技术领域
[0001] 本
发明涉及兽医
生物制品技术领域，具体涉及一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法。
背景技术
[0002] 干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗
肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，IFN-γ对
机体免疫系统具有强大的调节作用，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分，因此，IFN-γ在
疾病的诊断、
治疗和
疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用，是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一，IFN-γ能进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的激活。
[0003] 当前高致病性猪蓝
耳病、高致病性禽流感、
口蹄疫、
猪瘟等重大动物疫病一直威胁着邕宁区
畜牧业的健康发展，目前对于IFN-γ的研究集中在其作为免疫佐剂增强疫苗毒株的免疫增强作用上，而将IFN-γ作为
饲料添加剂的应用鲜有报道，本研究将进一步推动新型的免疫增强剂IFN-γ在猪病免疫防治中的应用，为猪病防治提供新的方法和思路。
发明内容
[0004] 本发明为解决上述技术问题，提供了一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法。
[0005] 具体是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0008] a、
发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，35～36℃，300～320rpm震荡培养1.5～2h，得大肠杆菌菌液，将其按1：90～100的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0009] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，
冰浴10min，倒入离心管中，以4000～5000rpm离心5～7min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴20～30min，再以4000～5000rpm离心10～15min，去除上清液。
[0010] 提取液是将0.15～0.2mol/L的CaCl2、0.45～0.6mol/L的EDTA和
葡萄糖按1∶0.65～0.85∶1.5～2的体积比混合。
[0011] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌15～20min，置于沸
水浴中加热15～20min，冷却至20～25℃，加入悬浮液等
质量的异戊醇，4000～5000rpm离心取沉淀。
[0012] (2)微胶囊：将10～15份聚乙烯醇、15～20份乙基
纤维素、6～10份木质素、3～5.5份
淀粉和40～60份的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入5～7份的海藻酸钠、2.5～3份的明胶，70℃下水浴搅拌20～30min，
真空干燥。
[0013] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1～1.5μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.3～0.5倍的丙
酮和沉淀质量的0.5～0.6倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100份日粮中添加0.05～0.1份的微胶囊，拌匀。
[0014] 进一步，所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨4～7、葡萄糖4～7、白头翁10～15、地锦草4～7、
马齿苋8～12、黄柏2～4、0.01～0.02％的生理盐水50～60。
[0015] 进一步，所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎20～25min，真空
压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，30～40℃下搅拌15～20min，再混入0.01～0.02％的生理盐水，拌匀，控制培养基的
温度为25℃即可。
[0016] 进一步，所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和
橄榄油按1∶0.2～0.4∶0.35～0.45的质量比混合制得。
[0017] 所述的冰浴，温度为4～7℃。
[0018] 综上所述，本发明的有益效果在于：本发明对机体免疫系统具有强大的调节作用，进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的激活，添加在饲料中能有效的提高猪自身的免疫
力，对目前高致病性猪蓝耳病、高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟等重大动物疫病有很好的免疫效果，有效的提高猪的存活率，减少疾病的发生，减少养殖成本。
具体实施方式
[0019] 下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本
实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明
权利要求所要求保护的范围。
[0020] 实施例1
[0021] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0022] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0023] a、发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5a菌株中，35℃，300rpm震荡培养1.5h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶90的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0024] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，冰浴10min，倒入离心管中，以4000rpm离心5min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴20min，再以4000rpm离心10min，去除上清液。
[0025] 提取液是将0.15mol/L的CaCl2、0.45mol/L的EDTA和葡萄糖按1∶0.65∶1.5的体积比混合。
[0026] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌15min，置于沸水浴中加热15min，冷却至20℃，加入悬浮液等质量的异戊醇，4000rpm离心取沉淀。
[0027] (2)微胶囊：将10g聚乙烯醇、15g乙基
纤维素、6g木质素、3g淀粉和40g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入5g的海藻酸钠、2.5g的明胶，70℃下水浴搅拌20min，真空干燥。
[0028] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.3倍的丙酮和沉淀质量的0.5倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.05g的微胶囊，拌匀。
[0029] 所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨4g、葡萄糖4g、白头翁10g、地锦草4g、马齿苋8g、黄柏2g、0.01％的生理盐水50g。
[0030] 所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎20min，真空压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，30℃下搅拌15min，再混入0.01％的生理盐水，拌匀，控制培养基的温度为25℃即可。
[0031] 所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和橄榄油按1∶0.2∶0.35的质量比混合制得。
[0032] 实施例2
[0033] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0034] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0035] a、发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，320rpm震荡培养2h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶100的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0036] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，冰浴10min，倒入离心管中，以5000rpm离心7min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴30min，再以5000rpm离心15min，去除上清液。
[0037] 提取液是将0.2mol/L的CaCl2、0.6mol/L的EDTA和葡萄糖按1∶0.85∶2的体积比混合。
[0038] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌20min，置于沸水浴中加热20min，冷却至25℃，加入悬浮液等质量的异戊醇，5000rpm离心取沉淀。
[0039] (2)微胶囊：将15g聚乙烯醇、20g乙基纤维素、10g木质素、5.5g淀粉和60g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入7g的海藻酸钠、3g的明胶，70℃下水浴搅拌30min，真空干燥。
[0040] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1.5μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.5倍的丙酮和沉淀质量的0.6倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.1g的微胶囊，拌匀。
[0041] 所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨7g、葡萄糖7g、白头翁15g、地锦草7g、马齿苋12g、黄柏4g、0.02％的生理盐水60g。
[0042] 所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎25min，真空压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，40℃下搅拌20min，再混入0.02％的生理盐水，拌匀，控制培养基的温度为25℃即可。
[0043] 所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和橄榄油按1∶0.4∶0.45的质量比混合制得。
[0044] 实施例3
[0045] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0046] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0047] a、发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，33℃，310rpm震荡培养1.8h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶95的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0048] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，冰浴10min，倒入离心管中，以4500rpm离心6min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴25min，再以4500rpm离心13min，去除上清液。
[0049] 提取液是将0.18mol/L的CaCl2、0.52mol/L的EDTA和葡萄糖按1∶0.7∶1.8的体积比混合。
[0050] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌18min，置于沸水浴中加热18min，冷却至23℃，加入悬浮液等质量的异戊醇，4500rpm离心取沉淀。
[0051] (2)微胶囊：将13g聚乙烯醇、18g乙基纤维素、8g木质素、4g淀粉和50g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入6g的海藻酸钠、2.8g的明胶，70℃下水浴搅拌25min，真空干燥。
[0052] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1.3μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.4倍的丙酮和沉淀质量的0.55倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.08g的微胶囊，拌匀。
[0053] 所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨5g、葡萄糖6g、白头翁13g、地锦草5g、马齿苋10g、黄柏3g、0.015％的生理盐水55g。
[0054] 所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎23min，真空压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，35℃下搅拌18min，再混入0.015％的生理盐水，拌匀，控制培养基的温度为25℃即可。
[0055] 所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和橄榄油按1∶0.3∶0.4的质量比混合制得。
[0056] 实施例4
[0057] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0058] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0059] a、发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，300rpm震荡培养1.5h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶90的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0060] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，冰浴10min，倒入离心管中，以4000rpm离心7min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴30min，再以4000rpm离心10min，去除上清液。
[0061] 提取液是将0.2mol/L的CaCl2、0.45mol/L的EDTA和葡萄糖按1∶0.85∶1.5的体积比混合。
[0062] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌20min，置于沸水浴中加热15～20min，冷却至20℃，加入悬浮液等质量的异戊醇，4000rpm离心取沉淀。
[0063] (2)微胶囊：将15g聚乙烯醇、15g乙基纤维素、10g木质素、3g淀粉和40g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入7g的海藻酸钠、3g的明胶，70℃下水浴搅拌20min，真空干燥。
[0064] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.3倍的丙酮和沉淀质量的0.6倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.05g的微胶囊，拌匀。
[0065] 所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨7g、葡萄糖4g、白头翁10g、地锦草4g、马齿苋12g、黄柏4g、0.01％的生理盐水50g。
[0066] 所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎20min，真空压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，30～℃下搅拌15min，再混入0.01％的生理盐水，拌匀，控制培养基的温度为25℃即可。
[0067] 所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和橄榄油按1∶0.4∶0.35的质量比混合制得。
[0068] 实施例5
[0069] 一种对猪有免疫增强活性的IFN-γ的制备方法，包括以下步骤：
[0070] (1)IFN-γ量产，包括以下步骤：
[0071] a、发酵：将IFN-γ质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中，36℃，300rpm震荡培养1.5h，得大肠杆菌菌液，将其按1∶95的体积比接种于发酵培养基中，发酵培养25h以上。
[0072] b、萃取：将步骤a中发酵后的菌液震荡搅拌，冰浴10min，倒入离心管中，以5000rpm离心7min，去除上清液，在剩余的菌体悬浮液中加入提取液，在冰浴20min，再以4000rpm离心10min，去除上清液。
[0073] 提取液是将0.2mol/L的CaCl2、0.45mol/L的EDTA和葡萄糖按1∶0.85∶1.5的体积比混合。
[0074] c、加热：取步骤b中的悬浮液，震荡搅拌15min，置于沸水浴中加热20min，冷却至25℃，加入悬浮液等质量的异戊醇，5000rpm离心取沉淀。
[0075] (2)微胶囊：将10g聚乙烯醇、15g乙基纤维素、6g木质素、5.5g淀粉和40g的蒸馏水混合得混合料，在100℃下水浴搅拌30min，冷却至常温后，加入5g的海藻酸钠、2.5g的明胶，70℃下水浴搅拌30min，真空干燥。
[0076] (3)配料：将步骤(2)中的微胶囊按1μm的厚度涂覆在步骤(1)中的沉淀上，加入微胶囊质量的0.3倍的丙酮和沉淀质量的0.5倍的乳化剂，拌匀，真空干燥至丙酮完全挥发，得到微胶囊，在100g日粮中添加0.05g的微胶囊，拌匀。
[0077] 所述的发酵培养基，由以下按重量份计的原料组成：蛋白胨7g、葡萄糖4g、白头翁10g、地锦草4g、马齿苋8g、黄柏2g、0.01％的生理盐水50g。
[0078] 所述的发酵培养基，是将白头翁、地锦草、马齿苋、黄柏按比例称取后，捣碎20min，真空压榨，得汁液，再加入蛋白胨和葡萄糖，40℃下搅拌15min，再混入0.01％的生理盐水，拌匀，控制培养基的温度为25℃即可。
[0079] 所述的乳化剂，卵磷脂、黄原胶和橄榄油按1∶0.2∶0.45的质量比混合制得。
[0080] 实验例
[0081] 随机选取生长健康、无病害的、不同年龄的猪若干头，随机分为两组，第一组在日粮中添加本发明进行喂养，第二组不添加，对两个组中的母猪的发情率和产仔数，仔猪的存活率及窝重，育肥猪的日增重及肉料比，进行测评，结果如表1所示，对猪蓝耳病、禽流感、口蹄疫、猪瘟的血清
抗体水平进行评测，结果如表2所示：
[0082] 表1
[0083]项目 第一组 第二组
母猪的发情率 72～78％ 60～65％
产仔数 11～13 10～12
仔猪的存活率 90～92％ 75～79％
平均每头初生仔猪的重量 1879.3g 1350.1g
育肥猪的日增重 512.3～556.2g 431.2～479.8g
育肥猪的肉料比 2.15～2.37∶1 1.55～1.75∶1
[0084] 表2
[0085]
