来自1989年美国Chiron公司的报道，以前被称之为非A非B型 肝炎病毒的人肝炎病毒的基因片段已经被克隆，命名为HCV (SCIENCE，Vol.244，359-362，1989)。HCV是基因组为一条链+RNA 链的病毒。此后，除了Chiron公司以外，国立癌症中心的下远野等人 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.87，9524-9528)、大阪大学微生 物研究所的高见等人(J.Virol，Vol.65，No.3，1105-1113，1990)也 发表了丙型肝炎病毒的全基因序列。后来知道在HCV中存在核、包膜1 (以下也称之为「E1」或「E1蛋白」)、包膜2(「E2/NS1」「E2/NS1 蛋白」)3种结构蛋白和6种非结构蛋白。
如果感染上HCV，得急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化的几率高，最终 转变为肝癌，使患者死亡。以往治疗中使用代表性抗病毒药是干扰素， 存在着治疗效果在患者中差异较大，以及发热等副作用的问题 (J.Med.Virol.，Vol.42，299-305，1994)(日消会誌， Vol.91，995-1002，1994)。
另外虽然也进行了使用利巴韦林等其它抗病毒药物的治疗研究， 但都没有获得十分满意的效果(Lancet，Vol.337，1058-1061，1991)、 现状就是期待着新的抗HCV药物的开发。
另外人们认为HCV基因非常容易变异，由于HCV的高变异性，它 可逃避患者体内的免疫。特别是在HCV的E2/NS1的N末端存在着由25 个到30个氨基酸构成的称之为hyper variable region(超可变区) 的富于变异的区域，按照加藤的预测人免疫系统的抗原表位可能不在 超可变区(J.Virol.，Vol.67，No.7，3923-3930，1993) (J.Virol.，Vol.68，No.8，4776-4784，1994)内。就是说，由于人 的免疫系统，例如中和抗体识别的区域处于超可变区内，中和抗体即 使在感染患者体内生成，但由于超可变区迅速变异病毒有可能逃避抗 体。然而石井等人的报告发现抑制E2/NS1与人T细胞Molt-4结合的 抗体以高活性只出现在自然治愈HCV感染的患者的血中，表明尽管HCV 的变异性高，但体液免疫与HCV  的治愈有关 (Hepatology，Vol.28，No.4，1117-1120，1998)。
而1999年美国Chiron公司分离出了E2/NS1结合的细胞表面蛋白 -CD81(SCIENCE，Vol.282，938-941，1999)。在大肠杆菌表达的CD81 与E2/NS1的结合就像石井等人报告的那样，而HCV自然治愈患者的血 清抑制这种结合。这一结果表明CD81是HCV的受体。
通过以上结果可以考虑如果利用与HCV感染细胞有密切关系的包 膜蛋白结合的，而且阻止与有HCV感染性人细胞结合的物质，例如抗 体那样的物质作为药物，就有可能阻止血中的HCV再感染肝脏等感染 对象，就有可能使患者治愈。然而现状是就针对起因于HCV疾病的阻 止感染物质还没有进行充分地研究。
发明公开
人们已了解到HCV由于是RNA病毒，所以非常容易变异。通过变 异无论是在HCV的结构蛋白、还是在非结构蛋白中的各种各样的部位 都发生了变异。人们认为由于变异使得开发阻止HCV感染的物质，例 如识别特定蛋白序列的抗体等变得困难。然而本发明人注意到尽管感 染每一治愈患者的病毒的序列不同，但石井等人报告中的中和抗体可 阻止与一种E2/NS1的结合。就是说，如果是识别抗原的特定区域或结 构的物质，不管病毒序列的多样性如何，都阻止E2/NS1与有HCV感染 性的人细胞、CD81表达细胞或CD81的结合，就有可能阻止感染。
在本发明中，为了开发改善丙型肝炎患者症状的药物，又进行了 抑制E2/NS1与有HCV感染性的细胞、CD81表达细胞或CD81结合的物 质的探索，结果获得了期待的阻止HCV与有HCV感染性细胞结合和感 染的物质。
即本发明提供抑制丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白与有感染性的丙型 肝炎病毒细胞、表达CD81的细胞或CD81结合的物质。
按照本发明的理想模式，可以提供：以通过与含有丙型肝炎病毒 E2/NS1蛋白的带正电荷的区域结合，能够抑制丙型肝炎病毒的E2/NS1 蛋白与有感染性的丙型肝炎病毒细胞、表达CD81的细胞或CD81结合 为特征的物质；以丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的 E2/NS1蛋白上带有可识别该E2/NS1蛋白的物质的蛋白质为特征的物 质；以丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白 上带有通过荧光法或发色法可检测该E2/NS1蛋白的物质的蛋白质为 特征的物质；以丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的 E2/NS1蛋白上带有标记的蛋白质为特征的物质；以丙型肝炎病毒的 E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的C末端带有标记的蛋 白质为特征的物质；以表达CD81的细胞是表达人CD81的细胞为特征 的物质；以CD81是可溶表达的人CD81为特征的物质；以与丙型肝炎 病毒的E2/NS1蛋白的结合常数在108以上，而解离常数在10-8以下为 特征的物质；以结合常数在109以上，或解离常数在10-9以下为特征的 物质；以物质是蛋白质、硫酸化多糖类或低分子化合物为特征的物质； 以蛋白质是抗体为特征的物质；以抗体来自丙型肝炎治愈患者B细胞 为特征的物质；以抗体来自丙型肝炎治愈患者的B细胞的基因为特征 的物质；以及以丙型肝炎治愈患者是自然治愈患者，B细胞是周围血单 核细胞为特征的物质。
本发明另一方面还可以提供：
H链可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列号1、2和3 记载的氨基酸序列，或是含有在序列号1、2和3记载的氨基酸序列中 缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病 毒E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号16或34记载的氨基酸序列，或含有在序 列号16或34记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基 酸的氨基酸序列为特征的上述抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列表中序列 号4、5和6记载的氨基酸序列，或含有在序列号4、5和6记载的氨 基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对 丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号17记载的氨基酸序列，或在序列号17记 载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列 为特征的上述抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列号7、8 和9记载的氨基酸序列，或含有在序列号7、8和9记载的氨基酸序列 中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎 病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号18记载的氨基酸序列，或在序列号18记 载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列 为特征的上述抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列号10、11 和12记载的氨基酸序列，或含有在序列号10、11和12记载的氨基酸 序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型 肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号19记载的氨基酸序列，或在序列号19记 载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列 为特征的抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列号13、14 和15记载的氨基酸序列，或含有在13、14和15记载的氨基酸序列中 缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病 毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号20记载的氨基酸序列，或含有在序列号20 记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序 列为特征的上述抗体。
本发明另一方面还可以提供：L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及 CDR-3分别含有序列表的序列号42、43和44记载的氨基酸序列，或 含有在序列号42、43和44记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1 个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲 和性的抗体；
以含有序列表中序列号54记载的氨基酸序列，或含有在序列号54 记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序 列为特征的上述抗体；
本发明另一方面还可以提供：L链的可变区的CDR-1、CDR-2以 及CDR-3分别含有序列表的序列号45、46和47记载的氨基酸序列， 或含有在序列号45、46和47记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1 个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲 和性的抗体；
以含有序列表中序列号55记载的氨基酸序列，或含有在序列号55 记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序 列为特征的上述抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列表中序列 号48、49和50记载的氨基酸序列，或含有在序列号48、49和50记 载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列， 并对丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号56记载的氨基酸序列，或含有在序列号56 记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序 列为特征的上述抗体；
L链的可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别含有序列号51、52 和53记载的氨基酸序列，或含有在序列号51、52和53记载的氨基酸 序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型 肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
以含有序列表中序列号57记载的氨基酸序列，或含有在序列号57 记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序 列为特征的上述抗体。
本发明另一方面还提供作为重链的氨基酸序列含有序列表中序列 号40记载的氨基酸序列，或含有在序列号40记载的氨基酸序列中缺 失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病毒 的E2/NS1蛋白有亲和性的抗体；
作为轻链的氨基酸序列含有序列表中序列号41记载的氨基酸序 列，或含有在序列号41记载的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或 数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性 的抗体。
本发明另一方面还提供含有序列表中序列号26、27、28或29记 载的氨基酸序列，或含有在序列号26、27、28或29记载的氨基酸序 列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的单链抗体。
本发明另一方面还提供含有序列表中序列号36、37、38或39记 载的氨基酸序列，或含有在序列号36、37、38或39记载的氨基酸序 列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的单链抗体。
本发明另一方面还提供含有序列表中序列号62、63、64或65记 载的氨基酸序列，或含有在序列号62、63、64或65记载的氨基酸序 列中缺失、置换或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，并对丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白有亲和性的单链抗体。
本发明另一方面还提供编码上述本发明抗体的核酸。提供的比较 理想的上述核酸是含有序列表中序列号21、22、23、24、25、35、58、 59、60、61中任一个记载的碱基序列的上述核酸；含有序列号40或 41记载的碱基序列的上述核酸；含有序列表中序列号26、27、28、29 中任一个序列记载的碱基序列的上述核酸；含有序列表中序列号36、 37、38、39中任一个序列记载的碱基序列的上述核酸；含有序列表中 序列号62、63、64、65中任一个序列记载的碱基序列的上述核酸。
本发明另一方面还提供应用上述任一个核酸生产抗体的方法。
本发明另一方面还提供应用上述方法可以获得的对丙型肝炎病毒 的E2/NS1蛋白有亲和性的重组抗体。提供的理想的重组抗体是抗体的 Fc区是人源化重组抗体，抗体是单链抗体。
本发明另一方面还提供含有上述本发明物质作为有效成分的药 物，含有上述本发明的抗体作为有效成分的药物，含有上述本发明的 重组抗体作为有效成分的药物。提供的理想药物是治疗和/或预防丙型 肝炎的药物，以及用于诊断丙型肝炎的药物。另外本发明提供含有上 述本发明的物质作为有效成分的抗HCV剂、含有上述本发明的抗体作 为有效成分的抗HCV剂、含有上述本发明的重组抗体作为有效成分的 抗HCV剂。
本发明另一方面还提供获得抗体可变区序列的方法，其特征是： 刺激丙型肝炎治愈患者的B细胞，使抗丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的 抗体的mRNA表达，从该B细胞获得抗体mRNA和抗体cDNA，获得与该 E2/NS1结合的抗体的可变区序列。理想的是以丙型肝炎治愈患者是自 然治愈患者、B细胞是周围血单核细胞为特征的获得抗体可变区序列的 方法。
本发明另一方面还提供含有利用上述方法获得的具有可变区序列 的抗体。
本发明另一方面还提供包括在被检验物质存在或不存在情况下使 丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白与有丙型肝炎病毒感染性的细胞、表达 CD81的细胞或CD81接触的工序；以及在被检验物质存在或不存在情 况下对丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白与有丙型肝炎病毒感染性的细 胞、表达CD81的细胞或CD81结合进行比较的工序的，对抑制丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白与有丙型肝炎病毒感染性的细胞、表达CD81的 细胞或CD81结合的物质进行筛选的方法。比较理想的是提供以丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白是丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上带有可识别该 E2/NS1蛋白的物质的蛋白为特征的筛选方法，以丙型肝炎病毒的 E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上带有通过荧光法或发 色法可检测出该E2/NS1蛋白的物质的蛋白质为特征的筛选方法；以丙 型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上带有标 记的蛋白质为特征的筛选方法；以丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白是在丙 型肝炎病毒的E2/NS1蛋白的C末端带有标记的蛋白质为特征的筛选方 法；以表达CD81的细胞是表达人CD81的细胞为特征的筛选方法；以 CD81是可溶表达的人CD81为特征的筛选方法；以被检验物质为蛋白 质、硫酸化多糖类或低分子化合物为特征的筛选方法。
本发明另一方面还提供由上述任一筛选方法得到的，抑制丙型肝 炎病毒的E2/NS1蛋白与有丙型肝炎病毒感染性的细胞、表达CD81的 细胞或CD81结合的物质。
本发明另一方面还提供抑制丙型肝炎病毒生活环境的物质，该丙 型肝炎病毒是通过包括在被检验物质存在或不存在情况下测定有HCV 感染性的细胞和表达HCV蛋白的细胞的结合，与没有被检验物质存在 情况下的结合进行比较的工序的筛选方法得到的；以及提供抑制丙型 肝炎病毒生活环境的物质，该丙型肝炎病毒是通过包括在被检验物质 存在或不存在情况下在有HCV感染性的细胞和表达HCV蛋白的细胞结 合后，对被检验物质与有HCV感染性细胞或表达HCV蛋白的细胞的融 合进行测定，与没有被检验物质存在情况下的融合进行比较的工序的 筛选方法得到的。理想的被检验物质是蛋白质、硫酸化多糖类或低分 子化合物。
本发明另一方面还提供含有上述物质作为有效成分的抗HCV剂； 以及提供使用上述物质包括使抗HCV剂制剂化的抗HCV剂的制造方 法，该制造方法最好包括利用上述筛选方法确认抑制丙型肝炎病毒增 殖的工序。
附图的简单说明
图1是表示本发明的抗体scFv1-1和scFv1-4中和活性图。
图2是表示肝素的中和活性图。
图3表示舒拉明中和活性图。
图4是表示修饰scFv的NOB活性图。
图5是表示whole抗体的NOB活性图。
图6是表示whole抗体的抑制细胞融合(cell fusion)活性图。
图7是表示表达质粒pEX gammal loxP-Hyg HCVI的构建图。
图8是表示表达质粒pEX kappa Km HCVI的构建图。
图9是表示表达质粒pEX loxP-Hyg HCVI W的构建图。
实施发明的最好方式
以下就本发明进行详细地说明。
本发明的物质是抑制丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白与有丙型肝炎病 毒感染性细胞(以下有时也称之为「HCV感染性细胞」)、表达CD81 的细胞(以下有时也称之为「CD81表达细胞」)或CD81结合的物质。
以下就对上述那样的物质进行筛选，各种物质是否有抑制E2/NS1 与HCV感染性细胞、表达CD81的细胞或CD81结合的可能性进行说明。
象上述那样，HCV的包膜蛋白中含有E1和E2/NS1。人们预测其中 称之为E2/NS1超可变区的富于变异区域可能不是人免疫系统的抗原 表位。就是说，由于人们预料E2/NS1与作为病毒感染的第一阶段-与 细胞结合有密切关系，所以在本发明中进行到将阻止E2/NS1与HCV感 染性细胞、CD81表达细胞或CD81结合的物质作为阻止HCV与细胞结 合或感染的物质开发的地步。
E2/NS1是由HCV基因组表达的蛋白质的第384位氨基酸到746位 氨基酸的蛋白质。在本发明中E2/NS1与HCV感染细胞的结合可以通过 例如使在HCV基因的E2/NS1的C末端带有标记的蛋白以可溶性形式表 达，然后与HCV感染性细胞或CD81表达细胞结合，使用针对其标记的 抗体，通过发光法或发色法进行确认E2/NS1与上述细胞的结合。抑制 结合的物质是通过在确认结合的系统中可溶性E2/NS1与上述细胞结 合之前使E2/NS1与希望确认抑制结合的物质混合，然后与该细胞混合 之后通过测定发光或发色的变化进行确认的。抑制结合的物质虽然后 面进行了详细的叙述，例如有H链中存在序列号1到3记载的氨基酸 序列，L链中存在序列号4到6记载的氨基酸序列的抗体、肝素、苏拉 明等，但只要是对E2/NS1与HCV感染性细胞或CD81表达细胞结合有 抑制的物质即可，并不受此限定。另外由于可溶性CD81和E2结合也 有报道(SCIENCE，Vol.282，938-941)，所以容易类推使用上述物质 也有可能抑制可溶性CD81和E2的结合。
人们已经知道肝素等硫酸化多糖类带负电荷多，与抗凝血酶III 和成纤维细胞生长因子等蛋白中带正电荷多的区域结合(FEBS Lett，Vol.69，51-54，1976)(Cell，Vol.64，841-848，1991)。另外 就像后面的实施例所表明的那样，在本发明中发现了E2/NS1与肝素结 合。就是说，可以很容易类推在实施例给出的物质中，肝素通过与 E2/NS1的正电荷多的部位结合，抑制E2/NS1与HCV感染性细胞或CD81 表达细胞或CD81的结合。即只要是与E2/NS1含有正电荷多的部位结 合的物质，有可能抑制E2/NS1与HCV感染性细胞、CD81表达细胞或 CD81的结合。
另外由于肝素等硫酸化多糖类与糖蛋白结合时影响该蛋白表面的 电荷，也引起结构上的变化，所以在本发明中虽然对硫酸化多糖类与 E2/NS1的结合进行了确认，但也可以想象到上述那样的结构变化也与 E2/NS1与HCV感染性细胞或CD81表达细胞或CD81的结合有关。
这里所说的带负电荷或正电荷是指存在于蛋白或与蛋白结合的糖 链上的带有电荷的地方。在本发明中E2/NS1作为与肝素琼脂糖CL-6B (Phamacia公司)结合，在没有用含有0.15M的NaCl的10mM磷酸缓 冲液洗脱时与柱子结合的结构域。
在本发明中所谓可识别丙型肝炎病毒E2/NS1蛋白的物质是指利用 象以下那样带有标记的蛋白、半抗原等的抗体可检测该E2/NS1蛋白的 物质。
本发明所谓的在丙型肝炎病毒E2/NS1蛋白上带有标记的蛋白例如 只要是在由HCV基因组上的384位到711位氨基酸构成的蛋白质的C 末端上附加上由众所周知的Etag(Phamacia公司)、Histag、myctag、 FLAGtag、HAtag、GST、IgG Fc区域等5个以上氨基酸构成的可被特 异抗体识别的序列即可，并没有特别限定。进一步讲，就像先前讨论 的那样，人们认为在HCV的E2/NS1的N末端存在称之为超可变区的免 疫系统的抗原表位。因此使E2/NS1结合上标记使其表达时，有希望使 用C末端结合标记的E2/NS1。而这样得到的蛋白质是可溶性的。该可 溶性E2/NS1只要是使384位到746位氨基酸间的E2/NS1的膜外结构 域表达即可，可以无特别限制地使用。带有标记的可溶性蛋白E2/NS1 可以使其在动物细胞、昆虫细胞、酵母等蛋白上可能附加糖链的细胞 中表达。
而所谓在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上加上通过半抗原等的抗体 等可检出的物质的蛋白指的是例如E2/NS1在使384位到746位氨基酸 间的E2/NS1的膜外结构域表达的产物上结合生物素、荧光素、DIG等 可被抗体等识别的低分子物质。其中识别低分子的物质例如象例举的 生物素由于除了抗体以外也可以被抗生物素蛋白、链抗生物素蛋白等 蛋白所识别，所以只要是识别该物质的物质即可，不一定非得是抗体 和蛋白质。
另外在所谓的在丙型肝炎病毒的E2/NS1蛋白上带有通过荧光法、 发色法可检出的物质的蛋白指的是例如E2/NS1在使384位到746位氨 基酸间的E2/NS1的膜外结构域表达的产物结合上FITC、碱性磷酸酶、 HRP等发荧光的物质，或该物质与某物质、例如酶的底物混合时发色的 物质，并没有特别限定。
本发明所谓的有HCV感染性细胞指的是作为HCV可以增殖或感染 的细胞如Huh7、HepG2、WRL68等人肝细胞以及Molt-4、MT-2、Daudi 等淋巴系细胞，只要是确认HCV感染性的细胞即可，即使不是这里提 到的细胞也可以。
所谓表达CD81的细胞举一个例子，如利用脂质转染法(GIBCO BRL)将在invitrogen公司的pCDNA3.1(+)的多克隆位点插入了人 的CD81基因(Gen Bank登录号M33680)的载体导入NIH3T3细胞后 的细胞，但只要CD81在通过基因重组常规方法构建的细胞中的表达能 够利用蛋白质印迹法、抗CD81抗体的荧光检测法、RNA印迹法等可检 测蛋白或mRNA的方法确认，在本发明中CD81表达用的载体、表达细 胞、基因导入法没有特别限定。
在本发明中在选择抑制E2/NS1与CD81结合的物质时，这里说的 CD81也可以利用可溶性人CD81。可溶性人CD81只要是可使CD81的膜 外结构域表达即可，使用上没有特别限制。可溶性CD81使用动物细胞、 昆虫细胞、酵母和大肠杆菌等利用基因重组常规方法使其表达是可能 的。另外也没有必要只使可溶性CD81的膜外结构域表达，例如为了纯 化或检测目的即使是加上标记的产物或进行修饰的产物也没有问题。
而在使用针对标记的抗体检出E2/NS1与HCV感染性细胞或CD81 表达细胞或CD81结合的方法如发光法、发色法，理想的是流式细胞仪、 cell ELISA法、ELISA法等。但只要是可以检测出E2/NS1与CD81表 达细胞或CD81结合的方法即可，没有特别限定。
所谓本发明的抗体除了包括通常生物体内存在的抗体外，也包括 至少含有一个由抗体的H链或L链的可变区或它们的组合形成的抗原 结合部位的肽、由1组H链片段和L链片段构成的Fab、由2组H链片 段和L链片段构成的F(ab)2、H链片段和L链片段串连结合在同 一个肽的单链抗体(以下有时也称之为「scFv」)。在本发明中whole 抗体最理想。
在本发明中单克隆抗体是通过从丙型肝炎治愈患者的B细胞获得 的抗体的基因制作的。作为从来自人的多个B细胞只分离目的抗体基 因的方法有用EBV转化患者B细胞之后，使B细胞增殖后，只克隆生 产目的抗体的细胞等以往的手法，但本发明人通过深入研究，结果利 用噬菌体展示法获得了scFv。
举一个利用噬菌体展示法获得抗体的例子，从丙型肝炎治愈患者 进行肝素采血，使用Ficoll法获得周围血单核细胞，利用抗CD19抗 体单抗只纯化B细胞。然后使用人IL-2、人IL-10、E2/NS1抗原 1ng/ml、抗人CD40抗体1μg/ml，刺激B细胞中抗体基因向mRNA的 转录。该B细胞的纯化只要是能够特异地分离B细胞的方法即可，并 没有特别限制。而有关B细胞的刺激也可以利用上述以外的方法，即 使使用适当简略的方法也没有问题。然后从B细胞提取抗体mRNA，进 一步获得抗体cDNA。接下来在scFv表达质粒制作整合H链和L链可 变区的基因的单链抗体基因的框架，再于框架的下游结合上M13噬菌 体的gene3基因。在整合抗体的H链和L链的可变区地方整合从上述 得到的cDNA利用PCR法随机获得的H链和L链。利用该质粒以与gene3 蛋白的融合蛋白形式使整合的单链抗体在M13噬菌体的前端表达，然 后通过只选择与E2/NS1结合的抗体，获得表达H链的可变区的CDR1、 CDR2以及CDR3分别是序列表中序列号1、2和3记载的氨基酸序列， L链的可变区的CDR1、CDR2以及CDR3的序列分别是序列表中序列号 4、5和6记载的氨基酸序列的单链scFv1-1以及表达该scFv1-1的噬 菌体。而且发现scFv1-1和表达该scFv1-1的噬菌体对E2/NS1的亲 和性特别强，强烈地抑制E2/NS1与HCV感染性细胞或CD81表达细胞 或CD81的结合。
另外上述例举了使用M13噬菌体系统筛选单链抗体的手法，在本 发明中「抗体」和噬菌体表面提示蛋白只要是以融合蛋白形式表达的 手法即可，没有特别限制。
本发明提到的丙型肝炎治愈患者指的是检测血液中HCV的mRNA， 测定肝功能的值，例如ALT等值发现异常，即处于所谓丙型肝炎状态 的患者的血液中的HCV的mRNA处于检测界限以下，ALT等肝功能测定 值连续6个月以上处于正常状态的患者。
上述作为本发明抗体代表性例子例举的scFv1-1使用BIACORE (BIACORE公司)测定与E2/NS1的结合常数Ka为4.5×108(M)，解 离常数Kd为2.2×10-9(1/M)。本发明人获得了多个带有与scFv1-1 相同的可变区的H链而L链可变区不同的单链抗体，对各个单链抗体 的结合能力与抑制E2/NS1与HCV感染性细胞以及人CD81表达细胞结 合的能力进行比较时，发现各个单链抗体的结合能力与阻止E2/NS1与 细胞结合的能力存在相关性。其中结合常数在108(M)以上，解离常数 在10-8(1/M)以下的单链抗体scFv1-1从其抑制活性可以判断作为药 物的能力是充分的。就是说，通过用BIACORE测定，与E2/NS1的结合 常数在108(M)以上，解离常数在10-8(1/M)以下的抗体作为阻止感 染HCV感染性细胞的药物更理想。为了进一步提高抗体的能力，结合 常数为109(M)以上，解离常数为10-9(1/M)以下的抗体作为药物最 理想。
通常的抗体是由两种大小的多肽链构成的，大的亚基称为「H链」， 小的亚基称为「L链」。而各个肽链是由存在于N末端形成抗原结合部 位的「可变区」和与抗体类别有关的一定的「恒定区」构成的。可变 区又可进一步分为与抗原结合部位的形成有特别密切关系的互补决定 区「CDR」和存在于该区域之间的「框架」。已知CDR在H链和L链中 从N末端开始分别存在着称之为「CDR1」、「CDR2」和「CDR3」的3 个区域。
以下举例说明本发明的抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和 ScFv1-4。抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的氨基酸序 列记载于序列表中序列号1至20，DNA序列记载于序列号21至25。
构成抗体可变区的氨基酸往往因抗体不同而不同。ScFv1-1的H 链的部分氨基酸序列如序列号16所示。而序列号16是表示为使scFv 在大肠杆菌表达的序列、即scFv1-1的H链的N末端附加了2个氨基 酸的序列。因此考虑到作为抗体的框架，给出了由序列号16氨基酸的 第3位到32位构成的框架1、从第33位到37位的「CDR1」、第38 位到51位构成的框架2、从第52位到68位的「CDR2」、第69位到 100位的框架3、从第101位到117位的「CDR3」、第118位到128 位构成的框架4。ScFv1-1的L链的部分氨基酸序列如序列号17所示。 序列号17氨基酸的第1位到23位构成的框架1、从第24位到34位的 「CDR1」、第35位到49位构成的框架2、从第50位到56位的「CDR2」、 第57位到88位的框架3、从第89位到97位的「CDR3」、第98位到 111位构成的框架4。ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H链氨基酸序 列都如序列号16所示。而关于L链分别如下面所示那样。ScFv1-2的 L链的部分氨基酸序列如序列号18所示。序列号18氨基酸的第1位到 23位构成的框架1、从第24位到34位的「CDR1」、第35位到49位 构成的框架2、从第50位到56位的「CDR2」、第57位到88位的框 架3、从第89位到97位的「CDR3」、第98位到111位构成的框架4。 ScFv1-3的L链的部分氨基酸序列如序列号19所示。序列号19氨基 酸的第1位到23位构成的框架1、从第24位到34位的「CDR1」、第 35位到49位构成的框架2、从第50位到56位的「CDR2」、第57位 到88位的框架3、从第89位到97位的「CDR3」、第98位到111位 构成的框架4。ScFv1-4的L链的部分氨基酸序列如序列号20所示。 序列号20氨基酸的第1位到22位构成的框架1、从第23位到36位的 「CDR1」、第37位到51位构成的框架2、从第52位到58位的「CDR2」、 第59位到90位的框架3、从第91位到102位的「CDR3」、第103位 到116位构成的框架4。这些框架和CDR的分界是参考Kabat等人的 「免疫学上有用蛋白的序列」(National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987)和(1991)决定的。
在ScFv的制备中可以利用重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System(Phamacia公司))等，但该单链抗体对于 作为生产宿主的大肠杆菌有毒性，会引起大肠杆菌死亡、该单链抗体 分解那样的情形，所以不能有效利用试剂盒就需要更多的办法。单链 抗体可以通过研究pSE380质粒(invitrogen公司)和pET24d(+) 质粒(Novagen公司)等的诱导性载体和作为宿主的菌体制备。另外 在生产中除了上述方法外，也可以有效利用动物细胞表达系统、昆虫 细胞表达系统、酵母细胞表达系统。连接H链和L链的铰链在实施例 中使用了3个重复的(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)共15个残基的氨基酸， 在本发明中不限定于本序列，也可以利用其它序列。
序列表中序列号21给出了相当于序列表中序列号16的第1位到 128位的氨基酸序列的核酸碱基序列。序列表中序列号22给出了相当 于序列表中序列号17的第1位到111位的氨基酸序列的核酸碱基序 列。序列表中序列号23给出了相当于序列表中序列号18的第1位到 111位的氨基酸序列的核酸碱基序列。序列表中序列号24给出了相当 于序列表中序列号19的第1位到111位氨基酸序列的核酸碱基序列。 序列表中序列号25给出了相当于序列表中序列号20的第1位到116 位的氨基酸序列的核酸碱基序列。而在这些碱基序列中只要表现出本 发明叙述的那样的效果，缺失、置换或附加1个或数个碱基的碱基序 列也都包括在本发明的范围内。
抗体的抗原特异性和与抗原结合的强度主要由CDR的氨基酸序列 决定，这是通过小鼠抗体的人源化表示的(Methods in Enzymology，203，99-121，1991)。
另外由scFv制作通常存在于生物体内的抗体是有可能的。举一个 例子，利用PCR法从与E2/NS1结合的scFv的质粒只扩增H链和L链 的可变区部分。扩增的各个片段重组到例如含有人抗体的H链基因和/ 或L链基因的质粒，作成带有处于上述ScFv可变区的存在于通常生物 体内形式的抗体是有可能的。具体来说，例如在通过从质粒扩增H链 和L链的可变区时得到的基因片段的两端引入适当的限制酶切位点， 然后与含有人抗体的H链和/或L链的质粒上的适当的限制酶切位点组 合，为了不引起框架漂移可改换可变区的基因。利用这样的方法制作 保持原有处于质粒上的可变区序列的出现在通常生物体内的抗体是有 可能的。由该抗体制作至少含有一个由抗体的H链或L链的可变区或 它们的组合形成的抗原结合部位的肽、由1组H链片段和L链片段构 成的Fab、2组H链片段和L链片段构成的(Fab’2)也是有可能的。
另外通过置换下列本发明给出的抗体的序列有可能提高与E2/NS1 的结合能力以及中和活性，这些抗体是：H链可变区的CDR-1、CDR-2 以及CDR-3分别是序列号1、2和3记载的氨基酸序列，L链可变区的 CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别是序列号4、5和6记载的氨基酸序列 的抗体；或者H链可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别是序列号1、 2和3记载的氨基酸序列，L链可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分 别是序列号7、8和9记载的氨基酸序列的抗体；或者H链可变区的 CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别是序列号1、2和3记载的氨基酸序列， L链可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3分别是序列号10、11和12记 载的氨基酸序列的抗体；或者H链可变区的CDR-1、CDR-2以及CDR-3 分别是序列号1、2和3记载的氨基酸序列，L链可变区的CDR-1、CDR-2 以及CDR-3分别是序列号13、14和15记载的氨基酸序列的抗体。例 如通过随机置换CDR3序列改换抗体也是有可能的，通过置换H链和L 链的CDR-1、CDR-2以及CDR-3的氨基酸序列和基因序列获得高活性的 抗体也是有可能的。此时变换了氨基酸序列的抗体只要没有丢失中和 活性就没有问题。就是说，在本发明中只要具有抑制E2/NS1与HCV感 染性细胞、表达CD81的细胞或CD81的结合，即使在上述氨基酸序列 中进行了置换、缺失、插入等修饰的序列也都包括在本发明范围内。
本发明的抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4是在上述 抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的H链中进行了氨基酸 置换的抗体。抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4的H链氨 基酸序列和DNA序列记载于序列表中序列号34和35中。
抗体ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的氨基酸序列和DNA 序列记载于序列表中序列号42至65中。
有关抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、ScFv2-4、ScFv3-1、 ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的说明与ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3 和ScFv1-4的说明同样。
在本发明，使用全长抗体最理想。
在本发明抗体的表达中虽然可以使用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、 动物细胞等，但考虑到作为用于人的药品，要进行糖链修饰使用更接 近人型的动物细胞更好。举一例子，在使抗体在COS或CHO细胞中表 达时可以使用pCDNA3.1(+)或pMAMneo(CLONETECH公司)等。例如将 通过上述手法获得的抗体的H链的基因插入到pCDNA 3.1(+)的多克隆 位点，将L链的基因插入到pMAMneo。并且在插入了H链的载体的适 当位点插入在启动子和polyA之间含有L链基因的表达单元。将该载 体通过基因工程的常规方法导入COS细胞或CHO-K1、CHO.DG44中，可 以进行目的抗体的生产。另外在上述制作的载体中例如从pSV2/DHFR (Nature，1981，Vol.294，Lee F.et al.，)切出DHFR基因的表达单元， 整合到表达H链和L链的载体中。将该载体通过基因工程的常规方法 导入CHO DG44。由此选择的细胞通过使用采用MTX的DHFR基因扩增 系统有可能大幅度提高抗体的生产率。虽然在COS细胞中只瞬时表达 抗体，但在CHO细胞中抗体的基因有可能以染色体的整合形式进行表 达。而通过使用先前提到的DHFR基因扩增系统也可以使抗体高效表 达，由于在无血清的培养基中可以进行抗体生产，所以工业生产使用 CHO细胞更好。
COS细胞通常使用加有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改良 Eagle’s Medium(DMEM)，于5％CO2、37℃下进行培养。向COS细胞导 入基因后的细胞育种生产法在「生物手册系列丛书4基因导入和表达、 解析法；横田崇、新井贤一」(羊土公司、1994)等实验书中有记载。 向COS细胞导入基因的方法除了电穿孔法之外也可以使用DEAE葡聚糖 法、脂质转染法等使用转染试剂的方法。
CHO K-1细胞、CHO DG44细胞除了使用在DMEM加有10％FBS的 培养基外，也可以使用例如CHO S SFM2(GIBCO公司)等销售的无血清 培养基于5％CO2、37℃下进行培养。向CHO细胞导入基因也与COS细 胞一样除了电穿孔法之外也可以使用DEAE葡聚糖法、脂质转染法等使 用转染试剂的方法。特别是对于CHO DG44细胞，可以在没有次黄嘌呤、 胸苷的培养基中培养，可以通过向培养基中添加DHFR的抑制剂MTX， 通过基因扩增使抗体的生产率提高。
本发明在生产抗体时，为了避免混入来自血清的牛抗体，希望在 无血清培养基中进行培养。而对于不适合无血清培养基的COS和CHO 在血清培养基培养的细胞希望通过不加入血清的DEME进行培养。从这 样培养上清中得到的本发明的抗体可以通过诸如使用蛋白A柱子或蛋 白G柱子的一般纯化IgG抗体的方法很容易地进行纯化。
本发明中生产的抗体可以用于HCV的治疗，作为抗体的形状虽然 也可以直接利用生产的抗体分子，经各种蛋白酶处理得到的含有抗原 结合部位的片段Fab、F(ab’)2、Fv或Fd也适用，但whole抗体最理 想。关于这些片段在「抗体工学入门」(地人书馆)中有详细的说明。 肽片段可以通过用酶处理抗体分子得到，也可以通过基因工程手法使 细菌、酵母等生产肽片段。通过利用这些方法得到的单克隆抗体、来 自单克隆抗体的抗体片段、肽等的组合，产生更强的结合性。
利用本发明生产的抗体，可以减少HCV感染患者血液中的HCV粒 子。例如，通过将本发明生产的抗体投予使用HCV的mRNA或者市售的 HCV诊断药物在血液中观察到存在抗HCV抗体的患者，由于使血液中的 HCV粒子减少，所以可以防止HCV的再感染、使患者治愈。另外如果将 本抗体投予HCV患者，也可以与HCV患者的体内HCV感染的细胞，特 别是细胞表面有E2/NS1提示的细胞结合。预期通过该结合和生物体内 补体等免疫系统的活化对HCV感染细胞也有阻碍能力。另外通过整合 来自其它抗体的可变区基因生产双特异性抗体、多特异性抗体也是有 可能的。所谓多特异性抗体指的是至少含有2种以上识别不同抗原或 同一抗原的不同抗原表位的抗原结合部位的抗体。而其中的双特异性 抗体指的是至少含有2种以上识别不同抗原或抗原表位的抗原结合部 位的抗体。例如通常的抗体一方的抗原结合部位与另一方抗原结合部 位不同的双特异性抗体比通常的抗体与抗原的结合更强，且可与范围 广泛序列的HCV结合。另外作为IgM识别更多价抗原的抗体的制作也 是可能的。在进行这样生产时除了进行双特异性化以外，也可以对单 克隆抗体进行生产、纯化，然后使抗体之间结合进行双特异性化，多 特异性化。该双特异性化不仅对同一抗原，而且针对其它抗原的组合 也是可能的。例如，利用针对出现在HCV粒子表面的E1的抗体，制作 双特异性抗体、以及多特异性抗体也是有可能的。
单链抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4的氨基酸序列 如序列表中序列号26、序列号27、序列号28和序列号29所示。而编 码这些序列的核酸序列也随氨基酸序列一起给出了。序列号26氨基酸 序列的第1位到22位是含有来自大肠杆菌的分泌用信号肽的序列，第 23位到第148的序列是H链的可变区，第149位到第165位序列是接 头，第166位到第276位是L链的可变区，第277位到299位的序列 是含有tag的序列。序列号27氨基酸序列的第1位到22位是含有来 自大肠杆菌的分泌用信号肽的序列，第23位到第148的序列是H链的 可变区，第149位到第165位序列是接头，第166位到第276位是L 链的可变区，第277位到299位的序列是含有tag的序列。序列号28 氨基酸序列的第1位到22位是含有来自大肠杆菌的分泌用信号肽的序 列，第23位到第148的序列是H链的可变区，第149位到第165位序 列是接头，第166位到第276位是L链的可变区，第277位到299位 的序列是含有tag的序列。序列号29的氨基酸序列的第1位到22位 是含有来自大肠杆菌的分泌用信号肽的序列，第23位到第148的序列 是H链的可变区，第149位到第165位序列是接头，第166位到第281 位是L链的可变区，第282位到304位的序列是含有tag的序列。
缺失序列号26、序列号27、序列号28和序列号29记载的氨基酸 序列中第1位到22位的序列也有可能在大肠杆菌中表达单链抗体。而 序列号26、序列号27和序列号28记载的氨基酸序列的第277到第299 位序列是为了检测单链抗体、以及纯化用的序列，也可以缺失或置换 成任意序列。另外，序列号29中记载的氨基酸的第282位到304位同 样为了检测单链抗体，以及纯化的序列，也可以缺失成置换成任意序 列。含有来自大肠杆菌的分泌信号肽以及纯化用序列的载体的制作如 实施例所示那样进行。序列号26、序列号27、序列号28和序列号29 记载的氨基酸序列的第149位到165位的接头序列只要实质上使H链 和L链的可变区的立体结构与ScFv1-1保持一样也可以置换为任何序 列。单链抗体除了在动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞生产以外，也可 以在大肠杆菌中生产。
另外单链抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、以及ScFv2-4的氨 基酸序列如序列表中序列号36、序列号37、序列号38和序列号39所 示。而编码这些序列的核酸序列也随氨基酸序列一起给出了。
另外单链抗体ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的氨基酸 序列如序列表中序列号62、序列号63、序列号64和序列号65所示。 而编码这些序列的核酸序列也随氨基酸序列一起给出了。
有关单链抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3、ScFv2-4、ScFv3-1、 ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4的说明就像上述ScFv1-1、ScFv1-2、 ScFv1-3和ScFv1-4说明的那样。
即使单链抗体也有可能双特异性化和多特异性化。例如可以通过 将多个抗原识别部位组合的H链和L链反复排列在一条肽链内使其生 产。而在生产、纯化后进行连接也是可能的。不通过H链和L链的组 合，只利用H链或L链也可以。这样构成的抗体种类的选择可以根据 使用用途进行，可以通过结合强度、抗原结合部位进行选择。
另外本发明还提供含有上述抗体或具有与这些抗体同样功能的所 谓本发明规定的抑制E2/NS1与有HCV感染性细胞、表达CD81的细胞 或CD81的结合的物质作为有效成分的药物，例如上述物质与药学上容 许成分组成的载体构成的药物组合物。特别是本发明中的抗E2/NS1抗 体基因使抗E2/NS1抗体效率生产成为可能，可提供各种形式的治疗用 制剂。这样生产的重组抗体可以与例如为了在将药学上容许的成分组 成的载体或稳定剂等用于人体时使该抗体保持活性而使用的物质一起 包含在药物组合物中。作为这样的载体和稳定剂如人血清清蛋白、明 胶等。所谓药学上容许意味着不会发生恶心、目眩、呕吐等副作用， 以及不会发生对多次使用的制剂的免疫应答等。另外使诸如毒素等物 质与本发明抗体结合的抗体也可以作为药物使用。而与医药上容许的 适当的溶剂和稀释剂、稳定剂一起溶解的液体药物组合物也可以使 用。另外除了上述药物组合物之外以在生物体内调节浓度为目的微粒 体、脂质体进行非口服(注射)用药时，抗体和单链抗体为1μg～50mg/ 体重kg比较合适，但不限于该范围。
上面以抗体作为代表例子进行叙述，而在本发明中作为抑制 E2/NS1与HCV感染性细胞、表达CD81的细胞或CD81结合的物质除了 抗体之外，抗体以外的蛋白质、硫酸化多糖类或低分子化合物只要不 损失本发明的活性也可以使用。
作为抗体以外的蛋白质如乳铁蛋白等，作为药物组合物的制备和 投药方法可以按照上述抗体的情况进行。
另外本发明中提到的硫酸化多糖类指的是如分子量从平均分子量 5000Da到1000000Da范围的肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素A、硫 酸软骨素C、硫酸皮肤素、硫酸角质素1和硫酸角质素2等葡萄糖胺聚 糖类和硫酸葡聚糖等，理想的是5000Da到30000Da左右大小的肝素。 投药方法有诸如将10000到30000单位用5％葡萄糖液、生理盐水、 复方生理盐水稀释后进行静脉点滴；每隔4至8小时一次静脉注射5000 到10000单位，但采用注射开始3小时后每隔2到4小时进行间歇静 脉注射法；以及浓制剂初次15000到20000单位，然后继续维持每天2 次，每次10000到15000单位经皮下/肌肉注射注射法，但并不限定于 这些方法。
本发明提到的低分子化合物是如下面的实施例例举的苏拉明等， 但只要是抑制HCV的E2/NS1和HCV感染的物质即可，并不限定于苏拉 明。
该低分子化合物的结合部位要考虑到各种各样的场所，如果是结 合在上述肝素结合的地方的物质，最好是附加了硫酸基的化合物。
将这里举出的抗体等蛋白质、硫酸化多糖类、低分子化合物作为 药物使用时，不必单独使用，就各个物质来说按照本说明书给出范围 内的量也可以多个物质同时投药。
另外如果是上述单链抗体的情况，用于丙型肝炎病毒诊断比较合 适。
还有，本发明涉及到在被检验物质存在或不存在情况下对HCV有 感染性的细胞和表达HCV蛋白的细胞的结合进行测定，通过包括与在 没有被检验物质存在情况下结合进行比较的工序在内筛选方法得到的 抑制丙型肝炎病毒生活环境的物质，以及通过包括在被检验物质存在 或不存在情况下在对HCV有感染性的细胞和表达HCV蛋白的细胞结合 后，对被检验物质和对HCV有感染性的细胞和表达HCV蛋白的细胞的 融合进行测定，通过包括与没有被检验物质存在情况下的融合进行比 较的工序在内的筛选方法得到的抑制丙型肝炎病毒生活环境的物质。 这里提到的丙型肝炎病毒生活环境的物质的例子有丙型肝炎病毒感染 和增殖等。
在Takikawa等人文献(Takikawa et al，J.Virol.，74，5066- 5074，2000)中记载了有关可对HCV感染性细胞(HepG2)和表达HCV 蛋白的CHO细胞的结合和融合进行测定的分析系统和使用该系统分析 的HCV感染机制。
通过本发明得到的抗体是最初得到的可以竞争性地中和该分析系 统的物质。
细胞融合分析系统是在通过HTLV-1等测定病毒的细胞融合活性 中使用的系统。本发明的分析系统由于是模拟表示HCV的细胞融合系 统，所以希望抑制本分析系统的物质具有阻止HCV感染、特别是抑制 与细胞的结合和脱核的效果。
实施例
以下通过实施例对本发明进行进一步详细具体地说明，但本发明 并不限定于以下的实施例。
1.E2的表达
(E2tag表达载体的构建)
使用由HCV J1克隆基因(Genbank登录号：D89815)内E2/NS1 的HCV基因组中的第384位氨基酸到711位构成的部分100ng，作为PCR 扩增用引物在5’侧使用含有促进在动物细胞中分泌的信号肽序列的PCR 引物基因(5’CCC AAG CTT ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG GCT AGC CAT ACC CGC GTG ACG GGG GGG GTG CAA GG 3’；序列号30)，基因3’侧使用含有Etag序列的PCR引物 (5’CCC CCT CGA GTC TAG ATT AAC GCG GTT CCA GCG GAT CCG GAT ACG GCA CCG GCG CAC CGG AGA CGA CCG CCG ACC CTA TAC C 3’；序列号31)，通过 PCR反应对DNA(tPA信号肽+E2(384-711)+tag)片段进行扩增。 使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(从 东洋纺公司购入，反应条件按照说明书进行)进行PCR反应。然后， 目的DNA片段使用5％丙烯酰胺凝胶电泳法按照Molecular Cloning 部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方法进行纯化。对纯化 的1μl DNA片段使用1单位的HIndIII和XbaI在50μl的系M (10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)中于37℃反应2小时，进行 酶切，然后通过70℃的10分钟的热处理，使酶失活。同时对动物细胞 用表达载体pCDNA 3.1(+)(从Invitrogen公司购入)1μg使用1 单位的HindIII和XbaI在50μl的系M(10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)中于37℃反应2小时，进行酶切，然后通过70℃的 10分钟的热处理，使酶失活，添加与酶液等量的苯酚、氯仿和异丙醇 (以25∶24∶1比例混合)的混合液，进行离心，只回收水相(今后该 操作称为苯酚氯仿萃取)。然后使1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体 积的乙醇与回收的水相混合，于-20℃下过夜，或者是于-80℃下静 置15分钟，然后离心回收DNA片段。再加入70％的乙醇之后，进行滗 析、真空干燥(今后将这些加乙醇，回收DNA片段等一系列操作称之 为乙醇沉淀)后，将回收的DNA片段溶解在5μl的灭菌水中。使用连 接酶试剂盒使(从宝酒造购入，反应按说明书进行)该纯化的DNA片 段之间连接，转化大肠杆菌JM109(从宝酒造购入，反应按照说明书进 行)，得到目的E2tag表达质粒pE2tag。
(E2tag在动物细胞中的表达)
带有质粒pE2tag的大肠杆菌于挡板烧瓶培养过夜。通过于 8,000rpm下离心10分钟回收菌体，使用QIAGEN Plasmid Midi kit (从QIAGEN公司购入)根据说明书纯化质粒。
使用脂质转染试剂(从LIFETECH公司购入)，根据说明书用纯化 的质粒转染于添加了5％FBS的EX-CELL302(从JRH购入)培养的CHO DG44株。CHO DG44于5％CO2、37℃下进行培养。转化2天后，细胞 用0.25％的胰蛋白酶溶解之后，将细胞接种到添加了400μg/ml G418 的EX-CELL302中。2周左右使用G418添加培养基进行培养基交换， 确认有菌落出现。
得到的细胞表达E2tag的确认是通过Western blotting操作确 认的。蛋白质印迹法是根据从Pharmacia公司购入的Anti-E Tag Antibody的说明书进行的。在检测抗体时使用了HRP结合山羊抗鼠IgG 抗体。发光反应使用ECL蛋白质印迹检测试剂(从Pharmaciabiotech 购入)，根据说明书通过使X线光片感光进行的。将得到的多个克隆 中表达更高的细胞用于以后的实验。
(E2tag的纯化)
为了获得需要量的上清将用上述方法得到的E2tag于EX- CELL302中进行培养。细胞对数增殖期结束时通过离心除去细胞，回 收上清。上清再用0.45μm膜除去混入物。这样获得的上清使用RPAS Purification Module(从Pharmacia公司购入)进行亲和层析纯化。 纯化根据RPAS Purification Module附带的说明书进行。由于E2tag 是在RPAS Purification Module附带的洗脱缓冲液中得到的，所以 置换为PBS。具体来说，向Centricon 30(从Amicon公司购入)的膜 上部添加含有上述E2tag的各个洗脱级分，于5000rpm下进行离心直 至其中含有的缓冲液量达到100μl以下为止。然后再添加2mL左右PBS 进行同样的离心操作。该操作重复进行4次以上，回收溶解在PBS中 的E2tag。
2.NOB分析系统的构建
(CD81表达载体的构建)
为了获得人CD81基因(Genbank登录号M33680)的全长DNA， 使用RT-PCR kit ver 2.1(TAKARA公司)，根据附带的资料使用随 机引物从Hela细胞纯化的1μg mRNA合成cDNA。然后根据该试剂盒 附带的资料，作为PCR扩增用引物5’端设计为 GCGCCGCCATGGGAGTGGAGGGCTGC(序列号32)，3’端设计为 CTCAGTACACGGAGCTGTTCCGGA(序列33)，进行PCR反应。PCR产物进 行0.8％琼脂糖凝胶电泳，使用QIAEXII Gel Extraction Kit(从QIAGEN 公司购入)，根据附带的说明书纯化目的带。然后再使用TOPO TA Cloning KIT with TOP10F’cells(从Invitrogen公司购入)，根据 附带的说明书使pCR2.1-TOPO与上述目的CD81片段结合并转染大肠杆 菌，得到目的pCRhCD81。使用1单位的EcoRI在50μl的系H (10mMTris-HCl，100mM NaCl，2mM MgCl2)于37℃下反应2小时，对 pCRhCD81 11μg进行酶切，通过于70℃下进行10分钟热处理，使酶 失活后，使用QIAEXII Gel Extraction Kit(从QIAGEN公司购入)， 根据附带说明书纯化含有CD81基因的片段。pCDNA3.1(+)也利用另 外同样的系统进行EcoRI处理，使酶失活后，加入1μl的细菌碱性磷 酸酶(从TOYOBO公司购入)，于65℃下温育1小时。然后经酚氯仿 萃取和乙醇沉淀纯化后，将分别回收的DNA片段溶解在5μl灭菌水 中。再将两个片段用连接酶试剂盒(从宝酒造购入，反应根据说明书 进行)进行连接，转染大肠杆菌JM109(从宝酒造购入，反应根据说明 书进行)，得到所期望的CD81表达质粒pCDNA3.1(+)/CD81。
(CD81表达细胞构建)
带有质粒pCDNA3.1(+)/CD81的大肠杆菌于50mL挡板烧瓶培 养过夜。通过于8,000rpm下离心回收菌体，使用QIAGEN Plamid Midi kit(从QIAGEN公司购入)，根据说明书纯化质粒。
用纯化的质粒使用转染试剂(从LIFETECH公司购入)根据说明书 转染10％FBS的Dulbeccos Modified Eagle’s Medium(DMEM)培养 的NIH3T3株。NIH3T3以下都于5％CO2、37℃下进行培养。转染2天 后，细胞用0.25％的胰蛋白酶溶解之后，将细胞接种到添加了10％FBS 和800μg/mL G418的DMEM中。2周左右使用G418添加培养基进行培 养基交换，确认有菌落出现。
CD81在得到的细胞株中表达的确认通过以下操作进行。将得到的 细胞株用选择培养基在6孔板中培养至铺满。细胞用PBS/0.05％EDTA 洗一次后，用PBS/0.05％EDTA溶解后，悬浮于含有0.1％BSA和0.1％ 叠氮化物的20μl PBS(以下称为FACS缓冲液)，加入抗CD81抗体 (从Pharmacia购入)(终浓度为0.025mg/mL)，混合后，于冰上温 育1小时。加200μl FACS缓冲液后，于3000rpm离心，回收细胞， 上述操作反复进行2次。将回收的细胞悬浮于30μl的FACS缓冲液， 加入FITC标记羊抗鼠Igs抗体(从カペル公司购入)使终浓度为 0.05mg/mL，混合后，避光之后于冰上温育1小时。加入200μl FACS 缓冲液后，于3000rpm下离心，回收细胞，上述操作反复进行2次后， 将细胞悬浮于200μl FACS缓冲液之后，通过FACScan(Becton Dickinson公司)测定细胞的荧光量，选择荧光量高的细胞，命名为 NIH3T3/CD81。
(E2tag与Molt-4或NIH3T3/CD81结合的确认)
将Molt-4(理研RCB No.0206)或NIH3T3/CD81的终浓度定为5 ×106cell/mL，E2tag最终浓度为50μg/mL以下，摇动混合，于含有 1％FBS的RPMI 1640中用20μl的系于冰上温育1小时。加入含有5 ％FBS的PBS 200μl，用3000rpm进行离心，回收细胞，上述操作反 复进行2次。用含有1％FBS的RPMI 1640将抗Etag抗体稀释到10μ g/mL，向各个样品中加入10μl稀释液，混合后于冰上温育1小时。 加入含5％FBS的PBS 200μl、在3000rpm下离心回收细胞，操作重复 2次。用含有5％FBS的PBS稀释FITC标记山羊抗鼠Igs(从カペル 公司购入)，使其终浓度变为25μg/mL，将该稀释液10μl加入到各 个样品中。混合后于冰上温育1小时。加200μL含有5％FBS的PBS， 于3000rpm离心，回收细胞，上述操作反复进行2次。将样品悬浮于 200μL含有5％FBS的PBS后通过FACScan(Becton Dickinson公司) 测定细胞的荧光量变化，对E2tag与Molt-4或NIH3T3/CD81的结合 进行确认。
(抑制E2tag与Molt-4或NIH3T3/CD81结合的物质的确认)
将E2tag用含有1％FBS的RPMI 1640稀释，稀释后最终浓度为 50μg/mL，该稀释液和用含有1％FBS的RPMI 1640稀释的浓度范围 为0.125μg/mL～12.5μg/mL的ScFv(通过本说明书中以下记载的筛 选方法得到的抗体)、4μg/mL～400μg/mL的肝素(sigma公司生产、 H3393)、50μg/mL～5000μg/mL的苏拉明(sigma公司生产、S2671) 溶液各10μl混合，于37℃下温育30分钟。将Molt-4或NIH3T3/CD81 悬浮于含有1％FBS的RPMI 1640中的溶液10μl混合(终浓度为1× 107cell/mL)，于冰上温育1小时。加200μl含5％FBS的PBS，于 3000rpm离心，回收细胞，上述操作反复进行2次。用含有1％FBS的 RPMI 1640将抗Etag抗体稀释到10μg/mL，向各个样品中加入10μl 稀释液，混合后于冰上温育1小时。加200μl含有5％FBS的PBS， 于3000rpm离心，回收细胞，上述操作反复进行2次。用含有5％FBS 的PBS稀释FITC标记抗鼠Igs(从カペル公司购入)，使其终浓度变 为25μg/mL，将该稀释液10μl加入到各个样品中。混合后于冰上温 育1小时。加200μL含有5％FBS的PBS，于3000rpm离心，回收细 胞，上述操作反复进行2次。将样品悬浮于200μl含有5％FBS的PBS 后通过FACScan(Belton Dickinson公司)测定细胞的荧光量变化， 确认E2tag与Molt-4或NIH3T3/CD81的结合可以被添加的患者血清 或抗体抑制。
结果如图1至3所示。图1表示上述氨基酸序列代表的抗体的中 和活性。图1中ScFv1-1和ScFv1-4对应于上述的氨基酸序列表示的 抗体，对照表示识别VLA4的单链抗体。图2是表示使用肝素时的中和 活性，图3表示使用苏拉明时的中和活性图。
3.抗体文库的制作
(来自HCV治愈患者的mRNA的纯化)
从HCV治愈患者进行肝素采血，获得血液40mL，该HCV治愈患者 血清中含有具有阻止E2tag与Molt-4或表达NIH3T3/CD81细胞的结 合能力的抗体。为了分离末梢血淋巴细胞，利用比重离心法 (Ficoll-Paque：Pharmacia)获得4×107淋巴细胞。使用MACS(第 一化学药品，Miltenyi Biotec GmbH公司生产)利用抗CD19抗体进 行B细胞纯化，获得2.8×106细胞。为了确认纯化细胞中的B细胞的 纯度，对用抗CD19抗体纯化的细胞进行染色，通过流式细胞仪确认纯 度在95％以上。使用该纯化的B细胞，在人IL-2(Genzym) 200unit/mL、人IL-10(Genzym)10ng/mL、E2/NS1抗原1ng/mL、 抗人CD40抗体(Genzym)1μg/mL的刺激下，于5×105B细胞/mL 10％FCS RPMI的条件下培养72小时。通过显微镜确认B细胞的活化，用PBS 洗2次，使用RNAlater(Ambion公司)根据说明书进行操作，从B 细胞中获得mRNA并进行了纯化。
(抗体文库的制作)
抗体文库的制作根据By-Passing Immunization Human Antibodies from V-gene Libraties Displayed on Phage(Journal of Molecular Biology 1991 222582-597)记载的方法进行。使用 RT-PCR kit ver 2.1(TAKARA公司)，根据附带的资料利用随机引物 从1μg纯化的mRNA合成cDNA。然后根据试剂盒附带的资料，以该cDNA 为模板，通过PCR分别扩增抗体的H链、L链(λ链、κ链)。抗体基 因克隆用引物和接头使用根据上述论文制作的产物。PCR产物利用1％ 琼脂糖凝胶进行电泳，切出抗体H链、L链的带。使用QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN公司)，从切出的琼脂糖凝胶萃取DNA。然 后使相同摩尔数的H链、L链、接头混合，使用连接用引物进行PCR。 PCR是在50μl的体系中，使用1单位Tag polymerase(PerkinElmer 公司)、于94℃下加热5分钟后，进行每循环为94℃30秒、55℃30 秒、72℃30秒的30个循环，然后于72℃加热5分钟结束。PCR产物 进行1％琼脂糖凝胶电泳，切出H链、L链、接头连接成一条链的带。 使用QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN公司)，从切出的琼脂 糖凝胶萃取DNA。然后通过限制酶Sfi I和50μl的体系M (10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)于55℃下反应2小时进行酶 切，经70℃下的10分钟热处理，使酶失活。进一步添加限制酶NotI 50 μl的体系从(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)于37℃反应 2小时进行酶切，经70℃的10分钟处理使酶失活。对DNA依次通过酚 氯仿萃取和乙醇沉淀进行纯化，溶解在50μl的灭菌水中。使用TAKARA 公司的连接酶试剂盒，根据说明书使纯化的DNA片段100ng和50ng的 pCantab5MycHis(pCantab5E(AmershamPharmacia)的Etag序列替换 为Myc-Histag的载体)结合。对连接样品依次通过酚氯仿萃取和乙醇 沉淀进行纯化，溶解在10μl的灭菌水。然后取出5μl样品根据 Molecular Cloning(1982)p249、Cold Spring Harbor Labs.进行 转化。获得1×106菌落。将这些菌落作为单链抗体文库备以后用。
4.文库噬菌体的筛选
(噬菌体的制备)
用2ml的2xTY液体培养基回收生长在平板上的大肠杆菌，取其中 20μl加到2ml的2xTY液体培养基(含有100μg/mL氨苄西林和2％ 葡萄糖)。于37℃、200rpm下进行振荡培养，培养至吸光度600nm值 达到1.0为止。向该培养液中加入1×1011pfu/mL的辅助噬菌体 M13K07，于37℃下静置30分钟。然后继续于37℃、200rpm下进行振 荡培养。30分钟后，将该溶液用3000rpm离心10分钟，回收大肠杆 菌。弃掉上清，沉淀悬浮于20ml的2xTY液体培养基(含有100μg/mL 氨苄西林和50μg/mL卡那霉素)，于37℃、200rpm下振荡培养过夜。 第二天用15000rpm将培养液离心，使大肠杆菌沉淀，回收上清。该上 清作为噬菌体溶液使用。
(筛选操作)
将溶解在50mM NaHCO3(pH9.6)溶液中的10μg/mL的E2抗原1ml 加到塑料管(Nunc MaxisorpTube)中，于4℃下放置过夜。第二天， 弃掉抗原溶液，用PBS溶液5ml洗该试管，反复洗3次。然后加入5ml 的5％BSA，置于37℃下。2小时后，弃掉BSA溶液，用5ml的PBS溶 液洗试管。然后将事先准备的噬菌体溶液250μl与5％BsA溶液750 μl混合，加到试管中，置于37℃下。1小时后，弃掉加入的溶液，用 PBST(0.1％)溶液5ml洗试管。上述操作重复20次。然后用5ml的 PBS溶液洗试管，反复操作20次。向该试管中加入1mL的100mM三乙 基胺，于室温下放置10分钟。然后回收三乙基胺溶液，向该溶液中加 入500μL的1M Tris-HCl(pH7.5)，充分混合。将该溶液750μl加到 培养到吸光度600nm值达到0.6的10mL的大肠杆菌TG-1中，于37 ℃下放置30分钟。然后于37℃、200rpm下进行振荡培养。30分钟后， 用3000rpm对该溶液离心10分钟，回收大肠杆菌。将该大肠杆菌铺在 2×TY平板培养基(含有100μg/L氨苄西林和2％葡萄糖)，于37℃ 下放置过夜。第二天，按照(噬菌体制备)记载的操作从平板上生长 的大肠杆菌回收噬菌体，重复(筛选操作)记载的操作。反复进行3 次筛选操作。
其结果得到了含有序列表中序列号1～29记载的氨基酸序列的抗 体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和ScFv1-4。
序列表中序列号1～3表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和 ScFv1-4的H链的CDR-1、CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号4～6表示抗体ScFv1-1的L链的CDR-1、CDR-2、 和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号7～9表示抗体ScFv1-2的L链的CDR-1、CDR-2、 和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号10～12表示抗体ScFv1-3的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号13～15表示抗体ScFv1-4的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号16表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和 ScFv1-4的H链的氨基酸序列。
序列表中序列号17～20分别表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、 ScFv1-3和ScFv1-4的L链的氨基酸序列。
序列表中序列号21表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、ScFv1-3和 ScFv1-4的H链的碱基序列。
序列表中序列号22～25分别表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、 ScFv1-3和ScFv1-4的L链的碱基序列。
序列表中序列号26～29分别表示抗体ScFv1-1、ScFv1-2、 ScFv1-3和ScFv1-4的L链的碱基序列和氨基酸序列。
另外也可得到H链氨基酸序列为序列表中序列号34记载的氨基酸 序列的抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和ScFv2-4。
序列表中序列号34表示抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和 ScFv2-4的H链的氨基酸序列。
序列表中序列号35表示抗体ScFv2-1、ScFv2-2、ScFv2-3和 ScFv2-4的H链的碱基序列。
序列表中序列号36～39分别表示抗体ScFv2-1、ScFv2-2、 ScFv2-3和ScFv2-4的碱基序列和氨基酸序列。
5.关于ScFv的改造
(抗体文库的制作)
抗体文库的制作利用与上述抗体文库制作一项同样的手法进行。
首先制作将PCantab5scFv3-1MycHis(将实施例给出的ScFv1-1 基因插入到PCantab5MycHis的Sfi I site和Not I site之间，L 链的5′末端配置Alw44I、3′末端配置Not I位点)的L链部分替换成 对HCV抗原没有反应性的L链的载体。该载体称之为 PCantab5scFv3-1/L-/MycHis。
使用RT-PCR kit ver 2.1(TAKARA公司)，根据附带的资料利 用随机引物从1μg纯化的mRNA合成cDNA。然后根据试剂盒附带的资 料，以该cDNA为模板，通过PCR分别扩增抗体的L链(λ链、κ链)。 抗体基因克隆用引物使用根据上述论文制作的产物。PCR产物进行1％ 琼脂糖凝胶电泳，切出抗体H链、L链的带。使用QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN公司)，从切出的琼脂糖凝胶萃取DNA。
然后通过限制酶Alw44I和50μl的体系M(10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)于37℃下反应2小时进行酶切，经70℃下的10分 钟热处理，使酶失活。然后再加Not I于100μl的体系H (10mMTris-HCl，50mM NaCl，2mM MgCl2)，于37℃下反应2小时进行 酶切，经70℃下的10分钟热处理，使酶失活。对DNA依次通过酚氯仿 萃取和乙醇沉淀进行纯化，溶解在50μl的灭菌水。使用TAKARA公司 的连接酶试剂盒，根据说明书使纯化的DNA片段100ng与同样经Alw44 I和NotI处理的50ng的pCantab5scFv3-1/L-/MycHis结合。对连 接样品依次通过酚氯仿萃取和乙醇沉淀进行纯化，溶解在10μl的灭 菌水。然后取出5μl样品根据Molecular Cloning(1982)p249、Cold Spring Harbor Labs.进行转化。获得1×106菌落。将这些菌落作为 单链抗体文库备以后用。
(文库噬菌体的筛选)
噬菌体的制备、筛选操作都与上述操作一样。
其结果得到了含有序列表中序列号42～65记载的氨基酸序列的抗 体ScFv3-1、ScFv3-2、ScFv3-3和ScFv3-4。
序列表中序列号42～44表示抗体ScFv3-1的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号45～47表示抗体ScFv3-2的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号48～50表示抗体ScFv3-3的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号51～53表示抗体ScFv3-4的L链的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3的氨基酸序列。
序列表中序列号54～57分别表示抗体ScFv3-1、ScFv3-2、 ScFv3-3和ScFv3-4的L链的氨基酸序列。
序列表中序列号58～61分别表示抗体ScFv3-1、ScFv3-2、 ScFv3-3和ScFv3-4的L链的碱基序列。
序列表中序列号62～65分别表示抗体ScFv3-1、ScFv3-2、 ScFv3-3和ScFv3-4的碱基序列和氨基酸序列。
6.从筛选的噬菌体制备scFv
将候补菌落接种于100ml的2xTY液体培养基(含有100μg/L氨 苄西林和2％葡萄糖)，于30℃、200rpm下振荡培养过夜。翌日，将 上述培养液加到900ml的2xTY液体培养基(含有100μg/mL氨苄西林 和2％葡萄糖)中，于30℃、200rpm下振荡培养1小时。加入1mL的 1M IPTG(异丙基-β-硫-吡喃半乳糖)，再于同样条件下培养5小时。 培养液于8000rpm下离心10分钟，使菌沉淀。弃掉上清，用50ml的 50mM Tris-HCl(pH8)、20％蔗糖、1mM EDTA溶液将沉淀悬浮后，于 冰中放置15分钟。接着用10000rpm将悬浮液离心15分钟，回收上清， 上清中加入MgCl2，其终浓度为1mM。
7.ScFv的纯化
上述从大肠杆菌得到的ScFv使用Ni-NTA琼脂糖(从QIAGEN公 司购入)根据说明书进行纯化。加入30ml的A溶液(50mMNa- phosphate、300mM NaCl、pH7.4)洗1mL的Ni-NTA，搅拌后于1000rpm 下离心2分钟，弃掉上清。向该Ni-NTA琼脂糖中加入上述上清。于4 ℃下搅拌45分钟，使ScFv的His tag部位与Ni-NTA agarose结合。 然后后于1000rpm下离心2分钟，弃掉上清。加入30ml的A溶液洗 Ni-NTA琼脂糖，于1000rpm下离心2分钟，弃掉上清。然后再用30ml B溶液(A溶液+10mM咪唑)按照同样操作洗。然后悬浮于10ml B溶 液，添加到poly-prep柱子(Bio-Rad公司)上。再添加10ml B溶液， 洗Ni-NTA琼脂糖。加入的洗液完全从柱子上流出后，用2ml的C溶 液(A溶液+250mM咪唑)洗脱结合在Ni-NTA琼脂糖上的ScFv。然 后将洗脱出的溶液加入到用25ml的PBS(10mM phosphate、pH7.4、 150mM NaCl)洗的PD10柱(AmershamPharmacia公司)上，用PBS 溶液洗脱，改换缓冲液。测定各个洗脱级分的280nm的吸光度，将ScFv 洗脱级分作为一个级分用于以后的实验。
8.ScFv的E2结合能力的确认
将溶解于50mM NaHCO3(pH9.6)溶液的1μg/ml的E2tag 1mL加到 FALCON的96孔板中，每孔50μl，于37℃下温育1小时。同时向作 为对照的孔中只加入同样量的不含E2tag的缓冲液。通过倾倒弃掉各 个孔的溶液后，向各个孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS， 然后倾倒弃掉，反复进行5次。除去各个孔的水分后，向每一个孔中 加入200μl的含有5％BSA的PBS溶液，于37℃下温育1小时。通过 倾倒弃掉各个孔的溶液后，向各个孔加入200μl的加有0.1％的 Tween20的PBS，然后倾倒弃掉，反复进行5次。用含有0.1％BSA的 PBS溶液稀释分别从加有E2tag的孔和没加E2tag的孔得到的scFv， 稀释到终浓度至10μg/ml以下，然后向每个孔中加入稀释后溶液50 μl，于37℃下温育1小时。通过倾倒弃掉各个孔的溶液后，向各个孔 加入200μl的加有0.1％的Tween20的PBS，然后倾倒弃掉，反复进 行5次。除去各个孔的水分后，抗myc-tag抗体(Santa Cruz Biotechnology公司购入)用含有0.1％BSA的PBS溶液稀释(终浓度 为10μg/ml)，然后向每个孔中加入稀释后溶液50μl，于37℃下温 育1小时。通过倾倒弃掉各个孔的溶液后，向各个孔加入200μl的加 有0.1％Tween20的PBS，然后倾倒弃掉，反复进行5次。HRP标记抗 鼠Igs用含有0.1％BSA的PBS溶液稀释(终浓度为1μg/mL)，然后 向每个孔中加入稀释后溶液50μl，于室温下温育1小时。通过倾倒弃 掉各个孔的溶液后，向各个孔加入200μl的加有0.1％的Tween20的 PBS，然后倾倒弃掉，反复进行5次。向各个孔中各加入100μl的于 25ml OPD缓冲液中加有邻苯二胺10mg、30％过氧化氢12.5μl的溶 液，于室温温育直至充分发色，然后加4N硫酸100μl终止反应，通 过测定490nm的吸光度，确认scFv与E2tag的结合。
9.抗体表达载体的构建
通过PCR对含有pRC/CMV(从In Vitrogen公司购入)的CMV启 动子的区域、多克隆位点、polyA信号肽序列区(同一公司基因图谱 209-1250碱基区)进行扩增。使用的引物序列：5′端为 5′CCC TGA TCA GAA TTC GCA GGA TCC CTC GAG ACT AGT GAT GAT CGG GCC AGA TAT ACG CG 3′(序列号66)、3′端为 5′CCC TGA TCA AGA TCT GCT AGC GTC GAC TCC CCA GCA TGC CTG CTG CTA TTG 3′(序列号67)，利用Applied Biosystems Model 394 合成后，根据常规方法制备。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler，聚合酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)， 进行PCR反应。然后所希望的约1.0Kbp DNA片段通过5％聚丙烯酰胺 凝胶电泳方法，根据Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方法进行纯化。用1单位的Bcl I在50μl的体系H中 对1μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。另外用1单位的 BamH I在50μl的体系H中对ppUC119(从宝酒造公司购入)DNA 1 μg于37℃下进行2小时酶切。使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购 入，反应按照说明书进行)对酶切得到的DNA片段和质粒进行连接， 转染大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得 到所希望的表达质粒pKS1。
用1单位SpeI 1在50μl的体系M中对上面得到的pKS1于37℃ 下进行2小时酶切。
pc DNA 3.1/Hygro(+)(从In Vitrogen公司购入)，通过PCR对 1oxP-Hygromicin融合基因进行扩增。使用的引物序列：5′端为 Hyg-stop：ccccagatctctattcctttgccctcggacgag(序列号68)，3′端为 Hy-atg：ccccaagcttatgaaaaagcctgaactcaccgcg 3’(序列号69)，委托 SciMedia公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler，聚合酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)， 进行PCR反应。然后所希望的片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法， 根据Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载 的方法进行纯化。用1单位的NheI和NaeI在50μl的体系M中对约1 μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
使用pNeo.gal(从Stratagene公司购入)，通过PCR扩增含有 TK(A)n的DNA。使用的引物序列：5′端cccgccggctgggtgtggcggaccgc3’(序 列号70)，3′端5’cccctctagaaagtataggaacttcaagc 3’(序列号71)，利用 Applied Biosystems Model 394合成后，根据常规方法制备。使用 Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(从东洋 纺公司购入，反应条件根据说明书)，进行PCR反应。然后所希望DNA 片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据Molecular Cloning部 分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方法进行纯化。用1单位 的XbaI和NaeI在50μl的体系M中对约1μg纯化的DNA片段于37 ℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与loxP-HygromicinDNA片段和Tk(A)nDNA片段进 行连接，转染大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进 行)，得到所希望的表达质粒pEX loxP-Hyg。
使用pEX1-3-1W(WO 01/94571)，通过PCR扩增含有重链恒定区 的DNA片段。使用的引物序列：5′端 5’ccccaagcttctcgagactagtaccaagggcccatcggtcttccc3’(序列号72)，3′端 5’ccccgggccctctagtagctttcatttacccggagacaggg3’(序列号73)，委托サイメ デイア公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler， 聚合酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)，进行 PCR反应。然后所希望DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根 据Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的 方法进行纯化。用1单位的Hind III和ApaI在50μl的体系M中对 1μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
用1单位的Hind III和Apa I在50μl的体系M中对1μg pEX 1oxP-Hyg DNA于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与含有重链恒定区的DNA片段进行连接，转染大肠 杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得到所希望 的表达质粒pEX gammal loxP-Hyg。
使用ScFv1-1，通过PCR扩增含有重链可变区的DNA片段。使用 的引物序列为HB1-N 5’cccaagcttcaccATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTC CCAGGTGCAGCtggtgcagtctg3’(序列号74)，HB 1-C 5’cccgctagcACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC3’(序列号75)，委托サイメデイ ア公司合成的。使用Perkin Elmer Cetus DNA thermal Cycler，聚 合酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)，进行PCR 反应。然后所希望DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据 Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方 法进行纯化。用1单位的Hind III和NheI在50μl的体系M中对约 1μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
用1单位的Hind III和SpeI 1在50μl的体系M中对1μg pEX gammal loxP-Hyg DNA于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与含有重链可变区的DNA片段进行连接，转化大肠 杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得到所希望 的表达质粒pEX gammal loxP-Hyg HCVI(图7)。
使用pEGFPN2(从Clonetech公司购入)，通过PCR扩增含有卡 那霉素抗性基因的DNA片段。使用的引物序列为H链5′端为 5′ccccagagctagtcctgcaggcggggaaatgtgcgcggaacccct3′(序列号76)，3′端为 5′ccccgctagcctgcaagtcatttcgaaccccagcgtccc3′(序列号77)，委托サイメデイ ア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合 酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)，进行PCR 反应。然后所希望DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据 Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方 法进行纯化。用1单位的SpeI和NheI在50μl的体系M中对约1μg 纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
用1单位的Nhe I在50μl的体系M中对1μg pSK1 DNA于37 ℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与含有卡那霉素抗性基因的DNA片段进行连接，转 化大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得到 所希望的表达质粒pEX-1Km、Amp。
用1单位的Dra I，Sca I在50μl的体系H中对1μg pEX-1Km、 Ampl DNA于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 连接酶切得到的质粒，转化大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应 按照说明书进行)，得到所希望的表达质粒pEX-1Km。
使用pCZOK(T，Shibui等人Appl Microbiol Biotechnol(1993)38，770-775记载)，通过PCR扩增含有轻链恒定 区的DNA片段。使用的引物序列为H链5′端为 5’ccccaagcttctagagtcgacggtaccgtggaaatcaaacgaactgtgg3’(序列号78)，3′ 端为5’ccccgggccctctagcggccgcctaacactctcccctgttgaagc3’(序列号79)，委 托サイメデイア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)， 进行PCR反应。然后所希望的DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方 法，根据Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor 记载的方法进行纯化。用1单位的Hind III和Apa I在50μl的体系 M中对1μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
用1单位的Hind III和ApaI在50μl的体系M中对1μg pEX -1Km DNA于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与含有轻链恒定区的DNA片段进行连接，转化大肠 杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得到所希望 的表达质粒pEXkappa Km。
使用scFv1-1，通过PCR扩增含有轻链可变区的DNA片段。使用 的引物序列为LK 1-N 5’cccaagcttcaccATGGCGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTA CGGGgacatccagatgacccagtctcc3’(序列号80)，LK 1-C 5’CcccgtacgTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCCCG3’(序列号81)，委托サイメデイ ア公司合成。使用Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler，聚合 酶使用KOD(从东洋纺公司购入，反应条件根据说明书)，进行PCR 反应。然后所希望DNA片段通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，根据 Molecular Cloning部分6.46-6.48，Cold Spring Harvor记载的方 法进行纯化。用1单位的Hind III和BsiWI在50μl的体系M中对1 μg纯化的DNA片段于37℃下进行2小时反应后，在50℃反应2小时 后酶切。
用1单位的Hind III和Asp187I在50μl的体系M中对1μg pEX kappa Km DNA于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒与含有重链可变区的DNA片段进行连接，转化大肠 杆菌JM109(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行)，得到所希望 的表达质粒pEX kappa Km HCVI。(图8)
用1单位的SpeI，NheI在50μl的体系M中对1μg pEX kappa Km HCV1 DNA于37℃下进行2小时酶切。
用1单位的NheI在50μl的体系M中对1g pEX gammal loxP-Hyg HCVI DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒进行连接，转化大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购 入，反应按照说明书进行)，得到所希望的表达质粒pEX loxp-Hyg HCVI W Km。
用1单位的Sse8387在50μl的体系M中对1μg pEX loxp-Hyg HCVI W Kml DNA片段于37℃下进行2小时酶切。
使用连接酶试剂盒(从宝酒造公司购入，反应按照说明书进行) 对酶切得到的质粒进行连接，转化大肠杆菌JM109(从宝酒造公司购 入，反应按照说明书进行)，得到所希望的表达质粒pEX loxp-Hyg HCV1 W(图9)。
10.抗体基因向高表达部位检索株的位点特异导入
使用Mkamp 1株(WO 01/94571记载的菌株)根据说明书对pBS185 (位点特异的重组酶表达质粒，从Lifetech公司购入)、pEX loxP- Hyg HCV1 W进行转染(每200万个细胞使用1.0μg的DNA)。用含 有5％FBS(胎牛血清：从Lifetech公司购入)的CHO-S-S FM-II 培养基(从Lifetech公司购入)，于37℃、5％CO2条件下培养48小 时后，再用加有200mg/L的潮霉素(从SIGMA公司购入)的同一培养 基于37℃、5％CO2条件下培养25日，选择新霉素抗性菌落(Mkamp HCV1 株)。
11.利用ELISA assay测定抗体产率
将抗人免疫球蛋白山羊抗体(从Zymed公司购入)溶液(用溶液1 稀释到10μg/ml)加到96孔板中，每孔50μl，于37℃下处理2小 时。然后将孔中的溶液倒掉，向各个孔中加入250μl的溶液2，于4 ℃下保温16小时以上。除去溶液后，用溶液3洗各个孔，洗5次，向 各孔中加入用溶液4稀释的抗体(标准)或样品溶液(用溶液4对培 养上清任意稀释后的溶液)，每孔50μl，于37℃下保温2小时。除 去溶液后，用溶液3洗5次，然后加入溶液5，每孔50μl，于20℃下 保温40分钟。除去溶液后，用PBS洗5次，然后加入溶液9，每孔100 μl，于室温下避光反应约5分钟。然后加入等量的10％硫酸终止反应 后，利用Immuno Reader(Inter Med公司制造，Immuno Reader NJ -2000)测定各个孔在11＝490nm以及12＝650nm的吸光度A1和A2， 求(A1-A2)。利用稀释标准液制作测量曲线，测定样品中的1-3- 1抗体(作标准使用的)的浓度。各溶液组成如下。
溶液1：含有0.1％叠氮化钠的PBS
溶液2：含有1％BSA、0.1％叠氮化钠的PBS
溶液3：含有0.05％Tween20的PBS
溶液4：含有1％BSA的PBS
溶液5：HRP标记抗人免疫球蛋白山羊抗体(从Zymed公司购入) 原液2μl溶解在10ml溶液4中后的溶液(用时制备)
溶液6：取磷酸一氢钠14.2g，加水配成500ml
溶液7：取带1个水合物的柠檬酸10.5g，加水配成500ml
溶液8：向257ml溶液5中加入243ml溶液6，加水配成1000ml
溶液9：取邻苯二胺(从和光纯药购入)4.0mg，加10ml溶液7 和30％(v/v)过氧化氢5μl，进行溶解的溶液(制备后10分钟以内 使用)
12.向Mkamp株位点特异导入了抗体表达基因后的菌株的抗体生 产率
通过上述ELISA法确认以下的生产量。

13.重组whole抗体的特性
利用与测定单链抗体对抗原的亲和性、中和活性时同样的方法测 定得到的纯化重组whole抗体的值。
Kd＝2×10-9  中和活性  IC50＝25mg/l
得到的重组whole抗体称之为whole抗体1-1，其重链和轻链的 氨基酸序列以及碱基序列分别表示在序列表中序列号40和41中。
14.细胞融合分析
细胞融合分析根据Takikawa等人的方法(Takikawa et al.，J.Virol.，74，5066-5074.2000)。将在细胞表面表达重组E1和 E2蛋白的CHO细胞(Matsuura et al.，unpublished)接种到包被了 胶原的96孔板的各个孔中，每孔2万个，于5％CO2、37℃条件下进行 培养。准备细胞时，不使用胰蛋白酶，在添加了10mM EDTA的磷酸缓 冲食盐水(PBS)中浸5分钟之后，振荡烧瓶使细胞尽可能地分散，用 吸管轻轻地吸、排，进行剥落。培养24小时后，细胞用200μL的Opti MEM(Gibco BRL)洗2次，使用Trans IT-LT1(Mirus)将在T7启 动子的下游整合了萤火虫荧光素酶基因的报告质粒pT7EMCLuc(Aoki et al.，Virology，250，140-150，1998)和为使基因导入效率标准化在 CMV启动子的下游整合了海椎茸的荧光素酶基因的pRL-CMV (Promega)导入细胞。每一个板都按以下组成准备，静置15分钟， 每孔加入30μl。2小时后各添加150μl的添加了10％血清的D-MEM (Gibco)，继续培养。
Opti-MEM       3ml
Trans IT-LT    150μl
pT7EMCLuc      9μg
pRL-CMV        0.6μg
作为细胞融合反应的容纳细胞使用来自人肝细胞癌的HepG2细 胞。将HepG2细胞接种到6孔板中的各个孔，每孔80×105个细胞，于 5％CO2、37℃条件下进行培养。培养24小时后，将表达T7 RNA聚合 酶的质粒pCAGT7pol(Ishii et al.，unpublished)以下列组成导入 细胞，2小时后，添加1.5ml的加有10％血清的D-MEM。培养24～36 小时后，用胰蛋白酶使细胞剥落，悬浮于25～30ml的加有10％血清 的D-MEM后，转移至50ml的离心管中，于5％CO2、37℃条件下，放置 在振荡机上浮游培养过夜。
Opti-MEM       100μl
Trans IT-LT11  5μl
pCAGT7pol      1μg
在向96孔板中导入了准备的报告质粒的表达HCV包膜蛋白的CHO 细胞(转染48小时后)的上面导入表达T7RNA聚合酶的质粒之后，向 各个孔各加入浮游培养一夜的2×104/100μl的HepG2细胞，培养5 小时后，倒掉介质，在100μl的pH 5.0约PBS中浸渍2分钟后，直 接舍弃掉该液体，向各孔加入加有10％血清的D-MEM 200μl，继续培 养。培养5小时后，使用dual-luciferaze reporter assay sytem(Promega)，按照附带的程序测定细胞的荧光素酶的活性，对细 胞融合活性进行评价。
15.细胞融合抑制分析
研究抗体抑制细胞融合的抑制活性基本上与上述细胞融合抑制分 析相同，在向CHO细胞加入HepG2细胞之前，先用Opti-MEM将HepG2 细胞洗2次后，在与用Opti-MEM阶段稀释的被检测抗体(whole抗 体)反应60分钟之后，进行共培养。然后同样测定荧光素酶活性，对 细胞融合抑制活性进行评价。结果可以确认在以表现NOB活性的单链 抗体为基础制作的完全抗体中，HCV的包膜蛋白具有特异抑制细胞融合 的活性。
16.利用BIACOR X测定结合常数
利用BIACOR X测定得到的ScFv的结合常数根据附带的说明书进 行。
用セントリコン30将E2tag置换为10mM醋酸缓冲液(pH＝5.0)。 通过将该E2tag(100μg/mL、20μl)以5μl/min速度输送到传感芯 片CM5(BIACOR公司)的各个不同line(阵列)上，利用氨基偶合 (aminocappling)法进行固定，得到固定了E2tag的传感芯片。用 セントリコン30将ScFv1-1置换为HBS缓冲液(10mMHEPES(pH＝ 7.4)，0.15MNaCl，3.4mM EDTA，0.005％Tween 20)。利用BIACORE X (BIACOR公司)，将该scFv1-1溶液以5μl/min速度输送到先前制 作的E2tag传感芯片上，得到结合时的sensorgram。然后只将HBS缓 冲液以5μl/min速度输送到传感芯片上，得到解离时的sensorgram。 通过这些sensorgram的解析，得到E2tag与scFv1-1的结合常数4.5 ×108(M)、解离常数2.2×10-9(M)。
17.E2tag与肝素结合的确认
作为确认在E2tag上存在与硫酸化多糖类结合的部位的方法是对 E2tag与肝素共价结合的柱子Heparin-Sepharose CL-6B(从 Pharmacia公司购入)结合进行确认的方法。Heparin-Sepharose CL-6B用10mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)平衡。
在50μl的体系中使溶解在PBS的E2tag 2μg和高分子量肝素(从 Sigma公司购入)300μg或Heparin(从Sigma公司购入)300μg混 合，于37℃搅拌下温育1小时。与此同时也准备了作为对照只温育 E2tag的样品。用10,000rpm离心5分钟，只将上清转移到其它容器 中。加入100μl的0.15M NaCl、10mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)后， 离心之后，将上清转移到其它容器，这样操作反复进行5次。加50μl 的0.15M NaCl、10mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，于室温温育5分钟后， 离心后将上清转移到其它容器。
移至其它容器的洗脱样品进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用与 E2tag表达株构建一节同样的方法进行Western blotting，确认各个 洗脱级分中是否存在E2tag，结果只有将E2tag与Heparin-Sepharose CL-6B混合时，E2tag全部结合在柱子上，而在与Heparin-Sepharose CL-6B混合前，与高分子量肝素或与肝素温育时，抑制E2tag与柱子 的结合。该结果表明E2tag和E2中存在与肝素紧密结合的部位。
产业上利用的可能性
利用本发明可以提供具有抑制HCV感染作用等抗病毒效果的新 药。
序列表
<110>三菱东京制药株式会社
<120>丙型肝炎治疗药
<130>A11037MA
<160>81
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Asp Gln Pro Ile Gly
  1               5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
  1               5                  10                  15
Gly
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp
  1              5                10                  15
Pro
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
  1              5                  10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser
  1              5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Gln Gln Thr Lys Ser Phe Pro Leu Thr
  1              5
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Trp Leu Ala
  1              5                  10
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>8
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
  1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>9
Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Phe Ser
 1               5
<210>10
<11>8
<212>PRT
<213>人类
<400>10
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn
  1              5
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>11
Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg
  1              5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>12
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Asn Pro Thr
 1               5
<210>13
<211>14
<212>PRT
<213>人类
<400>13
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
 1               5                  10
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>14
Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser
  1             5
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Phe Glu
  1              5                  10
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
 1               5                 10                 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ile
            20                  25                  30
Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                   40                 45
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln
     50                  55                  60
Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
 65                 70                  75                  80
Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr
            100               105                110
Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
      115                 120                125
<210>17
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
        35                40                  45
Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Ser Phe Pro Leu
                85                    90              95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
              100              105                110
<210>18
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Phe
                85                90                 95
Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                   110
<210>19
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                 10                  15
Asp Thr Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Met Ile
        35                40                  45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg Gly Asp Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Asn Pro
                85                90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                   110
<210>20
<211>116
<212>PRT
<213>人类
<400>20
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln
  1              5                  10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
             20                  25                  30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
 65                  70                 75                   80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                90                  95
Leu Ser Gly Phe Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100               105                 110
Arg Ala Ala Ala
        115
<210>21
<211>384
<212>DNA
<213>人类
<400>21
atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct  48
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
 1               5                  10                15
ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc tac atc  96
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ile
            20                  25                30
gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag  144
Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca cac tac gca cag  192
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln
    50                   55                  60
aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag tcc acg agc aca  240
Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
 65                 70                  75                  80
gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac acg gcc gta tat  288
Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                95
tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt ggt tcc tgc tat  336
Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr
            100               105                110
gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt  384
Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115               120                125
<210>22
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>22
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag gac att agc aac tat  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg ctc  144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
        35                  40                45
tat gct aca tcc aga ttg tac agt ggg gtc cca tcc agg ttc agt ggc  192
Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc agc atc agc agc ctg cag cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag act aag agt ttc ccc ctc  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Ser Phe Pro Leu
                85                    90              95
act ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>23
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>23
gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc gtg tct gct tct gta ggg  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag gat att agc acc tgg  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Trp
            20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aga gcc cct aag ctc ctg atc  144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc  192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc aca atc agc agc ctg cag cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt cta cag cat gat agt tac ccc ttc  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Phe
              85                 90                  95
tct ttc ggc cct ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100                 105                 110
<210>24
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>24
gac atc gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aca gtc acc atc tct tgc cgg gca agt cag agc att tcc aac ttt  96
Asp Thr Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
            20                  25                   30
tta aac tgg tat cgg cag aaa cca gga aag gcc cct gaa ctg atg att  144
Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Met Ile
        35                  40                45
tat gct gcg tcc aga ctg caa cgt ggg gac cca tca agg ttt agt ggc  192
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg Gly Asp Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                60
agt gga tct ggg aca gaa ttc agt ctc acc atc agc ggt ctg cag cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
gag gat tct gca acc tat cac tgt caa cag agt tac agt acc aat ccc  288
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Asn Pro
                85                90                  95
acg ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100                  105                  110
<210>25
<211>348
<212>DNA
<213>人类
<400>25
cag gct gtg ctc act cag ccg tcc tca gtg tct ggg ccc cca ggg cag  48
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Pro Pro Gly Gln
 1               5                  10                  15
agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg gca ggt  96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
             20                 25                   30
tat gat gta cac tgg tac cag cag ctt cca gga aca gcc ccc aaa ctc  144
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
ctc atc tat ggt aac aac aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc  192
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
     50                 55                60
tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc  240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
 65                  70                  75                  80
cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcc tat gac agc agc  288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
                85                90                  95
ctg agt ggg ttt gag gtc ttc gga acc ggg acc aag gtg gag atc aaa  336
Leu Ser Gly Phe Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100               105                 110
cgt gcg gcc gca                                                  348
Arg Ala Ala Ala
        115
<210>26
<211>900
<212>DNA
<213>人类
<400>26
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
            20                  25                30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                  40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
     50                  55                  60
caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
                85                90                    95
tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
            100                 105               110
acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
        115                 120               125
ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                  135                  140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155               160
ggc gga agt gca ctt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg  528
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
                165               170                 175
tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
            180                 185                 190
gac att agc aac tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc  624
Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
        195                 200               205
cct aag ctc ctg ctc tat gct aca tcc aga ttg tac agt ggg gtc cca  672
Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro
    210               215                 220
tcc agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc agc atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
225                 230                 235               240
agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag act  768
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr
                245               250                 255
aag agt ttc ccc ctc act ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gaa atc aaa  816
Lys Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            260               265                 270
cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
        275                  280                  285
agg tcg acc cac cat gcg cat cac cac gcc gca tag                  900
Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala
    290                 295
<210>27
<211>900
<212>DNA
<213>人类
<400>27
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
            20                  25                30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                 40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                   55                  60
caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
                85                90                    95
tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
            100                 105               110
acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
        115                 120               125
ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135               140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155               160
ggc gga agt gca ctt gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc gtg  528
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
               165                170                 175
tct gct tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
            180                 185                 190
gat att agc acc tgg tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aga gcc  624
Asp Ile Ser Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala
        195                 200                 205
cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca  672
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
    210                 215                 220
tca agg ttc agc ggc agt ggg tct ggg aca gaa ttc act ctc aca atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
225                 230                 235               240
agc agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt cta cag cat  768
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His
                245               250                255
gat agt tac ccc ttc tct ttc ggc cct ggg acc aag gtg gaa atc aaa  816
Asp Ser Tyr Pro Phe Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            260               265                 270
cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
        275               280                 285
agg tcg acc cac cat gcg cat cac cac gcc gca tag                  900
Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala
    290                 295
<210>28
<211>900
<212>DNA
<213>人类
<400>28
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
            20                  25                30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                 40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
     50                  55                  60
caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
                85                90                    95
tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
            100                 105               110
acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
        115                 120               125
ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135               140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155               160
ggc gga agt gca ctt gac atc gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg  528
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
                165               170                 175
tct gca tct gta gga gac aca gtc acc atc tct tgc cgg gca agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
            180                 185                 190
agc att tcc aac ttt tta aac tgg tat cgg cag aaa cca gga aag gcc  624
Ser Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala
        195                 200                 205
cct gaa ctg atg att tat gct gcg tcc aga ctg caa cgt ggg gac cca  672
Pro Glu Leu Met Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Arg Gly Asp Pro
    210                 215               220
tca agg ttt agt ggc agt gga tct ggg aca gaa ttc agt ctc acc atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile
22                  5230                 235              240
agc ggt ctg cag cct gag gat tct gca acc tat cac tgt caa cag agt  768
Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser
              245                 250                255
tac agt acc aat ccc acg ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gag atc aaa  816
Tyr Ser Thr Asn Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            260               265                 270
cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
        275               280                 285
agg tcg acc cac cat gcg cat cac cac gcc gca tag                  900
Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala
    290                 295
<210>29
<211>915
<212>DNA
<213>人类
<400>29
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1               5                  10                   15
gcc cag ccg gcc atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
                 20                 25                  30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                 40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                   60
caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
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tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
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acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
        115                 120               125
ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135               140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                  150                    155                160
ggc gga agt gca ctt cag gct gtg ctc act cag ccg tcc tca gtg tct  528
Gly Gly Ser Ala Leu Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser
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ggg ccc cca ggg cag agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc  576
Gly Pro Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser
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aac atc ggg gca ggt tat gat gta cac tgg tac cag cag ctt cca gga  624
Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
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aca gcc ccc aaa ctc ctc atc tat ggt aac aac aat cgg ccc tca ggg  672
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly
    210                 215                 220
gtc cct gac cga ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg  720
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
225                 230                 235                 240
gcc atc act ggg ctc cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag  768
Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
                245               250                255
tcc tat gac agc agc ctg agt ggg ttt gag gtc ttc gga acc ggg acc  816
Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Phe Glu Val Phe Gly Thr Gly Thr
           260                  265               270
aag gtg gag atc aaa cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa  864
Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
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gag gat ctg ggc tcg agg tcg acc cac cat gcg cat cac cac gcc gca  912
Glu Asp Leu Gly Ser Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala
        290                 295               300
tag                                                                915
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<211>110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<220>
<223>引物
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<212>DNA
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<223>引物
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<212>DNA
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<223>引物
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<210>34
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<212>PRT
<213>人类
<400>34
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
 1               5                  10                15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr TyrIle
            20                  25                  30
Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                   40                 45
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln
    50                   55                  60
Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
 65                 70                  75                  80
Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr
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Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210>35
<211>380
<212>DNA
<213>人类
<400>35
atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gag gtg aag aag cct  48
Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
 1               5                  10                15
ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc tac atc  96
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Ile
            20                  25                  30
gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag  144
Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                   40                 45
tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca cac tac gca cag  192
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro His Tyr Ala Gln
     50                  55                  60
aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag tcc acg agc aca  240
Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr
 65                  70                  75                  80
gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac acg gcc gta tat  288
Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ghu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                90                 95
tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt ggt tcc tgc tat  336
Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg Gly Ser Cys Tyr
            100               105                 110
gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcg agt  384
Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
       115               120                 125
<210>36
<211>900
<212>DNA
<213>人类
<400>36
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
            20                25                  30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                  40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaagtc tcg att acc gcg gac gag   288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
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tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
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acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
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ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln
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gac att agc aac tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc  624
Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr
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aag agt ttc ccc ctc act ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gaa atc aaa  816
Lys Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg arc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
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Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala
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<213>人类
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gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
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gcc cag ccg gcc atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
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gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
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ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
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cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
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tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
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ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His
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Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
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Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
                325               330                 335
ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc  1056
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
            340                  345                  350
aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa  1104
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
        355               360                   365
ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat  1152
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
    370               375                 380
gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc  1200
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
385               390                 395                 400
tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag  1248
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
                405                 410               415
aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc  1296
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
          420                 425                 430
ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg  1344
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
            435                 440               445
aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac  1392
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
    450                 455               460
acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                  1428
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Stop
465                 470                 475
<210>41
<211>720
<212>DNA
<213>人类
<400>41
atg gcg ttg cag acc cag gtc ttc att tct ctg ttg ctc tgg atc tct  48
Met Ala Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
 1              5                   10                15
ggt gcc tac ggg gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct  96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
            20                  25                  30
gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cag gcg agt cag gac  144
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp
        35                  40                  45
att agc aac tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct  192
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
      50                55                  60
aag ctc ctg ctc tat gct aca tcc aga ttg tac agt ggg gtc cca tcc  240
Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
 65                 70                75                  80
agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc agc atc agc  288
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser
                85                  90               95
agc ctg cag cct gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag act aag  336
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys
            100               105                 110
agt ttc ccc ctc act ttc ggc ggg ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt  384
Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg
        115               120                 125
acc gtg gaa atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc 432
Thr Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
    130                 135                 140
ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc  480
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145                  150              155                   160
ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg  528
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
              165                170                 175
gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag  576
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
          180                185                 190
gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc  624
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
   195                    200                 205
aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat  672
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
    210               215                 220
cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt  720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235               240
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>42
Arg Ala Asn Gln Asn Ile Gly Asn Phe Leu Asn
1             5              10
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>43
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
  1              5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>44
Gln Gln Ser His Asn Ile Pro Leu Thr
  1              5
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>45
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
   1             5                  10
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>46
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
  1              5
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>47
Gln Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Leu Phe Thr
  1              5                  10
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>48
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
  1              5                   10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>49
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
  1              5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>50
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
  1              5
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>51
Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
  1              5                  10
<210>52
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>52
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
  1              5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>53
Gln Gln Ser Tyr Thr Ile Pro Tyr Thr
  1              5
<210>54
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>54
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Asn Ile Gly Asn Phe
            20                  25                30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
        35                40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Asn Ile Pro Leu
                85                    90              95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>55
<211>112
<212>PRT
<213>人类
<400>55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr
            20                25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
         50              55                 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
 65                  70                 75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Leu
                85                90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>56
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>57
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>57
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
        35                  40                45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ile Pro Tyr
                85                    90                95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>58
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>58
gat gtt gtg atg act cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg  48
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca aat cag aac att ggt aat ttt  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Asn lle Gly Asn Phe
            20                  25                30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ccc ctg atc  144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile
        35                  40                45
tat gct gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc  192
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc agt ctc acc atc agc agt ctg caa cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag agt cac aat atc ccg ctc  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Asn Ile Pro Leu
                85                90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>59
<211>336
<212>DNA
<213>人类
<400>59
gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aga gtc acc atg act tgc cgg gca agt cag agt att aac aac tat  96
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr
            20                25                  30
tta aat tgg tat caa caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc  144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                45
tct gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tcg agg ttc agt ggc  192
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                 55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc acc agt ctg caa cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
 65                  70                 75                  80
gag gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac gat tcc acc cta  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Leu
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ttc act ttc ggc cct ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gcg gcc gca  336
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>60
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>60
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tat  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
      20                            25                   30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc  144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc  192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                 70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc ccg ctc  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>61
<211>333
<212>DNA
<213>人类
<400>61
gac atc gtg atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1              5                  10                  15
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
        35                  40                45
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Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac act att ccg tac  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ile Pro Tyr
                85                90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt gcg gcc gca      333
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lle Lys Arg Ala Ala Ala
            100               105                 110
<210>62
<211>900
<212>DNA
<213>人类
<400>62
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
            20                  25                30
gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
         35                 40                  45
ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
     50                  55                  60
caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
 65                 70                  75                  80
cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
                85                  90                  95
tcc acg agc aca gct tac ctg gaa ctg acc agc ctc aca tct gag gac  336
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
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acg gcc gta tat tac tgt gcg agg gtc ctt agg ggt tat tgt cgt cgt  384
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Gly Tyr Cys Arg Arg
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ggt tcc tgc tat gac tgg ctc gac ccc tgg ggc cag ggc acc ctg gtc  432
Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135               140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
ggc gga agt gca ctt gat gtt gtg atg act cag tct cca tcc tcc ctg  528
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
                165               170                 175
tct gca tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca aat cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln
            180                 185                 190
aac att ggt aat ttt tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc  624
Asn Ile Gly Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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cct aag ccc ctg atc tat gct gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca  672
Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro
    210                 215                 220
tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc agt ctc acc atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile
225                 230                 235                 240
agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag agt  768
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
                245               250                 255
cac aat atc ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa  816
His Asn Ile Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
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agg tcg acc cac cat gcg cat cac cac gcc gca tag                  900
Arg Ser Thr His His Ala His His His Ala Ala Stop
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<210>63
<211>903
<212>DNA
<213>人类
<400>63
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
gcc cag ccg gcc atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gct gag  96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
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gtg aag aag cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga  144
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
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ggc acc tac atc gac caa cct atc ggc tgg gtg cga cag gcc cct gga  192
Gly Thr Tyr Ile Asp Gln Pro Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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caa ggg ctt gag tgg atg gga ggg atc atc cct ctc tct ggt ccg cca  240
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Leu Ser Gly Pro Pro
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cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
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Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp
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Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atg act tgc cgg gca agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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agt att aac aac tat tta aat tgg tat caa caa aaa cca ggg aaa gcc  624
Ser Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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cct aag ctc ctg atc tct gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca  672
Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
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tcg agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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acc agt ctg caa cct gag gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt  768
Thr Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
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tac gat tcc acc cta ttc act ttc ggc cct ggg acc aag gtg gaa atc  816
Tyr Asp Ser Thr Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
            260               265                 270
aaa cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc  864
Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly
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<210>64
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<212>DNA
<213>人类
<400>64
gtg aaa aaa tta tta ttc gca att cct tta gtt gtt cct ttc tat gcg  48
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
  1              5                  10                  15
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Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
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Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
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cac tac gca cag aag ttc cag ggc aaa gtc tcg att acc gcg gac gag  288
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Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
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agc att agc agc tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc  624
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca  672
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
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tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc  720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt  768
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
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tac agt acc ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa  816
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg  864
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Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala
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Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
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His Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Lys Val Ser Ile Thr Ala Asp Glu
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Gly Ser Cys Tyr Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135               140
acc gtc tcg agt gga ggc ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt  480
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Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
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tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag  576
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
            180                 185                 190
cgc att agc aac tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc  624
Arg Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
        195               200                 205
cct aag ctc ctg gtc tat gct gca tct aat ttg caa agt ggg gtc cca    672
Pro Lys Leu Leu Val Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro
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tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc    720
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225                 230                 235               240
agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt    768
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
                245               250                255
tac act att ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa    816
Tyr Thr Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            260                 265               270
cgt gcg gcc gca gag cag aag ctg atc agc gaa gag gat ctg ggc tcg    864
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ser
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<210>66
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>66
ccctgatcag aattcgcagg atccctcgag actagtgatg atcgggccag atatacgcg   59
<210>67
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
ccctgatcaa gatctgctag cgtcgactcc ccagcatgcc tgctgctattg            51
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
ccccagatct ctattccttt gccctcggac gag                               33
<210>69
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
ccccaagctt atgaaaaagcctgaactcac cgcg                               34
<210>70
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
cccgccggct gggtgtggcg gac cgc                                      26
<210>71
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
cccctctaga aagtatagga acttcaagc                                    29
<210>72
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
ccccaagctt ctcgagacta gtaccaaggg cccatcggtc ttccc                  45
<210>73
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
ccccgggccc tctagtagct ttcatttacc cggagacagg g                      41
<210>74
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
cccaagcttc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg  60
ggtcctgtcc caggtgcagc tggtgcagtc tg
<210>75
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>75
cccgctagca ctcgagacgg tgaccagggt gcc                               33
<210>76
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>76
ccccagagct agtcctgcag gcggggaaat gtgcgcggaa cccct                  45
<210>77
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>77
ccccgctagc ctgcaagtca tttcgaaccc cagcgtccc                         39
<210>78
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>78
ccccaagctt ctagagtcga cggtaccgtg gaaatcaaac gaactgtgg              49
<210>79
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>79
ccccgggccc tctagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagc                  45
<210>80
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>80
cccaagcttc accatggcgt tgcagaccca ggtcttcatt tctctgttgc tctggatctc  60
tggtgcctac ggggacatcc agatgaccca gtctcc
<210>81
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>81
ccccgtacgt ttgatttcca ccttggtccc cccg                              34