本发明属生物技术领域，涉及人胸腺素α原的全基因合成、基因工程和含 有胸腺素α原的制剂作为治疗人类免疫缺陷性疾病和癌症的治疗药物。

胸腺上皮细胞分泌的多种类激素在T淋巴细胞分化成熟的过程中起着重要 的作用。胸腺素α1就是此类多肽之一，它是由28个氨基酸残基组成的等电点 为4.2的酸性多肽，分子量为3KDa。它具有胸腺素组分V的部分功能。同时， 在从胸腺素组分V分离α1时，发现了另一组分，它由35个氨基酸残基组成， 其N-末端的28个氨基酸序列与胸腺素α1完全一致，具有与α1相同的生物 学活性，称之为胸腺素α2。并且α1与α2C-末端最后一个氨基酸皆为谷氨 酸，推测可能是某一分子较大的蛋白质在蛋白酶作用下分解成α1和α2两种活 性成分。

Haritos等在液氮中直接匀浆新鲜胸腺后，迅速放入煮沸的磷酸盐缓冲液， 以灭活内源蛋白酶，在进行蛋白分离时，并未发现胸腺素α1和α2，而得到一 个分子量为12KDa的酸性蛋白，其等电点为3.55。氨基酸序列分析表明，其N -末端的前28个氨基酸残基与α1序列相同，前35个与α2序列相同，因此将 该蛋白质称为胸腺素α原(prothymosinα，Pro Tα)。

以前胸腺素α原的基因克隆，都是通过PCR的方法，从其cDNA文库中扩增 基因，由于其DNA序列中GC含量较高，因而表达水平一般偏低。国外多采用融 合蛋白的方法进行表达，这又为以后的分离提取带来了困难，我们利用密码子 的兼并性降低了其DNA中的GC含量，选择了大肠杆菌偏爱的密码子，进行了全 基因合成，利用基因工程方法制备人胸腺素α原取得了成功。

本发明采用下述技术方案：

(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞 的差异，本发明专门设计合成了人胸腺素α原基因大肠杆菌偏爱密码子及富含 A、T(其中A、T含量超过50％，并且基因中连续G、C的个数不越过个)的全 DNA片段，它可以在不改变产物人胸腺素α原的氨基酸组成与排列顺序的基础 上，提高胸腺素α原基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤为首先设计DNA序 列，将全基因和起始、终止密码子、酶切位点等分成12个片段合成正、反两链， 然后再以正、反两条链的5′端第1段序列为正、反向引物，进行PCR扩增，得 到PCR产物与pUC19连接，测序正确后将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的 高效表达载体pBV220中，构建成胸腺素α原表达质粒pThα。它能在大肠杆菌 HB101和DH5α中高表达，使胸腺素α原占菌体总蛋白的20％左右，表达率经 100次以上传代不降低。

(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通 过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达25 左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在20-25％之间。产物表达量 可达每升培养物200mg以上。

(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、热处 理去除杂蛋白、阴离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。

所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点：①通过热 处理去除了90％以上的可溶性蛋白，而目标蛋白胸腺素α原无损失；②由于胸 腺素α原pI＜4，因而阴离子交换层析可去除几乎所有的杂蛋白；③最后一步凝 胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。本工艺对三批各22.5L发酵产物 纯化后每批可得纯品3-5g。

(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔 滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于人免疫缺陷 性疾病和癌症的治疗。

本品在体外能明显提高淋巴细胞玫瑰花结形成率，据此可以测定胸腺素α 原的生物活性。

胸腺素α原治疗病毒性肝炎或在增进免疫系统反应性方面的作用机理尚未 完全查明。在多个不同的活体外试验，它促使致有丝分裂原激活后的外周血淋 巴细胞的T细胞成熟作用，增加T细胞在各种抗原或有丝分裂原激活后产生各 种淋巴因子例如α，γ干扰素，白介素-2和白介素-3的分泌和增加T细胞上 的淋巴因子受体的水平。它同时通过对T4(帮助者/诱导者)细胞的激活作用 来增强异体和自体的人类混合的淋巴细胞反应。胸腺素α原可能影响NK前体细 胞的募集，前体细胞在暴露于干扰素后变得更有细胞毒性。在活体内，胸腺素 α原能增强经刀豆球蛋白激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌白介素-2和增加白 介素-2受体的表达作用。

本发明运用重组DNA技术，采用分段合成技术再拼接形成胸腺素α原全基 因，在不改变编码氨基酸的前提下，改变基因部分核苷酸，从而提高了产物的 表达，且产物以可溶性形式存在于大肠杆菌胞浆内，产物活性高。下游纯化方 式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于免疫缺陷性疾病、病 毒性肝炎和癌症的治疗，能得到显著的疗效。

本发明用下述实例进行说明：

实施例1、基因编码序列设计

采用大肠杆菌偏爱密码子，并在5′端加入ATG起始密码子和EcoRI酶切位 点，3′端引入BamHI酶切位点，全序列长352bp，分成12个片段合成，示意图 如下：

    P1  P2  P3  P4  P5  P6

5′————————————3′

3′————————————5′

      N6  N5  N4  N3  N2  N1

CGGAATTCATGTCTGATGCAGCTGTAGATACTAGCTCTGAAATCACTAC

TAAGGACTTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTGGAAAGAGCAGAAAA

TGGTAGAGACGCTCCTGCTAACGGTAATGCTGAGAATGAGGAAAACG

GTGAGCAGGAGGCTGACAATGAGGTAGACGAAGAAGAGGAAGAAGG

TGGTGAGGAAGAGGAGGAGGAAGAAGAAGGTGATGGTGAGGAAGAG

GATGGTGATGAAGATGAGGAAGCTGAGTCTGCTACTGGTAAGCGTGC

AGCTGAAGATGATGAGGATGACGATGTCGATACTAAGAAGCAGAAGA

CTGACGAGGATGACTGAGGATCCGC

P1：CGG AAT TCA TGT CTG ATG CAG ATG TAG ATA CT 32mer

P2：AGC TCT GAA ATC ACT ACT AAG GAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT G63mer

P3：GTA GAG ACG CTC CTG CTA ACG GTA ATG CTG AGA ATG AGG AAA ACG GTG AGC AGG AGG CTG ACA A64mer

P4：TGA GGT AGA CGA AGA AGA GGA AGA AGG TGG TGA GGA AGA GGA GGA GGA AGA AGA AGG TGA TGG T64mer

P5：GAG GAA GAG GAT GGT GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCT GCT ACT GGT AAG CGT GCA GCT GAA G64mer

P6：ATG ATG AGG ATG ACG ATG TCG ATA CTG AGA AGC AGA AGA CTG ACG AGG ATG ACT GAG GAT CCG C64mer

N1：G CGG ATC CTC AGT CAT CCT CGT CAG TCT TCT G32mer

N2：CT TCT TAG TAT CGA CAT CGT CAT CCT CAT CAT CTT CAG CTG CAC GCT TAC CAG TAG CAG ACT CA64mer

N3：G CTT CCT CAT CTT CAT CAC CAT CCT CTT CCT CAC CAT CAC CTT CTT CTT CCT CCT CCT CTT CT64mer

N4：CAC CAC CTT CTT CCT CTT CTT CGT CTA CCT CAT TGT CAG CCT CCT GCT CAC CGT TTT CCT CAT T64mer

N5：CT CAG CAT TAC CGT TAG CAG GAG CGT CTC TAG CAT TTT CTG CCT CTT CCA CAA CTT CCT TCT TC64mer

N6：T CCT TTA AGT CCT TAG TAG TGA TTT CAG GGC TAG TAT CTA CAG CTG CAT CAG ACA TGA ATT CCG64mer

实施例2、全长片段的克隆、测序鉴定

1)5′端磷酸化：将合成的12个片段用水溶解各取50pmol，40微升反应体 积，用T4多核苷酸激酶将ATP的γ-磷酸基转移到各片段的5′端，具体反应 条件为37℃，60min。然后70℃，5min灭活。

2)退火连接：上述反应产物，95℃，5min，于保温杯中缓慢降温(过夜)。 次日加T4 DNA连接酶，12℃过夜(12h以上)。

3)PCR扩增：以连接产物为模板，N1，P1为引物，63℃退火，72℃延伸40s， 30个循环。

4)回收PCR产物，双酶切后与同样酶切的质粒pUC19连接，转化到DH5α 受体菌，蓝白斑筛选获得阳性转化子，挑选10个转化子测序。

5)测序结果表明，上述10个转化子克隆只有一个序列与设计序列完全一 致(测得的核苷酸序列及相应的氨基酸序列见表1)。

实施例3、表达载体的构建

从pUC19/Thα酶切获得目的基因片段，回收后连接已双酶切的pBV220表 达载体，转化后用PCR方法筛选阳性克隆，且酶切正确。含有以上表达质粒(pTh α)的DH5α工程菌经扩增培养、温度诱导，在12kd左右多出一条蛋白条带。

实施例4、人胸腺素α原的发酵生产

工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到 OD600为2.0时，将温度升至42℃，此时胸腺素α原即诱导产生，4h后收集菌 体。在表达的不同时机加氮源、碳源等营养素。最终发酵产物密度可达OD600为 25，生物量为每升培养物30-35g。电泳鉴定胸腺素α原表达水平，薄层扫描显 示胸腺素α原占菌体总蛋白的20-25％之间。

实施例5、工程菌的保存及稳定性

工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用琼脂LB平板。为检查 工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定， 结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的 工程菌是十分稳定的。

实施例6、胸腺素α原的分离纯化

人胸腺素α原在菌体内以可溶性形式存在于菌体胞浆内，菌体破碎后离心 回收上清，上清80℃作用5min离心收集上清，产物得到初步纯化。上清再经 DEAE-Sepharose柱层析可以得到电泳纯的胸腺素α原。最后用Sephacryl S-100精制得到12kd的胸腺素α原。

实施例7、胸腺素α原产物的鉴定

SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，玫瑰花结实验表明其具有明显的 生物活性。N末端蛋白质序列分析与体内天然蛋白相同，顺序是 Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。

实施例8、无菌过滤、分装、冻干

根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂

重组人胸腺素α原每支含0.75、1.5和3.0mg，缓冲体系为10mM PB，pH6.8，5 ％甘露醇，以上辅料必须符合注射用药的要求。

无菌过滤：在环境洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤， 分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。

1   CG GAA TTC ATG TCT GAT GCA GCT GTA GAT ACT AGC TCT GAA ATC ACT ACT AAG GAC TTA

2                  Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu

                                                        10

1  AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCG GAA AAT GGT AGA GAC GCT CCT GCT AAC GGT

2  Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly

                20                                      30

1  AAT GCT GAG AAT GAG GAA AAC GGT GAG CAG GAG GCT GAC AAT GAG GTA GAC GAA GAA GAG

2  Asn Ala Glu Asn Glu Glu Asn Gly Glu Glu Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu

                40                                      50

1  GAA GAA GGT GGT GAG GAA GAG GAG GAG GAA GAA GAA GGT GAT GGT GAG GAA GAG GAT GGT

2  Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly

                60                                      70

1  GAT GAA GAT GAG GAA GCT GAG TCT GCT ACT GGT AAG CGT GCA GCT GAA GAT GAT GAG GAT

2  Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala ala Glu Asp Asp Glu Asp

                 80                                     90

1  GAC GAT GTC GAT ACT AAG AAG CAG AAG ACT GAC GAG GAT GAC TGA GGA TCC GC

2  Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp

               100                                     110

            表1.胸腺素α原cDNA及氨基酸序列

(1.核苷酸序列 2.氨基酸序列代__表根据密码子的兼并性、改动之处)