弯曲杆菌疫苗

申请号 CN201480020298.0 申请日 2014-04-04 公开(公告)号 CN105307677B 公开(公告)日 2019-08-02
申请人 阿尔伯塔大学理事会; 发明人 克丽斯汀·希曼斯基; 哈拉尔德·诺萨特;
摘要 本 申请 案提供一种 疫苗 组合物,其包含:经工程化以在其细胞表面上表达弯曲杆菌如空肠弯曲杆菌的至少一种N‑聚糖或其N‑聚糖衍 生物 的细菌;和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一个或多个。所述细菌是大肠杆菌、沙 门 氏菌或提供充分表达和改进的免疫原性反应的任何适合的细菌。所述疫苗组合物可经调配以用于投与动物,如 家禽 ,包括鸡。
权利要求

1.一种家禽疫苗组合物,其包含:
用具有非活性的pglB基因的空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)pgl操纵子工程化以在其细胞表面上表达空肠弯曲杆菌的至少一种N-聚糖或其N-聚糖衍生物的大肠杆菌(Escherichia coli);和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一种或多种,其中所述大肠杆菌经工程化以使O-抗原表达部分或完全失活,并且其中所述N-聚糖以脂质A核心融合体形式表达在大肠杆菌表面上。
2.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其中所述组合物包含活的经工程化大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其中所述组合物包含灭活的经工程化大肠杆菌细胞。
4.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其中所述组合物包含经工程化细菌在适合的缓冲稀释液中形成的悬浮液。
5.根据权利要求4所述的家禽用疫苗组合物,其中所述缓冲稀释液是磷酸盐缓冲盐
6.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其进一步包含佐剂、稳定剂或防腐剂
7.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其中所述组合物在制备过程中经调配以用于经口投与、卵内投与或肠胃外投与。
8.根据权利要求7所述的家禽用疫苗组合物,其中所述组合物在制备过程中经调配以用于通过注射或输注投与。
9.根据权利要求7所述的家禽用疫苗组合物,其中所述疫苗组合物在制备过程中经调配以便喷雾或添加到家畜饲料、饲料添加剂或水中。
10.根据权利要求1所述的家禽用疫苗组合物,其中所述家禽是鸡。
11.权利要求1所述的疫苗组合物在制备用于对家禽进行疫苗接种以对抗空肠弯曲杆菌的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途,其中所述家禽是鸡。
13.根据权利要求11或12所述的用途,其中所述疫苗组合物适合于通过喷雾投与。
14.根据权利要求11或12所述的用途,其中所述疫苗组合物适合于在医药组合物、食物、饲料添加剂或饮用水中投与。
15.根据权利要求14所述的用途,其中所述医药组合物在制备过程中经调配以用于经口投与、卵内投与、注射或输注投与。

说明书全文

弯曲杆菌疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及弯曲杆菌疫苗。更确切地说,本发明涉及弯曲杆菌疫苗,其包含表达来源于N-糖基化路径的空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)七糖聚糖的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

背景技术

[0002] 在北美和许多工业化国家中,革兰氏阴性细菌弯曲杆菌是人类胃肠炎的最常见细菌性病因。弯曲杆菌也是包括家禽在内的家畜(其被认为是人类弯曲杆菌症的主要来源)中的显著食源性病原体。因此,家禽中弯曲杆菌的农场上控制将降低人类暴露于此病原体的险且对食品安全和公共健康具有显著影响。
[0003] 弯曲杆菌是许多发展中国家特有的,主要由于卫生条件较差以及人类与作为病原体蓄池的动物的密切接触。卡塔日娜(Katarzyna)等人疫苗专家评论(Expert Rev.Vaccines)8:625-645,2009)的报导提出,在美国,弯曲杆菌感染是每年150万(世界卫生组织(World Health Organization)数据)到240万(美国疾病控制中心(U.S.Centers for Disease Control)数据)疾病病例的病因。另外,根据世界卫生组织,每年约1%的西欧人群被弯曲杆菌属感染。人类感染主要由两个种引起:大肠弯曲杆菌(C.coli)和空肠弯曲杆菌,其引起超过95%的弯曲杆菌症病例。弯曲杆菌感染的临床表现可在无症状病例到重度胃肠炎(有时伴随着持久的粘液、血性或样腹泻)范围内变化。
[0004] 林军(Jun Lin)“家禽中弯曲杆菌控制的新颖方法(Novel Approaches for Campylobacter Control in Poultry)”(食源性病原体和疾病(FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE),第6卷,第7期,第755-765页,2009)的公开案(其以引用的方式并入本文中)论述减少家禽中弯曲杆菌感染的各种策略。林提出在农场层面控制家禽中弯曲杆菌的三种一般策略:(1)减少环境暴露(生物安全措施),(2)提高家禽的宿主抗性以减少弯曲杆菌在消化道中的运送(例如竞争性排斥、疫苗接种和宿主遗传选择),和(3)使用抗微生物替代方案以降低且甚至消除来自定殖鸡的弯曲杆菌(例如噬菌体疗法和细菌素治疗)。林进一步陈述了,除了生物安全措施,另一干预方法是商业上不可获得的且仍处于开发中。
[0005] 从家畜消除这些病原体可用作降低人类感染发生率以及防止在农场动物中扩散的手段。农场上的疫苗接种还可降低来自食用或处理动物产品的人类污染以及来自家畜粪肥的通过粪便排出细菌的污染的风险。用抗生素治疗弯曲杆菌症也变得越来越具挑战性,因为弯曲杆菌对先前有效抗生素的抗生素抗性变得更常见。
[0006] 糖基化一度被明确认为是一种真核现象,但后来展示为在古细菌和细菌两个域中广泛分布。细菌O-和N-键与在真核糖蛋白中观察到的那些相比在较宽范围的糖的情况下形成。细菌中蛋白质的一般糖基化路径首先展现在空肠弯曲杆菌中。(希曼斯基(Szymanski)等人分子微生物学(Molecular Microbiology)32:1022-1030,1999)。空肠弯曲杆菌的糖基化机制已经表征且已甚至成功地转移到大肠杆菌中(瓦克(Wacker)等人科学(Science),298:1790-1793,2002)且展现蛋白质的活性N-糖基化(杨(Young)等人生物化学杂志(J Biol Chem),277:42530-42539,2002;瓦克等人科学,298:1790-1793,2002)。空肠弯曲杆菌的基因座(称为pgl(用于蛋白质糖基化))参与多种蛋白质的糖基化。其突变沉默在许多生物学表现型之中引起多种蛋白质的免疫原性丢失。
[0007] 美国专利申请公开案2006/0165728A1(现在的美国专利第7,598,354号,其以引用的方式并入本文中)鉴别了一种特异性且高度免疫原性的七糖,其存在于空肠弯曲杆菌的多种周质和表面暴露糖蛋白中。此七糖是至少数种弯曲杆菌种和作为人类和兽医学病原体重要的许多菌株所共有的(诺萨夫(Nothaft)等人分子和细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)11:1203-1219,2012)。七糖具有下式(I):GalNAc-α1,4-GalNAc-α
1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-diNAcBac,其中diNAcBac(也称为二-N-乙酰基杆菌胺)是2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱-D-吡喃葡萄糖,GalNAc是N-乙酰基-半乳糖胺且Glc是葡萄糖。此聚糖部分是多种糖蛋白的组分。在空肠弯曲杆菌中,N-聚糖对于空肠弯曲杆菌与宿主细胞的相互作用很重要。糖基化机制中的突变引起小鼠和鸡中的肠道的定殖减少。在空肠弯曲杆菌中,N-聚糖对于以下各项很重要:人类上皮细胞的附着和侵袭(希曼斯基等人传染与免疫(Infect Immun)70:2242-2244,2002)、小鼠和鸡的肠道定殖(凯莉(Kelly)等人细菌学杂志(J Bacteriol)188:2427-2434,2006;希曼斯基等人传染与免疫70:2242-2244,2002;亨德里克松(Hendrixson)和迪里塔(DiRita),分子微生物学(Mol  Microbiol)52:471-484,2004;卡里雷切夫(Karlyshev)等人微生物学
(Microbiology)150:1957-1964,2004)、在IV型分泌系统情况下菌株中的天然感受态(拉森(Larsen)等人细菌学杂志186:6508-6514,2004)以及结合于人类巨噬细胞C型凝集素MGL(凡佐尔格(van Sorge)等人,细胞微生物学(Cell Microbiol)11:1768-1781,2009)。此外,弯曲杆菌表面N-聚糖展示出起到对抗鸡消化道蛋白酶的保护性作用,使得细菌适合度增加(阿伦卡(Alemka)等人传染与免疫81:1674-82,2013)。
[0008] 美国专利申请公开案2012/0100177描述一种肠道沙氏菌菌株,其包含空肠弯曲杆菌的至少一个pgl操纵子或其功能衍生物且在其细胞表面上呈现空肠弯曲杆菌的至少一种N-聚糖或其聚糖衍生物。此重组肠道沙门氏菌被假设适用于对抗弯曲杆菌感染的疫苗,尤其在家畜(如家禽)中。然而,令人遗憾的是,后续公开案展示出,虽然在其表面上表达来自弯曲杆菌的N-聚糖的重组肠道沙门氏菌能够定殖鸡而不引起疾病,但在经疫苗接种的鸡中无可检测的对抗弯曲杆菌N-聚糖的体液免疫反应(托曼(Thommen)“呈现鼠伤寒沙门氏菌的弯曲杆菌N-聚糖:一种用于肉鸡的新疫苗?(Campylobacter N-glycan presenting Salmonella Typhimurium:a new vaccine for broiler chickens?)”苏黎士开放储存库和档案(Zurich Open Repository and Archive),苏黎士大学(University of Zurich),论文,兽医学院(Vetsuisse Faculty),2011)。此外,在用空肠弯曲杆菌攻击感染后,经疫苗接种的鸡中的空肠弯曲杆菌定殖并未减少。
[0009] 仍然需要一种预防和/或治疗人类和动物(具体地说家畜,更具体地说家禽)中弯曲杆菌感染的有效疫苗。
[0010] 出于申请人认为已知信息与本发明可能相关的目的,提供此背景信息。未必打算承认,或不应理解为前述信息中的任一个构成针对本发明的现有技术

发明内容

[0011] 本发明的一个目的是提供一种对抗弯曲杆菌的疫苗。根据一个方面,提供一种疫苗组合物,其包含经工程化以在其细胞表面上表达弯曲杆菌的至少一种N-聚糖或其聚糖衍生物的细菌;和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一个或多个。在某些实施例中,弯曲杆菌种是空肠弯曲杆菌。细菌可以是大肠杆菌或沙门氏菌,且经工程化细菌在其表面上表达空肠弯曲杆菌七糖。
[0012] 在某些实施例中,疫苗组合物包含活的、经工程化大肠杆菌或活的、减毒的、灭活的或杀灭的经工程化大肠杆菌细胞。组合物可包含经工程化细菌于适合的缓冲稀释液(如磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液,且可经调配以例如用于经口投与、卵内投与、肠胃外投与(例如通过注射或输注投与)或喷雾。疫苗组合物还可经调配以用于添加到家畜饲料、饲料添加剂或水中以及用于投与家禽(如鸡)。
[0013] 根据另一方面,提供一种疫苗接种动物对抗弯曲杆菌的方法,所述方法包含投与动物如本文所述的疫苗组合物,所述疫苗组合物包含经工程化以在其细胞表面上表达弯曲杆菌(如空肠弯曲杆菌)的至少一种N-聚糖或其聚糖衍生物的细菌;和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、佐剂或载剂中的一个或多个。
[0014] 已知沙门氏菌上N-聚糖的表达并不诱发保护性免疫反应。出人意料的是,本发明人发现大肠杆菌(其是一种与沙门氏菌极其类似的细菌且预期将获得类似结果)当表达N-聚糖时确实诱发鸡中的保护性免疫反应。附图说明
[0015] 为了更好地理解本发明以及本发明的其他方面和进一步特征,提及与随附图式结合使用的以下说明,在所述随附图式中:
[0016] 图1展示来自大肠杆菌聚合酶突变体的大肠杆菌蛋白酶K处理的细胞裂解物。
[0017] 图2展示脂质A-N-聚糖的结构和经纯化脂质A-空肠弯曲杆菌N-聚糖组分的NMR实验
[0018] 图3展示使用大肠杆菌聚合酶突变体的FACS实验。
[0019] 图4A、B、C和D描绘如实例2中所述的疫苗接种和攻击实验,以及
[0020] 图5A和B描绘鸡IgY(IgG)N-聚糖特异性抗体反应(ELISA)。

具体实施方式

[0021] 定义
[0022] 除非另外规定,否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。
[0023] 如本说明书权利要求书中所用,除非上下文另外明确规定,否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个提及物。
[0024] 如本文所用,术语“包含”将理解为意指接着的清单为非穷尽性的且可按需要包括或可不包括任何其他额外适合的项目,例如一种或多种其他特征、组分和/或成分。
[0025] 术语“空肠弯曲杆菌聚糖”、“空肠弯曲杆菌七糖”、“N-聚糖七糖”、“弯曲杆菌N-聚糖”和“七糖”在本文中可互换地用于指弯曲杆菌的多种菌株和种中的多种表面暴露糖蛋白和游离寡糖中所存在的聚糖部分。在空肠弯曲杆菌的情况下和如本文中所例示,此聚糖具有下式:GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-diN AcBac,其中diNAcBac是2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖。这些术语可以指通过N-糖基化或使用来源于N-糖基化或其他路径的糖的糖基化。本发明人新近的工作已表明,空肠弯曲杆菌N-聚糖和游离寡糖在弯曲杆菌的嗜热性种中合理地保守(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012),且一些产生七糖的六糖衍生物的种缺乏葡萄糖分支。由(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012)描述的存在于非嗜热性弯曲杆菌种中的替代性N-聚糖结构和游离寡糖(如PCT公开案WO/2011/097733中描述的那些)的用途也涵盖在内,且以引用的方式并入本文中。
[0026] 如本文所用的术语“抗原”是指在动物或人类中诱发免疫反应的化学或生物物质。在本发明描述的系统中,抗原包含空肠弯曲杆菌的七糖或其N-聚糖衍生物。如本文所用的术语“N-聚糖衍生物”是指在动物中诱发与由七糖自身诱发的免疫反应相比类似或更好的免疫反应的七糖的衍生物。N-聚糖可以是结合于载体,如蛋白质(如PCT申请案第WO2012/
027850号中所述)和脂质(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012,凡佐尔格等人细胞微生物学11:1768-1781,2009),例如七糖的或更短或更长糖类重复序列到多糖中。
[0027] 如本文所用的术语“疫苗”是指用于改进动物或人类对某些微生物的免疫性的组合物。本发明描述的疫苗可用于多种动物,如类,如家禽,以及哺乳动物。本发明描述的疫苗所靶向的微生物是属于弯曲杆菌属的。
[0028] 如本文所用的术语“弯曲杆菌”是指包含弯曲杆菌属的任何和所有种的细菌属。此属的弯曲杆菌的各个种包括(但不限于)空肠弯曲杆菌、人弯曲杆菌(C.hominis)、直肠弯曲杆菌(C.rectus)、红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)、胎儿弯曲杆菌(C.fetus)、大肠弯曲杆菌(C.coli)、乌普萨拉弯曲杆菌(C.upsaliensis)、胎儿弯曲杆菌性病亚种(C.fetus subsp.venerealis)、胎儿弯曲杆菌胎儿亚种(C.fetus subsp.fetus)、巨贝弯曲杆菌(C.peloridis)、红嘴鸥弯曲杆菌贝亚种(C.lari subsp.concheus)、唾液弯曲杆菌(C.sputorum)、纤细弯曲杆菌(C.gracilis)、昭和弯曲杆菌(C.showae)、屠场弯曲杆菌(C.lanienae)、曲形弯曲杆菌(C.curvus)、瑞士弯曲杆菌(C.helveticus)、猪肠弯曲杆菌猪肠亚种(C.hyointestinalis subsp.hyointestinalis)、猪肠弯曲杆菌罗森亚种(C.hyointestinalis subsp.lawsonii)、粘膜弯曲杆菌(C.mucosalis)、唾液弯曲杆菌副溶血生物变种(C.sputorum bv.paraureolyticus)、唾液弯曲杆菌粪生物变种(C.sputorum bv.fecalis)、解脲弯曲杆菌(C.ureolyticus)、黑岛弯曲杆菌(C.insulaenigrae)、简要弯曲杆菌(C.concisus)、亚南极弯曲杆菌(C.subantarcticus)、禽类弯曲杆菌(C.avium)、兔弯曲杆菌(C.cuniculorum)和鸟弯曲杆菌(C.volucris)。
[0029] 本申请案提供一种聚糖和其免疫活性片段,其可以用作对抗人类和动物中的弯曲杆菌感染的疫苗。所述疫苗可以适用于预防或中和家畜中的弯曲杆菌感染,由此预防此病原体进入人类食物链。在某些实施例中,任选地与基酸、寡肽、脂质或其他适合的结合物连接的空肠弯曲杆菌七糖和其片段可以用作疫苗。举例来说,此疫苗可用于经弯曲杆菌感染的任何动物,其中N-聚糖可以脂质A核心融合体形式表达在大肠杆菌的表面上。
[0030] 疫苗组合物
[0031] 本申请案提供一种疫苗组合物,其包含重组大肠杆菌,所述重组大肠杆菌已经工程化以在其表面上表达至少一种弯曲杆菌N-聚糖或其七糖衍生物。重组大肠杆菌是活的、死的和/或减毒的。
[0032] 如上文所述,弯曲杆菌七糖对至少数种弯曲杆菌种和许多包括作为人类和兽医病原体重要的物质的菌株是常见的。其是多种糖蛋白的组分,包括例如空肠弯曲杆菌第Cj0114号、第Cj0200c号、第Cj0289c号、第Cj0367c号和其他。此聚糖部分还具强烈免疫原性,并且因此,此聚糖(和其相关衍生物和包含N-聚糖或其衍生物的糖肽)被确认为用作对抗哺乳动物(包括人类和家畜,包括鸡)中的弯曲杆菌的多种菌株和种的免疫接种用疫苗中的抗原的良好候选物(美国专利第7,598,354号)。
[0033] 大肠杆菌是革兰氏阴性细菌,其具有覆盖在脂多糖(LPS)中的外膜,所述脂多糖有助于细菌的结构完整性且提供物理屏障以保护所述膜。LPS由三种主要组分所组成:脂质A、核心和O-抗原。脂质A将LPS锚定到外膜,且O-抗原是LPS的最外层部分。核心是桥接LPS的脂质A和O-抗原组分的分支寡糖。
[0034] 适用于制备本发明疫苗组合物的大肠杆菌菌株是经过或可以充分减毒以允许其以活或死形式非病理性投与人类和/或动物的任何菌株。可使用其他细菌,如沙门氏菌或大肠杆菌的其他菌株,其可提供充分表达和改进的免疫原性反应。
[0035] 如本文所用的术语“pgl操纵子”是指能够糖基化由疫苗组合物中采用的大肠杆菌菌株产生的同源或异源结构的弯曲杆菌基因的任何生理学上活性的糖基化簇。空肠弯曲杆菌中的pgl操纵子编码对于空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖的合成、其经由内膜转运且转移到蛋白质所必需的所有酶。PglD、E、F编码参与二-N-乙酰基杆菌胺生物合成的酶,PglC将UDP-diN-乙酰基杆菌胺转移到十一二烯磷酸酯,且PglA、H和J添加GalNAc残基。Glc分支通过PglI连接。完整七糖跨越内膜转移经由PglK的作用进行,且寡糖基转移酶PglB将N-聚糖转移到蛋白质以及将七糖以其游离形式释放到周质中。
[0036] pgl操纵子的功能衍生物是来源于任何弯曲杆菌操纵子的基因簇,其具有核苷酸或整个基因的缺失、突变和/或取代,但仍能够产生可以与由疫苗组合物中所用的大肠杆菌菌株产生的同源或异源结构连接的寡糖或多糖。一个或多个pgl操纵子或其衍生物可以整合到大肠杆菌菌株的染色体中或其可以至少一个质粒的一部分形式引入。染色体整合通常是优选的,因为其与质粒载体相比更稳定,在繁殖期间可能发生质粒载体的丢失。应注意,大肠杆菌菌株可包含产生一种或多种N-聚糖或其衍生物的一种以上pgl操纵子或其衍生物。在某些实施例中,疫苗组合物包含大肠杆菌菌株,其具有产生在重组大肠杆菌的表面上表达的一种以上聚糖结构的一种以上类型的pgl操纵子。这对于在人类或动物中引发对抗不同弯曲杆菌种的更多样免疫反应可为有利的。在一个替代实施例中,疫苗组合物包含大肠杆菌菌株,其具有单个类型的pgl操纵子,产生在重组大肠杆菌的表面上表达的一种聚糖结构。这对于在人类或动物中引发对抗单一弯曲杆菌种的特异性免疫反应可为有利的。
[0037] 任选地,空肠弯曲杆菌聚糖的表达水平可以通过使用pgl操纵子上游的不同启动子或其他调节元件来调节,包括(但不限于)核糖体蛋白质基因的启动子以及来自抗生素抗性编码基因(如bla)的启动子或类似且优选强的启动子。这类调节可用于质粒编码或染色体整合的pgl操纵子。此外,质粒稳定性可以任选地通过在质粒上包括必需基因同时在疫苗组合物中采用的大肠杆菌菌株的基因组中缺失这些基因来增强的。
[0038] 在一个替代实施例中,pgl操纵子的pglB基因失活,意味着对应的寡糖基转移酶B不表达或至少以酶促方式失活。pglB基因产物将N-聚糖转移到如下文进一步描述的特定多肽接受体位点且将七糖以其游离形式释放。转移酶的失活引起N-聚糖或N-聚糖衍生物仅仅结合于大肠杆菌中的O-抗原接受体脂质A核心,且引起GlcNAc交换为diN-乙酰基杆菌胺,因为大肠杆菌O-抗原连接酶仅在连接位点(即,还原端)处识别含有GlcNAc的聚糖。
[0039] 在相关实施例中,pgl衍生物是其中用于二-N-乙酰基杆菌胺生物合成(pglD、E、F)和转移的一种或多种基因失活且pglB基因也失活的一者。此实施例引起GlcNAc交换为二-N-乙酰基杆菌胺。此类pgl衍生物并入沙门氏菌中引起细胞呈现增加以及经修饰的七糖转移到脂质A核心而非多肽受体中(参见美国专利申请公开案第2012/0100177号)。
[0040] 空肠弯曲杆菌的至少一种N-聚糖或其七糖衍生物可以是由弯曲杆菌的任何pgl操纵子或其功能衍生物产生的任何N-聚糖,其条件是聚糖是免疫原性的,以便其引发对弯曲杆菌种具有特异性的免疫反应。
[0041] 在一个具体实施例中,聚糖是如上文所述式(I)的七糖,即GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-diNAcBac,其中diNAcBac(也称为二-N-乙酰基杆菌胺)是2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖。
[0042] 替代实施例(其中pgl操纵子中的用于二-N-乙酰基杆菌胺生物合成的基因失活或大部分或完全缺失)引起式(II)的衍生物七糖(GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-GlcNAc)的合成。
[0043] 在一个特定实施例中,由至少一个pgl操纵子或其衍生物产生的N-聚糖或衍生物可以与最终将转移到细胞表面且在其上呈现的至少一种同源或异源大肠杆菌多肽连接。与N-聚糖(衍生物)连接的多肽可以是任何类型的多肽,如纯多肽(仅氨基酸)或翻译后修饰多肽(例如脂质连接的多肽)。
[0044] 在另一实施例中,聚糖或其衍生物以其游离寡糖形式从天然宿主纯化且接着化学结合于多肽或脂质载体。
[0045] 在一个具体实施例中,由至少一个pgl操纵子或其衍生物产生的至少一种聚糖或其衍生物与大肠杆菌脂质A核心或其功能等效衍生物连接。大肠杆菌的脂质A核心是寡糖结构,由(但不限于)己糖、庚糖和KDO(3-脱氧-D-甘露-辛糖酸)组成,经由两个氨基葡萄糖连接到酰基链,将所述结构锚定在细菌的外膜中。脂质A核心的功能等效衍生物是能够接受一种或多种聚糖或其衍生物且将其呈现在细胞表面上的一者。应注意,在这种情况下,七糖或其衍生物不是N-连接。因为大肠杆菌结构脂质A核心不是多肽。
[0046] 任选地,至少一种七糖或其衍生物代替LPS(脂多糖)中的O-抗原侧链。大肠杆菌的内部和外部脂质A核心保持不变,而O-抗原生物合成经由例如wzy的突变和/或其他突变而废止。在某些实施例中,至少一种七糖、其衍生物或两者的混合物与LPS中的O-抗原侧链同时表达,产生含有宿主O-抗原和七糖两者的异质LPS。
[0047] 优选的且对于医学用途高度重要的是,本发明的大肠杆菌菌株在以活和/或失活形式投与动物或人类时并不引发致病作用。熟练的人员了解许多使毒性大肠杆菌种通过突变减毒的方式。举例来说,使病原性大肠杆菌减毒的突变(1)禽类病原性大肠杆菌O2的CarAB突变体经减毒且作为对抗火鸡中大肠杆菌病的活的经口疫苗有效(夸加(Kwaga)等人感染与免疫(Infect Immun.)62:3766-3772,1994);(2)RNA伴随蛋白Hfq的突变显著降低线虫模型中VTEC、EAEC和UPEC的致病性(博厄(Bojer)等人微生物感染(Microbes Infect)14:1034-1039,2012);(3)磷酸盐特异性转运系统内的基因突变(Pst)使大肠杆菌菌株减毒(布克斯(Buckles)等人微生物学(Microbiology)152:153-160,2006;戴格尔(Daigle)等人感染与免疫63:4924-4927,1995)。
[0048] 在一个具体实施例中,疫苗组合物中采用的大肠杆菌菌株通过O-抗原表达的部分或完全失活,例如通过wzy基因中的突变(产生O-抗原聚合酶突变体)来减毒(巴芭(Baba)等人分子系统生物学(Mol.Syst.Biol.)2:2006)。
[0049] 上述大肠杆菌菌株是高度免疫原性的且产生对抗弯曲杆菌(如空肠弯曲杆菌)感染的免疫反应。此外,一旦经制备,其就可以容易地繁殖且大量产生。其可以死或活疫苗形式投与,活疫苗允许在宿主中长期繁殖和持续的免疫刺激物以及在有或没有佐剂情况下的完全免疫反应。
[0050] 因此,本申请案还涉及经工程化以在其表面上呈现一种或多种弯曲杆菌N-聚糖或其衍生物的活或死的大肠杆菌菌株尤其用于制备药物、优选地疫苗的医学用途。
[0051] 优选地,药物适用于预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染和/或优选地在家畜中、更优选地在和家禽中、最优选地在如鸡、火鸡、鹅和鸭的家禽中的定殖。
[0052] 根据一个方面,本申请案提供一种疫苗组合物,其为医药组合物、食物或饲料(添加剂),其包含经工程化以在其表面上呈现一种或多种弯曲杆菌N-聚糖或其衍生物的死或活的大肠杆菌以及生理学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。任选地,疫苗组合物包括其他组分(如佐剂)或与其他组分一起投与。在另一替代方案中,本文所述的疫苗组合物经调配以用于与另一疫苗组合物一起投与。
[0053] 佐剂一般包含以非特异性方式加强宿主免疫反应的物质。多个不同佐剂是所属领域中已知的。佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂(Freunds Complete and Incomplete adjuvant)、维生素E、非离子阻断聚合物和多胺,如硫酸葡聚糖、卡波普(carbopol)和吡喃。同样适合的是表面活性物质,如Span、Tween、十六烷基胺、溶血卵磷脂、甲氧基十六烷基甘油和皂苷(例如Quil )。此外,通常使用肽,如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和他福新(tuftsin)。紧接于这些佐剂,可有利地使用免疫刺激复合物(ISCOMS)、矿物油(例如或 )、植物油或其乳液和 Forte。
[0054] 任选地,疫苗与一种或多种稳定剂混合,从而例如保护易于降解的组分免于降解,增加疫苗的保存期,或改进冻干效率。适用的稳定剂是例如SPGA(博瓦尼克(Bovarnik)等人细菌学杂志(J.Bacteriology)59:509,1950)、脱脂奶、明胶、牛血清白蛋白、碳水化合物(例如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白质(如白蛋白或酪蛋白或其降解产物)和缓冲剂(如金属磷酸盐)。
[0055] 疫苗组合物可以呈例如溶液、悬浮液或适用于在投与之前复水的冻干组合物形式。
[0056] 冻干是保存疫苗组合物的高效方法。冻干物质可以稳定储存许多年。冻干物质的储存温度很可能高于零度,而不会对所述物质不利。冻干可以根据所有熟知的标准冻干程序进行。
[0057] 免疫接种方法
[0058] 本申请案提供一种使动物免疫对抗弯曲杆菌感染的方法。所述方法包含向动物投与疫苗组合物的步骤,所述疫苗组合物包含如上文所述的已经工程化以在其表面上呈现至少一种弯曲杆菌N-聚糖或其七糖衍生物的重组大肠杆菌。
[0059] 弯曲杆菌症是由经弯曲杆菌感染引起的疾病。最常见的症状是腹泻、腹痛、发热、头痛、恶心和/或呕吐。这些症状通常仅持续约三到六天。然而,罕见地,弯曲杆菌感染可以引起持续的并发症,如格林-巴利综合症(Guillain-BarréSyndrome,GBS)、关节炎和菌血症。因此,本文所述的疫苗适用于使动物(包括人类和家畜,如鸡,其是人类食源性疾病的主要病因)免疫。因此,本申请案进一步提供一种用于预防由弯曲杆菌感染引起的疾病或病症的效应或使所述效应减到最少的方法。在具体实施例中,由弯曲杆菌感染引起的疾病或病症是弯曲杆菌症、格林-巴利综合症(GBS)和/或关节炎和/或菌血症,不过其他弯曲杆菌种与其他病(如齿根骨膜炎和流产)有关。
[0060] 在疫苗组合物用于疫苗接种家畜的实施例中,存在用于投与可以便于大规模疫苗接种的组合物的多种途径。投与可以经由饮用水、食物或饲料、喷雾/雾化(例如向运送箱中的日龄鸡、或向圈养环境(如禽舍)中的动物)、滴眼剂、贯穿和划破(在翼蹼或足部的皮肤途径)、注射(例如肌内或皮下)或卵内投与执行。
[0061] 任选地,动物用初始剂量的疫苗组合物处理,接着在适当时间间隔下用一个或多个加强剂量处理。所属领域的工作人员将易于鉴别适合于具体应用的剂量和给药时程。在目前实例中,我们用1×108个活的或福尔林固定的大肠杆菌细胞(或与任何其他糖结合疫苗一起,即,与ToxC连接的空肠弯曲杆菌N-聚糖)在1周大禽鸟中进行初始疫苗接种。我们用相同量的细菌细胞(或蛋白质)在两周后执行一次加强。通常再过一周后用弯曲杆菌攻击,且在攻击后1周将禽鸟安乐死(如下文所述)。
[0062] 为了更好地理解本文所述的本发明,阐述以下实例。应理解,这些实例仅出于说明性目的。因此,其不应以任何方式限制本发明的范围。
[0063] 实例
[0064] 实例1:制备疫苗
[0065] 与蛋白质融合的空肠弯曲杆菌N-聚糖
[0066] 经空肠弯曲杆菌N-聚糖糖基化的ToxC-GT蛋白的表达和纯化:经空肠弯曲杆菌N-聚糖糖基化的ToxC-GT蛋白在表达空肠弯曲杆菌pgl操纵子的大肠杆菌BL21中表达且通过如国际公开PCT申请案第WO 2012/027850号中所述的Ni-NTA色谱纯化。蛋白质进一步使用装备有2.5ml MonoQ阴离子交换柱的AEKTA FPLC系统通过离子交换色谱纯化。流动相是50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0),且NaCl梯度设定为经30个柱体积0-500mM NaCl。含有糖结合物的洗脱份通过12.5%SDS PAGE分析,经由1g脂质移除吸收剂(LRA,苏佩克(Supelco))通过两次,针对无菌PBS透析,且在使用之前设定为0.5mg/ml蛋白质的浓度。蛋白质浓度使用标准方法(布莱德福测试(Bradford test))使用含递增浓度BSA的PBS测定以形成标准曲线。
[0067] 与大肠杆菌的脂质A核心结构融合的空肠弯曲杆菌N-聚糖:制备大肠杆菌疫苗[0068] 先前描述了表达空肠弯曲杆菌七糖的大肠杆菌细胞(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219)。细胞在液体肉汤(2×YT肉汤(酵母提取物和胰蛋白胨肉汤))中在37℃下在剧烈振荡(220rpm)下生长,直至达到生长停滞期。通过离心收集细胞并且用无菌PBS洗涤两次。细胞量通过接种细胞悬浮液的连续稀释液(设定为2.0的OD600且直接使用或经福尔马林固定)来测定。
[0069] 通过离心收集表达空肠弯曲杆菌pgl基因座的大肠杆菌过夜培养物的细胞且用无菌PBS缓冲液洗涤两次,如诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012中所述。接着,将OD600用无菌PBS调节到1.0的1ml细胞离心且悬浮于100μl 1倍勒姆利样品缓冲液(Laemmli sample buffer)中且在95℃下加热10分钟。将蛋白酶K添加到200μg/ml的最终浓度,且将样品在60℃下孵育1小时,接着在上孵育5分钟且离心15分钟。上清液的等分试样通过标准12.5%SDS-PAGE分离。使用空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性抗血清hR6作为一级抗体以及与碱性磷酸酶结合的抗兔作为二级抗体,通过如所述(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219)的蛋白质印迹法(Western Blotting)观测与脂质A核心融合的七糖(图
1)。泳道1展示来自表达具有非活性pglB基因的空肠弯曲杆菌的蛋白质糖基化操纵子的大肠杆菌O-抗原聚合酶突变体(pACYC184pglBmut)的蛋白酶K处理的细胞裂解物。脂质A-N-聚糖融合体的形成通过箭头标记。泳道2展示来自大肠杆菌O-抗原聚合酶突变体空白载体对照(pACYC184)的蛋白酶K处理的细胞裂解物。分子量标记物(MW,千道尔顿(kilodalton),kDA)指示在左边。较高分子量条带是在两种制备物中交叉反应的大肠杆菌的组分。
[0070] 经纯化脂质A-N-聚糖组分的核磁共振光谱(NMR)。糖脂由八升OD600=1.0的表达具有非活性pglB基因的空肠弯曲杆菌的蛋白质糖基化操纵子的大肠杆菌O-抗原聚合酶突变体培养物(pACYC184pglBmut)制备。LPS通过苯酚-水萃取,透析,用AcOH处理以沉淀核酸,透析,干燥,用2%AcOH水解,且在Biogel P6上分离。洗脱份通过NMR分析。将含有空肠弯曲杆菌N-聚糖信号的洗脱份合并且在阴离子交换Hitrap柱上使用梯度分离。洗脱份通过NMR分析。含有空肠弯曲杆菌N-聚糖信号的洗脱份通过Sephadex G-15色谱脱盐。联系通过核奥氏效应光谱分析(Nuclear Overhauser effect spectroscopy,NOESY)和杂核多键相关性光谱分析(HMBC)证实。可观察到特定空肠弯曲杆菌N-聚糖化学位移,空肠弯曲杆菌N-聚糖组分的所有1-4键均得到转糖苷NOE 1:4和1:6,且赋值与先前公开的数据良好一致(图2和表1,和诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012)。具有GlcNAc而非diNAcBac作为还原端糖的空肠弯曲杆菌N-聚糖的衍生物(图2)经由脂质A核心的L-甘油-D-甘露-庚糖的O-7连接。Hep(L)的所有信号均通过分析相关的主堆发现,且大肠杆菌脂质A核心部分的赋值与公开的数据一致(穆勒-洛宁斯(Muller-Loennies)等人生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)278:,34090-34101,2003和表1)。
[0071] 表1:化学位移
[0072]    1 2 3 4 5 6 7
α-GalNAc A δH 5.47 4.27 3.23 4.07 3.92 3.70;3.75  
  δC 98.2 51.0 68.0 77.6 72.7 60.8  
α-GalNAc C δH 5.13 4.29 4.19 4.13 4.49 3.66;3.78  
  δC 98.2 51.5 67.8 77.4 71.6 59.9  
α-GalNAc D δH 5.07 4.23 4.04 4.06 4.39 3.70;3.73  
  δC 99.3 51.4 68.4 69.6 71.9 61.8  
α-GalNAc E δH 5.04 4.30 4.15 4.13 4.43 3.65;3.68  
  δC 99.3 51.5 67.8 77.4 72.3 60.5  
α-GalNAc F δH 5.02 4.53 4.17 4.36 4.45 3.56;3.64  
  δC 99.5 50.5 67.8 75.6 72.3 60.3  
β-Glc G δH 4.60 3.32 3.48 3.38 3.43 3.71;3.92  
  δC   74.1 76.8 70.9 76.9 61.8  
α-GlcNAc N δH 4.54 3.82 3.74 3.68 3.45 3.75;3.92  
  δC   55.3 79.6 72.3 76.9 61.9  
α-Hep L δH 4.89 3.97 3.80 3.86 3.57 4.16 3.80;4.01
  δC 100.4 71.1 72.0 67.3 72.8 68.4 73.2
α-Glc K δH 5.18 3.61 3.75 3.51 4.15 3.67;3.92  
  δC 97.1 72.4 74.6 70.4 71.2 65.9  
α-Glc I δH 5.47 3.68 3.85 3.54 4.08 3.82;3.90  
  δC 98.2 76.8 72.1 70.3 72.6 61.2  
[0073] 荧光激活细胞分选术(FACS)分析.首先,1ml的OD600=1.0大肠杆菌细胞通过离心粒化且再悬浮在1ml封闭溶液(PBS,5%脱脂奶)中。细胞用空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性抗血清hR6和Alexa Flour-546结合的抗兔抗血清探测且通过FACS分析。FACS数据用FACS Diva4
软件处理。DAPI计数器-染色用于鉴别并选通完整细胞。2×10 个细胞群体的分析展示出,与大肠杆菌空白载体对照(pACYC184)细胞相比,表达空肠弯曲杆菌N-聚糖的大肠杆菌细胞的荧光显著增加,证实空肠弯曲杆菌N-聚糖呈现在细胞表面上(图3)。峰外观和峰几何形状展示出,每一大肠杆菌细胞在其表面上呈现出可比量的空肠弯曲杆菌N-聚糖。
[0074] 实例2:疫苗接种和攻击
[0075] 鸡暴露于ToxC-GT糖结合物的注射(图4D)或实例1中描述的经修饰大肠杆菌的死(图4A)以及活(图4B和C)菌株的经口剂量,引起受攻击鸡中弯曲杆菌的盲肠含量显著减小。使用表达空肠弯曲杆菌七糖的大肠杆菌进行三次鸡疫苗接种实验,展示鸡对弯曲杆菌的免疫性增加。这些实验的结果展示于图4A、B和C中。
[0076] 在第一次鸡疫苗接种实验中,用三组鸡进行攻击。对照PBS组含有四只鸡,而第2组和第3组各自含有八只鸡。第1组和第2组的条件展示于表2中。第3组在第7天和第21天用表面表达空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖的死的大肠杆菌细胞经口管饲。禽鸟随后如下攻击:第1组(阴性对照)用300μl PBS经口管饲;第2组和第3组用含有102个空肠弯曲杆菌81-176细胞的300μl PBS经口管饲。在第35天,将鸡安乐死,且通过在选择性卡马利琼脂(Karmaliagar)上接种每只禽的盲肠内容物的连续稀释液来测定定殖水平。在将培养板在微好氧条件下孵育
48小时之后,测定菌落形成单位(cfu)。结果图解展示于图4A中,且定殖水平显示为cfu/克盲肠内容物。水平条代表每一组的中位数。具体来说,结果展示出基于N-聚糖的疫苗减少鸡中的弯曲杆菌定殖。在第1组的培养板(PBS对照)上未检测到菌落形成单位,而第2组禽鸟定殖有平均约1010个弯曲杆菌细胞/克盲肠内容物。第3组中定殖降低约4个log。
[0077] 在第二次鸡疫苗接种实验中,用三组鸡进行攻击。第1组和第2组含有6只鸡,第3组含有8只鸡。第1组和第2组的条件展示于表2中。第3组在第7天和第21天用表达空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖的活的大肠杆菌细胞经口管饲。攻击浓度和定殖水平如第一次实验中所述测定。结果图解展示于图4B中,且定殖水平显示为cfu/克盲肠内容物。水平条代表每一组的中位数。结果展示出基于N-聚糖的疫苗减少鸡中的弯曲杆菌定殖。在第1组的培养板(PBS对照)上未检测到菌落形成单位,而第2组禽鸟定殖有平均约1010个弯曲杆菌细胞/克盲肠内容物。定殖在第3组中禽鸟中的任一个中是不可检测的。
[0078] 在图4C中展示的第三次实验中,用4组鸡进行攻击。第1组含有6只鸡,第2组、第3组和第4组含有8只鸡。第1组和第2组的条件展示于表2中。第3组和第4组在第7天和第21天经口管饲。第3组禽鸟接受表面上不表达N-聚糖的活的大肠杆菌,而第4组禽鸟接受在其表面上表达空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖的活的大肠杆菌细胞。结果图解展示于图4C中,且定殖水平显示为cfu/克盲肠内容物。水平条代表每一组的中位数。结果展示出,基于N-聚糖的疫苗可重复地减少鸡中的弯曲杆菌定殖,且不表达N-聚糖的大肠杆菌细胞并不具有益生菌效应,因为弯曲杆菌定殖水平在攻击之后与第2组禽鸟类似。
[0079] 在图4D中展示的第四次实验中,用六组鸡进行攻击,每一组含有八只鸡。每一组的条件展示于表2中。
[0080] 表2:攻击组
[0081]组别 条件
1 阴性对照:不暴露于抗原且无攻击
2 阳性对照:不暴露于抗原
3 在第21天单次IM剂量糖蛋白抗原
4 在第7天单次IM剂量糖蛋白抗原
5 在第7天和第21天糖蛋白抗原IM剂量
6 在第7天和第21天经口管饲表面表达空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖的活的大肠杆菌细胞[0082] 与先前实验类似,在第1天对10%禽鸟(随机选择的5只)执行泄殖腔拭子,且接种到选择性卡马利琼脂上以证实禽鸟不经空肠弯曲杆菌定殖。在37℃下在微好氧条件下在48小时孵育之后未观察到弯曲杆菌菌落。
[0083] 在第7天,与先前实验类似,从每只禽鸟收集最多50μl的血液(预放血)。如下制备血清:将血液样品在37℃下保持1小时接着离心(5分钟,18.000×g,4℃)后,将上清液(血清)转移到新鲜管中,且将甘油添加到10%的最终浓度。将血清储存在-20℃下,直到进一步使用。如下执行后续抗微生物治疗:第1组(PBS对照)和第2组(定殖对照)在第7天接受具有弗氏完全佐剂的300μl PBS,且在第21天接受相同量但具有弗氏不完全佐剂的PBS(150μl PBS+150μl佐剂),在胸部的两个部位注射,每一部位有150μl疫苗调配物(不具有糖结合物)。第3组在第7天不接受抗原但在第21天接受一个剂量的经空肠弯曲杆菌N-聚糖糖基化的ToxC-GT(100μg蛋白质于150μl PBS+150μl弗氏完全佐剂中);第4组在第7天接受一个剂量的含经空肠弯曲杆菌N-聚糖糖基化的ToxC-GT的弗氏完全佐剂且在第21天不接受抗原。第5组接受2个剂量(在第7天用弗氏完全且在第21天用弗氏不完全作为佐剂)在腿中注射的
100μg具有空肠弯曲杆菌N-聚糖的ToxC-GT(每条腿150μl疫苗调配物),且第6组用2个剂量
8
(在第7天和第21天)用含有在其表面上表达空肠弯曲杆菌N-聚糖的10 个活的大肠杆菌细胞的300μl PBS经口管饲。
[0084] 与先前实验类似,在第28天,从第1组到第6组的每只禽鸟抽取100μl血液(测试放血)且如上文所述制备且储存血清。禽鸟随后如下攻击:第1组(阴性对照)用300μl PBS经口2
管饲;第2组到第6组用含有10个空肠弯曲杆菌81-176细胞的300μl PBS经口管饲。在第34天,将鸡安乐死,经由心穿刺术获取血液(最终放血),且如上文所述制备且储存血清。通过在选择性卡马利琼脂上接种每只禽鸟的盲肠内容物的连续稀释液来测定定殖水平。在将培养板在微好氧条件下孵育48小时之后,测定菌落形成单位(cfu)。
[0085] 结果图解展示于图4D中,且定殖水平显示为cfu/克盲肠内容物。水平条代表每一组的中位数。具体来说,结果再次展示出,基于N-聚糖的疫苗减少鸡中的弯曲杆菌定殖,且包含在其表面上表达空肠弯曲杆菌N-聚糖的活的大肠杆菌细胞的疫苗与糖蛋白疫苗相比在鸡中表现更好(参见下文)。
[0086] 在第1组的培养板(PBS对照)上未检测到菌落形成单位,而第2组禽鸟定殖有平均约1010个弯曲杆菌细胞/克盲肠内容物。定殖在第3组、第4组和第5组中减少,分别平均为2.2×104、6.8×105和5.5×104cfu/克盲肠内容物。
[0087] 在第6组中的定殖几乎消除,平均100cfu/克盲肠内容物。另外,8只禽鸟中的5只完全未展示出空肠弯曲杆菌定殖的迹象。这清楚地指示,用基于蛋白质的空肠弯曲杆菌-N-聚糖疫苗治疗在用弯曲杆菌攻击之后与注射时间点和疫苗施用部位无关地引起定殖减少,且用在其表面上表达七糖的活的大肠杆菌细胞经口疫苗接种几乎完全消除弯曲杆菌定殖。此外,展现大肠杆菌疫苗菌株的自身限制性,因为当接种在选择性LB Kan-Cm上时,在这一组的盲肠内容物中未观察到大肠杆菌。在所有实验中观察到从鸡中消除活的大肠杆菌疫苗菌株。
[0088] 执行ELISA测试以分析N-聚糖特异性免疫反应,确切地说,鸡IgY(IgG)N-聚糖特异性抗体反应。来自空肠弯曲杆菌的游离寡糖(fOS)如所述(德维韦迪(Dwivedi)等人生物聚合物(Biopolymers),99:772-7830,2013)制备且如所述(诺萨夫等人分子和细胞蛋白质组学11:1203-1219,2012)通过还原性胺化反应与BSA偶联。BSA-Cj-N-聚糖结合物的形成通过蛋白质印迹法使用R1-4抗血清证实。在用PBS将浓度调节到1mg/ml之后,将糖结合物储存在4℃下,直到进一步使用。接着,96孔Maxisorb培养板经500ng BSA-Cj-N-聚糖结合物涂布在
4℃下过夜(18小时)。在移除未结合抗原之后,将培养板在室温下用100μl PBS-T、5%脱脂奶在振荡下封闭1小时。在丢弃封闭溶液之后,添加100μl抗体溶液,且如上文所述孵育1小时。抗体溶液包含在PBS-T、1%脱脂奶或鸡血清(由疫苗接种实验的第2次放血(即第28天)制备)中1:3000稀释的以及在PBS-T、1%脱脂奶中1:50稀释的N-聚糖-特异性抗血清。将培养板在室温下如所述孵育1小时,且每孔用100μl PBS-T洗涤3次持续5分钟。在添加100μl二级抗体溶液(用于R1-4对照的抗兔-AP(1:500)或用于实验样品的抗鸡IgY(1:500))且在室温下孵育1小时之后,丢弃二级抗体溶液,且用100μl PBS-T洗涤各孔4次5分钟。在最后一个洗涤步骤之后,从每一孔完全移除剩余洗涤溶液,且培养板使用PNPP作为底物显影。在OD405下在读板仪中扫描培养板之后,测定每一血清中的免疫反应性
[0089] 空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性抗体呈现(图5A)在从在用弯曲杆菌攻击之前在第28天从禽鸟抽取的血液制备的血清中,所述禽鸟经以下各者疫苗接种:在第21天1个剂量的具有聚糖的ToxC-GT(胸,IM)(样品第3组)、在第7天和第21天2个剂量具有聚糖的ToxC-GT(胸,IM)(样品第4组)、在第7天和第21天2个剂量具有聚糖的ToxC-GT(腿)(样品第5组)以及2个剂量死的大肠杆菌(样品第6组)。抗体反应(表示为OD405)在样品第6组中最高,且此样品组中的大部分鸡不展示定殖。阳性和阴性定殖对照组(样品第1组和第2组)中的抗体反应低于检测限。水平条代表每一组的中位数。
[0090] 空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性抗体呈现(图5B)在从在用弯曲杆菌攻击之前在第28天在从经表面呈现N-聚糖的活的大肠杆菌疫苗接种的禽鸟抽取的血液制备的血清中(样品第4组)。这对应于图4C中展示的疫苗实验3。经活的大肠杆菌无聚糖疫苗接种的禽鸟(样品第3组)以及阳性和阴性定殖对照组(样品第1组和第2组)中的抗体反应(表示为OD405)低于检测极限。水平条代表每一组的中位数。
[0091] 观察到以下各项:
[0092] 1)用表达空肠弯曲杆菌七糖的死的大肠杆菌细胞喂饲鸡接着用空肠弯曲杆菌攻击引起鸡消化道的空肠弯曲杆菌定殖减少约4个log(图4A);以及
[0093] 2)喂饲鸡表达空肠弯曲杆菌七糖的活的大肠杆菌细胞接着用空肠弯曲杆菌攻击一致地引起鸡消化道的空肠弯曲杆菌定殖减少大于7个log(图4B、C和D)。
[0094] 明显的是,包含表达空肠弯曲杆菌七糖的死的或活的大肠杆菌细胞的疫苗能够显著增强鸡对随后空肠弯曲杆菌攻击的免疫性。
[0095] 对照实验
[0096] 为了表明空肠弯曲杆菌定殖减少是用表达空肠弯曲杆菌七糖的活的大肠杆菌疫苗接种而非由于暴露于活的大肠杆菌细胞产生的益生菌效应的结果,将来自经活的大肠杆菌菌株疫苗接种的禽鸟的盲肠内容物还接种到如上所述的大肠杆菌选择性培养基上。在经活的大肠杆菌疫苗接种的鸡中未检测到大肠杆菌菌落,表明在实验终止之前已清除大肠杆菌。
[0097] 本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请案指示本发明所涉及的领域的技术人员的技术水平且以引用的方式并入本文中,其程度如同指示每一个别公开案、专利或专利申请案专门且个别地以引用的方式并入。
[0098] 已如此描述了本发明,将显而易见的是其可以多种方式变化。此类变化不应视为脱离本发明的精神和范围,且所属领域的技术人员将清楚的是所有此类修改打算包含在随附权利要求书的范围内。
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