OCTS-CAR双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用 |
|||||||
| 申请号 | CN201710418260.4 | 申请日 | 2017-06-06 | 公开(公告)号 | CN107337736B | 公开(公告)日 | 2019-07-26 |
| 申请人 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司; | 发明人 | 祁伟; 俞磊; 康立清; 林高武; 余宙; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种基于OCTS技术的OCTS‑CAR双靶向嵌合 抗原 受体、编码基因、OCTS‑CAR‑T重组表达载体及其构建方法和应用。该OCTS‑CAR双靶向嵌合抗原受体包括依次 串联 连接的CD8 leader膜受体 信号 肽、双抗原结合区、CD8 Hinge嵌合受体 铰链 、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、CD134嵌合受体共刺激因子以及TCR嵌合受体T细胞激活域，其中，双抗原结合区包括以一定方式连接的两个单链 抗体 的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner‑Linker以及单链抗体间铰链Inter‑Linker，该两个单链抗体指的是BCMA单链抗体、CD319单链抗体、CD38单链抗体、PDL1单链抗体、CD123单链抗体之间的任意两两组合。此外，还提供了编码该OCTS‑CAR双靶向嵌合抗原受体的基因，重组表达载体及其构建方法和应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种OCTS-CAR双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次串联连接的CD8 leader膜受体信号肽、双抗原结合区、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、CD134嵌合受体共刺激因子以及TCR嵌合受体T细胞激活域，其中，所述双抗原结合区包括以串联或转角方式连接的两个单链抗体的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner-Linker以及单链抗体间铰链Inter-Linker， |
||||||
| 说明书全文 | OCTS-CAR双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用 技术领域背景技术[0002] 肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞 (如，高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视” 理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫 治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1: 1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、 疫苗疗法等相继应用于临床。 [0003] 2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有 的临床疗效。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原 受体T细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、 效应区等共同组成的嵌合分子，导入T细胞基因组内，从而使T细胞对靶细胞的识别、信 号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[Eleanor J.Cheadle,et al.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immunological Reviews 2014.Vol.257: 91–106]。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急 性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到 两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017 年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到 66.6％。因此，CAR-T细胞疗法是抗癌研究的颠覆性突破，可能是最有可能治愈癌症的手 段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。 [0004] CAR-T目前在在治疗B-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是 也存在一些局限性，比如目前一个嵌合抗原受体只能识别一种抗原靶标，但肿瘤细胞是个 复杂的群体，含有相应抗原的肿瘤细胞被清除以后，不含相应抗原的肿瘤细胞会迅速增殖， 一段时间后导致肿瘤复发。 [0005] 要使CAR-T识别能同时识别两种抗原，有两个方案可选：一是将两组嵌合抗原受体 构建进入一个慢病毒转基因载体，一次性将两组嵌合抗原受体转导进入原代T淋巴细胞； 二是用两个慢病毒转基因载体分两次转导，将两组嵌合抗原受体分别转导进入原代T淋巴 细胞。 [0006] 方案一的缺点在于占用慢病毒转基因载体的宝贵容量，不利于装载其它功能元件；转 基因载体包装效率低；基因转导效率非常低，很难转导进入原代T淋巴细胞内。 [0007] 方案二的缺点在于需要经过两次转导，两次转导的综合效率较低，转导周期时间长， 原代细胞容易衰老，导致增殖能力衰退，杀伤功能下降，影响肿瘤清除疗效。 [0008] 作为肿瘤免疫治疗的重点研究对象，多发性骨髓瘤(Multiple myeloma)的肿瘤细胞起 源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞，因此是一种采 用现有治疗方法很难治愈的恶性浆细胞肿瘤。通常患者的生存期为3年，短的甚至只有6-12 个月。 [0009] 但研究发现，某些物质在B细胞或恶性肿瘤细胞表面稳定存在或高表达，可作为细胞 标记物或靶标。如： [0010] BCMA(B-cell maturation antigen)作为一种标志物选择性表达在B细胞(包括多发性 骨髓瘤细胞)表面，可以作为CAR-T细胞的靶标引导CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞(B-cell Maturation Antigen is a Promising Target for Adoptive T cell Therapy of Multiple Myeloma. Robert O.Carpenter,et al.Clin Cancer Res.2013April 15；19(8):2048–2060.)。 [0011] CD319又称为CS1、SLAMF7，是一种稳定的细胞表面标志物，在正常浆细胞和恶性 浆细胞表达均有表达。CD319是一种及其稳定的抗原，即便是经过粗糙的手段分离得到的 恶性浆细胞系，甚至是经过冻存以后，仍然可以稳定的检测出表达[Frigyesi I,Adolfsson J, Ali M,Christophersen MK,Johnsson E,Turesson I,Gullberg U,Hansson M,Nilsson B(Feb 2014)."Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma".Blood.123(9): 1336–40.]。 [0012] CD38也称做cyclic ADP ribose hydrolase，在很多免疫细胞表面能检测到，包括B细胞 和NK细胞。CD38是一种细胞活化的标志物，与HIV感染、白血病、骨髓瘤、实体瘤等 联系在一起。目前临床上有使用靶向CD38的抗体来治疗多发性骨髓瘤[Lokhorst,Henk M.； Plesner,Torben；Laubach,Jacob P.；Nahi,Hareth；Gimsing,Peter；Hansson,Markus；Minnema, Monique C.；Lassen,Ulrik；Krejcik,Jakub(2015-09-24)."Targeting CD38with Daratumumab Monotherapy in Multiple Myeloma".The New England Journal of Medicine.373(13): 1207–1219.]。 [0013] CD123是人白介素3受体的alpha链，在大多数的急性髓系白血病(AML)细胞和很多 造血细胞表面均有表达，CD123是一个非常好的免疫治疗靶点，因为即使在CD123表达 很少的细胞里，它的表达会随时间增长逐渐增强，并且急性髓系白血病很可能是由于处于 白血病前期的造血干细胞经过克隆演化而来，以CD123为靶点，则可以起到清髓的作用 (Saar Gill,Carl H.June et al.Preclinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells.Blood.2014；123(15):2343- 2354.)。 [0014] PD-L1在多数癌症组织中过量表达，包括NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌、胶质瘤、淋巴 瘤、白血病及各种泌尿系肿瘤、消化道肿瘤、生殖系肿瘤等[Intlekofer AM,Thompson CB.At the bench:preclinical rationale for CTLA-4and PD-1blockade as cancer immunotherapy[J].J Leukoc Biol,2013,94(1):25-39.]。Parsa在鼠和人的肿瘤细胞中，发现T细胞异常分泌的 IFN-γ，IFN-γ可以诱导肿瘤细胞上的PD-L1高表达[Ding H,Wu X,Wu J,et al.Delivering PD-1 inhibitory signal concomitant with blocking ICOS co-stimulation suppresses lupus-like syndrome in autoimmune BXSB mice[J].Clin Immunol,2006,118(2/3):258-267.]。PD-L1高表 达，可以通过抑制RAS及PI3K/AKT信号通路，进而调控细胞周期检查点蛋白和细胞增殖 相关蛋白表达，最终导致T细胞增殖的抑制[11]。Dong等体外实验和小鼠模型还发现， PD-1/PD-L1信号通路的激活可以诱导特异性CTL调亡，使CTL的细胞毒杀伤效应敏感性 下降，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸[Dong H,Strome SE,Salomao DR,et al.Tumor-associated B7-H1promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med,2002,8(8):793-800.]。 发明内容[0015] 本发明是基于上述发现而进行的，目的在于提供一种用于恶性肿瘤，尤其是多发性骨 髓瘤免疫治疗的基于OCTS技术的CAR双靶向嵌合抗原受体、编码基因、OCTS-CAR重 组表达载体及其构建方法和应用。 [0016] OCTS的全称是One CAR with Two ScFvs，通过串联OCTS(Series OCTS)或者转角 OCTS(Turn OCTS)的连接方式，将两段scFv与整合成一个嵌合分子(图1所示)，赋 予T淋巴细胞HLA非依赖的方式识别两种肿瘤抗原的能力，相对于传统的CAR-T细胞能 够识别更广泛的目标，进一步扩大了肿瘤细胞的清除范围。 [0017] OCTS的基础设计中包括两个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区 (通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区，两个 胞内信号转导区和一个效应元件区。scFv区域对于OCTS的特异性、有效性以及基因改造 T细胞自身的安全性来说是关键的决定因素。 [0018] 本发明所采用的OCTS-CAR-T技术，是在目前CAR-T细胞治疗的基础上，通过对嵌 合抗原受体(CAR)结构的优化改造，使得嵌合抗原受体能够识别两种抗原，大大扩展了 CAR-T细胞的识别范围，针对肿瘤群体的清除更彻底，疗效更持久。 [0019] 本发明的第一方面，提供了一种基于OCTS技术的CAR双靶向嵌合抗原受体，包括 依次串联连接的CD8leader膜受体信号肽、双抗原结合区、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、CD134嵌合受体共刺激因 子以及TCR嵌合受体T细胞激活域。其中，双抗原结合区包括以一定方式连接的两个单 链抗体的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner-Linker以及单链抗体间铰链Inter-Linker； 该两个单链抗体指的是BCMA单链抗体、CD319单链抗体、CD38单链抗体、PDL1单链 抗体、CD123单链抗体之间的任意两两组合。 [0020] 进一步，本发明的OCTS-CAR双靶向嵌合抗原受体，还具有如下技术特征：两个单链 抗体以串联或转角的连接方式连接。 [0021] 本发明的第二个方面，提供了编码上述CAR双靶向嵌合抗原受体的基因，编码上述 各部分的基因的序列编号对照如下：CD8leader膜受体信号肽(SEQ ID NO.15)、BCMA 单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.16)、BCMA单链抗体重链VH(SEQ ID NO.17)、CD319 单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.18)、CD319单链抗体重链VH(SEQ ID NO.19)、CD38 单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.20)、CD38单链抗体重链VH(SEQ ID NO.21)、PDL1 单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.22)、PDL1单链抗体重链VH(SEQ ID NO.23)、CD123 单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.24)、CD123单链抗体重链VH(SEQ ID NO.25)、抗体 内铰链Inner-Linker(SEQ ID NO.26)、单链抗体间铰链Inter-Linker(SEQ ID NO.27)、 CD8Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.28)、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.29)、CD28嵌合受体共刺激因子(SEQ ID NO.30)、CD134嵌合受体共刺激因子(SEQ ID NO.31)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ ID NO.32)。 [0022] 本发明的第三方面，提供了一种OCTS-CAR重组表达载体，具有这样的技术特征：包 括表达载体、人EF1α启动子、以及编码CAR-T双靶向嵌合抗原受体的基因。其中，人 EF1α启动子的基因序列如SEQ ID NO.14所示，编码CAR-T双靶向嵌合抗原受体中各部 分的基因如上所述。其中，抗原结合区的基因序列包括BCMA、CD319、CD38、PDL1、 CD123中任意两种的单链抗体的轻链VL和重链VH的基因序列。 [0023] 进一步，本发明还提供了另一种OCTS-CAR重组表达载体，相对于上述的重组表达载 体，该重组表达载体还包括编码PDL1单链抗体的基因，其基因序列如SEQ ID NO.33所 示。 [0024] 本发明所采用的表达载体骨架为第三代慢病毒载体(图2A所示)，3’SIN LTR去除了 U3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了cPPT和WPRE 元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用RSV启动子保证了慢病毒载体包装时核 心RNA的持续高效转录；采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间 持续表达。 [0025] 该慢病毒表达载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、 病毒复制子SV40Ori序列、RSV启动子、慢病毒5terminal LTR、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、Gag顺式元件、RRE顺式元件、env顺式元件、cPPT顺式元件、ZsGreen1 绿色荧光蛋白、IRES核糖体结合序列、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。 [0026] 本发明是将人EF1α启动子、CD8leader嵌合受体信号肽，BCMA、CD319、CD38、 PDL1、CD123中任意两种的单链抗体轻链VL和重链VH，抗体内铰链Inner-Linker，单链 抗体间铰链Inter-Linker，CD8Hinge嵌合受体铰链，CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区， CD28嵌合受体共刺激因子，CD134嵌合受体共刺激因子，TCR嵌合受体T细胞激活域， 以及PDL1单链抗体的表达基因构建进入重组慢病毒载体，由人EF1α启动子启动整个 OCTS结构基因表达。 [0027] CD8leader嵌合受体信号肽位于OCTS蛋白的N端，用于引导OCTS蛋白定位于细胞 膜；任意两组单链抗体的重链和轻链相互组合形成双抗原识别区，用于识别相应靶抗原； CD8Hinge嵌合受体铰链用于将scFv锚定于细胞膜外侧；CD8Transmembrane嵌合受体跨 膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；CD28嵌合受体共刺激因子用于刺激T淋巴细 胞体外激活和体内肿瘤细胞杀伤作用；CD134嵌合受体共刺激因子用于促进T淋巴细胞增 殖和因子分泌，增强肿瘤免疫，有利于记忆T细胞的长期存活；TCR嵌合受体T细胞激活 域用于激活下游信号通路的表达；PDL1的单链抗体能有效封闭PDL1，阻断免疫负调节信 号通路，临床上可用于抑制肿瘤的免疫逃脱，提高CAR-T细胞免疫治疗的疗效。 [0028] 当抗原识别区域与靶抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生T细胞 增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系 列生物学效应。 [0029] 本发明中，BCMA单链抗体轻链VL、BCMA单链抗体重链VH、CD319单链抗体轻 链VL、CD319单链抗体重链VH、CD38单链抗体轻链VL、CD38单链抗体重链VH、PDL1 单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、CD123单链抗体轻链VL、CD123单链抗体 重链VH、PDL1单链抗体，具有与所示核苷酸序列>＝80％同源性(优选地，>＝90％同源性； 等优选地，>＝95％同源性；最优选地，>＝97％同源性；)的核苷酸序列。 [0030] 本发明中，BCMA单链抗体轻链VL、BCMA单链抗体重链VH、CD319单链抗体轻 链VL、CD319单链抗体重链VH、CD38单链抗体轻链VL、CD38单链抗体重链VH、PDL1 单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、CD123单链抗体轻链VL、CD123单链抗体 重链VH、PDL1单链抗体，具有与所示核苷酸序列相对应的氨基酸序列>＝80％同源性(优 选地，>＝90％同源性；等优选地，>＝95％同源性；最优选地，>＝97％同源性)的氨基酸序 列。 [0031] 本发明中，BCMA单链抗体轻链VL、BCMA单链抗体重链VH、CD319单链抗体轻 链VL、CD319单链抗体重链VH、CD38单链抗体轻链VL、CD38单链抗体重链VH、PDL1 单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、CD123单链抗体轻链VL、CD123单链抗体 重链VH、PDL1单链抗体均经过人源化改造，能有效减少体内人抗鼠抗 (Human anti-mouse antibodies，HAMA)的产生，延长scFv的半衰期和作用效果。 [0033] 本发明中的OCTS嵌合受体中的共刺激因子区域可以是4-1BB、ICOS、CD27、OX40、 CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、、TNFRSF13B、 TNFRSF18等肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF) 中的一种、二种、三种、几种、几十种的组合。 [0034] 本发明中的使用的复制缺陷型慢病毒转基因载体可以是二代或者三代的慢病毒转基 因载体。 [0035] 本发明的第四个方面，提供了OCTS-CAR重组表达载体的构建方法，包括以下步骤： [0036] A.将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(SEQ ID NO.1)、原核复制子pUC Ori序列 (SEQ ID NO.2)、病毒复制子SV40Ori序列(SEQ ID NO.3)、RSV启动子(SEQ ID NO.4)、 慢病毒5terminal LTR(SEQ ID NO.5)、慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR(SEQ ID NO.6)、Gag顺式元件(SEQ ID NO.7)、RRE顺式元件(SEQ ID NO.8)、env顺式元件 (SEQ ID NO.9)、cPPT顺式元件(SEQ ID NO.10)、ZsGreen1绿色荧光蛋白(SEQ ID NO.11)、IRES核糖体结合序列(SEQ ID NO.12)、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录 后调控元件(SEQ ID NO.13)存储于第三代慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic上，该方法已 由本公司开发构建，并公开在《一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及 其构建方法和应用》201610008360.5专利中； [0037] B.将编码CD8leader膜受体信号肽、双抗原结合区、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、CD134嵌合受体共刺激因 子以及TCR嵌合受体T细胞激活域的基因经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架 质粒pLenti-3G basic中，得到第三代基于OCTS设计的重组慢病毒质粒，如 pOCTS123BCMAs、pOCTS319BCMAs、pOCTS38BCMAs、pOCTS-PDL1BCMAs、 pOCTS123BCMAt、pOCTS319BCMAt、pOCTS38BCMAt、pOCTS-PDL1BCMAt等，其中， 最后一个字母“s”代表两段scFv串联连接，字母“t”代表两段scFv转角连接。 [0038] C.将步骤B得到的所述重组慢病毒质粒分别与慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以 及膜蛋白质粒pEnv-G共同转染HEK293T/17细胞，在HEK293T/17细胞中进行基因转录 表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体 的上清液； [0039] D.将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式进行纯化，分别得到 CAR-T重组慢病毒表达载体，(命名为lvOCTS123BCMAs、lvOCTS319BCMAs、 lvOCTS38BCMAs、lvOCTS-PDL1BCMAs、lvOCTS123BCMAt、lvOCTS319BCMAt、 lvOCTS38BCMAt、lvOCTS-PDL1BCMAt)。 [0040] 此外，在步骤B中，还可以将编码PDL1单链抗体的基因与其他基因一起经过酶切、 连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic中，得到第三代基于OCTS设计的 重组慢病毒质粒。 [0041] 本发明的第五方面，提供了一种OCTS-CAR-T细胞，该OCTS-CAR-T细胞是基因组 内导入有OCTS-CAR重组表达载体或经基于OCTS的CAR双靶向嵌合抗原受体修饰的T 淋巴细胞。 [0042] 本发明采用的OCTS-CAR-T细胞由GMP级别的车间生产后，可用于人体临床实验。 [0043] 本发明的第六方面，提供了OCTS-CAR-T细胞在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。 [0044] 进一步，所述恶性肿瘤治疗药物为治疗恶性肿瘤为恶性浆细胞肿瘤、急性髓系白血病、 黑色素瘤、乳腺癌、胶质瘤、淋巴瘤、泌尿系肿瘤、消化道肿瘤或生殖系肿瘤的药物。 [0045] 发明的作用与效果 [0046] 本发明采用OCTS技术在目前传统CAR-T细胞治疗的基础上，通过对嵌合抗原受体 (CAR)结构的优化改造，使得嵌合抗原受体能够识别两种抗原，一方面大大拓展了CAR-T 细胞的识别范围，针对肿瘤群体的清除更彻底，疗效更持久；另一方面避免了分批培养 CAR-T细胞，大大节约成本，从而避免患者多次回输不同靶向CAR-T细胞，节约了患者 的经济支出，降低复发的几率，间接提高了患者的生存质量。 [0047] 通过串联OCTS(Series OCTS)或者转角OCTS(Turn OCTS)的连接方式，将两段 scFv整合成一个嵌合分子，不仅赋予T淋巴细胞HLA非依赖的方式识别两种肿瘤抗原的 能力，而且相对于传统的CAR-T细胞能够识别更广泛的目标，进一步扩大了肿瘤细胞的 清除范围，随着OCTS-CAR-T即将进入临床研究阶段，标志着CAR-T细胞治疗即将进入 2.0时代。 [0048] 此外，本发明的BCMA单链抗体轻链VL、BCMA单链抗体重链VH、CD319单链抗 体轻链VL、CD319单链抗体重链VH、CD38单链抗体轻链VL、CD38单链抗体重链VH、 PDL1单链抗体轻链VL、PDL1单链抗体重链VH、CD123单链抗体轻链VL、CD123单链 抗体重链VH、PDL1单链抗体均经过人源化改造，能有有效减少体内人抗鼠抗 (Human anti-mouse antibodies，HAMA)的产生，延长scFv的半衰期和作用效果，增加 OCTS-CAR-T细胞的存在时间。 [0049] 另外，本发明中使用的共刺激因子的一种或若干种组合，能够增加转导后细胞的增殖 速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。 [0051] 图1是本发明的CAR双靶向嵌合抗原受体(OCTS)的示意图，其中(A)为串联OCTS (Series OCTS)的示意图，(B)为转角OCTS(Turn OCTS)的示意图。 [0052] 图2是本发明的慢病毒载体结构示意图；其中(A)图是本发明采用的第三代慢病毒 载体结构示意图，(B)图是第二代和第三代慢病毒载体结构比较示意图。 [0053] 图3是本发明的重组慢病毒载体的构建流程图；其中，(A)图是慢病毒骨架质粒 pLenti-3G basic的结构示意图；(B)图是8个OCTS质粒的示意图；(C)图是慢病毒包 装质粒pPac-GP质粒的结构示意图；(D)图是慢病毒包装质粒pPac-R质粒的结构示意图； (E)图是膜蛋白质粒pEnv-G的结构示意图。 [0054] 图4是CAR双靶向嵌合抗原受体(OCTS)的元件顺序示意图，其中，(A)图是串 联OCTS(Series OCTS)的结构示意图，(B)图是转角OCTS(Turn OCTS)的结构示意 图。 [0055] 图5是重组慢病毒质粒pOCTS123BCMAs(A)、pOCTS319BCMAs(B)、 pOCTS38BCMAs(C)、pOCTS-PDL1BCMAs(D)、pOCTS123BCMAt(E)、pOCTS319BCMAt (F)、pOCTS38BCMAt(G)、pOCTS-PDL1BCMAt(H)的酶切预测图及酶切琼脂糖凝 胶电泳图。其中，在图A～H中，lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图；lane2是 上述各重组慢病毒质粒的酶切预测图； lane3是1kb DNA ladder Marker酶切琼脂糖凝胶电 泳图；lane4是上述各重组慢病毒质粒的酶切琼脂糖凝胶电泳图。 [0056] 图6是重组慢病毒载体的滴度检测结果。 [0057] 图7是本发明的OCTS-CAR-T细胞构建的流程示意图，包含分离培养、激活、基因转 导、OCTS-CAR-T细胞鉴定等阶段。 [0058] 图8是OCTS-CAR-T细胞的支原体检测结果，lane1为DL2000marker，从上到下条带 条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；lane3 为阴性对照；lane4为PBS；lane5为裂解液；lane6为OCTS123BCMAs-CAR-T细胞；lane7 为OCTS319BCMAs-CAR-T细胞；lane8为OCTS38BCMAs-CAR-T细胞；lane9为 OCTS-PDL1BCMAs-CAR-T细胞；lane10为OCTS123BCMAt-CAR-T细胞；lane11为 OCTS319BCMAt-CAR-T细胞；lane12为OCTS38BCMAt-CAR-T细胞；lane13为 OCTS-PDL1BCMAt-CAR-T细胞。 [0059] 图9是流式检测OCTS-CAR-T细胞的转导效率以及免疫分型结果。图A表示 OCTS123BCMAs-CAR-T细胞的转导效率结果；图B表示OCTS123BCMAs-CAR-T细胞的 免疫分型结果；图C表示OCTS319BCMAs-CAR-T细胞的转导效率结果；图D表示 OCTS319BCMAs-CAR-T细胞的免疫分型结果；图E表示OCTS38BCMAs-CAR-T细胞的 转导效率结果；图F表示OCTS38BCMAs-CAR-T细胞的免疫分型结果；图G表示 OCTS-PDL1BCMAs-CAR-T细胞的转导效率结果；图H表示OCTS-PDL1BCMAs-CAR-T 细胞的免疫分型结果；图I表示OCTS123BCMAt-CAR-T细胞的转导效率结果；图J表示 OCTS123BCMAt-CAR-T细胞的免疫分型结果；图K表示OCTS319BCMAt-CAR-T细胞的 转导效率结果；图L表示OCTS319BCMAt-CAR-T细胞的免疫分型结果；图M表示 OCTS38BCMAt-CAR-T细胞的转导效率结果；图N表示OCTS38BCMAt-CAR-T细胞的免 疫分型结果；图O表示OCTS-PDL1BCMAt-CAR-T细胞的转导效率结果；图P表示 OCTS-PDL1BCMAt-CAR-T细胞的免疫分型结果。 [0060] 图10为不同效靶标条件下，OCTS-CAR-T细胞对靶细胞杀伤效率柱状图：图A表示 OCTS123BCMAs-CAR-T细胞和OCTS123BCMAt-CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤结果； 图B表示OCTS319BCMAs-CAR-T细胞和OCTS319BCMAt-CAR-T细胞对不同靶细胞的 杀伤结果；图C表示OCTS38BCMAs-CAR-T细胞和OCTS38BCMAt-CAR-T细胞对不同 靶细胞的杀伤结果；图D表示OCTS-PDL1BCMAs-CAR-T细胞和OCTS-PDL1BCMAt-CAR -T细胞对不同靶细胞的杀伤结果。 具体实施方式[0061] 以下实施例仅用于说明本发明，而不用与限制本发明的范围。实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0062] 实施例以BCMA单链抗体分别与CD319、CD38、PDL1、CD123单链抗体组合成双 抗原识别区为例，对CAR双靶向嵌合抗原受体的构建、OCTS-CAR-T细胞构建以及功能 测试方法进行说明。在每种组合中，两段scFv分别以串联连接和转角连接的方式连接，共 形成了八种双抗原识别区。 [0063] 其他四种物质的单链抗体的轻链和重链也能组合成双抗原识别区，其CAR双靶向嵌 合抗原受体的构建、OCTS-CAR-T细胞构建以及功能测试方法与本实施例中所描述的方法 相同。 [0064] 实施例所用的实验材料如下： [0065] (1)慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic，慢病毒包装质粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋白 质粒pEnv-G，HEK293T/17细胞，同源重组酶，Oligo Annealing Buffer，支原体检测试剂 盒，内毒素检测试剂盒，PSCA+K562、PDL1+K562、PDL1+PSCA+K562、K562细胞购自 世翱(上海)生物医药科技有限公司；； [0066] (2)人新鲜外周血由健康供者提供； [0067] (3)OCTS123BCMAs、OCTS319BCMAs、OCTS38BCMAs、OCTS-PDL1BCMAs、 OCTS123BCMAt、OCTS319BCMAt、OCTS38BCMAt、OCTS-PDL1BCMAt DNA序列组 合自行设计(参见表1)，交给上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者 质粒形式保存； [0068] 表1慢病毒重组质粒设计 [0069] [0070] (4)工具酶Cla I、Pst I、BsrG I、Nde I、EcoR I、BamH I、ApaL I、Spe I、T4DNA 连接酶均购自NEB公司； [0071] (5)0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；D-PBS(-)、0.4％台盼蓝、筛网、 各类型细胞培养皿、培养袋、培养板均购自corning公司； [0072] (6)Opti-MEM、Pen-Srep、Hepes、FBS、AIM-V、RPMI 1640、DMEM、lipofectamine 3000购自invitrogen公司；Biotinylated protein L购自GeneScript公司；LDH检测试剂盒购 自promega公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自GE公司；20％人血白蛋白注射液购自杰特贝 林公司；CryoPremium冻存液、分选缓冲液自行配置；rIL-2，rIL-7，，rIL-15，rIL-21购 自peprotech公司；CD3单克隆抗体，CD28单克隆抗体，CD3/CD28磁珠CD4/CD8磁珠 购自德国Miltenyi公司； [0073] (7)冷冻离心机购自美国ThermoScientific公司；FACS流式细胞仪购自Thermo公司； 荧光倒置显微镜购自Olympus公司。 [0074] (8)CD4-FITC、CD8-APC购自BioLegend公司；0.9％生理盐水购自今迈公司；ProteinL Magnetic Beads购自BioVision公司；PrimeSTAR、RetroNectin购自Takara公司； phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin购自BD Bioscience公司；质粒抽提试剂盒、琼脂 糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；感受态细胞TOP10购自tiangen公司；NaCl、KCl、 Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、Trypsin、EDTA、CaCl2、NaOH、PEG6000均购自上海生工。 [0075] (9)DNeasy试剂盒购自上海捷瑞公司；SA-HRP购自上海翊圣公司； [0076] (10)引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段和靶位点所需的引物，该引物由上 海生物公司合成，具体为： [0077] EF1α-F：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(SEQ ID NO.34)[0078] EF1α-R：5’-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3’(SEQ ID NO.35) [0079] OCTS-F：CATTTCAGGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCGCTGCCGGTGAC(SEQ ID NO.36)[0080] OCTS-R：GGGGAGGGAGAGGGGCTTAGCGCGGCGGCAGCG(SEQ ID NO.37) [0081] IRES-F：GCCCCTCTCCCTCCCCC(SEQ ID NO.38) [0082] IRES-R：ATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAA(SEQ ID NO.39) [0083] PDL1scab-F：AAAACACGATGATAATGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCG(SEQ ID NO.40)[0084] PDL1scab-R：AATCCAGAGGTTGATTGTCGACGAATTCTCATTTGCCCGGGCTCAG(SEQ ID NO.41) [0085] WPRE-QPCR-F：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’(SEQ ID NO.42) [0086] WPRE-QPCR-R：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’(SEQ ID NO.43) [0087] Actin-QPCR-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO.44) [0088] Actin-QPCR-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO.45)。 [0089] 实施例一OCTS-CAR-T细胞构建 [0090] 一、重组慢病毒载体lvOCTS123BCMAs、lvOCTS319BCMAs、lvOCTS38BCMAs、 lvOCTS-PDL1BCMAs、lvOCTS123BCMAt、lvOCTS319BCMAt、lvOCTS38BCMAt、 lvOCTS-PDL1BCMAt的构建、纯化、检测 [0091] 如图3所示，本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下： [0092] 1、将人EF1α启动子、基于OCTS的CAR双靶向嵌合抗原受体(OCTS123BCMAs、 OCTS319BCMAs、OCTS38BCMAs、OCTS-PDL1BCMAs、OCTS123BCMAt、 OCTS319BCMAt、OCTS38BCMAt、OCTS-PDL1BCMAt)、PDL1单链抗体克隆至慢病毒 骨架质粒pLenti-3G basic，分别得到重组慢病毒质粒pOCTS123BCMAs、 pOCTS319BCMAs、pOCTS38BCMAs、pOCTS-PDL1BCMAs、pOCTS123BCMAt、 pOCTS319BCMAt、pOCTS38BCMAt、pOCTS-PDL1BCMAt。 [0093] (1)将慢病毒骨架质粒pLenti-3G basic使用Cla I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切， 产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认5823bp的片段V1，并割胶回收置于Eppendorf管 内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度 和浓度； [0094] 表2琼脂糖凝胶回收步骤 [0095]步骤 具体操作 溶胶 按200μl NTI/100mg gel比例加入溶胶液，50℃水浴放置5-10分钟。 结合DNA 11000g离心30秒，弃去滤液。 洗膜 加入700μl NT3，11000g离心30秒，弃去滤液。 洗膜 重复第三步一次 晾干 11000g离心1分钟，换新的收集管，室温放置1分钟。 洗脱DNA 加入15-30μl NE，室温放置1分钟，11000g离心1分钟，收集滤液。 [0096] (2)用引物EF1α-F和EF1α-R以合成的SEQ ID NO.14为模板，使用表3中的体系， PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。 产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1208bp的片段a，并割胶回收置于Eppendorf管内， 用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓 度。 [0097] 表3 50μL PCR反应体系 [0098]试剂 体积(μL) H2O 32.5 5×Buffer(with Mg2+) 10 dNTP(各2.5mM) 4 Primer1(+)(10μM) 1 Primer2(－)(10μM) 1 Template 1 PrimeSTAR 0.5 [0099] (3)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS123BCMAs为模板，使用表3中的体 系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃ 5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2357bp的片段b，并割胶回收置于Eppendorf 管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯 度和浓度； [0100] (4)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS319BCMAs为模板，使用表3中的体 系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃ 5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2375bp的片段c，并割胶回收置于Eppendorf 管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯 度和浓度； [0101] (5)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS38BCMAs为模板，使用表3中的体系， PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。 产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2378bp的片段d，并割胶回收置于Eppendorf管内， 用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓 度； [0102] (6)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS-PDL1BCMAs为模板，使用表3中的 体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle， 72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2372bp的片段e，并割胶回收置于 Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定 产物的纯度和浓度； [0103] (7)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS123BCMAt为模板，使用表3中的体 系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃ 5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2387bp的片段f，并割胶回收置于Eppendorf 管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯 度和浓度； [0104] (8)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS319BCMAt为模板，使用表3中的体 系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃ 5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2403bp的片段g，并割胶回收置于Eppendorf 管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯 度和浓度； [0105] (9)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS38BCMAt为模板，使用表3中的体系， PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。 产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2406bp的片段h，并割胶回收置于Eppendorf管内， 用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓 度； [0106] (10)用引物OCTS-F和OCTS-R以合成的OCTS-PDL1BCMAt为模板，使用表3中的 体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle， 72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2433bp的片段i，并割胶回收置于 Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定 产物的纯度和浓度； [0107] (11)用引物IRES-F和IRES-R以合成的SEQ ID NO.12为模板，使用表3中的体系， PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。 产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认575bp的片段j，并割胶回收置于Eppendorf管内， 用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓 度； [0108] (12)用引物PDL1scab-F和PDL1scab-R以合成的SEQ ID NO.33为模板，使用表3 中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle， 72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1557bp的片段k，并割胶回收置于 Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定 产物的纯度和浓度； [0109] (16)将重组慢病毒质粒DNA片段组合(见表4)以5μl总体积且摩尔比1:1:1:1的比 例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移 至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置 30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使 细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时 使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱 中37℃培养，16小时。 [0110] 表4重组慢病毒质粒DNA片段组合 [0111]重组慢病毒质粒 片段组合 pOCTS123BCMAs a、b、j、k pOCTS319BCMAs a、c、j、k pOCTS38BCMAs a、d、j、k pOCTS-PDL1BCMAs a、e、j、k pOCTS123BCMAt a、f、j、k pOCTS319BCMAt a、g、j、k pOCTS38BCMAt a、h、j、k pOCTS-PDL1BCMAt a、i、j、k [0112] 挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒 pOCTS123BCMAs、pOCTS319BCMAs、pOCTS38BCMAs、pOCTS-PDL1BCMAs、 pOCTS123BCMAt、pOCTS319BCMAt、pOCTS38BCMAt、pOCTS-PDL1BCMAt，对正确 的克隆进行酶切鉴定(见图5)，并送测序复核结果。 [0113] 如图5所示，A图代表pOCTS123BCMAs的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1 是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、 5kb、 4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS123BCMAs 的BamH I酶切预测，条带从上到下依次为：9712bp、1277bp、1023bp、511bp；lane3是 1kb DNA ladder Marker的电泳结果；lane4是pOCTS123BCMAs的BamH I酶切电泳结果。 [0114] B图代表pOCTS319BCMAs的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、 3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS319BCMAs的 ApaL I酶切预测： 条带从上到下依次为：6543bp、1961bp、1723bp、1234bp、488bp；lane3 是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；lane4是pOCTS319BCMAs的ApaL I酶切电泳结 果。 [0115] C图代表pOCTS38BCMAs的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、 3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS38BCMAs的BsrG I酶切预测，条带从上到下依次为：10928bp、1087bp；lane3是1kb DNA ladder Marker的 电泳结果；lane4是pOCTS38BCMAs的BsrG I酶切电泳结果。 [0116] D图代表pOCTS-PDL1BCMAs的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、 3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS-PDL1BCMAs 的Cla I酶切预测，条带从上到下依次为：8876bp、3139bp；lane3是1kb DNA ladder Marker 的电泳结果；lane4是pOCTS-PDL1BCMAs的Cla I酶切电泳结果。 [0117] E图代表pOCTS123BCMAt的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、 3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS123BCMAt的BamH I酶切预测：条带从上到下依次为：9545bp、1467bp、977bp；lane3是1kb DNA ladder Marker 的电泳结果； lane4是pOCTS123BCMAt的BamH I酶切电泳结果。 [0118] F图代表pOCTS319BCMAt的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、 3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS319BCMAt的Nde I酶切预测，条带从上到下依次为：9686bp、2342bp；lane3是1kb DNA ladder Marker的电 泳结果；lane4是pOCTS319BCMAt的Nde I酶切电泳结果。 [0119] G图代表pOCTS38BCMAt的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、 3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS38BCMAt的Spe I酶切预测：条带从上到下依次为：9976bp、1926bp；lane3是1kb DNA ladder Marker的电 泳结果；lane4是pOCTS38BCMAt的Spe I酶切电泳结果。 [0120] H图代表pOCTS-PDL1BCMAt的酶切预测图和酶切琼脂糖凝胶电泳图。lane1是1kb DNA ladder Marker的酶切预测图，条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；lane2是pOCTS-PDL1BCMAt 的Pst I酶切预测，条带从上到下依次为：10821bp、1340bp、411bp；lane3是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；lane4是pOCTS-PDL1BCMAt的Pst I酶切电泳结果。 [0121] 由图5所显示的电泳结果可知，各待测重组慢病毒质粒的酶切电泳结果和酶切预测结 果基本一致，上述重组慢病毒质粒的构建方法有效。 [0122] 2、重组慢病毒载体lvOCTS123BCMAs、lvOCTS319BCMAs、lvOCTS38BCMAs、 lvOCTS-PDL1BCMAs、lvOCTS123BCMAt、lvOCTS319BCMAt、lvOCTS38BCMAt、 lvOCTS-PDL1BCMAt的包装[0123] 2.1溶液配置 [0124] (1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml Pen-Srep，上下颠倒 混匀即可； [0125] (2)1XPBS溶液：称量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g 置于1000ml烧杯中，加入900ml Milli-Q grade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量 筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min； [0126] (3)0.25％Trypsin溶液:称量Trypsin 2.5g，EDTA0.19729g置于1000ml烧杯中，加入 900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μM过滤除菌，长 期使用可保存至-20℃冰箱； [0127] (4)0.5M CaCl2溶液：称量36.75g CaCl2用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；用Milli-Q grade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中， 每管45ml左右，4℃保存。 [0128] (5)2XHBS溶液：称量4.09g NaCl，0.269g Na2HPO4，5.96g Hepes，用400ml Milli-Q grade超纯水溶解；校准pH仪后，用2M NaOH溶液将HBS溶液的pH调到7.05。调整每 瓶HBS的PH消耗2M NaOH为3ml左右。 [0129] 2.2HEK293T/17细胞培养 [0130] (1)从液氮罐中取出冻存的HEK293T/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后 转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm2培养皿中，补足含10％FBS 2 的DMEM至8mL/10cmdish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代； [0131] (2)选择细胞状态良好、无污染的HEK293T/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细 胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml， 避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中； [0132] (3)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培 养皿； [0133] (4)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm2培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×106个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期 的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种； [0134] (5)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃 动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％CO2培养箱。剩余细胞做同样处理； [0135] (6)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养 皿中均匀分布； [0136] (7)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的CO2浓 度设定值提高到8％； [0137] 2.3细胞转染 [0138] (1)按照N+0.5配DNA/CaCl2溶液。每皿HEK293T/17细胞转染质粒量按照下列比例 使用：重组慢病毒质粒(20μg),pPac-GP(15μg)，pPac-R(10μg),pEnv-G(7.5μg)。取一个新的 5ml离心管，加入0.5M CaCl2：0.25ml，重组慢病毒质粒20μg：pPac-GP 15μg：pPac-R 10μg： pEnv-G 7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀； [0139] (2)另取一支5ml离心管，加入0.5ml DNA/CaCl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿 住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1mL 移液枪，吸取0.5mL 2×HBS溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。 2×HBS加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中； [0140] (3)取一皿细胞，将离心管中的1mL钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个 培养皿中； [0141] (4)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％CO2培养箱中。 确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％CO2培养箱中放置(6–8h)； [0142] (5)将第一个培养箱的CO2浓度设定值调回到5％； [0143] (6)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养 基吸走，更换10ml新鲜的DMEM完全培养基； [0144] (7)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞 都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10mL 新鲜培养基； [0145] (8)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起， 丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体lvOCTS123BCMAs、 lvOCTS319BCMAs、lvOCTS38BCMAs、lvOCTS-PDL1BCMAs、lvOCTS123BCMAt、 lvOCTS319BCMAt、lvOCTS38BCMAt、lvOCTS-PDL1BCMAt。 [0146] 3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体 [0148] (2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5M NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8)； [0149] (3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次过柱； [0151] (5)全部上清液过柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗一遍； [0152] (6)根据上样量使用1-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)进行洗脱，收集洗脱液； [0153] (7)将洗脱液分成25到50μL一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存。 [0154] 4、重组慢病毒载体滴度测定 [0155] (1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类 的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％； [0156] (2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS) 接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记 为N； [0157] (3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个 管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS), 终体积为500ul； [0158] (4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖 DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时； [0159] (5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应 减少，并拍照； [0160] (6)用0.2ml 0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个 细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入 200μl洗脱液洗下DNA并定量； [0161] (7)准备目的DNA检测qPCRmix总管Ⅰ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.42---SEQ ID NO.43)： [0162] 表5qPCRmix总管Ⅰ内组分 [0163]2×TaqMan Master Mix 25μl×n Forward primer(100pmol ml-1) 0.1μl×n Reverse primer(100pmol ml-1) 0.1μl×n Probe(100pmol ml-1) 0.1μl×n H2O 19.7μl×n [0164] n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe和788μl H2O混和，震荡后放在冰上。 [0165] (8)准备内参DNA检测qPCRmix管Ⅱ(QPCR引物序列为SEQ ID NO.44---SEQ ID NO.45)： [0166] 表6 qPCRmix总管Ⅱ内组分 [0167]2×TaqMan Master Mix 25μl×n 10×RNaseP primer/probe mix 2.5μl×n H2O 17.5μl×n [0168] n＝number of reactions.例如：总反应数为40，将1ml 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和，震荡后放在冰上。 [0169] (9)在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的 孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。 [0170] (10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1 次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。 [0171] (11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1 次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-template control)。 [0172] (12)所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟， 95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。 [0173] (13)数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定， 得到每基因组整合的病毒拷贝数。 [0174] 滴度(integration units per ml，IU ml-1)的计算公式如下： [0175] IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V [0176] 其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数 [0177] N＝感染时细胞的数目(约为1×105) [0178] D＝病毒载体的稀释倍数 [0179] V＝加入的稀释病毒的体积数 [0180] 重组慢病毒载体lvOCTS123BCMAs、lvOCTS319BCMAs、lvOCTS38BCMAs、 lvOCTS-PDL1BCMAs、lvOCTS123BCMAt、lvOCTS319BCMAt、lvOCTS38BCMAt、 lvOCTS-PDL1BCMAt的滴度结果如图6所示。 [0181] 二、OCTS-CAR-T细胞构建 [0182] 图7显示了OCTS-CAR-T细胞构建流程，本实施例中的OCTS-CAR-T细胞的构建方 法如下： [0183] 1、分离PBMC。 [0184] (1)抽取健康供者新鲜外周血50ml； [0185] (2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。 [0186] (3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。 [0187] (4)400g，20℃离心10min。 [0188] (5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g， 离心30min，取上清到50ml离心管中待用。 [0189] (6)用D-PBS(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。 [0190] (7)取2个新50ml离心管，每管加入15ml Ficoll淋巴细胞分离液。 [0191] (8)向每管Ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。 [0192] (9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、 无色透明的Ficoll层、红黑色的混合细胞层。 [0193] (10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加D-PBS(-)至50ml，颠倒混匀后500g， 20℃离心10min。 [0194] (11)加入25ml 5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。 [0195] (12)弃上清，加入25ml 5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。 [0196] (13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加 CryoPremium并冻存。 [0197] 2、CD4/CD8阳性T细胞分选。 [0198] (1)将获得的PBMC计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。 [0199] (2)再以20ul/107cells的比例加入CD4/CD8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。 [0200] (3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g， 4℃离心10min。 [0201] (4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。 [0202] (5)用镊子夹取LS分离柱到磁力架上。 [0203] (6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：CD4-/CD8-细胞液(A管)、CD4+/CD8+ 细胞液(B管)。 [0204] (7)用3ml分离缓冲液润洗LS,并用A管接缓冲液。 [0205] (8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入 新的液体)，总共三次，收集得到CD4/CD8-细胞。 [0206] (9)LS分离柱与磁力架分离，用B管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞 稍用力冲洗，收集为CD4+/CD8+细胞，取样计数。 [0207] (10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用AIM-V培养基重悬细胞沉淀，并加入 2×105～1×106U/L IFN-γ因子。 [0208] 3、T细胞激活。 [0209] (1)提前一天将1×103ug/L～1×104ug/L CD3单克隆抗体和1×103ug/L～1×104ug/L CD28 单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被； [0210] (2)取出包被的T75瓶，倒掉包被液，用D-PBS(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞 悬液接种到T75瓶中，摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。 [0211] 4、CAR基因转导及OCTS-CAR-T细胞诱导培养。 [0212] (1)提前一天包被1×103ug/L～1×104ug/L RetroNectin于24孔板内，封口膜封口，4℃ 过夜包被。 [0213] (2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按MOI＝5～20的量，分别加入 lvOCTS123BCMAs、lvOCTS319BCMAs、lvOCTS38BCMAs、lvOCTS-PDL1BCMAs、 lvOCTS123BCMAt、lvOCTS319BCMAt、lvOCTS38BCMAt、lvOCTS-PDL1BCMAt慢病毒 转基因载体，同时添加含2× 5 5 3 4 3 4 10～5×10U/L rIL-2，5×10ng/L～1×10ng/L rIL-7， 5×10ng/L～1×10 ng/L rIL- 15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培 养基37℃、5％CO2继续培养。 [0214] 5、OCTS-CAR-T细胞体外扩增。 [0215] (1)每2天等量补加含2×105～5×105U/L rIL-2，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-7， 5×103ng/L～1×104ng/L rIL-15，5×103ng/L～1×104ng/L rIL-21和含10％自体血清的AIM-V培 养基，使PH值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×105～2×106/ml之间，37℃、5％CO2继续培养10-14天。 [0216] (2)第7天左右，冻存培养的OCTS-CAR-T细胞用于后续检测。 [0217] 实施例2OCTS-CAR-T细胞病原检测和表达检测 [0218] 一、内毒素检测； [0219] (1)内毒素工作标准品为15EU/支； [0220] (2)鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml,0.5ml/管 [0221] (3)内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用BET水按比例稀释成4λ和2λ的 溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s； [0222] (4)加样：取鲎试剂若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管 中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2λ 浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品 的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品 的稀释40倍样品)。 [0223] 样品管中加入0.1mL样品，稀释比例见表7，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min； [0224] 表7内毒素稀释比例及OCTS-CAR-T细胞的内毒素检测结果 [0225] [0226] [0227] 如表7所示，所有细胞的内毒素含量均小于2.5EU/ml，符合《中华人民共和国药典》中 小于10EU/ml的标准。 [0228] 二、支原体检测 [0229] (1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养； [0230] (2)收集1mL细胞悬浮液(细胞数大于1×105)，置于1.5mL离心管中； [0231] (3)13000g离心1min，收集沉淀，弃去培养基； [0232] (4)加入500ul PBS用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000g离心5min； [0233] (5)步骤4重复一次； [0234] (6)加入50μl Cell Lysis Buffer，用枪头吹吸，充分混匀后,在55℃水浴中孵育20min； [0235] (7)将样品置于95℃中加热5min； [0236] (8)13000g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μl PCR反应体系为：ddH20 6.5μl、 Myco Mix 1μl、2x Taq Plus Mix Master(Dye Plus)12.5μl、模板5μl；PCR循环条件为：95℃ 30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。 [0237] 支原体检测结果显示请见图8，图8中的阳性对照、阴性对照以及样品的判定说明见 表8。如图8结果所示，OCTS-CAR-T细胞中均不含支原体。 [0238] 表8阳性对照、阴性对照以及样品的判定说明 [0239] [0240] 三、OCTS基因转导效率检测及免疫分型检测； [0241] (1)收集经病毒转导后的T细胞，用含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞并 调整为1×106/ml。 [0242] (2)向离心管中加入含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液1ml并混匀，350g离心5min， 弃上清。 [0243] (3)重复步骤2一次。 [0244] (4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入1ul 的1mg/ul protein L，5ul CD4-FITC，5ul CD8-APC，混匀，4℃孵育45min。 [0245] (5)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液并混匀，350g离心5min， 弃上清。 [0246] (6)重复步骤5两次。 [0247] (7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入0.2ul PE-SA，混匀，37℃避光孵育15min。 [0248] (8)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的D-PBS(-)溶液重并混匀，350g离心 5min，弃上清。 [0249] (9)用1ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，350g离心5min，弃上清。 [0250] (10)重复步骤9两次。 [0251] (11)用0.4ml D-PBS(-)溶液重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。 [0252] OCTS基因转导效率及免疫分型检测检测结果如图9所示，制备的OCTS-CAR-T细胞 的感染效率大多数位于37％～50％之间，CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的比例位于1∶3～3∶1 之间，可以进行后续功能检测。 [0253] 实施例3OCTS-CAR-T细胞的功能检测 [0254] 一、靶细胞杀伤效果评估。 [0255] (1)分别培养靶细胞[BCMA+K562、CD319+K562、CD38+K562、PDL1+K562、 CD123+K562、BCMA+CD123+K562、BCMA+CD319+K562、BCMA+CD38+K562、 BCMA+PDL1+K562、K562细胞]和效应细胞[OCTS-CAR-T细胞]，效应细胞分别与单靶细 胞和双靶细胞共孵育的分组如表9所示。 [0256] 表9效应细胞分别与单靶细胞和双靶细胞共孵育的分组列表 [0257]效应细胞 靶细胞1 靶细胞2 靶细胞3 OCTS123BCMAs-CAR-T CD123+K562 BCMA+K562 BCMA+CD123+K562 OCTS319BCMAs-CAR-T CD319+K562 BCMA+K562 BMCA+CD319+K562 OCTS38BCMAs-CAR-T CD38+K562 BCMA+K562 BCMA+CD38+K562 + + + + OCTS-PDLlBCMAs-CAR-T PDL1K562 BCMAK562 BCMAPDL1K562 OCTS123BCMAt-CAR-T CD123+K562 BCMA+K562 BCMA+CD123+K562 OCTS319BCMAt-CAR-T CD319+K562 BCMA+K562 BMCA+CD319+K562 OCTS38BCMAt-CAR-T CD38+K562 BCMA+K562 BCMA+CD38+K562 OCTS-PDL1BCMAt-CAR-T PDL1+K562 BCMA+K562 BCMA+PDL1+K562 [0258] (2)收集靶细胞4x105cells和OCTS-CAR-T细胞2.8x106cells，800g，6min离心，弃 上清； [0259] (3)用1ml D-PBS(-)溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清； [0260] (4)重复步骤3一次； [0261] (5)用700ul培养基(AIM-V培养基+1～10％FBS)重悬效应细胞，用2ml培养基(AIM-V 培养基+1～10％FBS)重悬靶细胞； [0262] (6)设置效靶比为1:1、5:1、10:1的实验孔，分组情况如表9所示，并设置对照组(K562 细胞)，每组3个复孔； [0263] (7)250g，5min平板离心； [0264] (8)37℃，5％CO2培养箱中培养4小时； [0265] (9)250g，5min平板离心； [0266] (10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)； [0267] (11)避光孵育25min； [0268] (12)每孔加入50ul终止液； [0269] (13)酶标仪检测490nm吸光度； [0270] (14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培 养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。 [0271] (15)将步骤14中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞 毒性百分比。 [0272] 杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)×100％[0273] 结果如图10所示，OCTS-CAR-T对各自的单靶细胞和双靶细胞均有较好的杀伤效果， Turn OCTS结构的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率略高于Series OCTS结构的CAR-T细 胞。 [0274] 上述实验结果表明，通过对传统CAR结构中抗原识别区的改造形成的OCTS结构， 能够显著提高OCTS-CAR-T细胞识别并杀伤靶细胞的范围，因此OCTS-CAR-T细胞将在 未来的BCMA阳性/CD319阳性/CD38阳性/CD123阳性/PDL1阳性/BCMA、CD319双阳 性/BCMA、CD38双阳性/BCMA、CD123双阳性/BCMA、PDL1双阳性的多发性骨髓瘤 等恶性肿瘤的细胞治疗中发挥巨大的作用。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈