探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测 |
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| 申请号 | CN201280056114.7 | 申请日 | 2012-09-14 | 公开(公告)号 | CN103946398B | 公开(公告)日 | 2019-08-13 |
| 申请人 | 健能泰格技术公司; | 发明人 | 戴维·A·谢弗; | ||||
| 摘要 | 相互作用并标记的多核苷酸探针和反义探针和/或互补的靶探针，为我们提供了用于扩增或检测核酸的组合物及方法。这些组分的竞争性热 力 相互作用导致显示靶 频率 的 信号 变化，并且可以提供促成单 碱 基识别错误的检查功能。这些探针、反探针组合物能进行实时 荧光 定量PCR检测，终点检测和 微 生物 的微阵列检测，耐药突变和癌症相关的变异。一些探针、反义探针在两个引物之间作为内部探针，一些作为引物探针。采用两个探针：反义探针系统检测同一模板的不同方面，以辨别或量化一些靶序列。还提供了增强靶扩增和检测特定单碱基变异的系统。探针也可通过引入一个碱基不匹配以增加相差一个碱基的正确与不正确的靶的 热力学 识别力而修饰。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种同时扩增和选择性地检测靶核苷酸序列的探针系统，所述系统包括至少一种探针:反义探针系统，其包括： |
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| 说明书全文 | 探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测[0001] 交叉引用的相关申请 [0002] 本申请要求于2011年9月15日提交的第61/534,925号、名称为 “探针：反义探针组合物对高特异性DNA或RNA的检测”的美国临时专 利申请的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。 [0004] 本发明包括其全部内容通过引用并入本文的一个序列表。 技术领域[0005] 本发明涉及核酸探针技术领域和特异性的鉴定以及定量DNA或 RNA序列的组合物和方法。本发明特别涉及基因扩增期间或扩增后靶向 基因的标记和检测。 背景技术[0006] 靶向多核苷酸序列的检测通常是基于使得标记DNA探针与感兴趣 的靶序列杂交的方法。为了有效地工作，该探针-靶杂交产物必须杂交后 进行洗涤以除去未结合的探针和被弱结合到非特异性靶的探针。然而， 在实时PCR(美国专利4,965,188；美国专利5,210,015；美国专利 5,487,972；美国专利5,538,848)的条件下，洗涤步骤是不可行的，因 此，必须设计出当它们被结合到匹配的靶上时选择性地生成信号或者当 它们未被结合并在溶液中自由漂浮时已减弱或淬火信号的新的探针。为 了达到这个目的，一直依赖于使用一个供体和受体分子间的荧光能量激 发和转移的探针，如两个荧光团之间或荧光团和淬灭剂([Didenko V，(2001)Biotechniques31：1106-1116，1118，1120-1121；Chen et al.， (1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA30：94：10756-10762)。供体的荧光发 射光谱应该与受体的吸收或激发光谱重叠。当它们很靠近(10至100埃) 时，所述荧光供体分子的激发态能量然后被转移到受体分子上。然而， 如果受体分子是荧光信号本身有荧光性的，它提供了一个较长波长的发 射信号。如果受体分子是一种有效的淬灭剂，荧光信号会明显地减少， 而且可以基本上关闭。 [0007] TAQMAN.RTM和分子信标探针都属于这种实时PCR检测的常用 探针。在这两种情况下，它们是作为内部探针，其用于与一对感兴趣的 靶区域侧翼的相对的引物相结合。引物扩增靶片段，探针选择性地结合 到引物位点之间的识别序列，由此导致相对于靶频率增加的荧光信号的 增加。虽然这些检测系统实际上是相似的，但它们采用不同的检测机 制。 [0008] 一种TAQMAN.RTM探针包含与靶序列互补的约20至30个碱基 的合成寡核苷酸，并且在相对的两端将其标记上荧光供体和受体(美国专 利5,538,848)。通常地，5′端具有更短波长的荧光团，例如荧光素，和 3′端标记有更长波长的发射荧光团(如TAMRA.RTM)或非荧光淬灭剂如 Black Hole Quencher.RTM。内部淬灭剂也被使用。而TAQMAN：RTM 专利已经过期，这项技术仍然是用于实时PCR的主要探针系统。 [0009] 分子信标探针也可以使用荧光相互作用来检测和量化PCR产物， 每个探针通常具有5′荧光标记端和3′淬灭剂标记端(美国专利5,925,517； Tyagi et al.，(1996)Nat.Biotechnology14：303-308)。然而，分子信标 探针进一步包括约5至7个互补的碱基的小片段，并在溶液中结合在一 起，形成茎-环结构，其中所述淬灭剂和荧光团标记端都被放在一起，且 信号被抑制。 [0010] SCORPlON.RTM探针还提供一种与分子信标相似的茎-环检测机 制，除了该探针还具有一个作为扩增引物(Whitcombe et al.，(1999)Nat. Biotechnol.17：804-807；US Pat.6,326,145)的附加片段之外。这些探针 使得茎-环结构保持在荧光团淬火的未杂交状态。当变性再次发生接着退 火时，所述探针片段结合到模板中，从而打开了茎-环结构并释放荧光。 [0011] 类似SCORPlON.RTM，SUNRISE.RTM探针包含在扩增期间连接 到被延伸的发夹探针的引物。这使得内部淬灭剂标记与5′末端的荧光团 分离(Nazarenko et al.，(1997)Nucl.Acids Res.25：2516-2521)。 [0012] 传统的双标记探针需要选择性的设计和高昂的成本。它们的合成是 困难的，而且需要手工合成后添加至少一种标记，以及高压液相色谱纯 化。TAQMAN.RTM和分子信标探针还需要探针侧翼的两个相对的引 物。要在退火步骤中有效地发挥作用，TAQMAN.RTM和分子信标探针 必须更长，并具有高于引物5到10℃的Tm(解链温度)，因为该探针在延 伸之前必须牢牢结合到靶上。这种要求使得很难设计或开发可以选择性 地检测SNPs(单核苷酸多态性)或单碱基突变的双标记探针，因此，假阳 性是一个常见的问题。 [0013] FISH(荧光原位杂交)技术要求四个处理步骤：1)标记探针的制备方 法，2)探针杂交以固定变性靶，3)未结合的探针的洗涤，和4)荧光激发 和检测(Barch M.J，，编辑“ACT细胞遗传学实验指南”第二版，纽 约：Raven出版社；1991)。小心的洗涤步骤是有效检测的关键因素，因 为信噪比高度依赖于洗涤的严格性。过度洗涤可大大降低信号。 [0014] 基因芯片检测与FISH检测类似。阵列通常根据与寡核苷酸cDNA 探针结合的印刷玻璃或硅基板；应用一定是被杂交到探针的荧光标记的 DNA或RNA靶；严格地洗涤阵列；然后检测结合的靶，通常是通过激 光扫描(Schena et al.，(1995)Science270：467-470；Heller et al.，(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94：2150-2155)。像FISH探针，其洗涤步 骤同样复杂和费时。然而，靶的制备和标记是昂贵的，因为每个靶样是 唯一的，限制了其在常规的基于微阵列中的测定，特别是在临床诊断中 的用途。 [0015] 发明概述 [0016] 本发明包括一种适合于DNA或RNA序列的实时和终点检测的探针 系统，尤其是可以区分单碱基变异如SNP和点突变的探针。本发明特别 是涉及提供适合于定量PCR(实时PCR)的探针，其中小的基因片段被指 数扩增和定量检测。本发明提供了在结构上和功能上相关的一系列探针 系统，但在特异性或敏感性的相应等级方面有偏差，并且其可以被组合 在一起以提供新的诊断或量化功能。 [0017] 本发明的一个主要方面是一种包含有能够一起反应的两个标记的寡 核苷酸、一个探针和一个反义探针的探针：反义探针系统。该探针序列与 预定的靶序列是互补的，并且该反义探针序列与该探针是互补的，除了 在非末端位置包含的至少一个不匹配碱基以外。该反义探针被设计用于 提供该探针的一种错误检测机制。在一些实施例中，该探针通常标记有 荧光发射器，该反义探针通常标记有荧光调制器，例如淬灭剂，虽然这 样的标记可以翻转，其它部件如第二荧光团，可以作为荧光调制器。在 这样的实施例中，当探针和反义探针结合在一起时，相互作用的标记基 团是最近的，信号被减弱，但是，当该探针结合到互补的靶上时，荧光 信号被释放。 [0018] 所述探针：反义探针系统可以被配置，以识别只相差一个碱基的两个 靶序列。因此，探针和反义探针序列被设计为用于实现溶液中三个独立 的杂交亲和水平：(i)该探针与预定的靶之间的第一高亲和水平，(ii)该探针 和该反义探针之间的第二中间亲和水平，其中该反义探针是由设于该反 义探针内不匹配的类型和位置所确定(iii)该探针与相差至少一个碱基的不 正确的靶之间的第三低亲和水平。预期的杂交亲和水平是通过计算预期 的双链的Tm和ΔG进行评估。组分的长度、序列和不匹配位置被设计 和配置，使得所述探针：预定的靶双链的杂交亲和力比探针的亲和力比所 述探针：反义探针双链的杂交亲和力高约4℃或更多的Tm值或约2千卡/ 摩尔或更多的ΔG值，并且使得所述探针：反义探针双链的杂交亲和力比 所述探针：不正确的靶双链的杂交亲和力高约4℃或更多的Tm值或约2 千卡/摩尔或更多的ΔG值。然而，所述探针：预定的靶双链和所述探针： 不正确的靶双链之间的固有热力学差异是有限的，探针也可通过故意不 匹配进行修饰，并方便地放置在与预期的单碱基变异相差约2个碱基的 位置。此探针修饰削弱了探针和不正确的靶之间的杂交亲和性，这是由 于探针不匹配接近序列不匹配，不正确的靶上的SNP或感兴趣的单碱基 突变。有了这些不同的热力学设计，探针：反义探针系统可以实现单碱基 变异的识别，并能保持这种识别在杂交条件和退火温度的一定范围内-尤 其是当用于实时PCR时。 [0019] 所述探针：反义探针系统进一步包括，其中所述探针被设计成作为一 个引物-探针组合物备用，它取代了一个引物，或其中所述探针与两个侧 翼引物一起使用可作为内部的探针。本发明还包括修饰探针：反义探针组 合物，其中所述反义探针在结构上与一个引物连接，而这种变化通过实 时PCR产生随S状弯曲扩增曲线变化的直线。 [0020] 本发明的其他实施例提供了修饰的探针：反义探针组合物，用于检测 通过等温方法(包括扩增阵列基板的方法)扩增的基因片段。本发明还描述 了两种或多种探针结合在一起的方法，以同时检测不同的靶位点，或为 了分别检测同一靶的两个方面。最后，本发明包含一种与未标记的阻断 探针相结合的探针：反义探针系统，以提高稀有序列变异(例如，嵌入在正 常组织中突变的癌细胞)的扩增和检测。 [0022] 图1A示意性地例示了总的DDS探针结构和机制。 [0023] 图1B示意性地例示了根据本发明的内部DDS(iDDS)系统。 [0024] 图1C示意性地例示了终止ZIPR DDS系统。 [0025] 图2A示意性地例示了FLIP DDS系统。 [0026] 图2B示意性地例示了ZIPR DDS：iDDS这两种探针系统量化一种 特殊变异的总扩增及其比例。 [0027] 图2C示意性地例示了G-Force DDS：iDDS这两种探针系统量化一 种特殊变异的总扩增及其比例。 [0028] 图3A示意性地例示了本发明的两步“野生终止子”(“WTx”)系统。 [0029] 图3B示意性地例示了本发明的一步“野生终止子”(“WTx”)系 统。 [0030] 图4A示意性地例示了终止子DDS探针与ISAM等温扩增相结合。 [0031] 图4B示意性地例示了内部DDS探针与ISAM等温扩增相结合。 [0032] 图4C示意性地例示了芯片上ISAM扩增的DDS探针。 [0033] 图5例示了交替的标记结构，以改善采用DDS探针：反义探针系统： (左侧)其中该探针具有一个荧光发射器和一个荧光调制器，该反义探针具 有一个荧光调制器，(中间)其中该探针具有一个荧光发射器和一个荧光调 制器，该反义探针具有一个荧光发射器和一个荧光调制器，以及(右侧) 其中该探针具有二个荧光发射器，该反义探针具有二个荧光调制器。 [0034] 图6例示了根据本发明的用于VKORC1(维生素K环氧化物还原酶 基因)的野生型SNP变异的检测的iDDS探针：反义探针系统。由于定量 PCR每个周期从变性的95℃下降至退火/检测的约52-62℃，探针先结 合到匹配的靶(顶部)，这是由于SNP位点(粗体G)的正确匹配，因此产 生较高的热力学亲和力(由ΔG和Tm测得)。如果没有匹配的靶是可用 的，该探针将在较低的ΔG和Tm(中间)下随后结合到反义探针，这是由 于设计的反义探针不匹配使得Tm下降约5-6℃和ΔG下降约2-2.5千卡/ 摩尔。在这种情况下和大多数情况下，所述探针和所述具有非匹配的 SNP(粗体A)的第二靶之间的热力学亲和力明显比探针和反义探针之间 的亲和力低约5-6个℃的Tm值和2-2.5千卡/摩尔的ΔG值(底部)。因 此，探针：反义探针系统选择性地检测到正确的靶，并抑制或防止不正确 的靶的结合和检测。 [0035] 图7A例示了包括被扩增以检测L858R SNP位点的癌症标记的碱 基对位置2535至2616的EGFR基因的外显子21的区域。该突变模板 (顶部)及野生模板(下部)与可变的 858SNP位点(以粗体表示)及共用引物 序列(以粗体表示)一起显示。 [0036] 图7B例示了通过qPCR检测EGFR的突变的858R探针：反义探针 组分，其中所述探针和反义探针被设计为使用不匹配碱基。插入反义探 针(T-T)的不匹配使得相对于探针：突变靶双链的探针：反义探针双链的热力 学亲和力降低。设计为探针(C-C)的辅助不匹配预计为具有与辅助不匹配 相差两个碱基的858L SNP变异体的野生靶。当突变探针遇到这样一个 靶时，3碱基“杂交泡沫”如图所示(CCG)发生，使得热力学亲和力下 降，并防止假靶的检测。采用有效的设计，这些热力学相互作用导致三 种不同的杂交水平，彼此具有约5-6℃的Tm差异和约2-2.5千卡/摩尔的 ΔG差异。因此，当在qPCR的退火步骤中温度下降时，该突变探针与 突变靶序列优先杂交，如果存在的话，这是由于如图所示(顶部)的双链的 较高Tm和ΔG。探针：反义探针双链的Tm和ΔG明显较低(中间)，但比 突变探针：野生靶双链(底部)的Tm和ΔG仍然高得多，这是由于以SNP 不匹配(G-A)和辅助不匹配(C-C)共同产生一个多碱基“杂交泡沫”。计 算的Tm和ΔG值被描绘于每个杂交水平和这些水平之间的差异的图 中，这是基于DINAMelt Web Server(run at58degrees)[N.R. Markham&M.Zuker.DINAMelt Web Server for Nucleic Acid Melting Prediction.Nucleic Acids Res.33，W577-W581，2005]的双态熔点(杂交) 分析程序。应当指出的是，这个系统的Tm水平相对高于其它通常使用 的Tm分析来源(例如，操纵子和IDT位点)。 [0037] 图8A显示了通过使用iDDS与特异于VKORC1的野生型SNP变 异与野生型(W)和突变(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的qPCR产生的 荧光信号的曲线图。 [0038] 图8B显示了通过使用iDDS与特异于VKORC1的SNP变异和野 生型(W)和突变(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的qPCR产生的荧光信 号的曲线图。 [0039] 图9显示了通过使用iDDS与特异于EGFR的突变858R SNP变异 与野生型(W)和突变(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的qPCR产生的荧 光信号的曲线图。 [0040] 图10A显示了通过使用iDDS与特异于大肠杆菌O157：H7的突变 SNP与野生型(W)和(两种浓度)突变(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的 qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0041] 图10B显示了通过使用TaqManMGB与特异于大肠杆菌O157：H7 的突变SNP与野生型(W)和突变(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的 qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0042] 图11A显示了通过使用特异于革兰氏阳性(P)和革兰氏阴性(N)细菌 的寡核苷酸iDDS与革兰氏阳性靶核苷酸序列的qPCR产生的荧光信号 的曲线图。 [0043] 图11B显示了通过使用特异于革兰氏阳性(P)和革兰氏阴性(N)细菌 的寡核苷酸iDDS与革兰氏阴性靶核苷酸序列的qPCR产生的荧光信号 的曲线图。 [0044] 图12显示了通过使用ZIPR DDS和特异于H3流感病毒基因靶核 苷酸序列的寡核苷酸探针的qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0045] 图13A显示了通过使用特异于与副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的同样靶区域相差一个单碱基的结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)的16S基因内的靶区域的FLIP DDS探 针，四个浓度的结核分枝杆菌的靶核苷酸序列和副结核分枝杆菌对照的 靶核苷酸序列的qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0046] 图13B显示了通过使用特异于与副结核分枝杆菌的同样靶区域相 差一个单碱基的结核分枝杆菌的16S基因内的靶区域的TaqMan探针， 四个浓度的结核分枝杆菌的靶核苷酸序列和副结核分枝杆菌对照的靶核 苷酸序列的qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0047] 图14显示了通过使用两步靶增强和特异于858R变异EGFR与 0.2％858R的靶核苷酸序列的混合样品和99.8％野生型变异靶核苷酸序 列的“野生终止子”阻断探针和iDDS探针的qPCR产生的荧光信号的 曲线图。 [0048] 图15显示了通过使用G-Force引物-探针与未在其引物的序列不同 的任何结核分枝杆菌野生(W)或突变(M)的模板的qPCR产生的荧光信号 的曲线图。 [0049] 图16A显示了通过使用特异于野生序列的无差别的G-Force探针 和iDDS探针，以及结核分枝杆菌突变(M)模板的qPCR产生的荧光信号 的曲线图。 [0050] 图16B显示了通过使用特异于野生序列的无差别的G-Force探针 和野生型特异性iDDS探针，以及不同量的与突变(M)的模板相对的结核 分枝杆菌野生(W)的qPCR产生的荧光信号的曲线图。 [0051] 图17显示了通过使用一步靶增强和特异于858R突变EGFR与 2％858R的靶核苷酸序列的混合样品和98％野生型变异靶核苷酸序列的 “野生终止子”阻断探针和iDDS探针的qPCR产生的荧光信号的曲线 图。 [0052] 图18显示了ZIPR和ISAM产生的荧光信号的曲线图。 [0053] 图19显示了iDDS和ISAM产生的荧光信号的曲线图。 [0054] 图20显示了ISAM芯片、Cy3标记点、FAM循环上的阵列检测的 数字图像。 [0055] 图21显示了EGFR缺失-19突变与野生仅iDDS探针及非特异 ZIPR探针的删除曲线图，其中所述曲线显示的是与100％的野生模板平 行的两个信号，以及平的iDDS信号与100％的突变模板。 [0056] 图22显示了EGFR缺失-19突变与野生仅iDDS探针及非特异 ZIPR探针的删除曲线图，其中所述曲线显示的是和下级的iDDS信号平 行的两个信号与50/50野生/突变模板，以及平的iDDS信号与100％的 突变模板。 [0057] 图23显示了EGFR缺失-19突变与野生仅iDDS探针及非特异 ZIPR探针和100％的突变模板和平的iDDS信号和100％的突变模板的 删除曲线图。 [0058] 图24显示了EGFR缺失-19突变测定中的检测方法。 [0059] 以下详细描述本发明的方法和系统的一些示例性实施例。根据以下 说明书、附图、实施例和权利要求的审查，其它特征、目的和本发明的 优点对本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。所有此类附加系 统、方法、特征和优点旨在被包括于本说明书与本发明的范围内，并且 由所附权利要求保护。 [0060] 发明详述 [0061] 在本发明详细介绍之前，应当理解的是，本发明并不限于所述的具 体实施例，当然，因此可能不同。也应当理解，此处所用的术语仅为了 描述特定实施例，并且不旨在进行限制，因为本公开内容的范围将仅由 所附的权利要求来限定。 [0062] 提供了值的范围，应当理解的是，每个中间值，到下限单位的十分 之一，除非上下文另有明确规定，该范围的上限和下限之间以及所述范 围的任何其它所述或插入的值，都包括在本发明之内。这些较小范围的 上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也包括在本发明的范围 内，但受到所述范围内的任何明确排除的界限的限制。当所述范围包括 一个或两个界限时，那些所包括的界限不包括其中一个或两个的范围也 包括在本发明之内。 [0063] 除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术语在本文中具有相 同的含义，通常被本发明所属领域的普通技术人员所理解。虽然类似或 等同于此处描述的任何方法和材料也可以在本发明的实践或测试中使 用，但现在介绍了优选的方法和材料。 [0064] 本说明书中引用的所有出版物和专利在此处通过引用的方式并入本 文，如同每个单独的出版物或专利具体地和单独地通过引用的方式并 入，以公开和介绍与引用的出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的 引用是其申请日之前的公开内容，不应被理解为，本发明无权凭借在先 公开而先于这些出版物。另外，出版物中提供的日期可能与需要单独确 认的实际公开日期不同。 [0065] 那些本领域的普通技术人员阅读本发明是显而易见的，此处描述和 示出的每一个单独实施例具有分立的构成和特点，在不背离本发明的范 围或精神下可以容易地与任何其它几个实施例分开或者结合。任何所列 举方法可以按所列举事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。 [0067] 但必须指出的是，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数 形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规 定。在说明书和权利要求书中，所提及的一些术语，应定义为具有以下 含义，除非有相反的意思表示。 [0068] 如此处所使用的，下列术语具有赋予它们的含义，除非另有规定。 在本发明中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美 国专利法赋予它们的含义，并且可以指“包括”、“包含”等；“基本 上由……组成”或“基本组成为”或类似的，当应用到由本发明所包括 的方法和组合物时，是指如同此处公开的那些组合物，但是其可以包含 其他结构基团，组合物组分或方法步骤(或如上面所讨论的类似物或其衍 生物)。然而，这些附加的结构基团，组合物组分或方法步骤等，相比于 那些相应的组合物或此处所公开的方法，实质上不影响该组合物或方法 的基础和新颖性(s)。“基本上由......组成”或“基本上组成为”或类似 的，当应用到由本发明所包括的方法和组合物时，具有美国专利法赋予 的含义，该术语是开放式的，允许其超过了所列举的存在，只要是所述 的基础或新颖性不被超过了所列举的存在改变了，但不包括现有技术的 实施例。 [0069] 在描述各种实施例之前，提供以下定义并应该被使用，除非另有说 明。 [0070] 定义 [0071] 此处所使用的术语和短语具有其本领域公认的含义，可以通过参考 本领域技术人员已知的标准教科书和期刊中找到。提供下列定义以阐明 它们在本发明的上下文中的特定用途。 [0072] 术语“互补”是指在寡核苷酸序列中足够数量的相匹配的碱基对与 被扩增或检测到的靶核酸序列发生特异性(杂交)的相互作用。在本领域 中，杂交的特异性和灵敏度需要非常高度的互补，虽然它不一定是 100％。 [0073] 术语“变性”是指互补的DNA链的伸展和分离，并可以通过热或 变性剂处理来完成。 [0074] 此处所使用的术语“可检测基团”是指间接或直接并入寡核苷酸的 标记分子(同位素或非同位素)，以促进检测。标记的寡核苷酸的合成可以 通过本领域技术人员已知的一些方法来实现。各种荧光分子适合于探针 标记。 [0075] 此处所使用的术语“可检测标记的”是指标记有荧光团或标记有诱 导出可通过眼睛或通过仪器观察或检测的物理或化学反应的其他分子种 类的寡核苷酸。此处所使用的，“标记”或“标签”是指一种分子，当 被所附加时，例如，但不限于，共价结合或杂交，至另一种分子，例 如，也没有限制，多核苷酸或多核苷酸片段提供或增强了检测其他分子 的手段。 [0076] 此处所使用的术语“DNA”是指以单链或双链的状态聚合的脱氧核 糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)，并且包括线性或环状 DNA分子。在讨论DNA分子时，序列仅可通过给出5′到3′方向的序列的 约定进行描述。 [0077] 术语“DNA扩增”和“扩增”是指任何方法，通过酶促扩增增加 一个特定的DNA序列的复制。通常使用的过程是聚合酶链反应(PCR)。 Mullis的PCR过程在美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。PCR 包括使用一种热稳定的DNA聚合酶、引物和加热循环，这能够使DNA 链分开，并指数扩增感兴趣的基因区域。任何类型的PCR，如定量 PCR、RT-PCR、热启动PCR、LAPCR、多重PCR、降落式PCR等，也 可使用。有利的是，实时PCR可使用。链式反应的延伸产物将是含有对 应于所使用的引物的末端的终端的不连续的核酸双链。 [0078] 此处所使用的术语“酶促扩增”或“扩增”是指DNA扩增。目前 最常用的方法是聚合酶链反应(PCR)。其它扩增方法包括LCR(连接酶链 式反应)、链置换扩增(SDA)；Qβ复制酶扩增(QβRA)；自我持续复制 (3SR)；以及NASBA(基于核酸序列的扩增)，其可以在RNA和DNA中 进行。 [0079] 此处所使用的术语“侧翼区”是指核苷酸序列的另一个区域即5′或 3′端的序列中核苷酸的一种延伸。 [0080] 此处所使用的术语“荧光团”是指其存在可以通过其发光特性检测 的任何报告基团。 [0081] 此处所使用的术语“荧光淬灭剂”或“淬灭剂”是指干扰或吸收由 附近的荧光团发出的荧光的分子。典型的淬灭剂包括，但不限于，无荧 光芳族分子的DABSYL或Black hole Quencher.RTM。淬灭剂也可以是第 二荧光分子，例如TAMRA(羧基四甲基罗丹明)，其在不同的波长发射。 [0082] 此处所使用的术语“杂交”是指两个核酸链结合的过程，以通过相 对的链之间的稳定氢键形成反平行双链。术语“杂交”和“结合”可互 换使用，并且是指两个多核苷酸片段的核苷酸序列之间的互补的A-T和 C-G碱基对的形成。杂交链被称为“双链”。 [0083] 此处所使用的术语“杂交特异性地”和“特异性杂交”和“选择性 杂交”是指严格条件下结合，形成双链，或核酸分子优先地与特定的核 苷酸序列进行杂交。 [0084] 此处所使用的术语“杂交亲和性”是指寡核苷酸补充和杂交到另一 核苷酸序列中的属性，以形成核酸双链。 [0085] 此处所使用的术语“固定至载体”是指寡核苷酸在特定的位置连接 到一个基片上，以便它可以经受洗涤或其它物理或化学处理，而不移 动。许多载体和固定化方法是本领域已知的，并且可以在本发明的方法 中使用。 [0086] 此处所使用的术语“锁核酸(LNA)”是指采用额外的桥连接2′氧和 4′碳的修饰核苷酸。桥将核糖“锁定”在3′-内切(North)的构象，这往往 是在A型双链中发现的。LNA核苷酸可并入寡核苷酸，以增加核酸双链 的稳定性。 [0087] 此处所使用的术语“解链温度”(Tm)是指杂交双链解杂交并返回到 它们的单链状态的温度。同样地，杂交不会在两链之间的温度高于所得 到的双链的解链温度下发生。有利的是，本发明的寡核苷酸片段双链中 的Tm的差异为约1℃至约10℃，以便容易检测。 [0088] 此处所使用的术语“不匹配碱基的位置”是指双链核酸中，两个相 对的核苷酸碱基以互补的方式不配对。例如，腺嘌呤将与胸腺嘧啶正确 地形成氢键，而胞嘧啶或胍将与腺嘌呤形成弱的或无氢键，由此造成不 匹配。或者，在一个双链的核酸中，不匹配碱基的位置可能是由于一个 相对的碱基中的互补对中一个碱基的添加或缺失，或者是由于含有非天 然碱基、无碱基位点或间隔子的相对的碱基的互补对中一个碱基的取 代。 [0089] 此处所使用的术语“经调制的检测信号”是指由强度减小或以其它 方式改变的标记基团发出的检测信号，例如，但不限于，波长的变化， 使得经调制的信号可检测地不同于未调制的信号。调制信号可以是，例 如，一个淬火信号，其中未调制信号的部分或全部能量被第二标记物所 吸收，使得调制后的信号比原来的信号强度低。或者，例如，第一标记 基团的第一信号可以是第二标记基团的刺激剂，以发射不同波长的信 号。 [0090] 此处所使用的术语“多碱非杂交区域”是指一个包括至少两个，优 选为三个或四个不匹配的相对碱基的双链核酸区域，从而形成一个非双 链碱基的“杂交泡沫”。 [0091] 此处所使用的术语“核苷酸”是指核酸的一个子单元(无论DNA或 RNA或其类似物)，其可以包括，但不限于，磷酸基、糖基、含氮基以及 这些子单元的类似物。术语“核苷酸”和“核苷”包括不仅含有天然存 在的嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌 呤(G)或尿嘧啶(U)的那些基团，而且要修饰或模拟本领域技术人员已知 的碱基。 [0092] 此处所使用的术语“寡核苷酸”是指包含PCR反应中使用的足够 数量的核苷酸碱基的一系列连接的核苷酸残基。短的寡核苷酸序列可以 是基于或由基因组或cDNA序列设计并用于扩增、确定，或揭示特定的 细胞或组织中相同、相似或互补的DNA或RNA的存在。寡核苷酸可以 被化学合成，并且可以被用作引物或探针。此处所使用的术语“寡核苷 酸”和“多核苷酸”也可以是指修饰或未修饰的RNA或DNA。 [0093] 术语“核酸”、“核酸序列”或“寡核苷酸”还包括多核苷酸。 “多核苷酸”是指一个核苷的3′-羟基基团和第二个核苷的5′-羟基基团之 间的磷酸二酯键连接的核苷酸直链，反过来通过第三核苷等的3′-羟基基 团连接到5′-羟基基团形成包含通过磷酸二酯骨架相连的核苷的聚合物。 “修饰的多核苷酸”是指多核苷酸，其中天然核苷酸已被经修饰的核苷 酸部分取代。 [0094] 术语“肽核酸(PNA)”是一个类似DNA或RNA的非天然存在的聚 合物，其中主链由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单位组 成。PNA/DNA链之间的结合比DNA/DNA链之间的强，因此，相比于 在10℃变性的类似的DNA/DNA双链，其6-碱基胸腺嘧啶的PNA/腺嘌 呤的DNA双链Tm(“解链”温度)为31℃。 [0095] 此处所使用的术语“聚合酶链反应”或“PCR”是指一种热循环 的、聚合酶介导的DNA扩增反应，其使用与模板分子、热稳定的DNA 聚合酶，以及脱氧核糖核苷酸互补的模板分子、寡核苷酸引物。而且它 涉及三个重复过程(变性、杂交和引物延伸)，它们在不同的温度和步骤下 进行。在许多实施例中，杂交和延伸过程可以同时进行。待分析的核苷 酸样品可以由美国专利6,569,672；6,569,627；6,562,298；6,556,940； 6,569,672；6,569,627；6,562,298；6,556,940；6,489,112；6,482,615；6,472,156； 6,413,766；6,387,621；6,300, 124；6,270,723；6,245,514；6,232,079；6,228,634； 6,218,193；6,210,882；6,197,520；6, 174,670；6,132,996；6,126,899；6,124,138； 6,074,868；6,036,923；5,985,651；5,958, 763；5,942,432；5,935,522；5,897,842； 5,882,918；5,840,573；5,795,784；5,795,547；5, 785,926；5,783,439；5,736,106； 5,720,923；5,720,406；5,675,700；5,616,301；5,576, 218和5,455,175中描述的 快速循环工艺提供的一种PCR扩增产物，它们的全部内容通过引用并入 本发明。扩增的其它方法包括，但不限于，NASBR、SDA、3SR、TSA 和滚环式复制。 [0096] 此处所使用的术语“聚合酶”是指将连续加入的单体单元催化为一 种聚合物链的酶。在本发明的有利实施例中，“聚合酶”将通过加入其 特性是由一个特定序列的互补模板确定的单体单元起作用。DNA聚合酶 如DNA聚合酶1和Taq聚合酶以模板依赖的方式添加脱氧核糖核苷酸到 多核苷酸链中的3′端，从而合成一个互补的核酸。聚合酶可能会延长引 物一次，或使用两个引物可以重复扩增两条互补链。 [0097] 此处所使用的术语“引物”是指与被扩增或复制的DNA片段互补 的寡核苷酸。通常引物用于PCR。一种引物与模板DNA杂交(或“退 火”)，并通过聚合酶作为复制/扩增过程的起点被使用。通过“互补”是 指该引物序列可与模板形成稳定的氢键复合物。 [0098] 此处的引物被选择为“基本上”互补于靶DNA序列的不同链，但 它们不必反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可连接到引 物的5′端，引物的其余部分与链是互补的。或者，非互补碱基可以穿插 入引物，只要与靶杂交有足够的互补性并引发延伸产物。 [0099] 此处所使用的术语“探针”是指可变长度的核酸序列的寡核苷酸， 适用于相同、相似或互补的核酸序列的杂交检测。用作检测探针的寡核 苷酸序列可以标记有可检测的基团。各种标记基团是本领域已知的，例 如放射性的、荧光性的、化学发光的或电化学发光的化合物。 [0100] 此处所使用的术语“探针：反义探针”是指具有几乎或恰好数目相同 的碱基位置的寡核苷酸对，并具有基本上互补的序列，使得在没有第三 核苷酸序列与反义探针或探针杂交时，所述寡核苷酸能够形成双链。探 针和寡核苷酸反义探针作为单独分子或连接为一个单一的分子实体区域 在本发明的范围内。 [0101] 此处所使用的术语“淬火”或“淬火的”或“猝灭”或“猝灭的” 是指减少由一个分子产生的信号。它包括，但不限于，降低产生的信号 至零或低于检测限。因此，一个给定的分子可以被另一个分子“猝 灭”，尽管该信号被大大降低，仍产生检测信号。 [0102] 术语“定量PCR”是指实时聚合酶链反应，也称为被用于扩增和 同时进行有针对性检测靶DNA分子的量的定量实时聚合酶链反应(Q- PCR/qPCR/qrt-PCR)。量可被表示为大量的复制或规范化为输入DNA的 相对量。检测不像标准的PCR随着反应实时进行，其中反应产物是在其 结束点进行检测。实时PCR中用于检测产品的两种常用方法有：(1)插入任 何双链DNA的非特异的荧光染料，和(2)标记有荧光受体的序列特异的寡 核苷酸和与互补的DNA靶杂交后的许可检测。 [0103] 此处所使用的术语“选择性地检测”是指本发明的寡核苷酸探针在 相同或相似的杂交条件下通过选择性地杂交到一个序列区分一个核苷酸 序列和另一个核苷酸序列的能力，并且当结合到一个序列而不是其它 时，以提供显示这种结合的检测信号。 [0104] 此处所使用的术语“间隔子”是指任何分子实体，例如，但不限 于，多碳间隔子、至少一个人造无碱基核苷酸、肽或可以被连接到寡核 苷酸端部或可将两个寡核苷酸连接在一起的任何其它无碱基延伸部分， 以提供阻止聚合酶在间隔子上前进的手段。 [0105] 此处所使用的术语“系统”是指至少两个寡核苷酸的组合进行协作 以选择性地杂交到靶核苷酸序列并产生指示所述靶序列存在的检测信 号。该系统还可以包括寡核苷酸引物，用于从模板核酸扩增为核苷酸序 列的聚合酶以形成扩增的扩增子，所述扩增子包含被怀疑为靶序列的核 苷酸序列。 [0106] 此处所使用的术语“靶”和“靶核苷酸序列”是指期望检测的寡核 苷酸。用于公开方法的靶分析物可能是一个分离的寡核苷酸，固定在载 体上或在自由溶液中的寡核苷酸。对于应用到本发明的方法，“靶”可 指来自植物、动物或人类个体、细菌、病毒或单细胞真核生物，或者是 来自整个生物体，及其组织，或者是来自培养细胞或细胞的任何核酸。 [0107] 此处所使用的术语“模板”是指与靶多核苷酸链，例如，但不限 于，未修饰的天然存在的DNA链，其中聚合酶用作识别哪些核苷酸应该 下一个合并到一个不断增长的链以聚合天然存在的链的互补链。模板可 以是单链或双链。在本发明要求聚合的重复循环的应用中，例如，聚合 酶链反应(PCR)，模板链本身可以经修饰的核苷酸的并入而修饰，但仍作 为聚合酶的模板来合成另外的多核苷酸。 [0108] 此处所使用的术语“终止子”是指寡核苷酸互补于位于扩增子中的 核苷酸序列，其中所述“终止子”探针具有耐外切酶的修饰的5′端和阻 断聚合酶活性的修饰的3′端。“终止子探针”的序列可以被选择或修 饰，使得“终止子”探针与其互补的核酸序列的杂交亲和性大于寡核苷 酸探针与靶核酸序列的杂交亲和性，等于寡核苷酸探针与互补的寡核苷 酸反义探针的杂交亲和性。 [0109] 此处所使用的术语“热循环反应”是指多步反应，其中至少两个步 骤是通过改变反应温度来实现。 [0110] 此处所使用的术语“热稳定的聚合酶”是指可以承受极高温度，例 如接近100℃的DNA或RNA聚合酶。耐热聚合酶的例子包括Taq、 Tth、Pfu、Vent和deep vent。 [0111] 除非另有定义，此处所使用的所有技术和科学术语具有分子生物学 的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然方法和类似或等 同于本文描述的材料可以用于本发明的实践中使用，合适的方法和材料 如本文所述。 [0112] 缩略语 [0113] DDS，DNA检测开关；iDDS，内部的DNA检测开关；EGFR，表 皮生长因子受体；qPCR，定量PCR(实时PCR)；LNA，锁核酸；PNA， 肽核酸；FISH，荧光原位杂交；Tm，熔融温度；ISAM，等温扩增法； SNP，单核苷酸多态性；ZNA，Zip核酸。 [0114] 说明书 [0115] 本发明的探针系统、组合物和方法提供了DNA或RNA靶序列的敏 感性和特异性检测，特别是评估通过实时PCR(定量PCR)扩增和检测的 PCR产物。本发明的几个实施例促进了区分细菌和病毒病原体，癌症和 遗传疾病的单碱基变异(单核苷酸多态性-SNPs)的识别力，其中包括抗药 性或药物敏感的变异或突变，使得采用普通的实时PCR探针系统或基于 杂交的基因芯片探针的检测落空。其他实施例促进了相同扩增子，如普 通的引物序列和可能是变异的内部SNP的两方面检测，以确定样品中这 样的变异序列的相对频率。 [0116] 根据本发明的探针：反义探针系统的一个特别有用的应用是特定的实 施例，其选择性增强了在不同于仅有一个不匹配碱基的靶的显著较大比 例存在的类似序列存在时特定靶序列的扩增和检测。例如，生物样品可 以来自患有癌症的人或动物患者，其中活检样品中的所有细胞由比癌细 胞更大的百分比的正常细胞组成。因此，提供对应于少数癌细胞的可检 测信号的同时避免正常细胞中的假阳性是很重要的。重要的是，在这种 情况下，癌细胞可通过单核苷酸多态性不同于正常细胞。因此，本发明 的系统有选择地从具有感兴趣的单个碱基变化(例如，与癌症相关的SNP 和不占主导地位的正常(野生型)序列的少数细胞)扩增和检测靶核苷酸序 列是有利的。本发明的系统中，例如，可以在约99.8％的非突变型靶类 中检测到含有单碱基突变的至少低至0.2％的靶类。 [0117] 本发明包括探针：反义探针组合物的实施例，此处称为DNA的检测 开关(DDS)探针，其中包括两个标记的寡核苷酸、一个寡核苷酸探针和一 个寡核苷酸反义探针，即序列互补且长度相同，并且，在与寡核苷酸探 针互补的靶核苷酸序列不存在时，相互作用以形成双链。寡核苷酸探针 包含与期望被检测到的靶序列互补的一个序列，并且还包括与其连接的 第一标记基团。本发明的系统的寡核苷酸反义探针包含互补于通常相同 长度的寡核苷酸探针的核苷酸序列，以及与其连接的第二标记基团。可 以设想，反义探针的核苷酸序列将包括至少一个与寡核苷酸探针的碱基 不匹配的碱基。还可以设想，虽然探针和反义探针的序列是互补的，也 具有相同的长度，但其它核苷酸序列可以连接至任一探针或反义探针， 在本发明的范围之内。这些连接的序列，当延伸至长度相同的探针或反 义探针时，本身不杂交并与探针或反义探针相互作用，但优选地被选择 为互补，例如，不同于寡核苷酸探针的靶序列的扩增子区域。 [0118] 本发明的系统将表现为：(i)已调信号状态，当该寡核苷酸探针结合到 反义探针和其相互作用的标记部分被带到一起时，或(ii)可检测地区分的 信号状态，当寡核苷酸探针结合至靶核苷酸序列且标记部分是分开的 时。 [0119] 在本发明的探针：反义探针系统的各种实施例中，特别是当系统在实 时PCR分析中使用时，寡核苷酸探针将具有5′端的一个第一标记基团， 其中，所述标记基团可以是，例如，一个荧光体(荧光团)，以及相对的3′ 端被阻断以防止通过5′-3′聚合酶延伸的寡核苷酸。在这些实施例中，反 义探针可以连接到3′端，第二标记基团是一个荧光猝灭化合物。相应 地，如图1、2、5-7的例子所示，在这些实施例中，当寡核苷酸探针和寡 核苷酸反义探针相联系时，形成双链核酸，所述第一标记基团，即，荧 光团，所述第二标记基团，即荧光猝灭化合物，被带入靠近，随后从所 述荧光团的荧光发射被调制，从而减少或消除任何可检测的荧光。如果 探针优先结合于靶核苷酸序列而不是寡核苷酸反义探针，荧光猝灭化合 物和所述荧光团在空间上是分离的，荧光发射不再被猝灭，并且是可检 测的，因此，这表明靶核苷酸序列的存在。 [0120] 在匹配靶序列的情况下，寡核苷酸探针更加牢固地结合到靶序列而 不是反义探针序列，引发检测信号，并且在一个不正确且不匹配的靶的 情况下，探针将更加牢固地结合到反义探针，从而抑制或防止探针：不匹 配的靶双链形成和检测，即使当杂交温度是未达最佳标准的。探针序列 可以任选地包括被定位在与期望被检测到的有针对性的变异碱基的位置 相差约2个碱基的碱基不匹配的辅助者，这样如果不同的碱基位点不会 与寡核苷酸探针中的相应碱基匹配，形成“杂交气泡”，如图7B所示， 以提高单碱基的识别力，任何未标记的3′端被任选地阻断，以防止聚合 酶延伸。 [0121] 在本发明系统的其它实施例中，所述寡核苷酸探针的第一标记基团 可以是荧光猝灭化合物，并且寡核苷酸反义探针的第二标记基团可以是 荧光团。进一步预期地，第一标记基团可以是在刺激时发射具有第一波 长的荧光的第一荧光团。探针和寡核苷酸反义探针很近，是由于其彼此 杂交，第一标记基团发射的荧光可以作为第二标记基团同样为荧光团(即 基于荧光共振能量转移的系统)的受激辐射。受激的第二标记基团，然后 可以比所述第一荧光在更长的波长发射荧光。因此，(i)探针和反义探针 结合时可检测的荧光波长和(ii)随着寡核苷酸与靶核苷酸序列复合，仅当 探针与反义探针解离时可检测的探针标记基团的荧光波长之间是有差异 的。 [0122] 适当选择用于感兴趣的特定靶的探针：反义探针系统的长度和序列， 该系统包括热力学上有利的两个结合和检测状态中的一种固有误差检查 的机制。当靶核苷酸序列存在相匹配的寡核苷酸探针序列时，状态一出 现，其中寡核苷酸探针优先地与互补的靶序列而不是寡核苷酸反义探针 结合，从而触发阳性检测。当没有靶，或者含有寡核苷酸探针序列的具 有至少一个碱基不匹配的靶存在时，状态二出现，使得寡核苷酸探针优 先与寡核苷酸反义探针结合，从而阻断或防止不匹配靶的检测，即使在 不理想的杂交或PCR退火温度下。根据本发明的这种探针：反义探针系统 的示例已在约52℃至约62℃之间的qPCR退火温度下达到单碱基分辨， 如图所示，例如图6-11。 [0123] 另外还发现，这种分辨被保持，即使当相同的测定在低得多的退火 温度(即低于50℃)下运行时。该反义探针结合和阻断机制，因此，提供 了一个独特的多温机制，以防止或减少获得假阳性结果的可能性。出现 这种性能，是因为探针、反义探针和靶序列之间竞争结合的差异产生三 种结合水平：1)基于探针和一个完全匹配的靶之间的高度互补性结合的第 一高水平；2)基于由反义探针内设计的至少一个不匹配碱基的位置之间 造成的探针和反义探针之间的弱结合的第二中间水平；和3)基于通常发 生在探针和一个不匹配的靶(图6)之间的大大减少的热力学结合的第三低 水平。本发明的系统，因此，包括一个探针，其首先结合到一个完全匹 配的靶如果这样的靶是存在的，并且是其次结合到反义探针如果没有正 确的靶存在。探针结合到一个不正确的靶，因此，被有效地避免或阻 止。 [0124] 当两个潜在的靶核苷酸序列不会有两个或更多个碱基的差异时，这 种差异会造成寡核苷酸探针和正确的(匹配的)的靶序列之间热力学结合相 对于寡核苷酸探针和不正确的(即不匹配)的靶序列之间的很大差异。在这 种情况下，几乎插入反义探针的任何不匹配将导致探针与反义探针的结 合是(a)探针与匹配的靶结合及(b)探针与不匹配的靶结合之间的热力学中 间物。 [0125] 然而，当靶是区别靶和另一个类似的序列之间的单碱基差异时，热 力学分析表明预期的变异将不会产生显著的热力学移动，通过包括寡核 苷酸探针序列的辅助不匹配进一步修饰探针：反义探针系统可能是必要 的，该寡核苷酸探针序列通常在期望被检测到的单碱基变异位点的两个 碱基之内，使得探针与非匹配靶的结合打开一个强调热力学差异(图7B) 的多碱基“杂交泡沫”。探针的修饰可以增加单个碱基的识别力，其中 感兴趣的不匹配的碱基变异体对TM或ΔG的影响有限。有时不匹配的 碱基变异体的Tm仅仅下降约5℃或更低，且ΔG也可能下降仅2千卡/摩 尔或更少。然而，当一个辅助不匹配被引入时，相对于所述探针和所期 望的靶之间的Tm和ΔG特性的结合，Tm可下降至少约10℃-15℃和/ 或至少约4～5千卡/摩尔对于ΔG。 [0126] 已经发现，单个碱基分辨是可以被预料的，如果：(i)含有探针的反义 探针不匹配被放置在相比于探针与匹配的靶结合Tm至少下降约5℃和/ 或ΔG至少下降2千卡/摩尔的位置，以及(ii)非匹配单个碱基突变或变 异，相比于探针与反义探针的结合进一步降低探针与不匹配的靶结合为 至少约5℃或更多的Tm，或至少约2千卡/摩尔或更多的ΔG。这些热力 学参数通常是通过选择位于该寡核苷酸探针各端的第二碱基和中央的2 个或3个碱基之间的一个不匹配位点以及通过在另外包括A、T或C的位 置插入一个不匹配碱基实现的，其中T碱基通常是插入到A位点，A碱 基通常是插入到T位点，或T碱基插入到C位点(形成弱G-T不匹配)。 当根据本发明的系统在扩增过程(如实时PCR)中被用作侧翼引物之间的内 部探针时，探针或反义探针的任何未修饰的3′端还应当被阻止，以防止 聚合酶延伸。 [0127] 本发明还包括用于制作单碱基识别的探针：反义探针系统的组合物的 方法实施例，所述方法包括以下步骤：(a)获得(i)一个互补于预定的靶核苷 酸序列的寡核苷酸探针，及(ii)一个与寡核苷酸探针具有相同数量的核苷 酸位置的寡核苷酸反义探针，和互补于探针的一个序列，除了至少一个 不匹配或缺失的碱基位置以外，并且其中所述探针和反义探针分别具有 与其连接的标记基团，该标记基团被选定为当探针结合到反义探针时， 以提供经调制的，即阴性的或减少的信号状态，并且当探针结合到靶核 苷酸序列时提供了一种指示探针：靶双链形成的信号状态；(b)通过热力学 分析确定探针、反义探针和靶序列之间的杂交结合力；(c)测量探针序列 与期望的靶序列，探针序列和反义探针序列，以及探针序列和不匹配的 靶序列之间的结合力，其中结合力被定义为ΔG和/或Tm；(d)确定该探针 与反义探针的结合力是否低于探针与匹配靶的结合力，其中至少约2千 卡/摩尔的ΔG水平和/或至少约5℃的Tm水平的差异，表明该探针将优 先结合到匹配的靶序列而不是反义探针；(e)确定探针与非匹配的靶的结 合力是否低于探针与反义探针的结合力，其中至少约2千卡/摩尔的ΔG 水平和/或至少约5℃的Tm水平的差异，表明该探针将优先结合到反义 探针而不是非匹配的靶；(f)确定探针和匹配的靶之间的结合力相对于探 针和反义探针相对于探针和非匹配靶是否存在差异，包括热力学结合的 递减水平，从而使探针结合到一个正确的靶，如果有的话，其次结合到 反义探针，由此探针结合到一个不正确的非匹配靶会被避免或防止；(g) 任选在反义探针的一个或多个碱基位置对其进行修饰，以增加或减少寡 核苷酸探针和反义探针之间的结合力；(h)任选在探针的一个或多个碱基 位置以及对应于所述靶序列的单碱基多态性的两个碱基位置中的一个碱 基位置对其进行修饰，从而提供一个“杂交泡沫”，当探针杂交到具有 SNP变异的靶序列的区域时，由此降低的寡核苷酸探针和不匹配的靶的 结合力；(i)通过使用互补于具有靶而不是SNP的寡核苷酸探针的靶序列 测试的探针：反义探针组合物进行评估；及(j)重复步骤(c)-(i)中，由此得到 一种从具有至少一种核苷酸差异的类似序列中鉴定靶核苷酸序列的探针： 反义探针系统。 [0128] 本发明的探针：反义探针系统的实施例可包括通过增加探针(通过增 加互补结合具有其对应的靶序列)的特异性的一个或多个成分修饰的寡核 苷酸探针或反义探针，例如，但不限于核苷酸，而不是腺苷、胞嘧啶、 鸟嘌呤和胸腺嘧啶，多个非天然核苷酸，包括但不限于，LNA(锁核酸)或 PNA(肽核酸)或BNA(桥接核酸)，或结构上修饰的MGB(小沟结合物)， ZNA(Zip核酸)等。 [0129] 探针的单个碱基的识别力，其中感兴趣的不匹配的碱基变异体对 Tm或ΔG的影响有限。有时不匹配修饰可以增加的碱基变异体的Tm仅 仅下降约5℃或更低，且ΔG也可能下降仅2千卡/摩尔或更少。然而， 当一个辅助不匹配碱基和“杂交泡沫”被引入时，相对于所述探针和所 期望的靶之间的Tm和ΔG特性的结合，Tm可下降至少约10℃-15℃和 /或至少约4～5千卡/摩尔对于ΔG。 [0130] 本发明的探针：反义探针系统可进一步包括选自天然非互补碱基、通 用碱基、人工碱基、额外的非匹配碱基、缺失碱基、无碱基位点、间隔 子、连接基团或能够减少寡核苷酸探针和寡核苷酸反义探针之间或寡核 苷酸探针与所期望的靶序列之间的互补结合的任何结构方式的探针或反 义探针中不匹配碱基的位置。 [0131] 为了增强信号或淬火，探针：反义探针系统的实施例还可以包括两端 被标记的寡核苷酸探针和/或寡核苷酸反义探针，其中，探针可包含荧光 发射器和荧光调制器，和反义探针可以包括荧光调制器和任选的荧光发 射器，或者，探针可以包括两个荧光发射器，和反义探针可以包括两个 荧光调制器。如果寡核苷酸探针包含3′荧光发射器，该端部可任选地采 用寡核苷酸探针和3′荧光团之间的间隔子域进行修饰。 [0132] 本发明的实施例还包括将探针：反义探针系统并入实时PCR检测的 系统。这些实施例包括，但不一定限于： [0133] 1.iDDS探针：用于qPCR如图1B所示，其中，所述寡核苷酸探针 被选择为位于二侧翼的PCR引物之间且与靶序列互补的；并且其中所述 寡核苷酸探针或反义探针的任何未标记的3′端被封闭以防止聚合酶从此 延伸。iDDS探针特别适合于在不同于单核苷酸多态性(SNP)的期望序列 的相关序列存在时检测期望的靶核苷酸序列。 [0134] 2.探针：反义探针组合物还可以包含标记的探针和其末端连接到包 含一种分子的反义探针组分，其中所述反义探针组分包括一个序列，该 序列是缺乏互补结合到探针组分，相比于探针对靶核苷酸序列的亲和 力。 [0135] 3.ZIPR探针：对于如图1C所示的定量PCR的使用，标记的探针， 被称为“ZIPR探针”，包括含有引物序列的寡核苷酸探针，由此允许 PCR扩增产物末端的靶段而不是位于PCR引物位点之间的内部序列的扩 增和同时检测，其中，所述寡核苷酸ZIPR探针的3′端没有被阻断，以防 止聚合酶延伸。配对的寡核苷酸反义探针也有助于减少假靶检测。两个 这样的引物-探针可在待扩增的靶的相对端被使用，其中它们可以包括相 同的标记，以提供双重的信号。或者，他们可以被各自不同标记，以提 供两种颜色的信号。 [0136] 4.FLIP探针：对于扩增靶的高特异性实时检测或终点检测，如图2A 所示，探针：反义探针系统的反义探针组分可以包括通过无碱基连接基 团，如间隔子连接到寡核苷酸引物的5′端的标记片段。该探针：反义探针 结构的这种修饰会改变引物的动力学，使得检测信号呈现出线性扩增曲 线和正常S形的扩增曲线，以便检测与样品的定量评估通过在扩增过程 中的实时监控能够准确地在终点获得，如图所示，例如，在图13A中。 探针和反义探针的序列也可以是完全互补的，没有不匹配，除了将探针 制作得比反义探针序列略长一个或多个碱基。该探针：反义探针组合物产 生的线性扩增曲线可与LATE PCR产生的线性曲线相提并论。在LATE- PCR中，然而，线性扩增是通过提供不相等的浓度的引物与一种导致不 对称扩增(Sanchez et al.(2004)101：1933-1938；Wangh et al.US Pat.NO.： 7,632,642)的量的严重限制的引物。 [0137] 5.G-Force探针：对于在实时PCR中的使用，如图2C所示，是一个 引物-寡核苷酸探针，此处称为“G-Force”探针，具有三个片段：标记的 探针片段，可以与探针片段一起折叠的反义探针片段，3′端的靶特异性引 物片段。该探针片段是5′荧光团标记的，并包括约6至约9个碱基的富C 序列。该反义探针片段是富G且与富C片段互补，并包括约6至约10个 碱基。当这些段折叠和杂交在一起时，由于它们的互补序列，反义探针 片段中的鸟嘌呤作为猝灭剂，以吸收探针的荧光发射。探针和反义探针 片段由无碱基连接基团，例如间隔子连接，以方便这些片段折叠和结合 在一起，并且可以防止探针片段的复制，当引物-探针结合到扩增子时。 无碱基连接基团可以通过一个或多个A或T碱基分开，以方便折叠及探 针与反义探针的结合。 [0138] 这种G-Force探针：反义探针系统具有两个结构和信号状态：(i)当该引 物-探针不与另一个杂交核酸结合时，折叠结构和信号状态出现，其中富 胞嘧啶核苷片段折叠并结合到富含鸟嘌呤片段，使得荧光发光标记紧接 着荧光吸收的鸟嘌呤，及(ii)当该引物-探针结合到扩增的靶时，第二结构 和信令状态出现，于是信号单元被展开和荧光发射被释放。然而，第一 个扩增循环后，靶模板被永久地加入互补于富含鸟嘌呤反义探针片段的 序列，从而方便了随后的扩增循环中的探针结合和信号。因此，扩增的 靶被标记，并采用一荧光团每扩增子定量检测。具有相同或不同标记的 类似的引物-探针可用于扩增子的另一端，以提供双重信号或两种颜色的 信号。 [0139] 在本系统的一个优选实施例中，G-Force的引物探针具有组成为 FAM-CCCCTCCA-间隔子18-AGGAGGGGG并加上3′引物的5′-3′探针：反 义探针结构。由于反义探针段上的额外G，当富C探针片段结合到富G 反义探针段上时，荧光团将在至少两个G碱基的附近。或者，所述探针 可以具有包含探针区段的5’端附近的约两个或多个C和反义探针区段的 3′端附近的约两个或多个G的互补序列。 [0140] 6.双DDS探针：可以设想，根据本发明的两个DDS探针系统可以同 时被用来检测相同的扩增靶的不同部分，示意性图见图2B和2C。这种 系统可以包括标记的引物-探针，例如但不限于，ZIPR探针、G-Force探 针、FLIP探针等，以检测和定量扩增靶，并结合被不同地标记的内部 iDDS探针，以检测和定量具有特定的内部序列，如SNP变异的那些扩增 靶。 [0141] 还可以预期的是，本发明的实施例可包含根据本发明的多个探针：反 义探针系统，能够选择性地检测多个靶序列，其中相对于第二探针的阴 性或弱信号的第一探针的阳性信号证实了包含第一靶序列的变异或突变 序列的存在。 [0142] 一种用于本实施例中的合适的内部探针可包含iDDS探针：反义探针 系统。一个有用的，但不是限制性的，引物-探针可以是G-Force引物-探 针，其中该引物-探针量化扩增的靶，并且该内部探针：反义探针组合物量 化特定的内部靶序列的频率。两种探针的使用允许感兴趣的变异序列的 相对频率的测量。在实时PCR中，引物-探针可以显示出陡升曲线，内部 探针显示出具有较低的角度与突变或变异体的频率成比例的曲线，如图 所示，例如，在图16A和16B中。 [0143] 分子诊断的一个共同问题是所有可能对基因产物或基因表达的结构 和功能有类似影响的不同的且密切相关的小突变的发生。例如，肺癌的 诊断和治疗可以通过在EGFR基因和或KRAS基因的几个突变的生物标 记的分析来确定。然而，在一些重要的疾病特异性突变可以包括一个单 碱基置换，如EGFR外显子21突变L858R2573T＞G，其它癌症生物标记 是多变的，尽管它们被被限制在一个小的序列区域内。临床上，知道哪 些特定缺失或碱基替换不是那么重要，因为一系列这样的突变中的任何 一个的临床结果实际上是相同的。而测序可以执行以确定是否任何这样 的密切相关的突变存在，测序不是有效的，当突变频率小于约10％时。 克服这个问题的方法之一是采用针对同样模板的两个探针，一个检测野 生序列是否存在，另一个为非特异性的，并检测任何野生或突变序列， 由此信号的差异可以指示突变的存在，而不是指定哪种突变是存在的。 这两种探针的方案可以与iDDS探针或特异于检测同一靶区域内的任何变 异的野生型非特异性引物-探针的引物-探针一起应用。 [0144] 7.iDDS和终止子探针：本发明的另一个方面是，探针：反义探针系统 可以适当地用于适合实时PCR或其它扩增检测方法的两个探针靶增强系 统，以选择性地扩增和检测与密切相关的第二靶核苷酸序列相差一个或 多个碱基的第一靶核苷酸序列。一般而言，所述第一靶序列是感兴趣的 突变和所述第二靶序列可以是野生型(“正常”)序列。这两种探针系统包 括第一标记的内部探针：反义探针系统诸如iDDS探针和第二非标记的内 部“终止子”探针(称为“野生终止子”如果特异于野生型核苷酸序列变 异)，其具有的PCR聚合酶阻断功能，如图3A和3B所示。 [0145] 第一探针包括第一靶序列或其互补，并具有只与第一个靶序列但不 是第二靶序列匹配的至少一个碱基位置。终止子探针包含第二靶序列或 其互补，并且包括存在于所述第二靶序列而不是第一靶序列中的至少一 个碱基位置。终止子探针在5′端被进一步修饰，以抑制或防止其5′核酸 酶的消化，以及在3′端被修饰，以抑制或防止3′聚合酶从此处延伸。 [0146] 终止子探针的长度和/或位置可以被选择，使得所述终止子探针和所 述第二靶序列的亲合性大于所述第一探针和所述第一靶序列的亲合性。 优选地，用于第二靶核苷酸序列的所述第一探针和所述终止子探针的亲 合性亲和力可能会有至少约6℃的Tm差异和/或至少约4千卡/摩尔或更 多的ΔG差异。另外，终止子探针可任选地被改性，以通过使用一个或 多个人工核苷酸如LNA，化学修饰物如ZNA或MGB探针，或其组合进 一步增强结合其匹配靶序列。 [0147] 因为两个探针之间的热力学差异，终止子探针能够强力结合第二靶 序列，并会抑制或阻止所述第二靶序列的扩增。它也将抑制或阻止所述 第一探针与第二靶序列的结合。因此，该系统将选择性扩增和/或检测所 述第一靶序列，从而提供用于检测稀有或低频率的突变或变异体如在癌 症诊断、药物抗性或产前遗传筛查中的靶增强系统。 [0148] 终止子探针可在其5′端通过连接一个分子如生物素、ZNA、MGB、 BHQ等，并入2′-O-甲基RNA碱基，连接一段随机选择的非互补碱基被 修饰。终止子探针可以在其3′端通过连接一个阻断分子(例如，磷酸盐、 间隔子、氨基等)，或一系列随机选择的非互补碱基被修饰。 [0149] 因此，本发明的两个探针靶增强系统可用于选择性地扩增和检测与 第二靶序列相差一个或多个碱基的第一靶序列的方法，虽然所述第二靶 序列的量显著地大于所述第一靶序列时。此方法的实施例，因此，可以 包括以下步骤：(a)获得检测探针：反义探针系统，未标记的终止子探针，和 一对侧翼引物；其中：所述检测探针：反义探针系统包括一个标记的探针： 反义探针系统，其中所述标记的探针包含第一靶核苷酸序列或其互补； 终止子探针，其特征为：(i)包括所述第二靶核苷酸序列或其互补，其中， 所述第二靶序列的终止子探针的结合亲和力大于所述第一靶序列的标记 探针的结合亲和力，(ii)具有5′端修饰以抑制或防止5′核酸酶消化，(iii)具 有3′端修饰以抑制或阻止3′聚合酶延伸，以及(iv)具有大于所述标记探针 的长度，并任选地包括内部或末端修饰，以提高如LNA或BNA、ZNA 或MGB的结合；(b)获得疑似包含所述第一或第二靶序列，或其混合物 的生物样品；(c)预扩增所述第一靶序列，同时阻止所述第二靶序列与终 止子探针的扩增；其中，该步骤任选地包括在在约48℃至约57℃低温退 火的约30至约75个PCR循环，并且其中每个变性、退火或延伸步骤被 限制到约5秒或更少；(d)预扩增样品的小份或稀释的小份与一对侧翼引 物及探针：反义探针系统的结合，所述小份为扩增反应的约5％或更少， 并且稀释的小份为至少约1∶100，并且通常在1∶300至约1∶1000的范围 内；以及(e)通过实时PCR或其它手段扩增和检测第一靶序列的存在。 [0150] 本发明的两个探针靶增强系统提供怀疑含有低频率的第一靶序列 (通常，但不限于，所感兴趣的突变序列)与相当高频率的第二靶序列(例 如，但不限于野生型序列)的混合物的样品的实时PCR分析。因为这两个 靶模板被相同的引物扩增，PCR反应组分(引物、酶等)将被更丰富的模板 耗尽，在某种程度上第一靶序列的扩增和检测将被抑制或防止。已经发 现，例如，对约2％到约0.002％的含量范围内的低频率突变进行有效地 检测。此外，可以设想，该方法将用于筛选血液或远离来源的其它组织 中的低频率突变或变异。 [0151] 该方法可通过提供上述步骤(e)中针对所述第二靶序列的另一个探针： 反义探针组合物进行进一步改进，以证实所述第二靶序列的抑制或阻 断。这个改进的方法可产生两种扩增曲线：第一曲线，表明所述第一靶序 列(通常是阳性和表示感兴趣的突变)增强的存在，而第二曲线，表明所述 第二靶序列的减少的存在(通常为阴性和表示感兴趣的野生或正常序列)。 [0152] 8.DDS的引物-探针和终止子探针：本发明的两个探针靶增强系统可 通过采用可以非特异性地扩增和检测终止子探针靶向的至少一部分序列 区域的引物-探针组合物替换PCR引物进行进一步修饰。为了达到这个目 的，引物-探针包括优于终止子探针的全部或一部分靶区域的一个引物序 列。由于引物-探针可以在该区域内扩增任何野生或突变序列，包括碱基 替换、缺失或插入，并且如果野生序列已经由终止子探针特定地阻断， 那么引物-探针的阳性信号表明一个突变序列存在于该靶区域内。因此， 一个测定系统可以检测多个感兴趣的序列变异体，并不需要多个序列特 异性检测。采用这个系统，引物-探针可以是ZIPR探针、G-Force探针、 半通用探针、通用探针、SUNRISE.RTM探针或任何其它适合于实时 PCR检测的引物-探针。此系统可以与一个两步或一步过程一起使用，如 图3A和3B所示。 [0153] 为了证实非特异性突变的检测，可以使用包括所述第二靶序列或其 互补的第二探针：反义探针组合物。采用这种修饰，所述第二探针：反义探 针的阴性或减弱的信号以及含有引物-探针的阳性信号可以确认样品中的 变异或突变序列的存在。 [0154] 本发明的探针：反义探针系统的任何探针可以被固定到基底上，优 选地通过共价连接基团，使用本领域众所周知的方法，以及反义探针与 未标记的靶一起被加入到溶液中。当使用一个共同的杂交温度时，单碱 基识别力可采用多个靶SNPs来实现，即使每个探针针对有点不同的杂交 温度可能已经被优化。当检测多种特异性高的靶，如单核苷酸多态性 (SNPs)或单碱基突变时，此温度耐受特性使设计更简单，性能更可靠。 9.DDS的探针和等温扩增方法(ISAM)：本发明还提供了一种并入此处公 开的探针：反义探针系统的等温扩增法(ISAM)，以指数扩增DNA或RNA 靶和实时或终点检测产品，该方法包括以下步骤：(a)获得含有RNA或 DNA靶序列的样品；(b)加入到所述样品(i)可以等温扩增靶序列的一对寡 核苷酸引物，其中任一个引物或两个引物包含RNA聚合酶启动子序列， (ii)一个寡核苷酸引物-探针，其包含第一引物序列，和一个匹配的反义探 针，或者包括RNA聚合酶启动子序列和所述第一引物序列和与RNA聚 合酶启动子序列互补的反义探针的任选的两个引物-探针段，(iii)包含 RNA聚合酶启动子序列和第二引物序列的修饰引物，或任选地，包含 RNA聚合酶启动子序列和第二引物序列和与RNA聚合酶启动子序列互 补的反义探针的两段引物-探针，和(iv)包含反应缓冲液、RNA聚合酶启 动子、逆转录酶和RNase H的反应混合物；(c)在等温或接近等温的条件下 扩增靶序列，所述条件包括在约35℃至约50℃范围内的单一温度，任选 地在约40℃到约42℃的范围内，或包含两个交替的温度，每个所述温度 在约35℃至约50度的范围内，任选地在约40℃和45℃之间交替变化； 和(d)在扩增期间或在定义的终点周期性地测定该荧光信号以确定扩增靶 序列的存在和频率。 [0155] 采用上述探针：反义探针组合物和扩增的方法，一种RNA靶序列可 以被直接扩增，以产生一端或两端附加有RNA聚合酶的启动子序列和荧 光供体标记的扩增DNA产物。DNA靶标产品可以被类似地扩增、修饰 和标记。采用这种方法，最大指数扩增可以在大约20至30分钟发生， 速度比典型的PCR或实时PCR的方法更快，其中每个步骤受所使用的循 环条件(图4A，18)的速率限制。虽然采用某些序列条件可能难以实现 ISAM扩增，ISAM靶扩增是更加有效的(产生20～50％的产品)，当这两 个引物都附加有RNA聚合酶的启动子序列时。 [0156] 在本发明这种方法的另一个实施例中，探针：反义探针组分可以针对 引物位点之间的内部序列。在本实施例中，探针可以包含荧光供体-受体 对的第一标记组分和引物序列内部的序列。该反义探针可以包含荧光供 体-受体对的第二标记组分，和互补结合到探针时(图4B，19)部分缺乏的 序列。反义探针还可以包括在互补结合到探针时不匹配或缺乏的多个碱 基位置。低温等温扩增的条件需要此反义探针序列修饰的结构。 [0157] 在上述探针：反义探针组合物的另一个实施例中，再加上ISAM等温 扩增方法，引物或引物-探针的5′端可以被固定到阵列基板，最佳地通过 共价连接基团，并且该RNA或DNA靶是等温扩增而连接在芯片基板 上。(图4C，20)采用此方法，多个靶可以被检测到，因为它们是实时或 终点扩增的。而且洗涤步骤是必需的，以除去未结合的标记的探针。 [0158] 本发明的一方面，因此，包括一种用于选择性地检测靶核苷酸序列 的系统的实施例，所述系统包括：至少一个探针：反义探针系统，其中包 括：(a)包括与第一靶核苷酸序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸探针，以 及与其连接的标记基团；和(b)包括与寡核苷酸探针完全互补的核苷酸序 列的寡核苷酸反义探针，除了非终止位置的至少有一个不匹配碱基，而 第二标记基团，其中，所述第二标签基团连接到寡核苷酸反义探针或者 是寡核苷酸反义探针的区域，其中：(i)该寡核苷酸探针被配置为对第一 靶核苷酸序列的杂交亲和力高于对寡核苷酸反义探针的杂交亲和力；和 寡核苷酸探针被配置为对寡核苷酸反义探针的杂交亲和力高于所感兴趣 的第二靶核苷酸序列的杂交亲和力；(ii)在第一靶核苷酸序列存在时，寡 核苷酸探针和所述第一靶核苷酸序列形成双双链，由此所述第一和第二 标记基团的不发生相互作用，从而提供了一个第一检测信号；(iii)在所述 第一靶核苷酸序列不存在时，该寡核苷酸探针和寡核苷酸反义探针形成 双链，从而使所述第一和第二标记基团发生相互作用以提供经调制的检 测信号，其中所述第一信号和调制检测信号是有区别的；及(iv)在与所述 第一靶序列相差至少一个碱基不匹配的不同的第二靶核苷酸序列存在 时，寡核苷酸探针和寡核苷酸反义探针优先形成双链，由此从形成抑制 寡核苷酸探针与第二靶核苷酸序列形成双链。 [0159] 在本发明这一方面的实施例中，寡核苷酸探针和所述第一靶核苷酸 序列，寡核苷酸探针和寡核苷酸反义探针的双链会有至少约2千卡/摩尔 的ΔG差异和至少约4℃的Tm差异；并且其中所述寡核苷酸探针和所述 第二靶核苷酸序列的双链，并且所述寡核苷酸探针和所述第一靶核苷酸 序列的双链会有至少约4千卡/摩尔的ΔG差异以及至少约8℃的Tm差 异。 [0160] 在本发明这一方面的实施例中，寡核苷酸探针序列可以在与第二靶 核苷酸序列与探针序列之间的预期不匹配差约两个碱基的不匹配碱基的 位置进行配置；据此，两个不匹配碱基产生一个寡核苷酸探针：第二靶核 苷酸序列双链的内部两个或三个碱基的未杂交区域，从而具有小于寡核 苷酸探针：寡核苷酸反义探针双链的ΔG和Tm。 [0161] 在本发明的这一方面的实施例中，寡核苷酸探针可连接到固体基底 上。 [0162] 在本发明的这一方面的实施例中，一个标记基团可以是荧光发射 器，另一标记基团可以包括选自以下组中的荧光调制器：淬灭剂化合物、 荧光化合物、金属颗粒以及富含鸟嘌呤的缀合物。 [0163] 在本发明这一方面的实施例中，寡核苷酸探针可以包含一个荧光发 射器以及一个荧光调制器或一个第二荧光发射器，并且其中所述寡核苷 酸反义探针包含荧光调制器和任选地包含一个荧光发射器或第二荧光调 制器。 [0164] 在本发明这一方面的实施例中，至少一个探针寡核苷酸探针和寡核 苷酸反义探针可以包含至少一种：非天然核苷酸、小沟结合物(MGB)以及 拉链核酸(ZNA)。 [0165] 在本发明这一方面的实施例中，该系统可以是一个iDDS探针，其 中所述探针寡核苷酸的3′末端，以及任选的寡核苷酸反义探针，可以被 阻断，以防止聚合酶延伸；并且其中所述系统还可以包括一对被配置用 于扩增包含第一靶核苷酸序列的核酸区域的侧翼引物。 [0166] 在本发明这一方面的实施例中，该系统可以是一个Flip探针，其中 所述寡核苷酸反义探针可以进一步包括，在3′端上，第一寡核苷酸引物 和该系统可以进一步包括第二寡核苷酸引物，其中所述第一和第二寡核 苷酸引物可以被配置用于扩增包含第一靶核苷酸序列的核酸区域。 [0167] 在本发明这一方面的实施例中，寡核苷酸反义探针与第一寡核苷酸 引物可以通过无碱基的间隔子连接。 [0168] 在本发明这一方面的实施例中，该系统可以是一个包含引物-探针 扩增子检测系统的ZIPR探针，其中所述寡核苷酸探针包含一个引物序列 和被配置成与寡核苷酸引物进行合作，以扩增靶核苷酸序列，由此当寡 核苷酸探针被并入到扩增子时，产生检测信号。 [0169] 在本发明这一方面的实施例中，该系统还可以包括一个第二寡核苷 酸探针，其中所述第一和第二寡核苷酸探针选择性地与核酸模板的不同 靶核苷酸序列进行杂交；并且其中两个寡核苷酸探针可以具有连接到其 上的标记基团，并且其中所述标记基团提供了两种不同的检测信号或相 同的检测信号。 [0170] 在本发明这一方面的实施例中，第一寡核苷酸探针可以包含被配置 为与一个寡核苷酸引物合作来扩增第一扩增子与第一标记的引物-探针， 从而提供了相对扩增子频率的信号，并且其中所述寡核苷酸探针是第二 引物-探针或可以包含第二标记和与靶序列互补的序列的内部探针；其中 所述靶序列可包含所述第一扩增子的可变序列段，或在核酸模板别处的 可变序列；因此，第一引物-探针和第二探针之间的信号差异提供了相对 于所述第一扩增子频率的变异序列的频率的指示。 [0171] 在本发明这一方面的实施例中，至少一个探针系统以从以下组成的 组中选择：ZIPR引物-探针，内部iDDS探针或内部Flip探针。 [0172] 在本发明这一方面的实施例中，引物-探针系统可选地包括一个G- Force引物-探针，其中包含：(i)5′荧光标记的探针片段，含有约7至9个 碱基的富胞嘧啶序列，(ii)无碱基间隔子团，(iii)与富胞嘧啶序列区域互 补的富含鸟嘌呤序列，以及(iv)的引物序列；因此，当被标记的寡核苷酸 引物-探针被并入到所产生的扩增子时，检测信号被激活。 [0173] 在本发明这一方面的实施例中，所述系统还包括适于扩增并测定 RNA或DNA靶序列的ISAM等温扩增系统，其中所述寡核苷酸引物-探 针被配置成与侧翼引物配合以扩增靶序列；其中所述侧翼引物进一步包 含5′RNA聚合酶启动子序列；并且其中所述扩增检测系统还包括RNA 聚合酶启动子的酶、逆转录酶和RNaseH酶；其中所述寡核苷酸引物-探 针任选地包含5′RNA聚合酶启动子序列；并且其中一个寡核苷酸反义探 针任选地包含一个与RNA聚合酶启动子序列互补的序列；并且其中所述 寡核苷酸引物-探针被配置为包含一个或两个引物；因此，信号传递和 RNA转录是从扩增子的一端或两端提供的；以及任选地，一个引物被固 定在固体基底上。 [0174] 在本发明这一方面的实施例中，所述系统还包括适于扩增并测定 RNA或DNA靶序列的一个ISAM等温扩增系统，其中，所述iDDS寡核 苷酸探针互补于一个包含约20至约25个核苷酸长的内部靶序列；并且 其中，所述寡核苷酸反义探针包含约10至约15个核苷酸；并且其中一 个或两个侧翼引物另外包含5′RNA聚合酶启动子序列；和包括RNA聚合 酶启动子的酶、逆转录酶和RNaseH酶的扩增检测系统；以及任选地，一 个引物被固定在固体基底上。 [0175] 在本发明这一方面的实施例中，该系统被配置为检测EGFR基因外 显子21的可变核苷酸碱基的位置，所述系统包括所述寡核苷酸SEQ ID NOS：7-12和39-41。 [0176] 在本发明这一方面的实施例中，该系统被配置为检测EGFR基因外 显子19的密码子746至753内的可变多碱基缺失，所述系统包括至少一 个未标记的引物，和含有不同标记的两个探针：反义探针系统；其中，所 述第一探针系统包括一个与非特异性的第一序列互补的引物-探针；其 中，所述第二探针系统与外显子19缺失位点的野生序列互补，并抑制或 排除包含EGFR基因外显子19的密码子746至753内多碱基缺失的靶模 板的检测；因此，外显子19缺失的存在和频率是通过比较两个探针系统 的相对信号进行评估。 [0177] 在本发明这一方面的实施例中，非特异性探针：反义探针-引物组是 SEQ ID NOs.：56，57和53，或SEQ ID NOs.：79，80和12；并且其中， 所述缺失-19野生型-仅探针：反义探针-引物组是SEQ ID NOs.：81，82，和 53，或SEQ ID NOs：54，55和53，并且其中每个非特异性探针：反义探针 -引物组和缺失-19野生型-仅探针：反义探针-引物组可任选地包括补充的引 物SEQ ID NO.：78。 [0178] 在本发明这一方面的实施例中，寡核苷酸反义探针与Taqman或分 子信标探针检测相结合；其中寡核苷酸反义探针包含荧光调制器，并包 含部分互补到Taqman或分子信标探针的一个序列。 [0179] 在本发明这一方面的实施例中，探针：反义探针系统被配置为检测 EGFR基因的外显子19、20或21、VKORC1基因、CYP2C9基因、大肠 杆菌的uidA基因、革兰氏阳性细菌的16S基因、革兰氏阴性细菌的16S 基因、分枝杆菌(mycobacterium)的inhA基因、分枝杆菌的rpoB基因、分 枝杆菌的16S基因、流感病毒的血凝素(HA)基因、A型流感病毒的基质 (M)基因、B型流感病毒的非结构(NS)基因、KRAS基因的核苷酸变异 体。 [0180] 在本发明这一方面的实施例中，探针：反义探针系统包括选自以下组 中的核酸序列：SEQ ID NOS：1和2，SEQ ID NO：3和4，SEQ ID NO：7中 和8，SEQ ID NO：9和10，SEQ ID NOS：13和14，SEQ ID NOS：17和 18，SEQ ID NOS：19和20，SEQ ID NOS：23和24，SEQ IDNOS：36和 37，SEQ ID NOS：54和55，SEQ ID NOS：56和57，SEQ ID NOS：64和 65，SEQ ID NOS：66和67，SEQ ID NO：70和71，SEQ ID NOS：72和73，SEQ ID NOS：79和80，SEQ ID NOS：81和82，SEQ ID NOS：85和 86，SEQ ID NOS：88和89，和SEQ IDNOS：91和92。 [0181] 在本发明这一方面的实施例中，该系统进一步包括用于选择性地抑 制相对于第二个靶序列的第一靶序列的定量PCR扩增和检测的未标记的 阻断终止子探针；其中所述终止子探针包含：(i)互补于所述第一靶核苷 酸序列的寡核苷酸，(ii)5′端修饰的抗核酸外切酶消化，(iii)3′端修饰的抗 聚合酶延伸，以及(iv)其中所述终止子探针进一步配置有一个Tm和Δ G，其超出qPCR分析的引物和/或探针的Tm和ΔG至少约5千卡/摩尔的 ΔG值和至少约5℃的Tm值。 [0182] 在本发明这一方面的实施例中，该系统，为了增强结合，终止子探 针还包括至少一个非天然核苷酸、一个小沟结合物(MGB)以及一个Zip核 酸(ZNA)。 [0183] 本发明的另一方面包括qPCR靶增强系统的实施例，其中所述系统 包括第一子系统和第二子系统，其特征在于，所述第一子系统包括：(i) 互补于所述第一靶核苷酸序列的未标记的寡核苷酸终止子探针，及(ii)被 配置为扩增包括第一和第二靶核苷酸序列的核酸区域的一个引物对；和 第二子系统包括：(i)由所述第一预扩增子系统产生的扩增产物的稀释小 份，其中所述稀释小份包含约0.05％或更少的预扩增产物；(ii)互补于至 少一种第二靶核苷酸序列的至少一种探针：反义探针系统，以及(iii)被配 置为扩增包括所述第一和第二靶核苷酸序列的核酸区域的至少一种引 物；因此，所述第一子系统的预扩增与所述第二子系统的再扩增和检测 提供了选择性扩增和检测第二靶核苷酸序列的手段，当所述第一靶核苷 酸序列的频率超过所述第二靶核苷酸序列的频率20∶1或更高的比例时。 [0184] 应当强调的是，本发明的实施例，特别是任何“优选的”实施例， 仅仅是实施的可能示例，仅仅是为了更清晰地理解本发明的原理。可以 对本发明的上述实施例作出许多变化和修饰，而基本上不脱离本发明的 精神和原理。所有这些修饰和变化旨在被包括在本发明的范围之内，并 且本发明被以下的权利要求所保护。 [0185] 以下的实施例被阐述，以便对本领域的普通技术人员提供如何实施 方法和使用此处公开和要求保护的组合物和化合物的完整公开和描述。 已作出努力，以确保数字(例如，量，温度等)的准确性，但一些误差和偏 差应予以考虑。除非另有说明，份数是重量份数，温度为℃，压力为大 气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。 [0186] 实例 [0187] 例1 [0188] 循环条件：采用HotStart-IT探针在MX4000仪(Stratagene，Inc)中进行 实时PCR。RTM定量PCR预混液(USB，Inc.)(2x)在20tl的反应中补充有 1μl的25mM的MgCl2。为了启动热启动条件下，将管在95℃下加热5分 钟，随后40个循环的两步PCR(变性：95℃，15秒；退火/延伸：58℃，1分 钟)。所使用的模板分别为包含有或没有T＞G颠换的靶向EGFR基因片 段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸(DNA整合技术，Iowa，USA)。 [0189] 例2 [0190] 检测VKORC1SNP变异体的内部DDS(iDDS)探针：反义探针组合物： 一个与华法林剂量相关的重要的SNP变异体位于编码维生素K环氧化物 还原酶亚单位1的VKORC1基因内，在其位点1639，其包括相对于野生 型的突变的G＞A的改变。通过实时PCR检测这两个SNP变异体，所述 探针，反义探针及以下引物用于在以下终浓度： [0191] VK-1639G-探针：5′-FAM-cgcacccggccaatg-Phos-3′(SEQ ID NO.：1)在200nM时； [0192] VK-1639G-反义探针：5′-catcggccgggtgcg-BHQ1-3′(SEQ ID NO.：2)在400nM时[0193] VK-1639A探针：5′-FAM-attggccaggtgcg-Phos-3′(SEQ ID NO.：3)在200nM时[0194] VK-1639A-反义探针：5′-cgcacctggcctat-BHQ1-3′(SEQ ID NO.：4)在400nM时[0195] VK-正向引物：5′-cctctgggaagtcaagcaag-3′(SEQ ID NO.：5)在200nM时[0196] VK-反向引物：5′-aaatgctaggattataggcgtga-3′(SEQ ID NO.：6)在200nM时[0197] 而在探针和反义探针包含VKORCl的靶向单碱基变异体，每个反义 探针用一个不匹配碱基(野生反义探针位置4，突变反义探针位置12)进行 修饰，以减少相对于探针与正确相匹配的靶的结合的探针对反义探针的 结合。在探针：反义探针结构中的预期失配是为了获得探针与反义探针之 间的亲和力，探针和正确的靶相对于探针和不正确的靶之间的亲和力的 中间物。 [0198] 图6显示了如何使野生探针的序列相互作用：(1)与预期的野生靶序 列，(2)与所选择的反义探针的序列，和(3)与一个不正确的靶序列(在这种 情况下的突变序列)以产生三个不同层次的由Tm和ΔG测量的热力学亲 和力。这些探针，反义探针和靶，然后进行实时PCR循环和检测，其中 温度反复地从变性的95℃下降到约58℃的退火温度，然后再返回到95℃ (在约72℃有或没有延伸步骤) [0199] 荧光信号是在每个退火步骤中进行评估。探针与正确的靶的结合首 先发生在超过退火温度约5℃时，然后，探针与反义探针的结合其次发生 在大约退火温度时。正确的靶结合开启信号而反义探针关闭信号。在热 力学上，探针与不正确的靶的结合只能发生在最后，或者根本没有，因 为它只能在比探针与反义探针的结合的温度低约5℃时有效地发生。此 外，由于提供了二比一的过量反义探针，探针与不正确的靶的结合被有 效地阻止。典型地，引物结合也被优化为用于PCR的退火温度。因为基 于iDDS探针：反义探针的分析的这些结构和热力学特性，探针很少有或 根本没有机会结合到不同于预定靶的单个碱基的不正确的靶。 [0200] 循环条件：采用HotStart-IT探针在MX4000仪(Stratagene，Inc)中进行 实时PCR。RTM定量PCR预混液(USB，Inc.)(2x)在20μl的反应中补充有 1μl的25mM的MgCl2。为了启动热启动条件下，将管在95℃下加热5分 钟，随后40个循环的两步PCR(变性：95℃，15秒；退火/延伸：58℃，1分 钟)。所使用的模板分别为通过包含有或没有突变碱基和侧翼引物位点的 靶向基因片段的IDT合成的Ultramers。 [0201] 图8A和图8B显示了来自包含有1,000个复制的野生型或突变模板 和使用野生型或突变探针的四个管的扩增曲线。阳性(向上)的曲线反映的 是突变模板与突变探针(图8B)的检测，或野生型模板与野生型探针(图 8A)的检测。平缓曲线反映的是野生型探针与突变模板或突变探针与野生 型模板。用于两个相关的诊断SNPs、CYP2C9*2和CYP2C9*3的类似的 野生型和突变iDDS探针：反义探针组，也被制作并采用类似的结果执 行。 [0202] CY2-W-探针：FAM-CATTGAGGACCGTGTTCAAGA-Phos(SEQ ID NO.：64)在 200nM时； [0203] CY2-W-反义探针：TCTTGAACACGGTCCTCTATG-BHQ1(SEQ ID NO.：65)在400nM时[0204] CY2-M探针：FAM-CTCTTGAACACAGACCTCAATGC-Phos(SEQ ID NO.：66) 在200nM时[0205] CY2M-反义探针：GCATTGAGGACTGTGTTCATGAG-BHQ1(SEQ ID NO.：67)在400 nM时[0206] CY2F-引物：AATTTTGGGATGGGGAAGAG(SEQ ID NO.：68)在200nM时 [0207] CY2R-物：GTTTTTCTCAACTCCTCCACAAGG(SEQ ID NO.：69)在200nM 时 [0208] CY3W-探针：FAM-GAGAAGGTCAATGAATCTCTGGAC-Phos(SEQ ID NO.：70) 在200nM时[0209] CY3W-反义探针：GTCCTGAGATACATTGACCTTCTC-BHQ1(SEQ ID NO.：71) 在400nM时[0210] CY3M-探针：FAM-AGAAGGTCAAGGAATCTCTGGAC-Phos(SEQ ID NO.：72) 在200nM时[0211] CY3M-反义探针：GTCCTGAGATACCTTGACCTTCT-BHQ1(SEQ ID NO.：73)在 400nM时[0212] CY3F-引物：CCACATGCCCTACACAGATG(SEQ ID NO.：74)在200nM时 [0213] CY3R-引物：CCTTGGGAATGAGATAGTTTCTGAA(SEQ ID NO.：75)在200nM 时 [0214] 例3 [0215] 用于与肺癌诊断和治疗相关的EGFR基因(外显子21L858R突变)的 单碱基变异的实时PCR检测的内部DDS(iDDS)探针：为了检测怀疑存在于 核酸样品中的EGFR外显子21突变密码子L858R，以及可能在858L野 生型(正常)的密码子序列存在时，以下的寡核苷酸探针、反义探针和PCR 引物被合成，并在指定的终浓度使用： [0216] EGFR858R探针：FAM-cagattttggccgggccaaactg-phos(SEQ ID NO.：7)在200nM 时[0217] EGFR858R反义探针：cagtttggcccgcccaatatctg-BHQ1(SEQ ID NO.：8)在400nM 时[0218] EGFR858L探针：CalRed610-cagattttgggctgaccaaactg-phos(SEQ ID NO.9)在200 nM时 [0219] EGFR858L反义探针：cagtttggccagcccataatctg-BHQ2(SEQ ID NO.：10)在400nM 时 [0220] 正向引物：gaaaacaccgcagcatgtC(SEQ ID NO.：11)在200nM时 [0221] 反向引物：ctgcatggtattctttctcttcc(SEQ ID NO.：12)在200nM时 [0222] 虽然上述探针和反义探针在密码子858的位置含有针对性的单碱基 变异，每个反义探针还包括相对于在突变858R反义探针位置18(5′末端) 和降低反义探针与其匹配的探针的结合亲和力(示于图7B)的野生858L反 义探针位置18(5′末端)的对应探针序列的一个额外的不匹配碱基。 [0223] 对于这些特定的靶，(i)该探针的结合和正确的靶以及(ii)该探针和不 正确的靶之间的热力学差异是很低的。该探针，因此，被各自设计成包 括位于与期望被检测到(分别在变异858R探针位置11，和野生858L探针 位置15)的变异碱基位点相差两个碱基的额外的辅助不匹配。在探针与不 正确的靶杂交的情况下，形成三碱基“杂交泡沫”(CCG)，以防止形成的 双链，并有利于杂交到正确的靶序列，或其相应的寡核苷酸反义探针。 [0224] 图9显示了来自含有1，000个复制的突变模板的两管的扩增曲线。阳 性(向上)曲线反映的是858R变异探针的单碱基突变的检测。反映的平面 曲线使用野生型探针，它不检测突变模板。 [0225] 例4 [0226] 实时PCR使用IDDS探针代表致病O157的检测：使用根据检测 uidA+93和与TaqMan-MGB探针比较的致病的O157：H7大肠杆菌的检测 的iDDS探针的实时PCR：采用以下的序列和标记制作该探针、反义探针 和引物，并在所指示的终浓度下使用： [0227] 突变型O157uidA探针：FAM-caccaacgctgctcaattc-phos(SEQ ID NO.：13)在200 nM时 [0228] 突变型反义探针：gaa ttgagctgcgttggtg-BHQ1(SEQ ID NO.：14)在400nM时[0229] uidA-For.引物：cagtctggatcgcgaaaactg(SEQ ID NO.：15)在200nM时 [0230] uidA-Rev.引物：accagacgttgcccacataatt(SEQ ID NO.：16)在200nM时 [0231] 循环条件：实时PCR如实施例1所述进行，除了定量PCR进行60个 循环，退火/延伸步骤在60℃下进行1分钟。 [0232] 图10A显示了使用O157突变探针检测两种浓度的大肠杆菌突变模 板(50份至5份)(阳性曲线)和50至5份大肠杆菌阴性模板(平缓曲线)的四 管的原料扩增曲线。采用60个循环的野生模板没有假阳性的检测发现。 [0233] 相比较而言，图10B显示了使用特异于O157突变的市售的Taqman- MGB探针检测50个复制的突变模板(日性(向上)的曲线)与50份对照模板 (主要是平缓曲线)的两管的扩增曲线。对照模板，不具有病原体相关的多 态性，在38个周期产生了Taqman-MGB探针的一些假阳性结果(曲线斜 向上)。 [0234] 例5 [0235] 使用实时荧光定量PCR的iDDS探针检测相对于革兰氏阳性(GP)细 菌的革兰阴性(GN)：采用以下的序列制作和标识探针、反义探针、引物， 并在指定的终浓度时被使用： [0236] GP探针：FAM-aaggggcttgatgatttgacgt-phos(SEQ ID NO.：17)在200nM时[0237] GP反义探针：acgtcaaatcttcatgcccctt-BHQ1(SEQ ID NO.：18)在400nM时[0238] GN探针：CalRed610-aagggccatgatgacttga-phos(SEQ ID NO.：19)在200nM时[0239] GN反义探针：tcaagtcttcatggccctt-BHQ2(SEQ ID NO.：20)在400nM时 [0240] 正向引物：tcccgcaacgagcgcaac(SEQ ID NO.：21)在200nM时 [0241] 反向引物：cagccattgtagcacgtgtgt(SEQ ID NO.：22)在200nM时 [0242] 循环条件：实时PCR如实施例1所述在58℃下的退火/延伸步骤进行 1分钟。两个探针在同样的管中一起使用，每个管中含有不同的模板.. [0243] 图11A显示了革兰氏阳性和革兰氏阴性探针的一个管中的两条曲 线。阳性(向上)4 曲线表示检测约1.3x10个细胞的革兰氏阳性模板的革兰 氏阳性探针，和平缓曲线反映了革兰氏阴性探针采用相同的模板，无假 阳性检测显示。 [0244] 或者，图11B显示了一个管中的两条曲线，其中所述阳性曲线反映 了检测约2.6x105个细胞的革兰氏阴性模板的革兰氏阴性特异性探针。 平缓曲线反映了革兰氏阳性探针采用那些相同的模板，无假阳性检测显 示。 [0245] 在另外的实验中，革兰阴性探针(SEQ ID NO：19)在其5′端采用FAM 荧光标记和在其3′端采用BHQ1猝灭剂标记被修饰，和革兰阴性反义探 针(SEQ ID NO：20)在3′端标记有BHQ1，并任选地在5′端标记有FAM。 这两个修饰改进了qPCR检测，产生更高水平的指数荧光信号和较低的背 景水平。 [0246] 例6 [0247] 使用实时荧光定量PCR的ZIPR DDS探针检测H3N2流感：该ZIPR H3N2探针针对H3N2流感基因组的血凝素(HA)段的位点，并且是FAM 标记的。所述探针包含靶特异性的引物序列。该反义探针是BHQ1-标记 的，并且与探针是基本互补的。引物被用于与所述探针及反义探针结 合，以扩增并检测H3N2样品，它们在以下的终浓度下时被使用： [0248] ZIPR H3探针：FAM-ctggttcagagttcctcaaca(SEQ ID NO.：23)在200nM时 [0249] ZIPR H3反义探针：tgttgatgaactctgaaccag-BHQ1(SEQ ID NO.：24)在400nM时[0250] H3引物：ccatcaaggatctgatgagga(SEQ ID NO.：25)在200nM时 [0251] 循环条件：实时PCR如例1所描述进行。 [0252] 图12显示了使用上述ZIPR H3探针的来自H3N2病毒感染的患者样 品的扩增曲线。 [0253] 例7 [0254] 使用实时荧光定量PCR的FLIP DDS探针检测相对于副结核分枝杆 菌的16S基因的结核分枝杆菌的16S基因：以下用于特异性检测结核分枝 杆菌类的FLIP DDS探针针对与副结核分枝杆菌的16S基因相差一个碱基 的16S基因的位点。所述探针是3′FAM标记的，并且包含内部靶序列。 该反义探针组分是5′BHQ1标记的，并且与3′引物序列结合，在这个实例 中与正向引物结合。 [0255] 只有一个侧翼引物被用于与FLIP探针组分一起使用。在靶扩增期 间，探针结合到靶序列，剩下反义探针，因为它被连接到被并入到扩增 产子的一个引物。因此，探针可向其靶位点翻转，引发荧光检测。该检 测使用不被反义探针阻断的第二引物。使用正向和反向引物以及相同的 测试样品对同一靶位点的Taqman探针进行比较。该引物和探针组分和终 浓度如下： [0256] FLIP探针：taggaccacgggatgcatgtctt-FAM(SEQ ID NO.：26)在125nM时 [0257] FLIP反义探针-引物：dT-BHQ1-aagacatgcatcccgtggt-间隔子9-gggataagcctgggaaactg (SEQ ID NO.：27)在200nM时 [0258] Taqman探针：FAM-catgtcttgtggtggaaagc-BHQ1(SEQ ID NO.：28)在100nM时[0259] 正向引物：gggataagcctgggaaactg(SEQ ID NO.：29)在200nM时 [0260] 反向引物：accccaccaacaagctgata(SEQ ID NO.：30在200nM时 [0261] 循环条件：实时PCR如例1所描述进行。 [0262] 图13A显示了使用特异于结核分枝杆菌16S基因的FLIP DDS探针 的五个管的扩增曲线。四个阳性(向上)曲线反映了结核分枝杆菌连续稀释 10：1的四个样品的检测。阴性曲线反映了与探针区域相差一个碱基的副 结核分枝杆菌是的样品。 [0263] 图13B显示了来自使用特异于结核分枝杆菌16S的Taqman探针在与 图13A所示的FLIP探针相同的靶区域的五个管的曲线。四个高阳性曲线 来自如上所示的结核分枝杆菌相同的四个连续稀释。重叠其它曲线的低 阳性曲线来自图13A所示的同一副结核分枝杆菌对照样品。这说明用 Taqman探针出现假阳性的检测。FLIP探针更为严格，避免了这种假阳性 的检测。 [0264] 例8 [0265] 使用G-Force DDS探针的实时PCR对结核分枝杆菌rpoB基因的检测： 用于结核分枝杆菌的G-Force DDS探针被设计成检测包括密码子526至 533的rpoB基因的一个区域。通用探针：反义探针的信号单元被连接到一 个引物，并连同其它侧翼引物运作，以扩增并检测靶位点。G-Force信号 单元由包含一个FAM标记的富胞嘧啶核苷探针片段，A’s两侧的间隔 子，以及一个富含鸟嘌呤反义探针片段(如SEQ ID NO：31)。 [0266] 在靶序列不存在时，探针和反义探针片段在间隔子的中间折叠在一 起，这是由于互补序列的结合。由于这使得荧光团紧接着一系列鸟嘌 呤，荧光显著减少。但是当引物/探针单元被结合到产品中时，反义探针 片段被复制，从而防止探针片段从折叠接近反义探针段，因此信号被释 放。 [0267] G-Force探针和引物序列以及终浓度为： [0268] GF引物/探针：FAM-cccctcca-间隔子18-aggaggggg-ccgctgtcggggttgac(SEQ ID NO.： 31)在100nM时；反向引物：cacgctcatgtgacagacc(SEQ ID NO.：32)在200nM时[0269] G-Force探针与两个模板一起使用。一个在密码子526(tac)包含单个 碱基突变；其它野生序列。G-Force探针没有区分这两个模板。 [0270] 循环条件：实时PCR如例1所描述进行。 [0271] 图15显示了来自两个野生和突变型模板的阳性曲线的探针的两个管 的结果。 [0272] 例9 [0273] 用于检测结核分枝杆菌rpoB基因的单碱基突变的与iDDS探针结合 的G-Force DDS探针：上述例8的该G-Force DDS探针被用于结合靶向针 对rpoB的526密码子的野生序列的iDDS探针。iDDS探针的组分和浓度 如下。该分析是为了检测一个突变是否存在于密码子526，利福平抗性突 变的基本位点，而无需采用不同的iDDS探针检测每一个特定的突变。因 此，IDDS探针产生了一条526突变是否存在的平缓曲线，而G-Force探 针仍产生了一条阳性曲线。这样的阳性/阴性结果证实了526密码子本身 的存在，然后表明，它含有一个突变碱基，无论哪个碱基突变是否存 在。而这个阳性/阴性结果证实，只有一个抗性突变的存在，所述分析可 以是不明确的，如果样品中含有大量的野生和突变型模板，并检测到两 个阳性曲线。 [0274] iDDS探针：CalFluorRed610-cggggttgacccactagcg-phos(SEQ ID NO.：33)在200 nM时 [0275] 反义探针：cgcttgtgggtctaccccg-BHQ2(SEQ ID NO.：34)在400nM时 [0276] 循环条件：实时PCR如例1所描述进行。 [0277] 图16A显示了采用上述两个探针和526位点的突变模板的一个管。 G-Force探针显示了检测526-533区域的阳性曲线，但更多的靶向针对 526位点的野生iDDS探针并没有显示出阳性曲线，因为526位点是突变 的。从而此分析提供了rpoB526突变状况而没有检测特定突变的指标。 [0278] G-Force探针可与iDDS探针结合，以量化样品中的特定突变的频 率。G-Force探针检测靶区域的所有的扩增子，而iDDS探针只检测那些 含有突变序列的扩增子。因此信号对野生或突变型的模板的G-Force探针 是高度一致的，而iDDS探针的信号高度与相对于野生模板的突变模板的 频率是成比例的，并提供了相对于细胞群中突变细胞的野生细胞的相对 比例的表示。同样结果会是相反的，如果IDDS探针检测到野生型而不是 突变序列。 [0279] 这种能力是采用下列探针和引物在一个共同的药物抗性突变的位点 将结核分枝杆菌的inhA基因与野生inhA序列的iDDS探针结合的G- Force探针显示的： [0280] 正向引物：gctcgtggacataccgattt(SEQ ID NO.：35)在200nM时；inhA iDDS探针： CalRed610-ccgacaacctatcgtctcgcc-Phos(SEQ ID NO.：36)在200nM时；inhA反义探针： cgagacgataggttgtcgg-BHQ2(SEQ ID NO.：37)在400nM时；InhA G-Force引物探针： cccctcca-间隔子18-aggagggggtccggtaaccaggactgaac(SEQ ID NO.：38)在100nM时[0281] 图16B显示了以75％野生：25％突变或25％野生：75％突变混合的野 生型和突变的模板运行的两个试管的测试。而G-Force探针的曲线均的任 一模板相同，该iDDS探针的曲线与存在的百分比野生模板成比例的高度 不同。 [0282] 例10 [0283] 采用“野生终止子”的方法增强了基于iDDS探针的突变检测：采用 iDDS探针的突变检测可以通过有选择地扩增靶突变型模板和阻断野生模 板扩增的预扩增步骤得到加强。在预扩增步骤后，反应产物被稀释，小 稀样品被转移到实时PCR反应中。由于此过程，野生型模板几乎消除， 定量PCR反应从突变型模板的扩增量开始。其结果是，与低频率的突变 型模板的样品可以通过定量PCR与iDDS探针被有效地检测，即使原始 样品含有丰富的另外隐蔽突变检测的野生模板。 [0284] 预扩增反应使用靶区域两侧的一组引物，且最终反应使用部分或完 全在外部引物之间的引物组。第一，预扩增步骤，在一个标准PCR仪上 运行30～70短周期。第一反应中的1微升通常被用100～500微升的水或 缓冲液稀释，然后1微升样品被转移到在实时PCR仪的第二反应中。 [0285] 在第一步骤中使用的野生终结者阻断探针，包括未标记的寡核苷酸 是互补的野生序列和大约22至28个碱基长-约2～5个碱基比IDDS较 长探针。的5′末端被修饰，以阻止5′-核酸酶消化一阻挡部分如一个生物 素分子，ZNA，一个MGB，或者非互补碱基(约5-10)的任意字符串的连 接。的3′-末端被修饰的分子使用，例如磷酸盐，氨基，或一垫片，以防 止延伸探针的。阻塞的Tm是探针通常为至少5℃的比IDDS更高探针， 使任何野生模板将绑定到它强烈。 [0286] 阻断“野生终止子”探针，从而表现得像一个反义探针在反向，阻 断野生模板，同时允许突变序列的iDDS探针结合至突变的模板，并检 测。这个例子说明了使用在例2中描述的相同IDDS探针的EGFR外显子 21突变位点L858R(T＞G)的增强检测，但提供了相对于野生序列变异的 突变序列的低频率的混合模板(0.2％)。 [0287] 用于以下模板和组分的第一预扩增步骤：模板：10，000拷贝野生型 EGFR外显子21858L；20拷贝突变EGFR外显子21858R(0.2％). [0288] 外部的正向引物：agccaggaacgtactggtga(SEQ ID NO.：39)在100nM时 [0289] 外部的反向引物：tgcctccttctgcatggtat(SEQ ID NO.：40)在100nM时； [0290] 终止子阻断探针：生物素-ctttcccaccaacgcagatcaattcca-phos(SEQ ID NO.：41)在 200nM时 [0291] 这第一步包括使用USB PCR扩增预混试剂(2x)的20μl反应。反应通 过在95℃下加热3分钟开始，接着40个循环的PCR，在95℃持续2 秒，50℃持续2秒，和72℃持续2秒。这一步抑制或阻止野生模板的扩 增，而突变的模板被扩增。从第一步稀释1/500，1μl被转移到第二步。 [0292] 第二定量PCR步骤使用以下的组分和条件： [0293] 内部的正向引物：gaaaacaccgcagcatgtc(SEQ ID NO.：11)在200nM时 [0294] 内部的反向引物：ctgcatggtattctttctcttcc(SEQ ID NO.：12)在200nM时； [0295] 突变探针858R：FAM-cagattttggcc gggccaaactg-Phos(SEQ ID NO.：7)在200nM时； [0296] 突变反义探针：cagtttggcccgcccaatatctg-BHQ1(SEQ ID NO.：8)在400nM时； [0297] 野生型探针858L：CalRed610-cagattttgggctgaccaaactg-Phos(SEQ ID NO.：9)在200 nM时； [0298] 野生型反义探针：gcagtttggccagcccataatctg-BHQ2(SEQ ID NO.；10)在400nM时[0299] 循环条件：实时PCR如例1所描述进行，除了退火/延伸步骤是在 52℃持续1分钟。 [0300] 图14显示了包含第一扩增步骤的相同反应产物(但用不同的探针，野 生型和突变型，在每个管)的两个管的定量PCR曲线。阳性(向上)曲线显 示了很早就从9个循环开始的指数扩增的突变检测。阴性曲线显示了没 有检测到原本很丰富的野生模板。 [0301] 例11 [0302] 检测EGFR外显子21突变的一步iDDS和“野生型终止子”的方法: “野生型终止子”探针和iDDS探针在一个单一的实时PCR反应中一起 使用，“野生型终止子”探针抑制或阻断野生型模板的扩增，和IDDS探 针检测突变模板。该过程只起作用，如果该突变频率为约1％或更高。在 这个例子中，突变模板的200个复制和野生模板的10,000个复制(2％的 突变)一起使用。所有引物和探针均与上述实施例10相同，除了在400 nM时使用的内部引物。“野生型终止子”探针在150nM时被使用，但 在100或200nM采用“野生型终止子”探针得到类似的结果。 [0303] 循环条件:实时PCR如例1所述采用在52℃持续1分钟的退火/延伸 步骤进行。 [0304] 图17显示了EGFR中L858R位点的含有“野生终止子”探针和野生 型和突变iDDS探针的一管的两条曲线。 [0305] 例12 [0306] 采用ZIPR DDS探针的ISAM等温扩增和定量PCR检测:DNA或 RNA靶序列可被等温扩增，并被一端的DDS引物-探针以及另一端为5' RNA聚合酶启动子序列的引物检测。在此例子中，T7RNA聚合酶启动 子序列被使用。此方法使用逆转录酶，以产生添加到5'端的T7位点的所 述靶区域的cDNA复制。然后ZIPR DDS引物-探针作为引物，以复制包 括T7位点的该cDNA，从而产生双链产物与T7启动子的识别序列。 RNA聚合酶，在这种情况下，T7RNA聚合酶，然后使得产物中的RNA 复制作为进一步扩增循环的模板，产生DNA和RNA产物之间的交替。 RNaseH通过降解RNA:DNA杂交中的RNA链促进了这一过程。RNaseH 可被单独提供，或作为一个具有RNase功能的逆转录酶，以产生RNA产 物的cDNA复制。 [0307] NUCLISENS.RTM基本试剂盒(BioMerieux，Inc)被使用。在扩增过程 中，所述荧光标记ZIPR引物-探针被并入到DNA产物，并从任何可用的 淬灭剂标记的反义探针分离，从而提供了定量PCR检测。由于低温扩 增，该反义探针被做得更短。所述探针和引物组分被使用，如下所示： [0308] GAPDH-Cy3F1：Cy3-gagtcaacggatttggtcgt(SEQ ID NO.：42)在200nM时； GAPDH-BHQ2：atccgttgactc-BHQ2(SEQ ID NO.：43)在400nM时；GAPDH-T7R1： [0309] aattctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag(SEQ ID NO.：44)在200nM时. [0310] 这个测试以1ng的GAPDH RNA为起始模板进行。初始反转录反应 在65℃下进行5分钟，然后41℃下持续5分钟。然后，采用如定量PCR 仪或37℃和45℃之间的水浴进行指数ISAM，最典型地在40℃到42℃之 间。在一个例子中，定量PCR步骤在两个稍微不同的温度下进行，在 42℃30秒，和40℃30秒之间来回地循环，运行80个循环。荧光发射分 别在每个循环的第二个步骤(40℃步骤)进行评估。 [0311] 在图18中，阳性扩增曲线显示了采用ZIPR DDS的引物-探针的 ISAM定量PCR DNA产物的检测。未检测到RNA产物。大多数的指数 扩增阶段是前20分钟内完成。 [0312] 例13 [0313] 采用内部DDS(IDDS)探针的ISAM等温扩增：ISAM扩增和定量PCR 检测，可以如上述实施例12所进行，但使用内部DDS探针代替终止子 引物-探针。此外，正向和反向引物可以具有一个附加的T7序列，修饰 增加约20％到50％的产量。然而，由于所使用的低温，DDS探针和反 义探针通过使用长探针(24bp)改性和较短的反义探针(15bp)被修饰。 [0314] GAPDH-T7F1：aattctaatacgactcactatagggagaagggagtcaacggatttggtcgt(SEQ ID NO.： 45)在300nM时；GAPDH-R1： [0315] aattctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag(SEQ ID NO.：46)在300nM时； GDH iDDS探针：FAM-ccttcattgacctcaactacatgg-氨基(SEQ ID NO.：47)在150nM时； GDH iDDS反义探针：tgaggtcaatgaagg-BHQ1(SEQ ID NO.：48)在300nM时 [0316] 测试模板是GAPDH RNA和HIV RNA。RT-PCR和定量PCR的步骤 如例13所述进行，进行与不同之处在于定量PCR循环为60个1分钟周 期在一个温度，41℃，用荧光检测评估每个周期实施例13中所述。在图 19，积极的扩增曲线显示的ISAM定量PCR检测GAPDH DNA的产品， 其内部的DDS探头和反义探针的。平曲线是从艾滋病防治的模板。与内 部的DDS探头，检测更严格，因此扩增曲线上升逐渐多了。 [0317] 例14 [0318] 芯片上的ISAM等温扩增和荧光检测：芯片阵列在CODELINK.RTM 幻灯片(GE Healthcare)上被采用含有GAPDH基因或Rab9基因的引物的 多斑点进行手工印刷。这些引物包括从5′端：氨基修饰、间隔子、T7启动 序列和基因特异性反向引物序列。根据CODELINK.RTM协议，引物通 过其5′氨基修饰被共价地结合到印刷的幻灯片上。然后，他们被处理以 阻断非特异性结合，洗涤和干燥。这些斑点被以GAPDH和Rab9引物斑 点之间的半棋盘格局交替排列。ISAM反应在芯片上完成，各加入150ng 的GAPDH RNA和Rab9RNA，加上包含有正向引物序列的Cy3标记的 GAPDH探针和包含有T7序列与正向引物序列的FAM标记的Rab9探 针。 [0319] 该反应在盖玻片上运行，但在密封室中，并在41℃的水浴中保持至 少2小时。芯片，然后采用：2xSSC/0.1％SDS，.1xSSC/0.1％SDS，1× SSC，之后0.01xSSC清洗芯片，然后旋转干燥。采用Perkin Elmer公司 的微阵列扫描仪进行检测。GDH和Rab9特异性引物和探针为： [0320] GDH-R1s：氨基-间隔子18-atttctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag (SEQ ID NO.49)；Rab9-R1s：氨基-间隔子18- atttctaatacgactcactatagggagaaggaaatggtgtcctcaggcttc(SEQ ID NO.50)；GDHCy3F1：Cy3- gagtcaacggatttggtcgt(SEQ ID NO.51)在900nM时；Rab9-FAM-T7F1：FAM- aattctaatacgactcactatagggagaaggcaatggcaggaaaatc(SEQ ID NO.52)在900nM时 [0321] 在图20中，芯片的ISAM基因特异性扩增的阵列上的绿色和蓝色的 斑点图案被观察到，并可以采用连接到芯片上的引物进行检测。由于黑 色背景和蓝色FAM标记的Rab9特定点之间的低着色的差异，这些基因 特异性荧光点被表示为黑/白图形中所示的白色圆圈。绿色Cy3标记的 GAPDH特异性点可以在黑色/白色图如实心白点或具有灰色中心的白点 被更容易地看出。扩增和检测是每个基因独有的。 [0322] 例15 [0323] 采用同样的扩增子上的两个探针：反义探针组合物检测EGFR外显子 19的可变的缺失突变：在肺癌和相关疾病中，可变的缺失突变通常发生在 包括含有密码子746至753的区域内的9至24个碱基缺失的EGFR基因 的外显子19上，这种缺失是响应络氨酸激酶抑制剂的最普通的生物标 记。外显子19(被认为是缺失-19)上的这些诊断缺失通常通过测序法检 测。Dahse等.2008已进行了PCR和采用特别的引物桥接和扩增最普通的 15bp缺失-19突变的凝胶试验，然而，这种试验不能用其它的外显子19 缺失突变进行。此处报道的例子克服了采用定量PCR试验中的一对探针： 反义探针组合物检测EGFR外显子19扩增子的两方面的限制。含有一个 标记的引物-探针被用来扩增和检测有或没有缺失-19突变的靶片段的所 有扩增子的终端，含有不同标记的第二iDDS探针将检测包含有密码子 746至753的内部片段，如果野生型序列是存在的。通过消除，这两种探 针系统区别缺失-19突变和野生型的相对比例。所使用的引物-探针是还 作为正向引物的ZIPR探针：反义探针。 [0324] CalRed610-TCTGGATCCCAGAAGGTGAG(SEQ ID NO：56)在200nM时； CTCACCTTCTGGGTTCCAGA-BHQ2(SEQ ID NO：57)在400nM时 [0325] 内部iDDS探针：反义探针包含：Fam-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC- Phos(SEQ ID NO：81)在200nM时；GATGTTGCCTCTCTTAATTCCTTG-BHQ1(SEQ ID NO：82)在400nM时[0326] 侧翼反向引物包含：cgtaggcttcatcgaggatt(SEQ ID NO：53)在200nM时 [0327] 有时少量(～100nM)的未标记的正向引物(tctggatcccagaaggtgag，SEQ ID NO：78)也被提供，以降低强的ZIPR信号，并使得其与iDDS信号达到平 衡，便于缺失-19突变频率的诊断翻译。 [0328] 如例1所述采用有或没有9bp或15bp缺失的人工基因靶或有或没 有已知的缺失-19突变的病人样品进行实时PCR。如果所有的模板是野生 型的，iDDS信号应该相当地等价于ZIPR探针信号，但是如果缺失-19突 变是存在的，相比于ZIPR探针信号的iDDS信号应该相对于突变频率明 显地下降。这种预期的结果在所测试的模板和样品中被观察到。 [0329] 图21显示了采用含有100％野生模板的上述两个探针的一个管的曲 线。该ZIPR探针显示了检测靶扩增子的阳性曲线，iDDS探针显示了等 效的阳性曲线，因为所有模板都是野生的。图。图22显示了相对于 ZIPR探针曲线的减弱的IDDS曲线，因为模板是50％的突变。图23显示 了阳性ZIPR探针曲线和平缓的iDDS曲线，因为野生序列在缺失-19靶 位点上是不存在的。此法从而提供了缺失-19突变频率的指标，而没有检 测特定的突变序列。该ZIPR信号与野生或突变的模板是高度一致的，而 IDDS探针的信号高度随着野生型及突变型模板的频率成比例地变化，而 不管该突变存在的大小或序列。 [0330] 例16 [0331] 检测与癌症治疗的酪氨酸激酶抑制剂的耐药性相关的密码子790上 的EGFR外显子20的单碱基突变的iDDS探针：反义探针： [0332] 由于EGFR外显子20中的突变T790M，一年后患有非小细胞肺癌的 病人通常对酪氨酸激酶抑制剂有复发反应。这种突变是由于C到T的碱 基对在密码子790上第二个字母的变化，导致苏氨酸到蛋氨酸的错义替 换(ACG＞ATG)。检测这种单碱基突变，从而提供了用于治疗变化的诊断 指标。在这个例子中，定量PCR分析采用iDDS探针：反义探针检测 EGFR扩增模板中790M突变序列的存在。引物和探针包含： [0333] F-引物：gcatctgcctcacctccac(SEQ ID NO：83)在200nM时；R-引物： gtctttgtgttcccggacat(SEQ ID NO：84)在200nM时 [0334] 探针：FAM-tgagctccatgatgagttgcacg-Phos(SEQ ID NO：85)在200nM时 [0335] 反义探针：cgtgcaactcttcatgcagctca-BHQ1(SEQ ID NO：86)在400nM时 [0336] 循环条件：实时PCR方法如例1所述进行。阳性曲线表明790M序列 是存在的。 [0337] 例17 [0338] 检测基于两种ZIPR探针：反义探针组合物的A型流感或B型流感的 多重测定： [0339] 这种测定采用具有不同的荧光标记的两种ZIPR探针来检测样品中的 A型流感或B型流感，其中包括： [0340] F-引物：cttctaaccgaggtcgaaacgta(SEQ ID NO：87)在200nM时 [0341] A-探针：Fam-gctttgagggggcctga(SEQ ID NO：88)在200nM时 [0342] A-反义探针：Tcagcccccctcaaagc-BHQ-1(SEQ ID NO：89)在400nM时 [0343] R-引物：CTAATTGTCTCCCTCTTCTGGTGA(SEQ ID NO：90)在200nM时 [0344] B-探针：CalRed610-CCCAATTTGGTCAAGAGCAC(SEQ ID NO：91)在200nM 时 [0345] B-反义探针：GTGCTgaTGACCAAATTGGG-BHQ-2(SEQ ID NO：92)在400nM 时 [0346] 循环条件：实时PCR方法如例1所述进行。FAM-阳性曲线表明A型 流感是存在的。CalRed610阳性曲线表明B型流感是存在的。 [0347] 例18 [0348] 检测与肺癌和结肠癌患者中EGFR靶向治疗的反应降低相关的 KRAS基因的外显子1、密码子12和13中的可变突变的多重试验。该试 验是类似于缺失-19检测方案，并采用了HEX荧光标记的非特异性ZIPR 探针系统和FAM标记的野生型探针IDDS系统。iDDS探针包括： [0349] FAM-CCTACGCCACCAGCTC-Phos(SEQ ID NO.93)在200nM时 [0350] GAGGTGGTGGCGTAGG-BHQ1(SEQ ID NO.94)在400nM时 [0351] ZIPR探针包含： [0352] HEX-TGGATCATATTCGTCCACAAAA(SEQ ID NO.95)在200nM时 [0353] TTTTGAGGACGAATATGATCCA-BHQ1(SEQ ID NO.96)在400nM时 [0354] 侧翼引物为：CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA(SEQ ID N0.97) 在200nM时。 |
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