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一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用

申请号 CN201510638297.9 申请日 2015-09-30 公开(公告)号 CN105175549B 公开(公告)日 2019-08-16
申请人 康希诺生物股份公司; 发明人 李军强; 苗丹青; 杨鸣鸣; 邵忠琦; 朱涛; 宇学峰;
摘要 本 发明 提供了一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用,所述融合蛋白是由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1:1的方式形成融合基因,其后转化原核表达系统得到的融合基因表达系统;该融合蛋白可有效的增强Hin47和HiD单个蛋白 抗原 的免疫原性,Hin47‑HiD作为结合 疫苗 蛋白载体,可有效增强多糖抗原的免疫原性;以融合蛋白Hin47‑HiD作为结合疫苗蛋白载体,开发的Hia和Hib二价结合疫苗,可同时 预防 侵袭性和非侵袭性流感嗜血杆菌。
权利要求

1.一种流感嗜血杆菌融合蛋白,其特征在于:为流感嗜血杆菌HiD蛋白和流感嗜血杆菌Hin47蛋白融合而成,即Hin47-HiD , Hin47的基酸序列为序列表1所示序列,HiD的氨基酸序列为序列表3所示序列。
2.权利要求1所述的流感嗜血杆菌融合蛋白,其特征在于:所述Hin47-HiD由以1:1方式和Linker融合而成,所述linker使Hin47蛋白和HiD蛋白单体维持自身特有的构象,所述融合蛋白的结构为Hin47-linker-HiD。
3.一种广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,其特征在于:该疫苗制剂以a或b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为抗原,以Hin47- HiD为蛋白载体。
4.根据权利要求3所述的广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,其特征在于:制剂中的多糖抗原成分有效预防相应血清型的流感嗜血杆菌,蛋白载体成分预防非分型流感嗜血杆菌。
5.根据权利要求3所述的广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,其特征在于:该制剂为包含Hia与 Hin47-HiD蛋白载体的偶联物、Hib与 Hin47-HiD蛋白载体的偶联物的二价结合疫苗。
6.根据权利要求5所述的广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,其特征在于:所述二价结合疫苗剂型为液体针剂,每剂以0.5ml计含有a型多糖的含量为8-15μg,b型多糖的含量为8-15μg,HiN47-HiD含量在20-80μg。
7.根据权利要求6所述的广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,其特征在于:制剂中的缓冲液为PB和NaCl,终浓度为0.45%NaCl+10mM PB。

说明书全文

一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及疫苗产品开发技术领域,尤其是一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza,Hi)是一类无动、无芽孢,呈杆状的革兰氏阴性杆菌,寄居于正常人的呼吸道,属条件致病菌,主要引起儿童上呼吸道感染,中炎和炎,亦可引起败血症、脑膜炎等严重感染。
[0003] 流感嗜血杆菌分为荚膜型(可分型)和无荚膜型(不可分型),荚膜型的流感嗜血杆菌根据荚膜多糖的成分不同又可分为a、b、c、d、e、f共6种血清型。无荚膜型又称之为不可分型流感嗜血杆菌(NontypeableHaemophilus influenza,NTHI)。
[0004] 流感嗜血杆菌侵入性疾病在全世界均有发生。b型流感嗜血杆菌(Hib)的毒性最强,是5岁以下儿童细菌性脑膜炎的主要致病菌。随着Hib结合疫苗在全球范围的推广使用,b型流感嗜血杆菌的发病率大幅下降。Hib结合疫苗是基于b型流感嗜血杆菌荚膜多糖开发的。荚膜多糖是荚膜型流感嗜血杆菌的主要抗原物质,能在人体中诱发保护力免疫反应,但是荚膜多糖为胸腺非依赖性抗原,虽可产生较弱的IgM抗体但是不产生免疫记忆,不能对2岁以内婴幼儿产生有效保护。疫苗开发者将荚膜多糖结合到蛋白载体上形成多糖蛋白结合疫苗,蛋白载体使多糖抗原由胸腺非依赖性抗原变为胸腺依赖性抗原,从而激活T辅助淋巴细胞,促使B细胞产生特异性IgG抗体,这使得Hib结合疫苗得到广泛应用。然而Hib结合疫苗仅对B型流感嗜血杆菌有效,不能对其它型流感嗜血杆菌及不可分型流感嗜血杆菌产生预防作用,这导致其它型流感嗜血杆菌及不可分型流感嗜血杆菌的感染率大幅上升。例如,不可分型流感嗜血杆菌可导致中耳炎(OM),不分型流感嗜血杆菌埃及生物群引起流行性结膜炎和巴西紫热。全球尚没有批准的用于预防b型以外的其它型流感嗜血杆菌或不可分型嗜血杆菌的疫苗。
[0005] D蛋白是流感嗜血杆菌表面的一种脂蛋白(HiD),相对分子量为42KDa,D蛋白在所有流感嗜血杆菌菌株(包括有荚膜和无荚膜的流感嗜血杆菌)中高度保守,是人免疫球蛋白D的特异性抗原。尽管D蛋白可有效预防NTHi引起的中耳炎,但HiD相对分子量较小,其免疫原性较弱。
[0006] Hin47(又称HtrA)是流感嗜血杆菌在环境压力条件下表达的热休克蛋白,具丝酸蛋白酶活性。Hin47是重要的免疫抗原,实验证明其可刺激机体产生B细胞和T细胞反应,其免疫原性已得到充分证实。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种结合疫苗蛋白载体Hin47-HiD融合蛋白。
[0008] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述融合蛋白的构建方法。
[0009] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述融合蛋白的的应用,以Hin47-HiD作为Hia和Hib结合疫苗的蛋白载体,开发通用性流感嗜血杆菌结合疫苗。
[0010] 为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
[0011] 一种流感嗜血杆菌融合蛋白,为流感嗜血杆菌HiD蛋白和流感嗜血杆菌Hin47蛋白融合而成,即Hin47-HiD,Hin47的氨基酸序列为序列表<400>1所示序列,HiD的氨基酸序列为序列表<400>3所示序列。
[0012] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,为流感嗜血杆菌HiD蛋白突变分子和/或流感嗜血杆菌Hin47蛋白突变分子融合而成,突变分子与野生型分子具有80%及以上的相同性,突变分子可以维持不低于野生型蛋白70%的免疫原性。
[0013] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述融合基因表达系统包括不限于原核表达系统、真核表达系统以及酵母表达系统。
[0014] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因(组成融合蛋白的单体蛋白)包括但不限于野生型和突变体两种。
[0015] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述Hin47-HiD由以1:1方式和Linker融合而成,所述linker使Hin47蛋白和HiD蛋白单体维持自身特有的构象。
[0016] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述linker包括但不限于G4S、DL或EL,所述linker使Hin47蛋白和HiD蛋白单体维持自身特有的构象。
[0017] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述linker为G4S,序列为序列表<400>2所示序列。
[0018] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,所述融合基因的组成形式为(n)Hin47-linker-(n)HiD,(n)HiD-linker-(n)Hin47,-linker-HiD-(Hin47-linker-HiD)n-linker-Hin47-,-linker-Hin47-(HiD-linker-Hin47)n-linker-HiD-,其中n为1-3、代表该单体基因的分子数。
[0019] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,Hin47-HiD,作为结合疫苗蛋白载体,可有效提高多糖抗原的免疫原性。
[0020] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白,Hin47-HiD,作为结合疫苗蛋白载体,在以多糖抗原作为有效成分的结合疫苗开发中进行应用,以其作为蛋白载体开发的多糖蛋白结合疫苗,包括不限于流感嗜血杆菌,肺炎,脑膜炎,痢疾,伤寒等。
[0021] 一种广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,该疫苗制剂以a、b、c、d、e、f型流感嗜血杆菌中一种或多种荚膜多糖为抗原,以Hin47-HiD为蛋白载体。
[0022] 优选的,上述广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,制剂中的多糖抗原成分可有效预防相应血清型的流感嗜血杆菌,蛋白载体成分可以预防非分型流感嗜血杆菌。
[0023] 优选的,上述广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,该制剂为包含Hia与Hin47-HiD蛋白载体的偶联物、Hib与Hin47-HiD蛋白载体的偶联物的二价结合疫苗。
[0024] 优选的,上述广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,所述二价结合疫苗剂型为液体针剂,每剂以0.5ml计含有a型多糖的含量为8-15ug,b型多糖的含量为8-15ug,HiN47-HiD含量在20-80ug。
[0025] 优选的,上述广谱的流感嗜血杆菌多糖蛋白结合疫苗制剂,所述二价结合疫苗不含有防腐剂,可以含有包括不限于磷酸在内的佐剂,制剂中的缓冲液为PB和NaCl,终浓度为0.45%NaCl+10mM PB。
[0026] 上述流感嗜血杆菌融合蛋白的构建方法,具体步骤如下:
[0027] (1)基因合成:
[0028] 融合基因各包括一分子的Hin47和一分子的HiD,且其前段为Hin47,后端为HiD;所设计的酶切位点,前面为NdeI,后为BamHI;
[0029] (2)T克隆构建
[0030] 融合基因经NdeI和BamHI双酶切后,同以相同内切酶双酶切的T载体进行连接,连接采用T4DNA连接酶;成功连接后转化DH5a感受态,抽提质粒,以PCR和双酶切进行鉴定;
[0031] (3)表达载体构建
[0032] 从T克隆中以NdeI和BamHI双酶切得到融合基因,同以相同内切酶双酶切的pET9a进行连接,成功连接后转变BL21感受态,后以双酶切和PCR对表达载体进行检定;
[0033] (4)表达检定
[0034] 挑取阳性单克隆菌落LB培养基培养并离心收集沉淀,PBS复溶沉淀,超声破碎后,上清液进行SDS-PAGE电泳
[0035] 优选的,上述流感嗜血杆菌融合蛋白的构建方法,具体步骤如下:
[0036] (1)基因合成:
[0037] Life technology公司合成Hin47-HiD融合基因,其中选择的linker为G4S(GGGGS),融合基因各包括一分子的Hin47和一分子的HiD,且其前段为Hin47,后端为HiD;所设计的酶切位点,前面为NdeI,后为BamHI,其中,所述Hin47的氨基酸序列为序列表<400>1所示序列,Linker的氨基酸序列为序列表<400>2所示序列,HiD的氨基酸序列为序列表<400>3所示序列,由此可以看出,Hin47-HiD含有790aa,分子量为87KD;
[0038] Hin47-HiD融合蛋白氨基酸序列
[0039]
[0040]
[0041] (2)T克隆构建
[0042] 融合基因经NdeI和BamHI双酶切后,同以相同内切酶双酶切的T载体进行连接,连接采用T4DNA连接酶;成功连接后转化DH5a感受态,抽提质粒,以PCR和双酶切进行鉴定;
[0043] (3)表达载体构建
[0044] 从T克隆中以NdeI和BamHI双酶切得到融合基因,同以相同内切酶双酶切的pET9a进行连接,成功连接后转变BL21感受态,后以双酶切和PCR对表达载体进行检定;
[0045] (4)表达检定
[0046] 挑取阳性单克隆菌落,转接LB培养基,37℃200rpm摇菌培养过夜,后转接50ml新鲜LB培养基中,待OD600=0.6---0.7时,加入终浓度为1mM的IPTG,37℃诱导4h后离心收集沉淀;PBS复溶沉淀,超声破碎后,上清液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,构建的表达载体经IPTG诱导,成功高表达目标蛋白。
[0047] 需要说明的是,上述Hin47-HiD融合蛋白表达载体构建以及诱导表达过程中所使用的技术为本领域技术人员所掌握的常规试验操作方法,这些方法在公开的文献和书籍中均可查到。
[0048] 上述Hin47-HiD融合蛋白纯化方法,具体步骤如下:
[0049] (1)菌体发酵
[0050] 菌体发酵采用常规的试验方法,这些实验方法在公开的文献中均可以找到,或者为本领域内技术人员所掌握的试验方法;冻存菌液接种LB培养基中,37℃250rpm摇菌过夜,进行复苏;复苏菌液转接至含有1L培养基的2L三瓶中进行放大培养,待0D600=0.6---0.7时,加入终浓度为1mMIPTG,诱导4h后,8000rpm离心30分钟收集菌体沉淀;
[0051] (2)蛋白纯化
[0052] 发酵结束,离心收集的菌体沉淀,PBS复溶后,超声破碎,离心收集上清。超声破碎上清过Q柱,收集流传液(目的蛋白流穿);将Q柱流穿液过CHT柱,此后用150mM PB+170mM NaCl洗杂蛋白,175mM PB+1M NaCl洗脱目标蛋白。
[0053] 通过两步柱纯化,即可得到纯度在80%以上的目标蛋白,用于后续结合疫苗的开发。
[0054] 上述Hia和Hib二价结合疫苗的制备方法,具体步骤如下:
[0055] (1)荚膜多糖的纯化
[0056] 多糖抗原采用常见的试验方法制备,具体包括流感嗜血杆菌发酵培养,CTAB或者乙醇分级沉淀粗纯,CL-4B凝胶分离进一步回收荚膜多糖抗原,透析冻干;
[0057] a型和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法,包括菌体发酵,在公开的文献中均可以找到。
[0058] (2)结合疫苗的制备
[0059] Hia结合疫苗的制备:a型荚膜多糖加入CDAP(是氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟酸)30s后,加入0.2M TEA调节PH到9.5进行多糖活化,活化持续2.5min;活化结束后调PH到9.0,后按照糖蛋白比1:1的方式加入载体蛋白,室温反应1h,4℃过夜,后加入2M甘氨酸终止反应即可;透析去除加入的反应试剂后,CL-4B凝胶分离纯化结合物;或
[0060] Hib结合疫苗的制备:b型荚膜多糖加入CDAP30s后,加入0.2M TEA调节PH到9.5进行多糖活化,活化持续2.5min;活化结束后调PH到9.0,后按照糖蛋白比1:1的方式加入载体蛋白,室温反应1h,4℃过夜,后加入2M甘氨酸终止反应即可;透析去除加入的反应试剂后,CL-4B凝胶分离纯化结合物。
[0061] 上述Hia和Hib二价结合疫苗,1/4剂量(125ul)免疫动物后可产生抗Hia荚膜多糖和Hib荚膜多糖的抗体反应,以及针对载体蛋白的抗体反应。其中抗Hia荚膜多糖的抗体可有效预防a型流感嗜血杆菌,抗Hib荚膜多糖的抗体可有效预防b型流感嗜血杆菌,抗载体蛋白(Hin47,HiD)的抗体可有效预防非侵袭性流感嗜血杆菌。
[0062] 本发明的有益效果:
[0063] Hin47-HiD融合蛋白可有效的增强Hin47和HiD单个蛋白抗原的免疫原性;不仅如此,Hin47-HiD作为结合疫苗蛋白载体,可有效增强多糖抗原的免疫原性;以融合蛋白Hin47-HiD作为结合疫苗蛋白载体,开发的Hia和Hib二价结合疫苗,可同时预防侵袭性和非侵袭性流感嗜血杆菌。附图说明
[0064] 图1是融合蛋白表达检定;
[0065] 图2是Hin47-HiD融合蛋白纯化图;
[0066] 图3是Hin47和HiD免疫原性比较;
[0067] 图4是Hin47和Hin47-HiD抗Hin47抗原免疫原性比较,其中,Hin47-HiD融合蛋白中Hin47单体的免疫剂量和对照组Hin47抗原相同,L、M、H分别表示Hin47-HiD融合蛋白中Hin47单体抗原剂量(包括对照组Hin47)分别为1ug,5ug和10ug;
[0068] 图5是HiD和Hin47抗HiD免疫原性比较,其中,Hin47-HiD融合蛋白中HiD单体的免疫剂量和对照组HiD抗原相同,L、M、H分别表示Hin47-HiD融合蛋白中HiD单体抗原剂量(包括对照组HiD)分别为1ug,5ug和10ug;
[0069] 图6:Hia结合物分离纯化图;
[0070] 图7:Hib结合物分离纯化图。

具体实施方式

[0071] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0072] 实施例1Hin47-HiD融合蛋白制备
[0073] (1)Hin47-HiD表达载体构建
[0074] Life technology公司合成Hin47-HiD融合基因,其中选择的l inker为G4S(GGGGS),融合基因各包括一分子的Hin47和一分子的HiD,且其前段为Hin47,后端为HiD;所设计的酶切位点,前面为NdeI,后为BamHI,其中,所述Hin47的氨基酸序列为序列表<400>1所示序列,Linker的氨基酸序列为序列表<400>2所示序列,HiD的氨基酸序列为序列表<400>3所示序列,具体见下表1。
[0075] 表1Hin47-HiD融合蛋白氨基酸序列
[0076]
[0077]
[0078] 从表1中可以看出Hin47-HiD含有790aa,分子量为87KD。
[0079] 融合基因经NdeI和BamH I双酶切后,同以相同内切酶双酶切的T载体进行连接,连接采用T4DNA连接酶;成功连接后转化DH5a感受态,抽提质粒,以PCR和双酶切进行鉴定。
[0080] 从T克隆中以NdeI和BamHI双酶切得到融合基因,同以相同内切酶双酶切的pET9a进行连接,成功连接后转变BL21感受态,后以双酶切和PCR对表达载体进行检定。
[0081] 挑取阳性单克隆菌落,转接LB培养基,37℃200rpm摇菌培养过夜,后转接50ml新鲜LB培养基中,待OD600=0.6---0.7时,加入终浓度为1mM的IPTG,37℃诱导4h后离心收集沉淀。PBS复溶沉淀,超声破碎后,上清液进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白是否表达,结果见图1:
[0082] 图1说明融合蛋白为上清表达,且表达量较高。
[0083] 需要说明的是,Hin47-HiD融合蛋白表达载体构建以及诱导表达过程中所使用的技术为本领域技术人员所掌握的常规试验操作方法,这些方法在公开的文献和书籍中均可查到。
[0084] (2)Hin47-HiD融合蛋白纯化
[0085] Hin47-HiD冻存种子过夜复苏后,转接发酵培养基,待OD600=0.8-1.0时加入IPTG,终浓度为1mM,37℃诱导4h后离心收集沉淀。
[0086] 将PBS复溶的沉淀超声破碎,离心收集上清;上清过Q柱收集流穿液(目标蛋白流穿),然后将Q柱的流穿液过CHT柱,用150mM PB+170mM NaCl洗杂蛋白,175mM PB+1M NaCl洗脱即可得到目标蛋白;本纯化工艺的优势为步骤简单,使用常规填料,仅通过两步就可以得到纯度在80%以上的目标蛋白,结果见图2。
[0087] 从图2中可以看出,经过两步柱纯化,则可收集到纯度在90%以上的目标蛋白。
[0088] 实施例2Hin47-HiD融合蛋白免疫原性研究
[0089] Hin47-HiD融合蛋白免疫BALB/C小鼠,研究其免疫原性,同时以Hin47和HiD作为对照,免疫三次,间隔两周,最后一次免后14天采集全血,检测血清中的抗体平。
[0090] 对照组Hin47和HiD蛋白抗原的免疫剂量为1ug,5ug和10ug,而融合蛋白的免疫组,蛋白单体的有效剂量则为1ug、5ug和10ug。
[0091] Hin47和HiD抗原以1ug、5ug和10ug三个剂量免疫小鼠,三免血清分别以相应的抗原检测抗体效价结果见图3,
[0092] 统计分析:
[0093] P(Hin471ug:HiD 1ug)=0.000<0.01
[0094] P(Hin475ug:HiD 5ug)=0.000<0.01
[0095] P(Hin4710ug:HiD10ug)=0.000<0.01
[0096] 结果表明:同等剂量,Hin47免疫原性强于HiD。
[0097] 融合蛋白Hin47-HiD以三个剂量进行免疫原性研究,且融合蛋白中单体蛋白的实际免疫剂量和对照抗原(Hin47或者HiD)相同,其中Hin47-HiD和Hin47免疫原性比较试验中,L、M和H三组表示融合蛋白中Hin47单体抗原的剂量为1ug、5ug和10ug。
[0098] Hin47与Hin47-HiD免疫原性比较见图4,
[0099] 统计分析:
[0100] P(L组Hin47:Hin47-HiD)=0.2820>0.05
[0101] P(M组Hin47:Hin47-HiD)=0.2820>0.05
[0102] P(H组Hin47:Hin47-HiD)=0.350>0.05
[0103] 结果表明:Hin47-HiD融合蛋白并没有影响Hin47单体的免疫原性。
[0104] 融合蛋白Hin47-HiD以三个剂量进行免疫原性研究,且融合蛋白中单体蛋白的实际免疫剂量和对照抗原(Hin47或者HiD)相同,其中Hin47-HiD和HiD免疫原性比较试验中,L、M和H三组表示融合蛋白中HiD单体抗原的剂量为1ug、5ug和10ug。
[0105] HiD与Hin47-HiD免疫原性比较见图5,
[0106] 经统计分析:
[0107] P(L组HiD:Hin47-HiD)=0.000<0.01
[0108] P(M组HiD:Hin47-HiD)=0.000<0.01
[0109] P(H组HiD:Hin47-HiD)=0.000<0.01
[0110] 结果表明:Hin47-HiD融合蛋白可有效增强HiD免疫原性。
[0111] 实施例3Hia和Hib结合疫苗的制备
[0112] Hia多糖和Hib多糖蛋白结合物的制备采用相同的试验方法,具体为荚膜多糖加入CDAP30s后,加入0.2M TEA调节PH到9.5进行多糖活化,活化持续2.5min。活化结束后调PH到9.0,后按照糖蛋白比1:1的方式加入Hin47-HiD融合蛋白,室温反应1h,4℃过夜,然后加入
2M甘氨酸终止反应即可。透析去除加入的反应试剂后,CL-4B凝胶分离纯化结合物。
[0113] Hia结合物CL-4B凝胶分离结果见图6。
[0114] Hib结合物CL-4B凝胶分离结果见图7。
[0115] 表2 Hia和Hib结合疫苗质检结果
[0116]
[0117] 实施例4a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗免疫原性的研究
[0118] a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗(均以HIN47-HID作为载体蛋白)以中国药典b型流感嗜血杆菌结合疫苗效力试验的方法来评价其免疫原性,具体为a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗以1/4人用剂量(各含Hia多糖和Hib多糖2.5ug)免疫10只12—14g BALB/C小鼠,同时以NS作为阴性对照免疫10只BALB/C小鼠,免疫2次,间隔2周,最后一次免疫后14天摘眼球采集血清。
[0119] ELISA检测血清中抗a、b型荚膜多糖抗体滴度,以NS免疫小鼠血清作为CUT off值,计算疫苗组小鼠血清阳转率,结果如表3。
[0120] 表3 a、b流感嗜血杆菌结合疫苗阳转率测定结果
[0121]
[0122] 结果表明:以Hin47-HiD融合蛋白作为蛋白载体可有效激发机体产生对多糖抗原的免疫反应。本实施例中,a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗以1/4剂量免疫小鼠,二免血清阳转率为100%,达到中国药典对Hib结合疫苗产品免疫效力的放行标准。
[0123] 实施例5a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗保护性研究
[0124] 通过ELISA可以有效测定血清中的特异性抗体含量,但是并非所有具有抗原结合能力的抗体均具有杀菌保护功能,血清杀菌抗体(SBA)能够反映抗体的功能活性,从而直接反映疫苗的保护作用。
[0125] a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗,免疫小鼠血清中SBA测定结果如表4。
[0126] 表4 a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗SBA测定结果
[0127]
[0128] 本实施例中a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗,免疫鼠血中SBA高达1300,可有效预防a型流感嗜血杆菌和b型流感嗜血杆菌
[0129] 表5 Hia和Hib二价结合疫苗抗载体蛋白抗体滴度
[0130]
[0131] 从表5中可以看出,a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗,免疫小鼠后,同时产生针对载体蛋白的有效抗体,其中针对HiD抗原的抗体滴度为5.65,而针对Hin47的则搞到6.34.这些抗体可有效预防非侵袭性流感嗜血杆菌。
[0132] 保护性结果表明:a、b型流感嗜血杆菌结合疫苗,免疫小鼠后,抗Hia和Hib多糖的抗体可有效预防a型流感嗜血杆菌和b型流感嗜血杆菌。而针对载体蛋白Hin47-HiD的抗体可有效预防非侵袭性流感嗜血杆菌。
[0133] 本发明的应用原理如下:多糖蛋白结合疫苗可促使胸腺非依赖性的多糖抗原变为胸腺依赖性,从而使多糖抗原适用于婴幼儿等群体的免疫预防。第一代结合疫苗蛋白载体为破伤类毒素TT和白喉类毒素DT,第二代结合疫苗蛋白载体为无毒的白喉毒素突变体CRM等蛋白;本发明研发的属于新一代结合疫苗蛋白载体,特点是除可有效提高多糖抗原的免疫原性外,针对载体蛋白本身的抗原也可以抵御某种疾病。Hin47和HiD已经被证明可预防非侵袭性流感嗜血杆菌,而本发明开发的Hin47-HiD融合蛋白可明显提高弱抗原HiD的免疫原性而不影响Hin47的免疫原性,更为关键的是Hin47-HiD融合蛋白可有效作为结合疫苗蛋白载体。因此,本发明开发了一个新型的结合疫苗蛋白载体,以此作为载体开发的结合疫苗除可预防多糖抗原相对应的细菌感染外,针对载体本身的抗体可预防非侵袭性流感嗜血杆菌。
[0134] 上述参照实施例对该一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
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