一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201811087438.2 | 申请日 | 2018-09-18 | 公开(公告)号 | CN109056078A | 公开(公告)日 | 2018-12-21 |
| 申请人 | 武汉菲沙基因信息有限公司; | 发明人 | 张骥诚; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种适用于细菌的Hi‑C高通量测序建库方法，该方法包：(1)样品甲 醛 交联；(2)液氮 研磨 和溶菌酶并行裂解交联后物料，释放细胞 染色 质；细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经Sau3AI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料；SDS灭活内源酶的条件为：65℃孵育10min后立即放置 冰 上；(3)酶切后物料进行末端补平；(4)末端补平后DNA分子内连接；(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端 生物 素，获得纯化DNA， 超 声波 随机打断DNA成利于测序的 片段 大小从而获得DNA测序文库。该方法通过设计合适的内源酶灭活条件，调整灭活时间和 温度 ，从而解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi‑C高通量测序建库，扩大了Hi‑C技术的适用范围。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： |
||||||
| 说明书全文 | 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法技术领域背景技术[0002] 染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在连接前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后，提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断，最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。 [0003] 常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象，其染色质比较单一，更容易获得比较好的结果，但是限制了其使用范围，距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如原核生物相较于真核生物染色质上结合的蛋白要少得多，现有适用于真核生物的Hi-C建库方法无法获得互作片段从而并不适用于原核生物。因此有必要开发一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法。 发明内容[0004] 针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，该方法通过设计合适的内源酶灭活条件，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。 [0005] 为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： [0006] 一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤： [0007] (1)对样品进行甲醛交联获得交联后的物料； [0008] (2)液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后物料，使裂解细胞释放细胞染色质；细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经Sau3AI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料；所述SDS灭活内源酶的条件为：65℃孵育10min后立即放置冰上； [0009] (3)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平，获得末端补平后DNA； [0010] (4)对所述末端补平后DNA进行DNA细胞核分子内连接获得分子内连接后物料； [0011] (5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素，获得纯化的DNA，超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。 [0012] 进一步地，所述灭活内源酶的步骤包括： [0013] (1)取液氮研磨样品0.1g，加入SET buffer 500μL、50mg/mL溶菌酶2.8μL充分混匀，37℃温浴1h； [0014] (2)2000g、4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬； [0015] (3)2000g、4℃离心5min，去上清，向每管溶解染色质中添加500μL1×CutSmart，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；所述1×CutSmart中含SDS，所述SDS的终浓度为0.3％； [0016] (4)65℃孵育10min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。 [0017] 进一步地，所述步骤(2)中SDS采用Triton X-100中和，所述Triton X-100的浓度为20％，中和后Triton X-100的终浓度为3％。 [0018] 进一步地，所述步骤(2)中Sau3AI核酸内切酶的浓度为5000units/mL。 [0019] 更进一步地，所述步骤(2)中酶切反应包括向每管内源酶灭活物料中加5000units/mL的Sau3AI核酸内切酶16μL，900rpm 37℃反应过夜。 [0020] 进一步地，所述步骤(5)中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分：解交联分子内连接后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dGTP 1μL、10mM dATP 1μL、3U/μL T4DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。 [0021] 进一步地，所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。 [0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于： [0023] (1)本发明提出的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，通过设计合适的内源酶灭活条件，调整灭活时间和温度，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，从而解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。 [0024] (2)由于细菌甲基化会严重影响MboI及DpnII的酶切效率，导致实验失败。因此本发明的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法在工具酶的选择上，避开了对细菌甲基化敏感的MboI及DpnII，选用对细菌甲基化不敏感的Sau3AI，以对细菌基因组进行良好的酶切，Sau3AI为4碱基内切酶，相较其他6碱基内切酶，可以将酶切分辨率从4096bp提高至256bp，显著增加了酶切精度。 [0025] (3)本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。 [0027] 图1为本发明的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法流程图。 [0028] 图2为鉴定基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。 [0029] 图3为本发明的方法构建的文库大小分布结果示意图。 具体实施方式[0030] 展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0031] 本发明针对原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题提出了一种新的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤。 [0033] 2.液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后物料，使裂解细胞释放细胞染色质；然后细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经Sau3AI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料。 [0034] 其中，细胞染色质SDS灭活内源酶的步骤包括： [0035] (1)取液氮研磨样品0.1g，加入SET buffer 500μL、50mg/mL溶菌酶2.8μL充分混匀，37℃温浴1h； [0036] (2)2000g、4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬； [0037] (3)2000g、4℃离心5min，去上清，向每管溶解染色质中添加500μL 1×CutSmart，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；所述1×CutSmart中含SDS，所述SDS的终浓度为0.3％； [0038] (4)65℃孵育10min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。 [0039] 灭活内源酶未反应的SDS采用Triton X-100中和，所述Triton X-100的浓度为20％，中和后Triton X-100的终浓度为3％。 [0040] 其中酶切反应具体操作为向每管内源酶灭活物料中加5000units/mL的Sau3AI核酸内切酶16μL，900rpm 37℃反应过夜。 [0041] 3.用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平，获得末端补平后DNA。 [0042] 4.对所述末端补平后DNA进行DNA细胞核分子内连接获得分子内连接后物料。 [0043] 5.解交联分子内连接后物料，并去除未连接的末端生物素，降低生物素捕获阶段的背景，获得纯化的DNA。超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。 [0044] 其中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分：解交联分子内连接后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dGTP 1μL、10mM dATP1μL、3U/μL T4DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。 [0045] 本发明的建库方法还包括捕获目的片段与文库扩增。使用链霉亲和素磁珠(MyOneTMStreptavidin C1，Thermo Fisher)特异性捕获标记了生物素的DNA 片段，对捕获的DNA片段进行PCR扩增以达到高通量测序所需文库量，通过一次高通量测序的少量数据初步检测文库的质量，同一染色体上互作的可能性绝对大于不同染色体，以此为依据评估文库质量，我们认为顺式互作比例大于60％即为一个比较好的文库，可以用于大量测序及后续分析。 [0046] 实施例1： [0047] 本实施例以链霉菌为研究对象，对菌体进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质，再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断，最后进行文库构建，具体实验过程如下： [0048] 1.甲醛固定 [0049] 1)取新鲜培养对数生长期的链霉菌菌液50mL，2000g RT离心5min，吸弃上清； [0050] 2)加入25mL 1×PBS配制的终浓度1％的甲醛，轻微吹打重悬细胞； [0051] 3)室温摇晃10分钟进行交联； [0052] 4)加入5.55mL 1×PBS配制的2.0M甘氨酸； [0053] 5)室温摇晃5分钟终止交联； [0054] 6)2000g RT离心5min，吸弃上清； [0055] 7)3mL预冷1×PBS重悬细胞，每1mL样品分装于一个1.5mL离心管中，4℃2000g离心5min，吸弃上清； [0056] 8)交联好的组织在-80℃冻存，可干冰运输。 [0057] 2.裂解酶切 [0058] 1)准备研钵，纯水洗净，使用锡箔纸包裹，倒入酒精，烧5min，室温放凉，研钵中加入液氮预冷，将保存的细胞倒入盛有液氮的研钵中，迅速研磨至粉末状态； [0059] 2)取研磨好的样品0.1g(取0.1g备份)加入500μL SET buffer，2.8μL溶菌酶(50mg/mL，88015U/mg Ready-lysozyme)，充分混匀，37℃温浴1h； [0060] 3)2000g，4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬； [0061] 4)2000g，4℃离心5min，去上清，通过添加500μL 1×CutSmart(含终浓度0.3％SDS)每管溶解染色质，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫； [0062] 5)65℃孵育10min，并立即放置冰上(长时间高温会解交联)，瞬时离心以移除管盖液体； [0063] 6)中和SDS：添加75μL的20％Triton X-100至终浓度3％，重悬细胞碎片并避免形成气泡，37℃950rpm震荡15min； [0064] 7)每管加入16μL限制性内切酶(Sau3AI，5000units/mL)，900rpm 37℃过夜(终体积约600μL)。 [0065] 3.末端标记 [0066] 1)2000g离心5min，弃上清，200μL 1×NEBuffer2.1重悬，65℃孵育20min； [0067] 2)补平末端并插入生物素碱基，生物素补平体系如表1所示： [0068] 表1 [0069] [0070] 3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积240μL)，混匀后，37℃孵育2h。 [0071] 4.分子内连接 [0072] 1)DNA分子内连接处理，连接体系如表2所示： [0073] 表2 [0074] [0075] 2)转移每个Hi-C反应体系至上述连接体系(终体积900μL)，轻柔颠倒混匀； [0076] 3)16℃孵育连接反应4h，每小时颠倒混匀。 [0077] 5.解交联 [0078] 1)5μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃处理2h； [0079] 2)将反应混合液冷却到室温，一倍氯仿分离回收上清，加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min，两次75％乙醇清洗(弹起沉淀)，吹干，回收产物溶解在50μL EB，通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA，Qubit测定浓度，大约20-100ng/μL为正常浓度范围。(store at-20℃)； [0080] 3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如输送2所示，图为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾；酶切效果明显，DNA片段整个下移；连接效果明显，DNA条带上移；说明酶切连接均达到预期效果，可以进行下步实验。 [0081] 6.末端去生物素 [0082] 1)取3μg样品1×Ampure XP beads纯化后Qubit测定浓度； [0083] 2)取1μg样品用于末端去生物素，去生物素体系如表3所示： [0084] 表3 [0085] [0086] 3)12℃反应4h，2μL 0.5M EDTA终止反应。 [0087] 7.DNA打断 [0088] 1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右，超声选择400bp程序90s进行1次； [0089] 2)1×Ampure XP beads回收DNA，溶解于52μL Tris，Qubit测定浓度大约10ng/μL左右为正常浓度范围。 [0091] 1)Illumina建库试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina)补平末端并+A及+Adaptor； [0092] 2)使用Illumina建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤，回收+Adaptor后的DNA。 [0093] 9.生物素捕获 [0095] 10.Illumina试剂盒扩增嵌合片段 [0096] 1)Illumina试剂盒建库(100μL，PCR至6cycles，分别取3微升摸索循环数6,8,10,12cycles)，选取能扩增出足量产物的最低循环数； [0097] 2)1.5％agarose凝胶回收400-600bp条带； [0098] 3)回收产物对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。从图中可以看出，文库大小集中在400-600bp之间，与凝胶回收预期范围一致。 [0100] 表4链霉菌数据分析结果说明 [0101] [0102] 注：为SE(Single End)数据，其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括，valid pair，single side，self circles，dangling ends及unmapped等类型。其中：valid pair是指符合Hi-C实验预期，由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段；single side是指，仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段；self circles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA，它主要由单一酶切片段两端相连接，经超声波打断，捕获并测序产生；dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段，它源自未经过连接反应，最终却被捕获测序产生的数据；unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中，仅valid pair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此，非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。 [0103] 因此，本发明提出的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，通过设计合适的内源酶灭活条件，调整灭活时间和温度，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，从而解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。 [0104] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈