SFV41133.1,SFV41348.1,SFV41401.1,SFV39479.1,SFV39638.1,SFV40987.1,SFV41416.1,SFV40572.1,SFV41363.1,SFV41389.1,SFV39520.1,SFV41355.1,SFV39523.1,SFV41215.1,SFV40548.1,SFV41453.1,SFV39931.1,SFV39561.1,SFV41587.1,SFV40543.1,SFV41219.1,SFV40551.1,SFV40495.1,SFV39480.1,SFV41586.1,SFV41375.1,SFV39972.1,SFV41245.1,SFV39654.1,SFV41440.1,SFV39577.1,SFV41615.1,SFV40571.1,SFV41784.1,SFV40573.1,SFV41667.1,SFV41206.1,SFV40537.1,SFV40926.1,SFV40651.1,SFV40075.1,SFV39756.1,SFV41378.1,SFV40565.1,SFV41619.1,SFV41625.1,SFV40326.1,SFV39477.1,SFV41463.1,SFV40943.1,SFV40024.1,SFV40549.1,SFV40811.1,SFV40021.1,SFV40522.1,SFV40865.1,SFV40736.1,SFV39608.1,SFV41603.1,SFV40329.1,SFV40145.1,SFV39684.1,SFV41576.1,SFV40064.1,SFV41377.1,SFV40541.1,SFV41758.1,SFV39754.1,SFV39850.1,SFV40327.1,SFV39560.1,SFV39971.1,SFV40056.1,SFV40292.1,SFV41362.1,SFV39765.1,SFV41387.1,SFV41052.1,SFV40536.1,SFV40544.1,SFV40559.1,SFV39682.1,SFV39697.1,SFV40535.1,SFV41671.1,SFV40969.1,SFV39763.1,SFV41225.1,SFV41614.1,SFV39439.1,SFV41023.1,SFV39717.1,SFV39526.1,SFV41513.1,SFV39973.1,SFV41744.1,SFV40077.1。

[0021] 5.Lactobacillus crustorum(菌株：MN047)(87)

[0022] APU72154.1,APU70962.1,APU72219.1,APU71500.1,APU72067.1,APU72354.1,APU71747.1,APU70425.1,APU71399.1,APU72106.1,APU72353.1,APU70476.1,APU71279.1,APU71287.1,APU72361.1,APU72210.1,APU72088.1,APU72087.1,APU72526.1,APU72362.1,APU70696.1,APU72357.1,APU71310.1,APU70895.1,APU72308.1,APU70608.1,APU70544.1,APU72285.1,APU70483.1,APU72560.1,APU71547.1,APU72150.1,APU72297.1,APU71957.1,APU71003.1,APU70995.1,APU70510.1,APU72538.1,APU72502.1,APU72523.1,APU72397.1,APU72097.1,APU72410.1,APU72173.1,APU71290.1,APU71305.1,APU71359.1,APU71689.1,APU71424.1,APU72438.1,APU71015.1,APU71967.1,APU71309.1,APU71397.1,APU72352.1,APU70836.1,APU71874.1,APU72069.1,APU72294.1,APU72299.1,APU71748.1,APU72119.1,APU71666.1,APU70985.1,APU71722.1,APU72541.1,APU71994.1,APU72215.1,APU72270.1,APU72096.1,APU71239.1,APU71777.1,APU71759.1,APU72478.1,APU72539.1,APU70960.1,APU71889.1,APU71237.1,APU72146.1,APU72570.1,APU71319.1,APU71136.1,APU72001.1,APU70366.1,APU72349.1,APU72525.1,APU71732.1。

[0023] 6.Lactobacillus curvatus(MRS6,WiKim38,WiKim52,KG6,FBA2)(5)[0024] ASN59164.1,ASN59873.1,ASN59662.1,AOO75317.1,ASN60093.1

[0025] 7.Lactobacillus delbrueckii(ND02,ATCC 11842,ATCC BAA-365,2038,MN-BM-F01)(37)

[0026] CAI98502.1,CAI98481.1,ADQ60993.1,CAI97147.1,CAI98503.1,CAI98475.1,CAI97809.1,CAI96906.1,CAI96905.1,CAI98653.1,ADQ61598.1,ABJ58245.1,CAI98636.1,CAI96897.1,CAI97887.1,CAI98670.1,ADY85733.1,CAI98652.1,CAI98587.1,CAI97511.1,CAI98152.1,ADQ60373.1,CAI97498.1,CAI98912.1,CAI97338.1,ABJ58549.1,ADY85939.1,ADQ61701.1,ABJ58621.1,ABJ58708.1,CAI97163.1,ADY84645.1,ADQ61510.1,CAI97219.1,CAI98516.1,CAI98517.1,CAI97516.1。

[0027] 8.Lactobacillus diolivorans(DSM 14421)(231)

[0028] WP_083485007.1,WP_057864655.1,WP_057864228.1,WP_057863756.1,WP_057866300.1,WP_057864090.1,WP_057864566.1,WP_057864826.1,WP_057864557.1,WP_
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[0029] 9.Lactobacillus fermentum(3872,IFO 3956,CECT 5716,NCC2970,F-6)[0030] BAG26486.1,AOR74465.1

[0031] 10.Lactobacillus harbinensis(DSM 16991)(311)

[0032] KRM26808.1,KRM29190.1,KRM28629.1,KRM25914.1,KRM25647.1,KRM28096.1,KRM29244.1,KRM28646.1,KRM29709.1,KRM27683.1,KRM25650.1,KRM29192.1,KRM24764.1,KRM26903.1,KRM29045.1,KRM26500.1,KRM26511.1,KRM29229.1,KRM27673.1,KRM27674.1,KRM26932.1,KRM26116.1,KRM25157.1,KRM25146.1,KRM27540.1,KRM27686.1,KRM27367.1,KRM23453.1,KRM24312.1,KRM27679.1,KRM26085.1,KRM26967.1,KRM26904.1,KRM27676.1,KRM25150.1,KRM25649.1,KRM29091.1,KRM29037.1,KRM26163.1,KRM27366.1,KRM27680.1,KRM25164.1,KRM29194.1,KRM26510.1,KRM27270.1,KRM26514.1,KRM29941.1,KRM26114.1,KRM26898.1,KRM30103.1,KRM23428.1,KRM27359.1,KRM27557.1,KRM26228.1,KRM26931.1,KRM29705.1,KRM27357.1,KRM26400.1,KRM28305.1,KRM25174.1,KRM28644.1,KRM28160.1,KRM26247.1,KRM27644.1,KRM26930.1,KRM28868.1,KRM28631.1,KRM27548.1,KRM28567.1,KRM28562.1,KRM26805.1,KRM29182.1,KRM27519.1,KRM26304.1,KRM29947.1,KRM29293.1,KRM28700.1,KRM28998.1,KRM26899.1,KRM28996.1,KRM25947.1,KRM27271.1,KRM28039.1,KRM23712.1,KRM26908.1,KRM26934.1,KRM25053.1,KRM27272.1,KRM24727.1,KRM27323.1,KRM27682.1,KRM25494.1,KRM26289.1,KRM25153.1,KRM27687.1,KRM27344.1,KRM27922.1,KRM25711.1,KRM27304.1,KRM27417.1,KRM23598.1,KRM25600.1,KRM27655.1,KRM26291.1,KRM26401.1,KRM26226.1,KRM25599.1,KRM27420.1,KRM26907.1,KRM29492.1,KRM26663.1,KRM27377.1,KRM23444.1,KRM29496.1,KRM26920.1,KRM28944.1,KRM29026.1,KRM24733.1,KRM27685.1,KRM29103.1,KRM26230.1,KRM27921.1,KRM26902.1,KRM23754.1,KRM29164.1,KRM28012.1,KRM28332.1,KRM30104.1,KRM28935.1,KRM25161.1,KRM23450.1,KRM25895.1,KRM27684.1,KRM27919.1,KRM25172.1,KRM25876.1,KRM27389.1,KRM27711.1,KRM23741.1,KRM27353.1,KRM30102.1,KRM28038.1,KRM29898.1,KRM27278.1,KRM28078.1,KRM25155.1,KRM26901.1,KRM27675.1,KRM28011.1,KRM26232.1,KRM28035.1,KRM27333.1,KRM27492.1,KRM29105.1,KRM27985.1,KRM25598.1,KRM27170.1,KRM29100.1,KRM27976.1,KRM24652.1,KRM26761.1,KRM25734.1,KRM29801.1,KRM26501.1,KRM24851.1,KRM29495.1,KRM24927.1,KRM26149.1,KRM28010.1,KRM24850.1,KRM27857.1,KRM27937.1,KRM26789.1,KRM27527.1,KRM27868.1,KRM26308.1,KRM29095.1,KRM28934.1,KRM29481.1,KRM30134.1,KRM24106.1,KRM27703.1,KRM27480.1,KRM28107.1,KRM28976.1,KRM27364.1,KRM25167.1,KRM27412.1,KRM29493.1,KRM23723.1,KRM24926.1,KRM25045.1,KRM26029.1,KRM26030.1,KRM28942.1,KRM24848.1,KRM25751.1,KRM27414.1,KRM27490.1,KRM27528.1,KRM26303.1,KRM25495.1,KRM27411.1,KRM29425.1,KRM27558.1,KRM27704.1,KRM27419.1,KRM27523.1,KRM28451.1,KRM25151.1,KRM26224.1,KRM25588.1,KRM27384.1,KRM24928.1,KRM27300.1,KRM25752.1,KRM28051.1,KRM29171.1,KRM30127.1,KRM23442.1,KRM25154.1,KRM28075.1,KRM25145.1,KRM27944.1,KRM27854.1,KRM24104.1,KRM25654.1,KRM29426.1,KRM25894.1,KRM26862.1,KRM27086.1,KRM27413.1,KRM24107.1,KRM29476.1,KRM25195.1,KRM26477.1,KRM27311.1,KRM25496.1,KRM28140.1,KRM25704.1,KRM26274.1,KRM28992.1,KRM28589.1,KRM28059.1,KRM29176.1,KRM30136.1,KRM25147.1,KRM27849.1,KRM29184.1,KRM29424.1,KRM23531.1,KRM23711.1,KRM25469.1,KRM26652.1,KRM27187.1,KRM29098.1,KRM28032.1,KRM28972.1,KRM30138.1,KRM24748.1,KRM27981.1,KRM23443.1,KRM26420.1,KRM28333.1,KRM24105.1,KRM26242.1,KRM27620.1,KRM30139.1,KRM27410.1,KRM29009.1,KRM23474.1,KRM23529.1,KRM25377.1,KRM29174.1,KRM29030.1,KRM25497.1,KRM30109.1,KRM23687.1,KRM26305.1,KRM29197.1,KRM29193.1,KRM25165.1,KRM30130.1,KRM26059.1,KRM28873.1,KRM24879.1,KRM29177.1,KRM25152.1,KRM25149.1,KRM25438.1,KRM25877.1,KRM27396.1,KRM28009.1,KRM26249.1,KRM28943.1,KRM26559.1,KRM30137.1,KRM29309.1,KRM27382.1,KRM29178.1,KRM24102.1,KRM29333.1,KRM27380.1,KRM26604.1,KRM27506.1,KRM24071.1,KRM25148.1,KRM27477.1,KRM28947.1,KRM26921.1,KRM27267.1。

[0033] 11.Lactobacillus hilgardii(ATCC 8290)(147)

[0034] EEI25793.1,EEI25379.1,EEI25393.1,EEI25347.1,EEI25201.1,EEI25378.1,EEI24200.1,EEI23396.1,EEI24270.1,EEI24177.1,EEI24174.1,EEI25815.1,EEI25348.1,EEI25819.1,EEI24213.1,EEI23769.1,EEI24011.1,EEI23397.1,EEI24405.1,EEI25042.1,EEI24323.1,EEI24005.1,EEI24662.1,EEI24016.1,EEI23954.1,EEI24025.1,EEI25669.1,EEI24006.1,EEI24007.1,EEI23162.1,EEI24183.1,EEI23293.1,EEI25668.1,EEI23622.1,EEI24549.1,EEI23270.1,EEI23204.1,EEI25787.1,EEI23244.1,EEI24548.1,EEI23284.1,EEI23288.1,EEI25671.1,EEI24134.1,EEI25405.1,EEI24426.1,EEI25670.1,EEI23955.1,EEI24406.1,EEI25079.1,EEI25818.1,EEI25385.1,EEI24425.1,EEI24207.1,EEI24714.1,EEI24785.1,EEI25466.1,EEI24132.1,EEI24787.1,EEI24519.1,EEI25838.1,EEI25606.1,EEI24235.1,EEI23283.1,EEI24358.1,EEI24404.1,EEI24260.1,EEI23567.1,EEI24233.1,EEI24948.1,EEI25605.1,EEI24208.1,EEI23453.1,EEI24832.1,EEI23309.1,EEI24180.1,EEI25660.1,EEI24979.1,EEI24151.1,EEI25281.1,EEI25594.1,EEI23372.1,EEI24209.1,EEI23069.1,EEI25570.1,EEI25573.1,EEI25576.1,EEI25581.1,EEI25585.1,EEI25587.1,EEI25590.1,EEI25593.1,EEI25595.1,EEI25597.1,EEI25609.1,EEI25612.1,EEI25614.1,EEI25622.1,EEI23079.1,EEI24771.1,EEI25591.1,EEI25596.1,EEI25598.1,EEI24866.1,EEI25608.1,EEI25610.1,EEI24004.1,EEI25571.1,EEI23294.1,EEI25586.1,EEI25621.1,EEI23528.1,EEI25054.1,EEI24139.1,EEI24229.1,EEI24701.1,EEI25592.1,EEI25623.1,EEI24196.1,EEI25015.1,EEI23804.1,EEI25574.1,EEI24198.1,EEI24337.1,EEI24469.1,EEI25676.1,EEI25601.1,EEI24595.1,EEI25582.1,EEI24658.1,EEI23985.1,EEI25009.1,EEI24188.1,EEI25584.1,EEI25618.1,EEI24289.1,EEI25013.1,EEI24009.1,EEI24359.1,EEI23237.1,EEI23212.1,EEI24555.1,EEI24533.1,EEI24820.1,EEI24921.1,EEI25613.1,EEI24346.1。

[0035] 12.Lactobacillus johnsonii(FI9785,N6.2,NCC 533,DPC 6026,BS15)(1)[0036] AAS09348.1

[0037] 13.Lactobacillus murinus(DSM 20452,ASF361)(30)

[0038] EMZ18623.1,EMZ16337.1,EMZ17084.1,EMZ17865.1,EMZ17461.1,EMZ16672.1,EMZ18624.1,EMZ17340.1,EMZ16538.1,KRM75690.1,EMZ18619.1,EMZ17237.1,EMZ18633.1,EMZ16827.1,EMZ18863.1,EMZ16536.1,EMZ16579.1,EMZ18628.1,EMZ18634.1,EMZ18907.1,EMZ16577.1,EMZ18625.1,EMZ16922.1,EMZ16537.1,EMZ17344.1,EMZ16725.1,EMZ18909.1,EMZ18658.1,EMZ18615.1,EMZ16576.1。

[0039] 14.Lactobacillus panis(DSM 6035)(89)

[0040] KRM30361.1,KRM30362.1,KRM30365.1,KRM29770.1,KRM27150.1,KRM25561.1,KRM25392.1,KRM28814.1,KRM25564.1,KRM29064.1,KRM29130.1,KRM30246.1,KRM28737.1,KRM29790.1,KRM29066.1,KRM29757.1,KRM25391.1,KRM28163.1,KRM28245.1,KRM24968.1,KRM28161.1,KRM29847.1,KRM28765.1,KRM28228.1,KRM24941.1,KRM29775.1,KRM29838.1,KRM24822.1,KRM25562.1,KRM26633.1,KRM30056.1,KRM30016.1,KRM29618.1,KRM29996.1,KRM30363.1,KRM29146.1,KRM24942.1,KRM28764.1,KRM26871.1,KRM29569.1,KRM30368.1,KRM24939.1,KRM29675.1,KRM25953.1,KRM28617.1,KRM28248.1,KRM30003.1,KRM24978.1,KRM28203.1,KRM24839.1,KRM25507.1,KRM30002.1,KRM28735.1,KRM27127.1,KRM29995.1,KRM30367.1,KRM26873.1,KRM30247.1,KRM24940.1,KRM28227.1,KRM29674.1,KRM27719.1,KRM25073.1,KRM30366.1,KRM25827.1,KRM30046.1,KRM30001.1,KRM28754.1,KRM27079.1,KRM25332.1,KRM29068.1,KRM27063.1,KRM29834.1,KRM30211.1,KRM30364.1,KRM24830.1,KRM26535.1,KRM25206.1,KRM29845.1,KRM25241.1,KRM27777.1,KRM25250.1,KRM29621.1,KRM25828.1,KRM27077.1,KRM29069.1,KRM29840.1,KRM26388.1,KRM29158.1。

[0041] 15.Lactobacillus plantarum(ZJ316,WCFS1,P-8,JDM1,ST-III)(6)[0042] CCC78699.1,ACT63459.1,ACT62283.1,CCC80627.1,CCC78692.1,CCC79682.1。

[0043] 16.Lactobacillus reuteri(ATCC 53608,DSM 20016,JCM 1112,I5007,SD2112)(18)

[0044] ABQ83523.1,BAG26027.1,AEI57562.1,ABQ82516.1,BAG25143.1,AEI57475.1,ABQ82819.1,ABQ82590.1,ABQ83587.1,BAG26260.1,BAG25396.1,ABQ83735.1,ABQ84082.1,BAG25278.1,ABQ83799.1,ABQ83649.1,BAG26246.1,ABQ82304.1。

[0045] 所述扩增特异性基因的引物序列，包括表1中两个以上不同种的乳杆菌的引物对序列。比如，包括Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidipiscis；其中，Lactobacillus acetotolerans的引物序列可以选择如下组合中的任意一种或者多种：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。

[0046] 表1

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052] 本发明的第二个目的是提供一种定位乳杆菌特异性基因的装置或方法，包括存储本发明的乳杆菌特异性数据库的模块，或者可调取本发明的乳杆菌特异性数据库的模块。

[0053] 在一种实施方式中，所述装置或方法中，含有乳杆菌种类的选项；以及对应乳杆菌种类的特异性基因的序列、特异性基因的登录号或者扩增特异性基因的引物中的任意一种以上。

[0054] 在一种实施方式中，所述装置或方法，还包括登陆模块。可选地，所述登录模块包括客户信息验证单元。可选地，所述客户信息验证单元用于验证客户信息是否正确。可选地，所述客户信息包括用户名和验证码，或者还包括手机短信验证码、二维码、网络图片验证码中的一种或两种以上的组合。

[0055] 在一种实施方式中，所述装置或方法，还包括输入装置，用以输入乳杆菌的种信息(比如中文全称/简称、英文全称/缩写，或者还包括可以模糊匹配到一种以上乳杆菌的信息)。

[0056] 在一种实施方式中，所述装置或方法，还包括输出装置，用以输出所述乳杆菌的特异性基因信息(包括序列或者其他数据库中对应的基因登录号)或者可扩增特异性基因的引物。

[0057] 在一种实施方式中，乳杆菌特异性数据库，与所述输入装置和所述输出装置相连，用以依据乳杆菌的种信息在所述乳杆菌特异性数据库中的位置，实现所述乳杆菌特异性基因的定位。

[0058] 本发明的第三个目的是提供一种定量或定性分析辅助乳杆菌的系统，包括存储本发明的乳杆菌特异性数据库的模块，或者可调取本发明的乳杆菌特异性数据库的模块。

[0059] 在一种实施方式中，所述系统还包括如下装置中的任意一种或多种：引物设计装置、引物合成装置、PCR信息存储装置、PCR装置、基因组提取信息存储装置、用于基因组提取的试剂存储装置等。

[0060] 本发明的第四个目的是的定性或者定量乳杆菌的方法，包括利用乳杆菌的[0061] (iv)特异性基因的序列；或者

[0062] (v)特异性基因的NCBI登录号，或者其他基因或蛋白数据库登录号；或者[0063] (vi)扩增特异性基因的引物序列。

[0064] 所述乳杆菌选自如下16种乳杆菌：Lactobacillus  acetotolerans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus murinus、Lactobacillus panis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reute。

[0065] 所述乳杆菌的特异性基因如前文所述。

[0066] 所述乳杆菌可以是来源于不同环境；比如酒醅、酒曲、土壤、肠道、发酵剂、酸奶、青贮饲料等等。

[0067] 所述方法，包括(1)获取原料样本；(2)提取样本基因组；(3)直接利用本发明的扩增特异性基因的引物序列，或者根据特异性基因设计引物序列；(4)根据引物序列合成引物，以样本基因组为模板，对样本基因组进行定量或者定性分析。

[0068] 有益效果：

[0069] 目前已知的所有乳杆菌，有176种。本发明通过大量的研究实验，获得了16种不同乳杆菌的特异性基因，这些特异性基因能够将该种乳杆菌与其他175种乳杆菌区分开来。进一步地，本发明针对特异性基因，设计了大量引物并进行了验证，结果显示可以用于区分所有乳杆菌不同种；这些引物可应用于定性或者定量PCR，能够从不同环境中准确地鉴定或者筛选对应的乳杆菌种；同时，用于荧光定量PCR检测时，具有速度快、检测限低、准确度高和应用范围广的特点。

[0070] 从本发明建立的数据库中，使用者可以根据想要分析、鉴定、筛选的乳杆菌可以快速锁定目的基因信息或者可扩增目的基因的引物。附图说明

[0071] 图1：Lactobacillus acetotolerans引物的特异性验证。

[0072] 图2：Lactobacillus brevis引物的特异性验证。

[0073] 图3：Lactobacillus buchneri引物的特异性验证。

[0074] 图4：Lactobacillus acidipiscis引物的特异性验证。

[0075] 图5：Lactobacillus crustorum引物的特异性验证。

[0076] 图6：Lactobacillus curvatus引物的特异性验证。

[0077] 图7：Lactobacillus delbrueckii引物的特异性验证。

[0078] 图8：Lactobacillus dioilvorans引物的特异性验证。

[0079] 图9：Lactobacillus fermentum引物的特异性验证。

[0080] 图10：Lactobacillus harbinensis引物的特异性验证。

[0081] 图11：Lactobacillus hilgardii引物的特异性验证。

[0082] 图12：Lactobacillus johnsonii引物的特异性验证。

[0083] 图13：Lactobacillus murinus引物的特异性验证。

[0084] 图14：Lactobacillus panis引物的特异性验证。

[0085] 图15：Lactobacillus plantarum引物的特异性验证。

[0086] 图16：Lactobacillus reuteri引物的特异性验证。

[0087] 图17：标准曲线。具体实施方式：

[0088] 以下将结合附图对本发明进行说明。其中表1为验证的100对引物。

[0089] 实施例1：Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选

[0090] (1)截至2019年1月3日，NCBI公开网站中乳杆菌种类共有176个。

[0091] (2)收集Lactobacillus acetotolerans NBRC 13120的基因组，BioSample ID：SAMD00026530

[0092] (3)收集其他175个乳杆菌种的基因组信息，已公布多个菌株信息的乳杆菌选择至少一个，最多5个基因组，共收集288个乳杆菌基因组。

[0093] (4)利用CD HIT生物信息学分析程序设定覆盖度40％，相似度40％比对287个基因组序列，寻找到Lactobacillus acetotolerans的特异性基因：BAQ57257.1,BAQ57150.1,BAQ56473.1,BAQ56663.1,BAQ57154.1,BAQ58028.1,BAQ56581.1,BAQ57015.1,BAQ57967.1,BAQ57829.1,BAQ57039.1,BAQ57180.1,BAQ57494.1,BAQ56679.1,BAQ56420.1,BAQ57303.1,BAQ56970.1,BAQ56470.1,BAQ56426.1,BAQ57196.1,BAQ57717.1,BAQ56427.1,BAQ57986.1,BAQ57174.1,BAQ56471.1,BAQ57182.1,BAQ57915.1,BAQ57245.1,BAQ57244.1,BAQ56574.1,BAQ56643.1,BAQ57987.1,BAQ57064.1,BAQ57503.1,BAQ57175.1,BAQ57346.1,BAQ57135.1,BAQ57988.1,BAQ57010.1,BAQ57665.1,BAQ57038.1,BAQ57247.1,BAQ56528.1,BAQ57963.1,BAQ56505.1,BAQ57936.1,BAQ56793.1,BAQ57256.1,BAQ57984.1,BAQ56709.1,BAQ57478.1,BAQ56670.1,BAQ56791.1,BAQ56682.1,BAQ58020.1,BAQ57713.1,BAQ56452.1,BAQ56479.1,BAQ57682.1,BAQ56797.1,BAQ56678.1,BAQ57194.1,BAQ57158.1,BAQ56597.1,BAQ57292.1,BAQ56974.1,BAQ57080.1,BAQ57597.1,BAQ57866.1,BAQ56664.1,BAQ56683.1,BAQ57476.1,BAQ57556.1,BAQ57475.1,BAQ57867.1,BAQ58014.1,BAQ56893.1,BAQ56705.1,BAQ56480.1,BAQ57246.1,BAQ57723.1,BAQ56440.1,BAQ57667.1,BAQ57728.1,BAQ58017.1,BAQ56694.1,BAQ57898.1,BAQ57910.1,BAQ57961.1,BAQ57173.1,BAQ56657.1,BAQ57666.1,BAQ56854.1,BAQ57657.1,BAQ57974.1,BAQ57479.1,BAQ56792.1,BAQ57132.1,BAQ57152.1,BAQ57404.1,BAQ57772.1,BAQ57922.1。

[0094] 实施例2：Lactobacillus brevis特异性基因的筛选

[0095] (1)选择菌株KB290,TMW 1.2113,TMW 1.2112,NPS-QW-145,ATCC 367的基因组，BioSample的ID为SAMD00060986,SAMN04517634,SAMN04517633,SAMN04871683,SAMN02598532.

[0096] (2)利用CD HIT筛选种内共有基因,参数设定为覆盖度75％，相似度90％。

[0097] (3)特异性基因筛选方法为将Lactobacillus brevis的共有基因与其余的284个归属于其他175个乳杆菌种的基因组比较，方法同Lactobacillus acetotolerans筛选方法。共筛选22条特异性基因：ABJ65033.1,BAN06310.1,BAN07618.1,ABJ64059.1,ABJ63238.1,ABJ65281.1,BAN05855.1,ABJ64025.1,BAN07871.1,ABJ64624.1,ABJ63636.1,ANN48415.1,ABJ64020.1,BAN05786.1,ABJ64467.1,ABJ63527.1,ABJ63707.1,ABJ64040.1,ABJ64068.1,BAN05806.1,BAN05979.1,BAN06075.1。

[0098] 实施例3：Lactobacillus buchneri特异性基因的筛选

[0099] 选择菌株ATCC  11577,NRRLB-30929,CD034的基因组，BioSample ID为SAMN00001469，SAMN00713605,SAMN02603054。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到18条特异性基因：AEB74514.1,AFR99155.1,AFR99248.1,AFR99431.1,AFR99676.1,AFS00622.1,AFS00627.1,AFS00934.1,AFS01139.1,AFS01140.1,AFS01141.1,AEB72577.1,AEB72752.1,AEB74347.1,AFR99245.1,AFR99292.1,AFR99525.1,AFR99562.1。

[0100] 实施例4：Lactobacillus acidipiscis特异性基因的筛选

[0101] 选择菌株ACA-DC 1533的基因组，BioSample ID为SAMEA4527927。筛选方法同Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选方法。共筛选得到117条特异性基因：SFV40567.1,SFV39692.1,SFV41443.1,SFV41643.1,SFV41759.1,SFV41359.1,SFV39507.1,SFV40570.1,SFV39822.1,SFV40003.1,SFV40035.1,SFV39803.1,SFV39559.1,SFV39525.1,SFV40347.1,SFV41418.1,SFV41417.1,SFV39755.1,SFV39522.1,SFV39948.1,SFV41133.1,SFV41348.1,SFV41401.1,SFV39479.1,SFV39638.1,SFV40987.1,SFV41416.1,SFV40572.1,SFV41363.1,SFV41389.1,SFV39520.1,SFV41355.1,SFV39523.1,SFV41215.1,SFV40548.1,SFV41453.1,SFV39931.1,SFV39561.1,SFV41587.1,SFV40543.1,SFV41219.1,SFV40551.1,SFV40495.1,SFV39480.1,SFV41586.1,SFV41375.1,SFV39972.1,SFV41245.1,SFV39654.1,SFV41440.1,SFV39577.1,SFV41615.1,SFV40571.1,SFV41784.1,SFV40573.1,SFV41667.1,SFV41206.1,SFV40537.1,SFV40926.1,SFV40651.1,SFV40075.1,SFV39756.1,SFV41378.1,SFV40565.1,SFV41619.1,SFV41625.1,SFV40326.1,SFV39477.1,SFV41463.1,SFV40943.1,SFV40024.1,SFV40549.1,SFV40811.1,SFV40021.1,SFV40522.1,SFV40865.1,SFV40736.1,SFV39608.1,SFV41603.1,SFV40329.1,SFV40145.1,SFV39684.1,SFV41576.1,SFV40064.1,SFV41377.1,SFV40541.1,SFV41758.1,SFV39754.1,SFV39850.1,SFV40327.1,SFV39560.1,SFV39971.1,SFV40056.1,SFV40292.1,SFV41362.1,SFV39765.1,SFV41387.1,SFV41052.1,SFV40536.1,SFV40544.1,SFV40559.1,SFV39682.1,SFV39697.1,SFV40535.1,SFV41671.1,SFV40969.1,SFV39763.1,SFV41225.1,SFV41614.1,SFV39439.1,SFV41023.1,SFV39717.1,SFV39526.1,SFV41513.1,SFV39973.1,SFV41744.1,SFV40077.1。

[0102] 实施例5：Lactobacillus crustorum特异性基因的筛选

[0103] 选择菌株MN047的基因组，BioSample  ID为SAMN05893358。筛选方法同Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选方法。共筛选得到87条特异性基因：APU72154.1,APU70962.1,APU72219.1,APU71500.1,APU72067.1,APU72354.1,APU71747.1,APU70425.1,APU71399.1,APU72106.1,APU72353.1,APU70476.1,APU71279.1,APU71287.1,APU72361.1,APU72210.1,APU72088.1,APU72087.1,APU72526.1,APU72362.1,APU70696.1,APU72357.1,APU71310.1,APU70895.1,APU72308.1,APU70608.1,APU70544.1,APU72285.1,APU70483.1,APU72560.1,APU71547.1,APU72150.1,APU72297.1,APU71957.1,APU71003.1,APU70995.1,APU70510.1,APU72538.1,APU72502.1,APU72523.1,APU72397.1,APU72097.1,APU72410.1,APU72173.1,APU71290.1,APU71305.1,APU71359.1,APU71689.1,APU71424.1,APU72438.1,APU71015.1,APU71967.1,APU71309.1,APU71397.1,APU72352.1,APU70836.1,APU71874.1,APU72069.1,APU72294.1,APU72299.1,APU71748.1,APU72119.1,APU71666.1,APU70985.1,APU71722.1,APU72541.1,APU71994.1,APU72215.1,APU72270.1,APU72096.1,APU71239.1,APU71777.1,APU71759.1,APU72478.1,APU72539.1,APU70960.1,APU71889.1,APU71237.1,APU72146.1,APU72570.1,APU71319.1,APU71136.1,APU72001.1,APU70366.1,APU72349.1,APU72525.1,APU71732.1。

[0104] 实施例6：Lactobacillus curvatus特异性基因的筛选

[0105] 选择菌株MRS6,WiKim38,WiKim52,KG6,FBA2的基因组，BioSample ID为SAMN07361834,SAMN05722918,SAMN05300426,SAMN07350659,SAMN05196003。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到5条特异性基因:ASN59164.1,ASN59873.1,ASN59662.1,AOO75317.1,ASN60093.1。

[0106] 实施例7：Lactobacillus delbrueckii特异性基因的筛选

[0107] 选择菌株ND02,ATCC 11842,ATCC BAA-365,2038,MN-BM-F01的基因组，BioSample ID为SAMN02603937,SAMEA3138258,SAMN02598530,SAMN02603124,SAMN04309302。筛选方法同Lactobacillus  brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到37条特异性基因:CAI98502.1,CAI98481.1,ADQ60993.1,CAI97147.1,CAI98503.1,CAI98475.1,CAI97809.1,CAI96906.1,CAI96905.1,CAI98653.1,ADQ61598.1,ABJ58245.1,CAI98636.1,CAI96897.1,CAI97887.1,CAI98670.1,ADY85733.1,CAI98652.1,CAI98587.1,CAI97511.1,CAI98152.1,ADQ60373.1,CAI97498.1,CAI98912.1,CAI97338.1,ABJ58549.1,ADY85939.1,ADQ61701.1,ABJ58621.1,ABJ58708.1,CAI97163.1,ADY84645.1,ADQ61510.1,CAI97219.1,CAI98516.1,CAI98517.1,CAI97516.1。

[0108] 实施例8：Lactobacillus diolivorans特异性基因的筛选

[0109] 选择菌株DSM 14421的基因组，BioSample ID为SAMN02369444。筛选方法同Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选方法。共筛选得到231条特异性基因:WP_083485007.1,WP_057864655.1,WP_057864228.1,WP_057863756.1,WP_057866300.1,WP_
057864090.1,WP_057864566.1,WP_057864826.1,WP_057864557.1,WP_057865432.1,WP_
057864053.1,WP_083484991.1,WP_083484900.1,WP_057864514.1,WP_083485160.1,WP_
057863649.1,WP_057864024.1,WP_057865769.1,WP_057864657.1,WP_057864372.1,WP_
057863901.1,WP_057865790.1,WP_057866057.1,WP_057864007.1,WP_057864042.1,WP_
057865750.1,WP_057864023.1,WP_057863938.1,WP_057864452.1,WP_083484996.1,WP_
057864371.1,WP_083484848.1,WP_057864047.1,WP_057864055.1,WP_057864207.1,WP_
057864565.1,WP_057863742.1,WP_057864675.1,WP_057864032.1,WP_057864656.1,WP_
057864825.1,WP_057865364.1,WP_057865935.1,WP_057866056.1,WP_057864824.1,WP_
057864760.1,WP_057863735.1,WP_083484976.1,WP_057865012.1,WP_057865792.1,WP_
057864551.1,WP_057865255.1,WP_083484877.1,WP_057865362.1,WP_057866019.1,WP_
057865951.1,WP_057865478.1,WP_057866279.1,WP_057865360.1,WP_057866273.1,WP_
057863920.1,WP_057865026.1,WP_057866290.1,WP_083485043.1,WP_057864424.1,WP_
057864494.1,WP_057865956.1,WP_083485146.1,WP_057865023.1,WP_057863583.1,WP_
057864012.1,WP_057865213.1,WP_057866109.1,WP_083485124.1,WP_083485026.1,WP_
057864430.1,WP_083485154.1,WP_057865924.1,WP_057864076.1,WP_057865215.1,WP_
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057864763.1。

[0110] 实施例9：Lactobacillus fermentum特异性基因的筛选

[0111] 选择菌株3872,IFO 3956,CECT 5716,NCC2970,F-6的基因组，BioSample ID为SAMN02314197,SAMD00060917,SAMN02604100,SAMN05510874,SAMN02603935。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到2条特异性基因:BAG26486.1,AOR74465.1。

[0112] 实施例10：Lactobacillus harbinensis特异性基因的筛选

[0113] 选择菌株DSM 16991的基因组，BioSample ID为SAMN02440850。筛选方法同Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选方法。共筛选得到311条特异性基因:KRM26808.1,KRM29190.1,KRM28629.1,KRM25914.1,KRM25647.1,KRM28096.1,KRM29244.1,KRM28646.1,KRM29709.1,KRM27683.1,KRM25650.1,KRM29192.1,KRM24764.1,KRM26903.1,KRM29045.1,KRM26500.1,KRM26511.1,KRM29229.1,KRM27673.1,KRM27674.1,KRM26932.1,KRM26116.1,KRM25157.1,KRM25146.1,KRM27540.1,KRM27686.1,KRM27367.1,KRM23453.1,KRM24312.1,KRM27679.1,KRM26085.1,KRM26967.1,KRM26904.1,KRM27676.1,KRM25150.1,KRM25649.1,KRM29091.1,KRM29037.1,KRM26163.1,KRM27366.1,KRM27680.1,KRM25164.1,KRM29194.1,KRM26510.1,KRM27270.1,KRM26514.1,KRM29941.1,KRM26114.1,KRM26898.1,KRM30103.1,KRM23428.1,KRM27359.1,KRM27557.1,KRM26228.1,KRM26931.1,KRM29705.1,KRM27357.1,KRM26400.1,KRM28305.1,KRM25174.1,KRM28644.1,KRM28160.1,KRM26247.1,KRM27644.1,KRM26930.1,KRM28868.1,KRM28631.1,KRM27548.1,KRM28567.1,KRM28562.1,KRM26805.1,KRM29182.1,KRM27519.1,KRM26304.1,KRM29947.1,KRM29293.1,KRM28700.1,KRM28998.1,KRM26899.1,KRM28996.1,KRM25947.1,KRM27271.1,KRM28039.1,KRM23712.1,KRM26908.1,KRM26934.1,KRM25053.1,KRM27272.1,KRM24727.1,KRM27323.1,KRM27682.1,KRM25494.1,KRM26289.1,KRM25153.1,KRM27687.1,KRM27344.1,KRM27922.1,KRM25711.1,KRM27304.1,KRM27417.1,KRM23598.1,KRM25600.1,KRM27655.1,KRM26291.1,KRM26401.1,KRM26226.1,KRM25599.1,KRM27420.1,KRM26907.1,KRM29492.1,KRM26663.1,KRM27377.1,KRM23444.1,KRM29496.1,KRM26920.1,KRM28944.1,KRM29026.1,KRM24733.1,KRM27685.1,KRM29103.1,KRM26230.1,KRM27921.1,KRM26902.1,KRM23754.1,KRM29164.1,KRM28012.1,KRM28332.1,KRM30104.1,KRM28935.1,KRM25161.1,KRM23450.1,KRM25895.1,KRM27684.1,KRM27919.1,KRM25172.1,KRM25876.1,KRM27389.1,KRM27711.1,KRM23741.1,KRM27353.1,KRM30102.1,KRM28038.1,KRM29898.1,KRM27278.1,KRM28078.1,KRM25155.1,KRM26901.1,KRM27675.1,KRM28011.1,KRM26232.1,KRM28035.1,KRM27333.1,KRM27492.1,KRM29105.1,KRM27985.1,KRM25598.1,KRM27170.1,KRM29100.1,KRM27976.1,KRM24652.1,KRM26761.1,KRM25734.1,KRM29801.1,KRM26501.1,KRM24851.1,KRM29495.1,KRM24927.1,KRM26149.1,KRM28010.1,KRM24850.1,KRM27857.1,KRM27937.1,KRM26789.1,KRM27527.1,KRM27868.1,KRM26308.1,KRM29095.1,KRM28934.1,KRM29481.1,KRM30134.1,KRM24106.1,KRM27703.1,KRM27480.1,KRM28107.1,KRM28976.1,KRM27364.1,KRM25167.1,KRM27412.1,KRM29493.1,KRM23723.1,KRM24926.1,KRM25045.1,KRM26029.1,KRM26030.1,KRM28942.1,KRM24848.1,KRM25751.1,KRM27414.1,KRM27490.1,KRM27528.1,KRM26303.1,KRM25495.1,KRM27411.1,KRM29425.1,KRM27558.1,KRM27704.1,KRM27419.1,KRM27523.1,KRM28451.1,KRM25151.1,KRM26224.1,KRM25588.1,KRM27384.1,KRM24928.1,KRM27300.1,KRM25752.1,KRM28051.1,KRM29171.1,KRM30127.1,KRM23442.1,KRM25154.1,KRM28075.1,KRM25145.1,KRM27944.1,KRM27854.1,KRM24104.1,KRM25654.1,KRM29426.1,KRM25894.1,KRM26862.1,KRM27086.1,KRM27413.1,KRM24107.1,KRM29476.1,KRM25195.1,KRM26477.1,KRM27311.1,KRM25496.1,KRM28140.1,KRM25704.1,KRM26274.1,KRM28992.1,KRM28589.1,KRM28059.1,KRM29176.1,KRM30136.1,KRM25147.1,KRM27849.1,KRM29184.1,KRM29424.1,KRM23531.1,KRM23711.1,KRM25469.1,KRM26652.1,KRM27187.1,KRM29098.1,KRM28032.1,KRM28972.1,KRM30138.1,KRM24748.1,KRM27981.1,KRM23443.1,KRM26420.1,KRM28333.1,KRM24105.1,KRM26242.1,KRM27620.1,KRM30139.1,KRM27410.1,KRM29009.1,KRM23474.1,KRM23529.1,KRM25377.1,KRM29174.1,KRM29030.1,KRM25497.1,KRM30109.1,KRM23687.1,KRM26305.1,KRM29197.1,KRM29193.1,KRM25165.1,KRM30130.1,KRM26059.1,KRM28873.1,KRM24879.1,KRM29177.1,KRM25152.1,KRM25149.1,KRM25438.1,KRM25877.1,KRM27396.1,KRM28009.1,KRM26249.1,KRM28943.1,KRM26559.1,KRM30137.1,KRM29309.1,KRM27382.1,KRM29178.1,KRM24102.1,KRM29333.1,KRM27380.1,KRM26604.1,KRM27506.1,KRM24071.1,KRM25148.1,KRM27477.1,KRM28947.1,KRM26921.1,KRM27267.1。

[0114] 实施例11：Lactobacillus hilgardii特异性基因的筛选

[0115] 选择菌株ATCC 8290的基因组，BioSample ID为SAMN00001467。筛选方法同Lactobacillus acetotolerans特异性基因的筛选方法。共筛选得到147条特异性基因:EEI25793.1,EEI25379.1,EEI25393.1,EEI25347.1,EEI25201.1,EEI25378.1,EEI24200.1,EEI23396.1,EEI24270.1,EEI24177.1,EEI24174.1,EEI25815.1,EEI25348.1,EEI25819.1,EEI24213.1,EEI23769.1,EEI24011.1,EEI23397.1,EEI24405.1,EEI25042.1,EEI24323.1,EEI24005.1,EEI24662.1,EEI24016.1,EEI23954.1,EEI24025.1,EEI25669.1,EEI24006.1,EEI24007.1,EEI23162.1,EEI24183.1,EEI23293.1,EEI25668.1,EEI23622.1,EEI24549.1,EEI23270.1,EEI23204.1,EEI25787.1,EEI23244.1,EEI24548.1,EEI23284.1,EEI23288.1,EEI25671.1,EEI24134.1,EEI25405.1,EEI24426.1,EEI25670.1,EEI23955.1,EEI24406.1,EEI25079.1,EEI25818.1,EEI25385.1,EEI24425.1,EEI24207.1,EEI24714.1,EEI24785.1,EEI25466.1,EEI24132.1,EEI24787.1,EEI24519.1,EEI25838.1,EEI25606.1,EEI24235.1,EEI23283.1,EEI24358.1,EEI24404.1,EEI24260.1,EEI23567.1,EEI24233.1,EEI24948.1,EEI25605.1,EEI24208.1,EEI23453.1,EEI24832.1,EEI23309.1,EEI24180.1,EEI25660.1,EEI24979.1,EEI24151.1,EEI25281.1,EEI25594.1,EEI23372.1,EEI24209.1,EEI23069.1,EEI25570.1,EEI25573.1,EEI25576.1,EEI25581.1,EEI25585.1,EEI25587.1,EEI25590.1,EEI25593.1,EEI25595.1,EEI25597.1,EEI25609.1,EEI25612.1,EEI25614.1,EEI25622.1,EEI23079.1,EEI24771.1,EEI25591.1,EEI25596.1,EEI25598.1,EEI24866.1,EEI25608.1,EEI25610.1,EEI24004.1,EEI25571.1,EEI23294.1,EEI25586.1,EEI25621.1,EEI23528.1,EEI25054.1,EEI24139.1,EEI24229.1,EEI24701.1,EEI25592.1,EEI25623.1,EEI24196.1,EEI25015.1,EEI23804.1,EEI25574.1,EEI24198.1,EEI24337.1,EEI24469.1,EEI25676.1,EEI25601.1,EEI24595.1,EEI25582.1,EEI24658.1,EEI23985.1,EEI25009.1,EEI24188.1,EEI25584.1,EEI25618.1,EEI24289.1,EEI25013.1,EEI24009.1,EEI24359.1,EEI23237.1,EEI23212.1,EEI24555.1,EEI24533.1,EEI24820.1,EEI24921.1,EEI25613.1,EEI24346.1。

[0116] 实施例12：Lactobacillus johnsonii特异性基因的筛选

[0117] 选择菌株FI9785,N6.2,NCC 533,DPC 6026,BS15的基因组，BioSample ID为SAMEA2272487,SAMN02641596,SAMN02603676,SAMN02603892,SAMN04631277。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到1条特异性基因:AAS09348.1。

[0118] 实施例13：Lactobacillus murinus特异性基因的筛选

[0119] 选择菌株DSM 20452,ASF361的基因组，BioSample ID为SAMN02369407,SAMN01731005。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到30条特异性基因:EMZ18623.1,EMZ16337.1,EMZ17084.1,EMZ17865.1,EMZ17461.1,EMZ16672.1,EMZ18624.1,EMZ17340.1,EMZ16538.1,KRM75690.1,EMZ18619.1,EMZ17237.1,EMZ18633.1,EMZ16827.1,EMZ18863.1,EMZ16536.1,EMZ16579.1,EMZ18628.1,EMZ18634.1,EMZ18907.1,EMZ16577.1,EMZ18625.1,EMZ16922.1,EMZ16537.1,EMZ17344.1,EMZ16725.1,EMZ18909.1,EMZ18658.1,EMZ18615.1,EMZ16576.1。

[0120] 实施例14：Lactobacillus panis特异性基因的筛选

[0121] 选择菌株DSM 6035的基因组，BioSample ID为SAMN02369492。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到89条特异性基因:KRM30361.1,KRM30362.1,KRM30365.1,KRM29770.1,KRM27150.1,KRM25561.1,KRM25392.1,KRM28814.1,KRM25564.1,KRM29064.1,KRM29130.1,KRM30246.1,KRM28737.1,KRM29790.1,KRM29066.1,KRM29757.1,KRM25391.1,KRM28163.1,KRM28245.1,KRM24968.1,KRM28161.1,KRM29847.1,KRM28765.1,KRM28228.1,KRM24941.1,KRM29775.1,KRM29838.1,KRM24822.1,KRM25562.1,KRM26633.1,KRM30056.1,KRM30016.1,KRM29618.1,KRM29996.1,KRM30363.1,KRM29146.1,KRM24942.1,KRM28764.1,KRM26871.1,KRM29569.1,KRM30368.1,KRM24939.1,KRM29675.1,KRM25953.1,KRM28617.1,KRM28248.1,KRM30003.1,KRM24978.1,KRM28203.1,KRM24839.1,KRM25507.1,KRM30002.1,KRM28735.1,KRM27127.1,KRM29995.1,KRM30367.1,KRM26873.1,KRM30247.1,KRM24940.1,KRM28227.1,KRM29674.1,KRM27719.1,KRM25073.1,KRM30366.1,KRM25827.1,KRM30046.1,KRM30001.1,KRM28754.1,KRM27079.1,KRM25332.1,KRM29068.1,KRM27063.1,KRM29834.1,KRM30211.1,KRM30364.1,KRM24830.1,KRM26535.1,KRM25206.1,KRM29845.1,KRM25241.1,KRM27777.1,KRM25250.1,KRM29621.1,KRM25828.1,KRM27077.1,KRM29069.1,KRM29840.1,KRM26388.1,KRM29158.1。

[0122] 实施例15：Lactobacillus plantarum特异性基因的筛选

[0123] 选择菌株ZJ316,WCFS1,P-8,JDM1,ST-III的基因组，BioSample  ID为SAMN02604341,SAMEA3138345,SAMN02603936,SAMN02603864,SAMN02603896。筛选方法同Lactobacillus brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到6条特异性基因:CCC78699.1,ACT63459.1,ACT62283.1,CCC80627.1,CCC78692.1,CCC79682.1。

[0124] 实施例16：Lactobacillus reuteri特异性基因的筛选

[0125] 选择菌株ATCC 53608,DSM 20016,JCM 1112,I5007,SD2112的基因组，BioSample ID为SAMEA2272605,SAMN02598351,SAMD00060920,SAMN02603119,SAMN00001494。筛选方法同Lactobacillus  brevis特异性基因的筛选方法。共筛选得到18条特异性基因:ABQ83523.1,BAG26027.1,AEI57562.1,ABQ82516.1,BAG25143.1,AEI57475.1,ABQ82819.1,ABQ82590.1,ABQ83587.1,BAG26260.1,BAG25396.1,ABQ83735.1,ABQ84082.1,BAG25278.1,ABQ83799.1,ABQ83649.1,BAG26246.1,ABQ82304.1。

[0126] 实施例17：对应各特异性基因的特异性引物的设计

[0127] (1)使用Batchprimer在线软件设计特异性引物，参数设定为：引物长度18-27bp，最优20bp；退火温度57-62℃，最优60℃；GC含量40-60％，最优50％；引物对之间的温度差设定为小于5℃；扩增产物100-300bp，最优150bp。

[0128] (2)所获得的引物对挑选100对在NCBI中进行primer-blast，比对数据库选择Nr数据库，比对结果只与目标菌株具有100％相似度，这表明所设计的引物可以区分任何微生物，具备特异性。

[0129] 实施例18：Lactobacillus acetotolerans特异性引物验证

[0130] (1)选择一株目的Lactobacillus acetotolerans进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus  reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium，空白对照为无菌水。

[0131] (2)以上所有微生物使用培养基MRS培养基筛选培养，MRS培养基配方为：培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K2HPO42.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；筛选培养条件为30℃，厌氧培养48小时。

[0132] (3)37种微生物纯培养物分别使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit(Qiagen Sciences,Valencia,CA)提取单菌基因组。阴性对照实验中36个微生物的基因组混合方式为1:1等质量混合，每份取100ng。

[0133] (4)选取特异性基因BAQ57922.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)。

[0134] (5)qPCR反应体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng(无空白组添加2μL无菌水)，无菌水补齐20μL。

[0135] (6)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0136] (7)结果如图1所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以L.acetotolerans作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对L.acetotolernas的特异性。

[0137] 实施例19：Lactobacillus brevis特异性引物验证

[0138] (1)选择一株目的Lactobacillus brevis进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus  reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0139] (2)以上所有微生物使用培养基MRS培养基筛选培养，MRS培养基配方为：培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K2HPO42.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；筛选培养条件为30℃，厌氧培养48小时。

[0140] (3)37种微生物纯培养物分别使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit(Qiagen Sciences,Valencia,CA)提取单菌基因组。阴性对照实验中36个微生物的基因组混合方式为1:1等质量混合，每份取100ng。

[0141] (4)选取特异性基因BAN06075.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示)。

[0142] (5)qPCR反应体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng(无空白组添加2μL无菌水)，无菌水补齐20μL。

[0143] (6)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0144] (7)结果如图2所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus brevis作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus brevis的特异性。

[0145] 实施例20：Lactobacillus buchneri特异性引物验证

[0146] (1)选择一株目的Lactobacillus buchneri进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus  reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0147] (2)以上所有微生物使用培养基MRS培养基筛选培养，MRS培养基配方为：培养基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、无水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K2HPO42.5g/L、三水合乙酸钠6.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·4H2O 0.08g/L、琼脂20.0g/L调节pH为6.8±0.3，添加1000mL蒸馏水配制成主溶液，121℃灭菌15min；筛选培养条件为30℃，厌氧培养48小时。

[0148] (3)37种微生物纯培养物分别使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit(Qiagen Sciences,Valencia,CA)提取单菌基因组。阴性对照实验中36个微生物的基因组混合方式为1:1等质量混合，每份取100ng。

[0149] (4)选取特异性基因AFR99562.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示)。

[0150] (5)qPCR反应体系为20μL：SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 100ng(无空白组添加2μL无菌水)(无空白组添加2μL无菌水)，无菌水补齐20μL。

[0151] (6)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0152] (7)结果如图3所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus buchneri作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus buchneri的特异性。

[0153] 实施例21：Lactobacillus acidipiscis特异性引物验证

[0154] (1)选择一株目的Lactobacillus acidipiscis进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus  harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0155] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0156] (3)选取特异性基因SFV40077.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示)。

[0157] (4)结果如图4所示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus acidipiscis作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus acidipiscis的特异性。

[0158] 实施例22：Lactobacillus crustorum特异性引物验证

[0159] (1)选择一株目的Lactobacillus crustorum进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0160] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0161] (3)选取特异性基因APU70836.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62所示)。

[0162] (4)结果如图5示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus crustorum作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus crustorum的特异性。

[0163] 实施例23：Lactobacillus curvatus特异性引物验证

[0164] (1)选择一株目的Lactobacillus curvatus进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0165] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0166] (3)选取特异性基因ASN59873.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78所示)。

[0167] (4)结果如图6示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus curvatus作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus curvatu的特异性。

[0168] 实施例24：Lactobacillus delbrueckii特异性引物验证

[0169] (1)选择一株目的Lactobacillus delbrueckii进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc  mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0170] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0171] (3)选取特异性基因CAI98587.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示)。

[0172] (4)结果如图7示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus delbrueckii作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus delbrueckii的特异性。

[0173] 实施例25：Lactobacillus diolivorans特异性引物验证

[0174] (1)选择一株目的Lactobacillus dioilvorans进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus  harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0175] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0176] (3)选取特异性基因WP_083485124.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示)。

[0177] (4)结果如图8示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus dioilvoranss作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus dioilvorans的特异性。

[0178] 实施例26：Lactobacillus fermentum特异性引物验证

[0179] (1)选择一株目的Lactobacillus fermentum进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0180] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0181] (3)选取特异性基因AOR74465.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116所示)。

[0182] (4)结果如图9示，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus fermentum作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus fermentum的特异性。

[0183] 实施例27：Lactobacillus harbinensis特异性引物验证

[0184] (1)选择一株目的Lactobacillus harbinensis进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0185] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0186] (3)选取特异性基因KRM29705.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示)。

[0187] (4)结果如图10，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus harbinensis作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus harbinensis的特异性。

[0188] 实施例28：Lactobacillus hilgardii特异性引物验证

[0189] (1)选择一株目的Lactobacillus hilgardii进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0190] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0191] (3)选取特异性基因EEI25466.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132所示)。

[0192] (4)结果如图11，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus hilgardii作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus hilgardii的特异性。

[0193] 实施例28：Lactobacillus johnsonii特异性引物验证

[0194] (1)选择一株目的Lactobacillus johnsonii进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0195] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0196] (3)选取特异性基因AAS09348.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146所示)。

[0197] (4)结果如图12，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus johnsonii作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus johnsonii的特异性。

[0198] 实施例30：Lactobacillus murinus特异性引物验证

[0199] (1)选择一株目的Lactobacillus murinus进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0200] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0201] (3)选取特异性基因EMZ18909.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:148所示)。

[0202] (4)结果如图13，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus murinus作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus murinus的特异性。

[0203] 实施例31：Lactobacillus panis特异性引物验证

[0204] (1)选择一株目的Lactobacillus panis进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillusfermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0205] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0206] (3)选取特异性基因KRM29995.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164所示)。

[0207] (4)结果如图14，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus panis作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus panis的特异性。

[0208] 实施例32：Lactobacillus plantarum特异性引物验证

[0209] (1)选择一株目Lactobacillus plantarum进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0210] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0211] (3)选取特异性基因CCC80627.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示)。

[0212] (4)结果如图15，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus plantarum作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus plantarum的特异性。

[0213] 实施例33：Lactobacillus reuteri特异性引物验证

[0214] (1)选择一株目的Lactobacillus reuteri进行qPCR，阴性对照为来自小鼠肠道、白酒小曲、大曲、商业发酵剂、酸奶、青贮饲料的36个微生物：Lactobacillus acidipiscis，Lactobacillus casei，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus brevis,Lactobacillus acetotolerans,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillus tequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium,空白对照为无菌水。

[0215] (2)培养方式、基因组提取方法、阴性对照、空白对照实验设计及其操作方法与实施例20相同。

[0216] (3)选取特异性基因BAG26260.1，设计了引物(引物序列如SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190所示)。

[0217] (4)结果如图16，通过Ct值以及溶解曲线统计引物的特异性，只有以Lactobacillus reuteri作为模板是有Ct值，且溶解曲线为单峰则证明所设计的特异性引物具有对Lactobacillus reuteri的特异性。

[0218] 实施例34：发酵酒醅中Lactobacillus acetotolerans的定量实验

[0219] (1)Lactobacillus acetotolerans菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0220] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0221] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0222] (4)使用Lactobacillus acetotolerans特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

[0223] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与耐酸乳杆菌菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0224] (6)提取酒醅样本中的总基因组，基因浓度为100.45ng/uL。

[0225] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算L.acetotolerans在样本中的浓度为C＝6.89Lg(CFU/g)。

[0226] 实施例35：酸奶中Lactobacillus brevis的定量实验

[0227] (1)Lactobacillus brevis菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0228] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0229] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0230] (3)使用Lactobacillus.brevis特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示。

[0231] (4)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus brevis菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0232] (5)提取酸奶样本中的总基因组，基因浓度为105.65ng/uL。

[0233] (6)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus brevis在样本中的浓度为C＝7.83Lg(CFU/mL)。

[0234] 实施例36：青贮饲料中Lactobacillus buchneri的定量实验

[0235] (1)Lactobacillus buchneri菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0236] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0237] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0238] (4)使用Lactobacillus buchneri特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示。

[0239] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus buchneri菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0240] (6)提取青贮饲料样本中的总基因组，基因浓度为152.65ng/uL。

[0241] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus buchneri在样本中的浓度为C＝6.41Lg(CFU/g)。

[0242] 实施例37：青贮饲料中Lactobacillus panis的定量实验

[0243] (1)Lactobacillus panis菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0244] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0245] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0246] (4)使用Lactobacillus panis特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如引物序列如SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164所示。

[0247] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus panis菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0248] (6)提取青贮饲料样本中的总基因组，基因浓度为136.57ng/uL。

[0249] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus panis在样本中的浓度为C＝4.63Lg(CFU/g)。

[0250] 实施例38：商业发酵剂中Lactobacillus plantrum的定量实验

[0251] (1)Lactobacillus plantrum菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0252] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0253] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0254] (4)使用Lacetobacillus plantrum特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示。

[0255] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillusplantrum菌浓的标准曲线，如图17所示，R2>0.99。

[0256] (6)提取发酵剂样本中的总基因组，基因浓度为105.65ng/uL。

[0257] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus plantrum在样本中的浓度为C＝6.78Lg(CFU/g)。

[0258] 实施例39：白酒大曲中Lactobacillus hilgardii的定量实验

[0259] (1)Lactobacillus hilgardii菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0260] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0261] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0262] (4)使用Lactobacillus hilgardii特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132所示。

[0263] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus hilgardii菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0264] (6)提取大曲样本中的总基因组，基因浓度为89.35ng/uL。

[0265] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus hilgardii在样本中的浓度为C＝4.58Lg(CFU/g)。

[0266] 实施例40：土壤中Lactobacillus harbinensis的定量实验

[0267] (1)Lactobacillus harbinensis菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0268] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0269] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0270] (4)使用Lactobacillus harbinensis特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示。

[0271] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus harbinensis菌浓2
的标准曲线，如图17，R>0.99。

[0272] (6)5g土壤样本高温灭菌(121℃)，接种5×108CFU的Lactobacillus harbinensis，并提取土壤样本中的总基因组，基因浓度为230.68ng/uL。

[0273] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus harbinensis在样本中的浓度为C＝7.26Lg(CFU/g)。

[0274] 实施例41：白酒小曲中Lactobacillus fermentum的定量实验

[0275] (1)Lactobacillus fermentum菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0276] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0277] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0278] (4)使用Lactobacillus fermentum特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116所示。

[0279] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus fermentum菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0280] (6)提取小曲样本中的总基因组，基因浓度为352.64ng/uL。

[0281] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus fermentum在样本中的浓度为C＝4.10Lg(CFU/g)。

[0282] 实施例42：小鼠粪便中Lactobacillus curvatus的定量实验

[0283] (1)Lactobacillus curvatus菌液根据实施例18中的培养方法获得，细菌浓度通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例18。

[0284] (2)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 0.5μL，无菌水补齐20μL。

[0285] (3)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

[0286] (4)使用Lactobacillus curvatus特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列如SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78所示。

[0287] (5)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Lactobacillus curvatus菌浓的标准曲线，如图17，R2>0.99。

[0288] (6)提取粪便样本中的总基因组，基因浓度为256.34ng/uL。

[0289] (7)qPCR体系和反应条件同(2)，(3)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Lactobacillus curvatus在样本中的浓度为C＝5.11Lg(CFU/g)。

[0290] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。