朊病毒蛋白结合材料及其使用方法
阅读：253发布：2020-05-18
专利汇可以提供朊病毒蛋白结合材料及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且朊病毒 蛋白结合材料以及应用结合材料来检测或者去除样品中朊病毒蛋白的方法，样品如 生物 液体或者环境样品。结合材料可以结合一种或多种形式的朊病毒蛋白，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)，传染性朊病毒蛋白(PrPsc)，重组朊病毒蛋白(PrPr)，以及蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPres)。来自包括人和仓鼠的多种不同物种的朊病毒被结合材料结合。，下面是朊病毒蛋白结合材料及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种从样品中检测和分离朊病毒蛋白的方法，所述方法包括在 使朊病毒蛋白和聚合朊病毒蛋白结合材料之间结合的条件下，用该聚 合朊病毒蛋白结合材料接触所述样品，其中该聚合朊病毒蛋白结合材 料包括结合至功能团的基质，且其中所述功能团包括亲水基团、疏水 基团、或两亲功能团。
2.如权利要求1所述的方法，其中该官能团是带正电基团、带负 电基团或不带电基团。
3.如权利要求1所述的方法，其中该功能团是胺基、亚硫酸盐基 团、磺酰基、2，2，2-三氟乙烷磺酰基、烷基、芳香基团、硅氧烷基或氟 化基团。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述芳香基团是苯基。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述烷基是丁基。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述官能团是胺基。
7.如权利要求6所述的方法，其中胺基是伯胺基团、仲胺基团、 叔胺基团或季胺基团。
8.如权利要求7所述的方法，其中季胺基团是二乙基氨基乙基、 二甲基氨基乙基或三甲基氨基乙基。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述官能团包括：
a)-OCH2-CHOH-CH2NH2；
b)-C6H5；
c)-(CH2)3-CH3；
d)-CH2-CH2-N+H(C2H5)2；
e)-SO2-CH2-CF3；
f)-CH2-CH2-N+H(CH3)2；
g)-CH2-CH2-N+(CH3)3；或
h)-SO3 2-。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述基质是聚甲基丙烯酸或 甲基丙烯酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述基质是FRACTOGELTM EMD、TOYOPEARLTM或者TSK-GELTM聚合物基质。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述聚合物基质是 TOYOPEARLTM AMINO 650。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述朊病毒蛋白是PrPc、 PrPsc、PrPr或PrPres。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合朊病毒蛋白结合材 料位于色谱柱中、膜上、纤维上、珠子上，注入非机织筛网中，涂覆 纤维，包括在过滤器壳体之中，或其组合。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物样品、食品、 环境样品或水样品。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述生物样品来源于人或 动物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述动物是牛、绵羊、猪、 马、鼠或者鹿科动物。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述朊病毒蛋白是人、牛、 绵羊、猪、马、鼠或者鹿科动物朊病毒蛋白。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述生物样品是来源于血 液的样品、来源于脑的样品、体液样品、胶原提取物、腺体提取物、 组织匀浆物或者提取物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述体液是血液、血浆、 血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、管液、眼泪或者精液。
技术领域
本发明涉及蛋白结合(binding)领域，更具体地，涉及与朊病毒 蛋白结合的材料以及应用朊病毒蛋白结合材料来检测或者去除生物样 品中的朊病毒的方法。
背景技术
天然或者细胞朊病毒蛋白“PrPc”广泛分布于哺乳动物中，并且具有 特别的非常保守的氨基酸序列以及蛋白结构。认为传染性朊病毒是由 正常细胞(PrPc)朊病毒蛋白的修饰形式构成，并且称作“PrPsc”。朊 病毒与其它传染性病原体有一些共同的特性，但是看起来其中并不含 有核酸。相反，认为翻译后的构象变化导致了非传染性的PrPc转变为 传染性的PrPsc，其中发生了α-螺旋转变成β-折叠。PrPc含有三个α- 螺旋结构以及很少的β-折叠结构；与之相反，PrPsc富含β-折叠。相信 PrPc到PrPsc的转变导致了可传播性海绵状脑病(TSEs)的发展，其 中，PrPsc积累于中枢神经系统并且同时伴随着神经病理学的变化以及 神经学上的功能紊乱。PrPsc，通常是指朊病毒蛋白的“骚痒症”形式， 并且认为这对于在动物和人中可传播的神经退化疾病的传播和致病机 理是必要的，并且很可能是充分的。
TSEs的具体例子包括骚痒症，该疾病侵袭绵羊和山羊；牛海绵状 脑病(BSE)；可传播的水貂脑病，猫海绵状脑病和慢性消耗疾病 (CWD)。在人中，TSE疾病可表现为苦鲁病，克雅(氏)病(或皮 层-基底节-脊髓变性症候群(CJD))，格-施-沙综合征 (Gerstmann-Straüssler-ScheinKer(GSS))，致命性失眠症以及CJD病 的变异体(vCJD)。最近在人类中出现vCJD，导致BSE在英国很流行， 并且其最有可能是由于吃了来源于感染了BSE或者“疯牛病”的家畜类 的食物引起。在英国，20世纪80年代中期到90年代早期，由于摄取 了感染了BSE的家畜神经组织潜在感染的食物的人数还不清楚。由于 在人类中，口腔感染疾病的潜伏期可能超过20年，vCJD的实际发生 率可能很多年都显现不出来。至今，已知超过150个人感染过该种疾 病，主要在英国；然而在加拿大，法国，香港，以色列，意大利以及 美国也报导过该种病例。英国在世界范围内出口被感染牛饲料产品表 明，很可能全球都存在BSE，并且由此而带来了vCJD的可能性。与 这些观察结果相一致的是在大多数欧洲国家、日本、加拿大、美国和 以色列检测到BSE。所以，从包括食品在内的各种不同材料中检测并 且去除传染性的朊病毒蛋白就变得非常重要。
所有TSEs的特征是：对于该类物质，缺乏可以检测到的宿主免疫 应答。所以，到目前还没有确定对TSCs特异的抗体。此外，缺乏已知 的核酸序列排除了应用聚合酶链式反应为基础的诊断方法。这样就没 有常规的血清学检测可以用于确定被感染的动物。最近，改良的以免 疫学为基础的技术已经用于确定在屠宰动物的脑中是否有PrPsc。
除了摄取来源于牛的被感染产品外，输血和器官移植是在人之间 传播vCJD的另一种方式。在人中通过输血来传播vCJD的风险目前是 未知的，但是，基于实验动物模型的数据，包括用实验手段使得口腔 感染了BSE后的绵羊以及天然地感染了骚痒症的绵羊进行传播，结果 它们具有非常可能的几率，已经最可能解释人与人之间vCJD的传播。 不象其它的人TSEs，PrPsc存在于vCJD患者的淋巴网状内皮细胞系统 中，因此增加了传染性物质存在于血液中的几率，并且可以通过输血 进行传播。其它涉及的通过输血来提高传播风险的因素还不清楚，可 以设想会很高，很多暴露于BSE的人群，缺乏对于vCJD潜伏期的诊 断测试。此外，vCJD的毒性在灵长类和鼠中随着种族的适应性似乎有 所增加，这意味着人与人之间的传播比牛对人的传播更有效。因此， 迫切地需要一些方法来阻止vCJD通过输血传播。这样的措施可以包括 被感染供体的早期确认以及动物来源的食物或者保健品中TSE物质的 延缓、去除和灭活，所述动物来源的食物或者保健品应用于动物或者 人的日常消费或应用，人和牛的血液来源制品，器官移植。很可惜， TSE的传染性对于灭活的化学和物理方法有显著的抗性，并且难以找 到选择性灭活方法。
已经确定了很多结合于朊病毒蛋白的材料。发现从组合肽库中筛 查结合于八肽重复序列(PHGGGWGQ)(SEQ ID NO：1)的配体，存 在于所有已知的哺乳动物朊病毒蛋白中，并且还发现了一系列配体， 正如在PCT/US01/11150中所描述的。其它的材料包括与淀粉样蛋白斑 如刚果红(Congo Red)淀粉样蛋白斑相互作用的配体(Ingrosso，L.，等 人，Congo Red Prolongs the Incubation Period in Scrapie-infected Hamsters.J.Virology 69：506-508(1995))；4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini， F.，等人，Effectiveness of Anthracycline Against Experimental Prion Diseases in Syrian Hamsters.Science 276：1119-1122(1997))；两性霉素 B，卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等人，Porphyrin and Phthalocyanine Antiscrapie Compounds，Science 287：1503-1506(2000))；金属(Stockel 等人，Biochemistry，37，7185-7193(1998))；与Prp相互作用形成复合体 的肽(参见美国专利5,750,361，Prusiner等人和Soto，C.等人，Reversion of Prion Protein Conformational Changes in Synthetic β-sheet Breaker Peptides，Lancet，355：192-197(2000))；肝素和其它聚硫酸化聚阴离子 (Caughey，B.，等人，Binding of the Protease-sensitive Form of Prion Protein Prp to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red，J.Virology 68：2135-2141(1994))；抗体(Kascsak，R.J.，等人，Immunodiagnosis of Prion Disease，Immunological Invest.26：259-268(1997))；和其它蛋白， 例如血纤蛋白溶酶原(Fischer，M.B.等人.，Binding of Disease-associated Prion Protein to Plasminogen.，Nature 408：479-483(2000))。离子交换层 析已经被用于纯化朊病毒蛋白污染的血液组分，例如血色素(美国专 利号5,808,011，Gawryl等人)。然而，Gawryl等人教导的层析材料结合 血色素，并且随后用梯度洗脱收集纯化的血色素。目前，还没有材料 已经被完全表征或者发现能结合来自多种介质的朊病毒蛋白。
到目前为止，人TSE疾病是100％致命的。不幸的是，尽管包括 两性霉素、硫酸化聚阴离子、刚果红染料和蒽环类(anthracycline)抗 生素的大量化合物已经被报导为有希望的治疗剂，但所有这些化合物 已经证明对于阻止朊病毒蛋白繁殖只有适度的潜力，并且没有一种化 合物显示出对于在受控的临床研究中从被感染的宿主中去除预先存在 的朊病毒蛋白有任何效果。因此，目前仍然迫切需要新型的治疗试剂。
从正常的可溶性蛋白到构象改变的、不可溶形式的装配和去装配 的过程，被认为是很多种其它疾病的病因，这些疾病很多是属于神经 系统方面的疾病。对于疾病的发病与正常蛋白转变为构象改变蛋白之 间的关系，还了解的很少。除了朊病毒蛋白，这些不溶性蛋白的具体 例子还包括：在阿耳茨海默(氏)病和大脑淀粉样血管病中的淀粉样 蛋白斑之中的β-淀粉状肽；在帕金森病中向心性多层圆形小体(卢伊 体)中的α-synuclein沉积物，额颞痴呆中神经原纤维缠结中的tau蛋 白，以及皮克病；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化中的超(过)氧化物歧 化酶；以及亨延顿(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。这些高度不溶性蛋 白通常形成由无分支的原纤维组成的聚集体，其共同的特征是β折叠 构象。
需要便于区分或者分辨两种或者更多种不同构象形式的蛋白，如 PrPc和PrPsc的方法学，从而理解这种转变的过程，并且发现与疾病 相关形式发生特异地相互作用的结构。区分或者分辨蛋白的同工型的 目前的方法学包括：在存在如尿素的离液剂条件下，在聚丙烯酰胺凝 胶上的差别迁移率，即横向尿素梯度(TUG)凝胶；对于蛋白酶处理 如蛋白酶K(PK)的差别敏感性，检测被称作PrPres的PrPsc的PK- 抗性消化产物；差别温度稳定性；在非离子去垢剂中的相对溶解性； 以及纤维结构结合某些化学物质，如刚果红和异黄酮S的能力。然而， 仍需要鉴定另外的朊病毒蛋白结合材料。而且也仍需要鉴定对构象改 变的蛋白质，特别是与疾病相关的蛋白质特异的高亲合性结合材料。 这些试剂将用于开发可能的诊断试剂盒，分离和纯化不同形式的蛋白， 用于从治疗试剂、生物制品、疫苗和食品中去除该疾病的传染性形式， 并且用于治疗。
TSEs的具体例子包括骚痒症，该疾病侵袭绵羊和山羊；牛海绵状 脑病(BSE)；可传播的水貂脑病，猫海绵状脑病和慢性消耗疾病 (CWD)。在人中，TSE疾病可表现为苦鲁病，克雅(氏)病(或皮 层-基底节-脊髓变性症候群(CJD))，格-施-沙综合征 (Gerstmann-Straüssler-ScheinKer(GSS))，致命性失眠症以及CJD病 的变异体(vCJD)。最近在人类中出现vCJD，导致BSE在英国很流行， 并且其最有可能是由于吃了来源于感染了BSE或者“疯牛病”的家畜类 的食物引起。在英国，20世纪80年代中期到90年代早期，由于摄取 了感染了BSE的家畜神经组织潜在感染的食物的人数还不清楚。由于 在人类中，口腔感染疾病的潜伏期可能超过20年，vCJD的实际发生 率可能很多年都显现不出来。至今，已知超过150个人感染过该种疾 病，主要在英国；然而在加拿大，法国，香港，以色列，意大利以及 美国也报导过该种病例。英国在世界范围内出口被感染牛饲料产品表 明，很可能全球都存在BSE，并且由此而带来了vCJD的可能性。与 这些观察结果相一致的是在大多数欧洲国家、日本、加拿大、美国和 以色列检测到BSE。所以，从包括食品在内的各种不同材料中检测并 且去除传染性的朊病毒蛋白就变得非常重要。
所有TSEs的特征是：对于该类物质，缺乏可以检测到的宿主免疫 应答。所以，到目前还没有确定对TSCs特异的抗体。此外，缺乏已知 的核酸序列排除了应用聚合酶链式反应为基础的诊断方法。这样就没 有常规的血清学检测可以用于确定被感染的动物。最近，改良的以免 疫学为基础的技术已经用于确定在屠宰动物的脑中是否有PrPsc。
除了摄取来源于牛的被感染产品外，输血和器官移植是在人之间 传播vCJD的另一种方式。在人中通过输血来传播vCJD的风险目前是 未知的，但是，基于实验动物模型的数据，包括用实验手段使得口腔 感染了BSE后的绵羊以及天然地感染了骚痒症的绵羊进行传播，结果 它们具有非常可能的几率，已经最可能解释人与人之间vCJD的传播。 不象其它的人TSEs，PrPsc存在于vCJD患者的淋巴网状内皮细胞系统 中，因此增加了传染性物质存在于血液中的几率，并且可以通过输血 进行传播。其它涉及的通过输血来提高传播风险的因素还不清楚，可 以设想会很高，很多暴露于BSE的人群，缺乏对于vCJD潜伏期的诊 断测试。此外，vCJD的毒性在灵长类和鼠中随着种族的适应性似乎有 所增加，这意味着人与人之间的传播比牛对人的传播更有效。因此， 迫切地需要一些方法来阻止vCJD通过输血传播。这样的措施可以包括 被感染供体的早期确认以及动物来源的食物或者保健品中TSE物质的 延缓、去除和灭活，所述动物来源的食物或者保健品应用于动物或者 人的日常消费或应用，人和牛的血液来源制品，器官移植。很可惜， TSE的传染性对于灭活的化学和物理方法有显著的抗性，并且难以找 到选择性灭活方法。
已经确定了很多结合于朊病毒蛋白的材料。发现从组合肽库中筛 查结合于八肽重复序列(PHGGGWGQ)(SEQ ID NO：1)的配体，存 在于所有已知的哺乳动物朊病毒蛋白中，并且还发现了一系列配体， 正如在PCT/US01/11150中所描述的。其它的材料包括与淀粉样蛋白斑 如刚果红(Congo Red)淀粉样蛋白斑相互作用的配体(Ingrosso，L.，等 人，Congo Red Prolongs the Incubation Period in Scrapie-infected Hamsters.J.Virology 69：506-508(1995))；4-碘，4-脱氧阿霉素(Tagliavini， F.，等人，Effectiveness of Anthracycline Against Experimental Prion Diseases in Syrian Hamsters.Science 276：1119-1122(1997))；两性霉素 B，卟啉和酞菁(Priola，S.A.，等人，Porphyrin and Phthalocyanine Antiscrapie Compounds，Science 287：1503-1506(2000))；金属(Stockel 等人，Biochemistry，37，7185-7193(1998))；与Prp相互作用形成复合体 的肽(参见美国专利5,750,361，Prusiner等人和Soto，C.等人，Reversion of Prion Protein Conformational Changes in Synthetic β-sheet Breaker Peptides，Lancet，355：192-197(2000))；肝素和其它聚硫酸化聚阴离子 (Caughey，B.，等人，Binding of the Protease-sensitive Form of Prion Protein Prp to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red，J.Virology 68：2135-2141(1994))；抗体(Kascsak，R.J.，等人，Immunodiagnosis of Prion Disease，Immunological Invest.26：259-268(1997))；和其它蛋白， 例如血纤蛋白溶酶原(Fischer，M.B.等人.，Binding of Disease-associated Prion Protein to Plasminogen.，Nature 408：479-483(2000))。离子交换层 析已经被用于纯化朊病毒蛋白污染的血液组分，例如血色素(美国专 利号5,808,011，Gawryl等人)。然而，Gawryl等人教导的层析材料结合 血色素，并且随后用梯度洗脱收集纯化的血色素。目前，还没有材料 已经被完全表征或者发现能结合来自多种介质的朊病毒蛋白。
到目前为止，人TSE疾病是100％致命的。不幸的是，尽管包括 两性霉素、硫酸化聚阴离子、刚果红染料和蒽环类(anthracycline)抗 生素的大量化合物已经被报导为有希望的治疗剂，但所有这些化合物 已经证明对于阻止朊病毒蛋白繁殖只有适度的潜力，并且没有一种化 合物显示出对于在受控的临床研究中从被感染的宿主中去除预先存在 的朊病毒蛋白有任何效果。因此，目前仍然迫切需要新型的治疗试剂。
从正常的可溶性蛋白到构象改变的、不可溶形式的装配和去装配 的过程，被认为是很多种其它疾病的病因，这些疾病很多是属于神经 系统方面的疾病。对于疾病的发病与正常蛋白转变为构象改变蛋白之 间的关系，还了解的很少。除了朊病毒蛋白，这些不溶性蛋白的具体 例子还包括：在阿耳茨海默(氏)病和大脑淀粉样血管病中的淀粉样 蛋白斑之中的β-淀粉状肽；在帕金森病中向心性多层圆形小体(卢伊 体)中的α-synuclein沉积物，额颞痴呆中神经原纤维缠结中的tau蛋 白，以及皮克病；肌萎缩性(脊髓)侧索硬化中的超(过)氧化物歧 化酶；以及亨延顿(氏)舞蹈病的huntingtin蛋白。这些高度不溶性蛋 白通常形成由无分支的原纤维组成的聚集体，其共同的特征是β折叠 构象。
需要便于区分或者分辨两种或者更多种不同构象形式的蛋白，如 PrPc和PrPsc的方法学，从而理解这种转变的过程，并且发现与疾病 相关形式发生特异地相互作用的结构。区分或者分辨蛋白的同工型的 目前的方法学包括：在存在如尿素的离液剂条件下，在聚丙烯酰胺凝 胶上的差别迁移率，即横向尿素梯度(TUG)凝胶；对于蛋白酶处理 如蛋白酶K(PK)的差别敏感性，检测被称作PrPres的PrPsc的PK- 抗性消化产物；差别温度稳定性；在非离子去垢剂中的相对溶解性； 以及纤维结构结合某些化学物质，如刚果红和异黄酮S的能力。然而， 仍需要鉴定另外的朊病毒蛋白结合材料。而且也仍需要鉴定对构象改 变的蛋白质，特别是与疾病相关的蛋白质特异的高亲合性结合材料。 这些试剂将用于开发可能的诊断试剂盒，分离和纯化不同形式的蛋白， 用于从治疗试剂、生物制品、疫苗和食品中去除该疾病的传染性形式， 并且用于治疗。
发明内容
本发明提供了结合于朊病毒蛋白的材料以及应用朊病毒蛋白结合 材料(此后为“结合材料”)的方法。在一些实施方案中，结合材料是 聚合物颗粒，优选的是色谱用树脂，其可以选择性地和特异地与朊病 毒分析物结合。在其它的实施方案中，结合材料是特异和选择性地与 朊病毒蛋白样品结合的无机材料。结合材料可以结合朊病毒蛋白的一 种或者多种形式，包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)、传染性朊病毒蛋白 (PrPsc)以及重组朊病毒蛋白(PrPr)。来自不同物种包括人和仓鼠的 朊病毒被结合材料结合。本发明还提供了含有在如层析柱的支持物上 存在的结合材料的组合物。
结合材料用于在样品如生物液体或者环境样品中或者从样品中检 测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白。结合材料 用于去除样品中所有形式的朊病毒蛋白，或者可以选择性地选取来检 测或者去除单一形式的朊病毒蛋白。因此结合材料可以用于在来自患 者的样品中区别传染性和非传染性朊病毒蛋白，患者包括人TSEs的病 人以及有骚痒症、BSE和CWD的动物。在一个实施方案中，使用在 此描述的结合材料从生物液体中去除一种或者多种朊病毒蛋白，随后 将纯化的或者去污染的生物液体施用或者返回到人或者动物中。在该 实施方案中可以应用血液透析技术。结合材料也可以用于在样品中检 测一种或者多种朊病毒蛋白。
本发明的另一方面提供了鉴定另外的结合材料的方法，尤其是对 蛋白的构象改变形式具有特异性的结合材料，其中一些蛋白涉及到疾 病的发展过程。
通过以下的详细说明和优选的实施方案，本发明的其它特征和优 势将是显而易见的。
附图说明
图1是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与人血浆 样品中的内源性PrPc的结合作用以及适当的对照。
图2是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与骚痒 症脑组织匀浆中的PrPsc的结合作用以及适当的对照。
图3是Western印迹的照片，说明了朊病毒蛋白结合材料在含有 人血清白蛋白的样品中捕获PrPc以及适当的对照。
图4是Western印迹的照片，说明了采用含有氨基功能团的树脂 对掺入到人血清白蛋白中的PrPres的去除作用。
结合材料用于在样品如生物液体或者环境样品中或者从样品中检 测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白。结合材料 用于去除样品中所有形式的朊病毒蛋白，或者可以选择性地选取来检 测或者去除单一形式的朊病毒蛋白。因此结合材料可以用于在来自患 者的样品中区别传染性和非传染性朊病毒蛋白，患者包括人TSEs的病 人以及有骚痒症、BSE和CWD的动物。在一个实施方案中，使用在 此描述的结合材料从生物液体中去除一种或者多种朊病毒蛋白，随后 将纯化的或者去污染的生物液体施用或者返回到人或者动物中。在该 实施方案中可以应用血液透析技术。结合材料也可以用于在样品中检 测一种或者多种朊病毒蛋白。
本发明的另一方面提供了鉴定另外的结合材料的方法，尤其是对 蛋白的构象改变形式具有特异性的结合材料，其中一些蛋白涉及到疾 病的发展过程。
通过以下的详细说明和优选的实施方案，本发明的其它特征和优 势将是显而易见的。
附图说明
图1是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与人血浆 样品中的内源性PrPc的结合作用以及适当的对照。
图2是Western印迹的照片，显示了朊病毒蛋白结合材料与骚痒 症脑组织匀浆中的PrPsc的结合作用以及适当的对照。
图3是Western印迹的照片，说明了朊病毒蛋白结合材料在含有 人血清白蛋白的样品中捕获PrPc以及适当的对照。
图4是Western印迹的照片，说明了采用含有氨基功能团的树脂 对掺入到人血清白蛋白中的PrPres的去除作用。
具体实施方式
在此描述了朊病毒蛋白结合材料以及应用朊病毒蛋白结合材料的 方法。结合材料是聚合材料，如层析用树脂或者珠子，或者无机材料， 如氧化铝，其可以与朊病毒蛋白特异性地并且亲和性地结合。聚合材 料含有一个或者多个以下的功能团：带负电的部分；带正电的部分； 不带电的部分以及疏水部分。优选地，聚合物结合材料具有结合于甲 基丙烯酸或者聚甲基丙烯酸基质骨架(matrix backbone)的功能团。
结合材料与样品中的朊病毒蛋白形成复合物，可以在从样品或在 样品中检测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白的 方法中使用，其中该样品如人或者动物来源的组织、器官、或者生物 液体或者环境样品。本发明还提供了在人或者动物中，或者其组织、 器官或者生物液体中诊断或者监控朊病毒疾病的方法。例如，在此描 述的结合材料可以通过测定生物样品如全血、来源于血液的组合物或 者组分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、眼泪、扁 桃体、大脑、阑尾以及其它，从而用于检测或者诊断诸如CJD、vCJD、 GSS、致命性失眠症、骚痒症、BSE和CWD和其它TSEs的病理。在 血液、组织或者器官移植前，对动物或者个体中的朊病毒蛋白传染进 行测定的重要性是显而易见的。结合材料可以特别地从样品或者生物 液体如全血、血液组分、血清、血浆、血浆衍生物以及类似物中去除 朊病毒蛋白。在生物液体传播给其它的动物或者人的情况下，如在输 血或者施用如凝血因子的血液制品中，朊病毒蛋白的去除是非常必要 的。结合材料可以从样品中去除或者检测所有不同形式的朊病毒蛋白， 或者可以选择性地选取来去除或者检测单一形式的朊病毒蛋白，并且 可以因此区分样品中的传染性和非传染性朊病毒蛋白。
定义
在此应用的术语“一个”、“一种”和“该”的定义是指“一个或多个”， 并且还包括复数，除非在上下文中认为不适当。
术语“3F4抗体”是指对于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或 者PrPres，具有特异性的单克隆抗体。该抗体对于变性形式的仓鼠和人 PrPc、PrPsc和PrPres有特异性。
正如在此所应用的，术语“来源于血液的组合物”、“血液组分”以及 “血液组合物”可以互相交互使用，并意欲包括全血，红细胞浓缩物， 血浆，血清，富集或者缺乏血小板的部分，血小板浓缩物，白血细胞， 血浆沉淀物，血浆分级沉淀物以及上清，免疫球蛋白制剂包括IgA、IgE、 IgG和IgM，纯化的凝结因子浓缩物，纤维蛋白原浓缩物，血浆分级中 间物，白蛋白制剂，或者来源于人或者动物血液的其它不同的物质。 这些术语也包括通过本技术领域内不同的常用方法如离子交换、亲和、 凝胶透过、和/或者疏水层析或者通过用乙醇或者聚乙二醇示差沉淀纯 化的来源于血液的蛋白。
术语“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然并广泛地表达于哺乳 动物的体内。其结构高度保守并且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”是指PrPc分子的构象改变形式，本技术领域的普通技 术人员认为该分子与诸如TSE/朊病毒蛋白的疾病包括vCJD、CJD、库 鲁病、致命失眠、GSS、骚痒症、BSE、CWD以及其它的TSEs相关， 包括捕获和实验动物中稀有的TSEs。PrPsc具有与正常的、细胞PrPc 相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋变成了β折叠，这一转变与 疾病状态相关。
术语“PrPres”是指分子量为27-30kDa的PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍 生物，其在蛋白酶K(PK)部分消化PrPsc后仍然存在。
术语“PrPr”是指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语“PrP”是指朊病毒蛋白的总称。
术语“珠子”是指固相颗粒或者微粒，其可以结合反应基团或者结 合成分。珠子具有不规则的形状，包括有球形、椭圆形、杆状或者甚 至是带角的形状，这些都属于该术语的范围。
术语“树脂”是指聚合介质。
在此应用的术语“聚合”描述的是由几种较小的、重复性化学或者 结构单元(单体)组成的化合物或者分子。
样品
在此应用的术语“样品”是指任何溶液、悬液、提取物、组合物、 制剂、产品、组分、组织、器官、细胞、或者其它的实物，它们按照 本发明的某些方面和实施方案的方法与朊病毒蛋白结合材料相接触。 按照本发明的某些方面和实施方案，样品包括但不限于，生物样品、 食品、环境样品或者水样品。生物样品包括但不限于：来源于血液的 样品；来源于脑的样品；体液，例如但不限于，血液、血浆、血清、 脑脊液、尿液、唾液、奶、管液、眼泪或者精液；生物提取物，如胶 原提取物、腺体提取物、或者组织匀浆物或者提取物。生物样品来源 于人或者动物，包括但不限于牛、绵羊、猪、马、鼠或者鹿科(Cervidae) 动物。来源于血液的样品包括，但是不限于，血小板浓缩物、血浆蛋 白制剂、免疫球蛋白制剂、纤维蛋白原制剂、因子XIII制剂、凝血酶 制剂、因子VIII制剂、von Willebrand因子制剂、蛋白C制剂或者活 化的蛋白C制剂。按照本发明的某些方面和实施方案的样品也包括， 但不限于药物组合物、治疗剂组合物、化妆品组合物以及产品、食物 或者食品、或者营养滋补组合物。食品样品的例子包括，但不限于明 胶、果冻、奶、乳制品、胶原或者婴儿配方食品。
按照本发明的某些方面和优选的实施方案，样品也包括含有不同 种蛋白的蛋白溶液，包括但不限于，人或者动物血清白蛋白。例如， 样品包括但不限于，含有人血清白蛋白的治疗剂产品；人或者动物的 血清白蛋白制剂；或者含有人或者动物血清白蛋白作为稳定剂的制剂。 按照本发明的某些优选的实施方案，样品也可以含有浓度高达大约 50％(w/v)的人或者动物的血清白蛋白，或者浓度从大约1％到大约 50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在本发明的优选实施 方案中，本发明出人意料地并有利地可以从具有高浓度蛋白的样品或 在其中去除、分离或者结合朊病毒蛋白，特别地从血液蛋白中，如血 清白蛋白。
环境样品包括但不限于土壤、污水或者水，如来自小溪、河流、 含水土层、井、水处理设备的水或者休养用水。
样品包括但不限于，液体样品、固体样品或者胶质样品。固体样 品可以用液相溶剂、有机溶剂或者临界流体提取得到，并且得到的上 清可以与结合材料相互接触。固体样品的例子包括，但不限于来源于 动物的产品，特别是那些暴露于传播朊病毒蛋白的试剂的样品，如来 源于牛的骨粉、脑组织、角膜组织、排泄物、骨粉、牛肉副产品、羊、 羊副产品、鹿和驼鹿、以及鹿和驼鹿副产品、以及其它动物和来源于 其它动物的副产品。
材料
在此提供的结合材料结合于来源于朊病毒蛋白的肽或者多肽，或 者完整的朊病毒蛋白分子，它们可以用于各种不同的分离程序，包括 但不限于层析，例如但不限于，薄层层析、柱层析以及分批层析；固 相支持物以及膜分离；反应器分离；磁性分离；免疫分离；以及胶体 分离。在一个优选的实施方案中，在如层析柱的柱子中包含结合材料， 加入样品，并且使其通过柱子以便样品中的朊病毒蛋白结合于结合材 料上，并且保留在柱子中。样品中的其它成分通过柱子，并且可以进 行收集。应当认识到在此描述的结合材料的应用并不限于分批层析或 者柱层析。预想了用于结合朊病毒蛋白的结合材料的应用的各种不同 的构造、修饰以及变化，并且这也属于本发明的范围。这样的变化和 修饰包括，但不限于：分批过程，连续过程；移动床层析过程；低压、 中压或高压过程；或者小、中或大规模过程。在可选择的实施方案中， 结合材料可以位于膜上、纤维上、珠子上，注入非机织筛网中，涂覆 纤维，包括在过滤器壳体之中，等等。
无机组分
在第一个实施方案中，结合材料含有无机化合物或者组分，例如 但不限于，铝或者氧化硅。优选地，铝是氧化铝，氧化硅是热解法二 氧化硅。最优选地，无机化合物是Al2O3；或者SiO2。这些结合材料 可以以不同的形式提供，包括但不限于，珠子或者树脂。结合材料可 以用于很多不同的分离过程，并且可能位于或者加入到层析柱中、膜 中、或者任何合适的分离仪器和工具中，或者可以用于批量过程，或 者在允许形成朊病毒蛋白结合材料和朊病毒蛋白的条件下，使得样品 与材料相接触而用于任何分离过程。含有无机化合物的结合材料可以 包括多个功能团。功能团是亲水性的，如带正电荷、带负电荷、不带 电荷或者中性、疏水性的、两性的或者它们的组合。以下详细说明了 特异的功能团。应该理解到，功能团可以是在无机化合物中固有存在 的，或者通过修饰使得无机化合物包含了功能团。功能团包括有机和 无机功能团。
聚合物组分
在第二个实施方案中，结合材料包括聚合材料或者组分，并且优 选地包括聚合物基质，同时也称为聚合物基质骨架。任选地，一个或 者多个功能团结合于聚合物基质中。在优选的实施方案中，聚合材料 是树脂，优选地是，层析树脂。聚合性聚合物基质骨架优选的是甲基 丙烯酸骨架，正如以下所述，但不限于，市售的TSKTM，和 TOYOPEARLTM或者FRACTOGELTM树脂(Tosoh Bioscience， Montgomeryville，PA)。这些包括，但不限于，带正电的、带负电的、 不带电的、疏水功能团或者它们的组合。特别优选的功能团在以下有 更详细的说明。
结合材料可以是任何形式，或者可以制造、加工成形、在形式上 制成，或者用于任何固体表面的支持物上，包括，但不限于，珠子、 膜、筒、滤器、浸量尺、微量滴定板、试管、固体粉末、浇铸或者挤 压成型模具、筛网、磁珠复合材料、或者任何其它的用如下材料包被 的固体材料，如聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚丙 烯酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、人造丝、尼龙、聚(乙烯基丁酸盐)、 聚偏乙烯双氟化物(PVDF)、硅酮、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、 硝化纤维、以及类似物。可选择地，可以应用形成凝胶的物质，如蛋 白(如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成多个水 相的聚合物也是适合的，如葡聚糖、聚烷撑乙二醇或者表面活性剂， 如磷脂、长链(12-24个碳原子)的烷基铵盐以及类似物。结合材料任 选地分布于这些组分中。
结合材料特别优选地，是颗粒、微粒或者珠子形式。微粒结合材 料优选地具有大小从大约1μm到500μm的范围，更优选地是从大约 20μm到150μm的颗粒或者珠子。
功能团
按照本发明的某些方面和实施方案的朊病毒蛋白结合材料包括功 能团。在此应用的术语“功能团”是指化学基团、亚基、或者亚结构， 它们对分子或者材料赋予化学、物理或者物理化学特征。在此说明的 功能团包括，但不限于，亲水性的功能团，如带正电的、带负电的或 者不带电的或者中性的、或者疏水的功能团。也预想了两性分子或者 多功能性的功能团，并且它们也属于本发明的范围。功能团包括有机 的和无机的功能团。优选的功能团含有胺、苯基或者亚硫酸盐基团。 优选的胺基是伯胺、仲胺、叔胺或者季铵离子，如二甲基氨基乙基 (DMAE)或者三甲基氨基乙基(TMAE)。其它的例证性功能团包括， 但不限于：-CH2-CHOH-CH2NH2；-C6H5；-(CH2)3-CH3； -CH2-CH2-N+H(C2H5)2；-SO2-CH2-CF3；-CH2-CH2-N+H(CH3)2； -CH2-CH2-N+(CH3)3；-SO3 2-。另一些可用的功能团包括磺酰基和2，2，2- 三氟乙烷磺酰基(tresyl)。
尽管并不想要受限于本叙述，但应该想到朊病毒蛋白具有三种不 同的结合区域，它们分别与带正电的功能团、带负电的功能团和疏水 的功能团结合。因此，应用一种或者几种结合材料，每一种包括一个 或者多个类型的功能团，用于增加和/或更加特异地鉴定或去除样品中 的朊病毒蛋白。当应用两个或者更多个结合材料时，样品与两种或者 多种结合材料同时接触，或者一个接一个，或者以任意次序相接触。 因此，结合材料优选地由两种或者更多种结合材料组成，每一种或者 含有带正电的功能团、带负电的功能团、不带电的功能团，或者含有 疏水的功能团。当结合材料是以微粒形式并且采用柱层析时，每一种 不同类型的结合材料可以在同一个柱子中或者分别在不同的柱子中。 在更为优选的实施方案中，应用三种结合材料，一种是具有带正电的 功能团，一种是具有带负电的功能团，一种是具有疏水性的功能团。
正如在此所应用的，术语“带正电的功能团”是指带有净正电荷的 化学成分。正电荷功能团的非限定性例子包括，含有氨基的基团，如 伯胺、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、三甲基氨基乙基和四级氨 基基团。术语“带负电的功能团”在此是指带有净负电荷的化学成分。 术语“不带电荷的功能团”在此是指中性的或者不带电荷的任何化学成 分。带负电荷的功能团的非限定性实例包括含有亚硫酸盐的基团。此 外，术语“疏水功能团”是指对于用水浸湿有抗性的任何基团，包括烷 基、芳香基团、硅氧烷和氟化的基团。疏水功能团的非限定性实例是 含有苯基和丁基的基团。术语“两性的功能团”是指同时疏水和亲水的 基团。
本发明的某些方面和实施方案中，朊病毒结合材料含有带正电荷 的功能团、带负电荷的功能团、和无电荷或中性的功能团、疏水的功 能团或者两者都有。带负电荷的功能团的一个例子是含亚硫酸的基团。 带正电荷的功能团的一个例子是氨基基团。不带电荷的功能团的一个 例子是苯基或丁基基团。疏水功能团的例子是苯基基团或丁基基团。 根据本发明的某些方面和实施方案，使用氨基基团，包括结合材料中 的伯胺、仲胺、叔胺或季铵基团都是对朊病毒结合有独特优势的。然 而，使用不同的基团，这依赖于特定的朊病毒蛋白，样品，以及样品 与结合材料接触的条件都在本发明的范围内。
很多种不同的物质可任选地用于结合材料，如薄层，例如，为了 赋予结合材料不同的期望特征。例如，蛋白包被，例如，明胶可以用 于避免非特异结合并且增强信号的检测或者其它类似的特性。
表面功能化以及间隔基
在优选的实施方案中，结合材料在它们的表面具有不同的功能团。 应当理解到，这些功能团固有地存在于结合材料的表面，或者可以通 过本技术领域熟练技术人员已知的程序加入到结合材料的表面。连接 各种不同的基团或者化合物于不同的表面的技术方法是公知的，并且 这些方法详细地描述于参考文献中。
功能团是用于结合朊病毒蛋白的，按照在此描述的方法，用于连 接另外的功能团，或者用于任何物理、化学或者物理化学特性的任何 修饰，物质的特性，例如但不限于，其离子特性或者疏水性。存在于 优选的结合材料表面的功能团包括，但不限于，羧酸、醛、氨基、氰 基、烯基、羟基、巯基、环氧基及其类似基团。
在优选的实施方案中，功能团可以包括间隔基。间隔基是在也被 称作基质或者支持物的材料和功能团之间提供空间和距离的基团。间 隔基优选地由碳、氮或氧原子组成。一方面，间隔基被用于更好地改 变朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白结合属性。按照某些实施方案， 间隔基的长度可以是多至20个原子，或者多至15个原子，或者5个 到10个原子。间隔基优选地，但不限于由烷基、聚乙二醇(PEG)、 碳水化合物基团、氨基酸、长至20个氨基酸长度的肽或者从1到10 个氨基酸长度的肽或者其混合物组成。最优选地，间隔基含有烷基和 PEG的组合。
市售层析树脂
优选地，结合材料是一种或者多种以下的市售层析树脂： FRACTOGELTM EMD；TOYOPEARLTM Amino、Butyl、Phenyl、或者 AF-Tresyl；或者TSK-GELTM Amino，Phenyl或者DEAE树脂。更加优 选地，结合材料包括，但不限于：FRACTOGELTM EMD TMAE， FRACTOGELTM EMD SO3 2-，FRACTOGELTM EMD DMAE，ToyopearlTM Amino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTM Phenyl，TSK-GELTM DEAE， TOYOPEARLTM Butyl，TOYOPEARLTM Phenyl，氧化铝， TOYOPEARLTM AF-Tresyl，以及硅土树脂。在最优选的实施方案中， 结合材料是TOYOPEARLTM Amino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTM Phenyl或者FRACTOGELTM EMD SO3 2-。已经预想了应用其它市售层 析树脂以及支持物，包括无机支持物，其也属于本发明的范围。
在本发明优选的实施方案中，结合材料包括聚甲基丙烯酸酯，羟 基聚甲基丙烯酸酯，或者AMINO 650TM树脂(Tosoh Biosciences)，以 及氨基，如伯胺、仲胺、或者叔胺。按照优选的实施方案的结合材料 可以进一步包括如结构式O-R-O-CH2-CHOH-CH2的间隔基，其中R的 长度是1-10个碳。结合材料可任选地涂覆到或者图案化施加到固体支 持物上，如珠子、膜或者层析树脂。
结合材料的鉴定
除了以上列出的结合材料外，可以按照如下所述，鉴定另外的结 合材料。筛选结合材料结合朊病毒分析物的能力。在此使用的术语“分 析物”或“多个分析物”是指多种分子，包括，但不局限于，蛋白质、多 糖和它们的任何聚集体或混合物。结合材料用已知含有朊病毒蛋白的 样品孵育，除去未结合的蛋白质，使用常规方法例如对朊病毒蛋白特 异的标记抗体检测结合的蛋白质。分析物已经与其结合的结合材料被 鉴定出是合适的结合材料。没有一抗或二抗的对照组也用于除去非特 异结合的材料。
在优选的实施方案中，被鉴定的结合材料与其结合的朊病毒分析 物是在来源于人或动物的血或脑样品中发现的朊病毒蛋白。更优选地， 分析物是在血或来源于血的产物中发现的。进一步优选地，分析物与 人或动物的TSE或者TSE的诱发因子相关。
使用结合材料除去朊病毒蛋白
结合朊病毒蛋白或者朊病毒蛋白片断的结合材料在多种分析、制 备和诊断应用中有用。在一些实施方案中，结合材料含有固相，或者 固体表面，以珠子或膜的形式存在，可以用于从样品中结合和除去朊 病毒蛋白或肽。结合材料可以接触样品，例如生物液体，在足以导致 形成朊病毒蛋白结合材料复合物的条件下，样品中的朊病毒蛋白结合 到结合材料上。然后结合材料从样品中分离，从而除去与样品的配体 结合的朊病毒蛋白。使用用于结合蛋白的珠子和膜的方法在技术领域 是公知的，例如在Baumbach等人的美国专利U.S.5,834,318和 PCT/US01/11150中描述的。
在本发明的一些实施方案中，基本上所有朊病毒蛋白都可以从样 品中除去。“基本上所有”的意思是朊病毒蛋白的浓度显著降低。换句 话说，把所有样品或部分样品转移到健康患者身上只能带来在公众健 康指导方针下可以接受的低的朊病毒传染的风险。使用单一结合材料 或者多种结合材料，基本上所有朊病毒蛋白可以同时或者连续地从样 品中除去。当使用多种结合材料时，优选地，如以上描述的，使用两 种或者更多种结合材料，每种含有正电荷功能团、负电荷功能团或者 疏水功能团。在更优选的实施方案中，使用两种或多种结合材料，每 种含负电荷功能团或者疏水功能团。样品接连地以任何顺序与两种或 多种结合材料接触。在优选实施方案中，使用三种结合材料，每一种 含有一种正电荷功能团、负电荷功能团和疏水功能团。
在其他的实施方案中，只有特定的朊病毒材料从样品中除去。例 如，只有传染性朊病毒(PrPsc)从样品中除去或者只有非传染性朊病 毒(PrPc)从样品中除去。在此描述的一个重要发现是多种具有不同 朊病毒特异性的结合材料的鉴定。表4所示为几种结合材料和它们对 仓鼠和人，非传染性和传染性朊病毒的特异性。选择性除去人PrPsc 的优选结合材料含有氨基基团，例如包括在ToyopearlTM Amino-650M 或者TSK-GELTM-Amino 750C色谱柱树脂或其功能相当物中的氨基基 团，或者含有苯基基团，例如在TSK-GELTM Phenyl-5PW或功能相当 物中含有的苯基基团。
优选地，结合材料是填充在柱子例如色谱柱中的珠子。然后样品 溶液、匀浆液或悬液或者由于重力或者由于压力通过柱子，例如高压 液相色谱柱子。样品中的朊病毒蛋白将如在此描述的结合到柱子中的 结合材料上。收集通过柱子的样品，除去朊病毒污染或者至少减少朊 病毒物质的水平。
一旦样品通过柱子，洗脱结合的朊病毒蛋白，并且将其收集用于 分析，或者如果需要的话，用于诊断或预示目的。假如期望从结合材 料中除去朊病毒蛋白，柱子的流动相可以首先变为除去弱结合杂质的 缓冲液，从而洗涤柱子。然后通过煮沸或者通过加入含有强去污剂例 如十二烷基肌氨酸钠去垢剂(十二烷基肌氨酸钠，Shelton Scientific-IBI， Shelton，CT)或者十二烷基硫酸钠(SDS)，离液剂例如盐酸胍，或低 pH的试剂例如乙酸，或者通过结合配体的化学修饰例如氨基基团的乙 酰化作用从柱子上除去朊病毒蛋白。
从其中除去朊病毒的生物样品的例子包括，但不局限于，全血、 来源于血液的组合物或组分、血清、脑脊液、尿、唾液、奶、肠液、 眼泪、精液或者人或动物的脑源组分。别的生物样品包括那些含有胶 原或腺体提取物的生物样品。在一个实施方案中，朊病毒通过使用含 有一种或多种在此描述的结合材料的血液透析环从人或动物的血中除 去。在该实施方案中，血液从人或动物中除去，直接注入含有一种或 多种在此描述的结合材料的设备中，其中朊病毒蛋白从血液中除去是 由于它们结合到结合材料上，然后无朊病毒的血液或朊病毒减少的血 液直接导入返回至人或动物体中。
朊病毒蛋白也可以使用在此描述的结合材料从(或者用于动物或 者用于人的消耗的)生物样品例如食品中除去。例如，样品含有来源 于动物的或者从动物获得的动物材料，包括，但不局限于，牛、羊、 猪、马、鼠、仓鼠或者鹿科动物。可替代地，样品材料可以是指人； 牛科；羊科；猪科；马科；鼠科，例如来源于鼠和仓鼠；和来源于鹿 科的材料，例如鹿和驼鹿。朊病毒蛋白可以根据本发明的某些方面和 实施方案所涉及的方法从其中除去的来源于动物的材料包括，但不局 限于明胶、果冻、奶、胶原和婴儿配方食品。朊病毒蛋白根据本发明 的某些方面和实施方案所涉及的方法从其中根据除去的样品也包括， 但不局限于，药品组分、治疗组分、营养添加组分、食品或者化妆品 组分。
根据优选的实施方案，样品是蛋白溶液，含有多种蛋白质，包括， 但不局限于，人或动物的血清白蛋白。例如，样品可以是，但不局限 于，含有人血清白蛋白作为稳定剂的血浆蛋白制剂、免疫球蛋白制剂、 纤维蛋白原制剂、凝血因子XIII制剂、凝血酶制剂、凝血因子VIII制 剂、冯·维勒布兰德凝血因子制剂(von Willebrand factor preparation)、 蛋白质C制剂、激活蛋白C制剂或者前述的任何组合制剂或改变；含有 人血清白蛋白的治疗产品；人或动物血清白蛋白制剂；以及含有人或 动物血清白蛋白作为稳定剂的稀释蛋白制剂。根据优选实施方案，样 品含有人或动物血清白蛋白的浓度高达大约50％(w/v)，或者从大约1％ 到大约50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在优选实施方 案中，本发明出乎意料地并且有利地从具有高浓度的蛋白质，特别是 血蛋白，例如血清白蛋白的样品中或在其中除去、分离或结合朊病毒 蛋白。
在此描述的结合材料也用于从环境样品如来源于诸如溪流、河、 蓄水池、井、水处理设备或消遣用水的水中除去朊病毒蛋白。
使用结合材料检测朊病毒
在此描述的结合材料也在检测生物或环境样品中存在朊病毒蛋白 或肽或者量化朊病毒蛋白或肽的方法中使用。在其中检测朊病毒蛋白 的生物样品包括，但不局限于，全血、来源于血液的组合物或组分、 血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、肠液、眼泪、精液、来源于脑的组 合物、粪便、或胶原的提取物或匀浆、腺体、组织(例如扁桃体或盲 肠)或器官。定性和定量的检测方法都被预想到，并且都在本发明的 某些方面和实施方案的范围内。
如以上描述的关于朊病毒蛋白的去除，结合材料也用于检测作为 食品的来源于动物的材料中朊病毒蛋白的存在。对于检测目的，术语 “来源于动物的材料”是指以上描述的材料和含有动物部件的材料，例 如肌肉、结缔组织或者器官组织。来源于动物的材料进一步包括，但 不局限于，骨粉、牛肉、牛肉副产品、羊、羊副产品、鹿、鹿副产品、 猪肉、猪肉副产品、香肠、火腿和婴幼儿食品。
在此描述的结合材料也用于检测环境样品，例如那些以上描述的 环境样品和土壤提取物中的朊病毒蛋白。
由于发现多种具有不同朊病毒结合特性的结合材料，所以结合材 料在单一样品中或样品之间区别传染性和非传染性朊病毒的方法中有 用。因此，提供了用于诊断和预测人或动物的朊病毒疾病的方法。朊 病毒疾病包括，但不局限于，可传播的海绵状脑病(TSEs)，例如骚痒 症，该疾病可以影响绵羊和山羊；牛海绵状脑病(BSE)，可以影响牛； 可传播的水貂脑病，猫的海绵状脑病，和长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和 驼鹿的慢性消瘦病(CWD)；苦鲁病，皮层-基底节-脊髓变性症候群 (CJD)，格-施-沙综合征(GSS)，致命性不眠症和变异的皮层-基底节 -脊髓变性症候群(vCJD)，这些疾病都会影响人类。
在一个实施方案中，使样品通过对PrPsc比对PrPc有更高特异性的 结合材料，使用以下描述的方法检测结合的PrPsc朊病毒。然后使相同 的样品通过对PrPc比对PrPsc有更高特异性的结合材料，使用以下描述 的方法检测结合的PrPc。表4提供了几种结合PrPc和PrPsc的结合材料的 特异性。优选地，选择性检测人PrPsc的结合材料含有类似于 TOYOPEARLTM TSK-GELTM-Amino 750C Amino-650M或 TSK-GELTM-Amino 750C化合物中含有的氨基基团，或者含有类似于 TSK-GELTM Phenyl-5PW(所有树脂来自Tosoh Biosciences， Montgomeryville，PA)中含有的苯基。
当使用在此提供的方法检测样品中的朊病毒时，样品与结合材料 在足以造成朊病毒蛋白和结合材料之间形成复合物的条件下接触。然 后用常规方法检测复合物，从而检测样品中朊病毒的存在。例如，结 合材料(第一配体)可以用可检测的标记物进行标记。作为可替代的 例子，复合物可以通过标记第二配体，例如抗体或别的蛋白质，把标 记的第二配体与样品在存在结合材料的条件下进行结合，检测标记了 的第二配体-朊病毒-结合材料复合物进行检测。第二配体可以共价地或 者非共价地结合于朊病毒。已知有多种标记物和结合技术，并且广泛 地在科学和专利文献中被报导。在一个实施方案中，第二配体在生产 的过程中被标记。合适的标记物包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因 子、抑制剂、荧光成分、化学发光组分、磁性颗粒以及类似物。
结合于朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白，或者朊病毒蛋白-朊病 毒结合材料复合物的定性和定量的检测方法包括在本发明的某些方面 和实施方案的范围内。形成复合物的朊病毒结合材料可以被填充到或 在制成柱子、膜或过滤器，或者结合到或制成或固定在固体支持物上。 定性和定量地检测结合的朊病毒蛋白，并且随后从朊病毒结合材料上 释放的方法也包括在本发明的某些方面和实施方案的范围内。
检测可以用任何方法进行，包括免疫印迹、Western分析、凝胶移 位分析、放射性或生物发光标记物的示踪法、核磁共振、电子顺磁共 振、停流光谱法、柱色谱法、毛细管电泳或者别的基于大小或电荷， 或两者的变化的分子示踪方法。检测前，第二配体-朊病毒复合物可以 或者可以不与结合材料分离。其它测定分析方法包括，但不局限于， 脂质体免疫测定法(LIAs)，这种方法使用设计用于结合特异分子(如 第二配体)的脂质体，并且释放被包被的试剂或标记物。然后释放的 化学药物根据标准技术进行检测。
非放射性标记物通常用间接的方法加上。一般地，第二配体分子 (如，生物素)共价结合于结合材料(第一配体)上。然后第二配体 结合于第三配体(如，链菌抗生物素)分子，该第三配体分子或者固 有的可检测，或者共价结合于信号系统，如可检测的酶、荧光化合物、 或者化学发光化合物。可以使用多种第二和第三配体。当第二配体具 有天然的第三配体，例如，生物素、甲状腺素和皮质醇，第二配体可 以用于与标记的、天然发生的第三配体结合。可替代地，任何半抗原 或抗原化合物可以与抗体结合。
用于检测结合材料-朊病毒复合物的特定标记物或可检测基团并不 是关键的。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材 料。这样的可检测标记物已经得到了很好的发展，一般地，在这些方 法中使用的任何标记物可以运用于本方法中。所以，标记物可以是任 何可以被分光镜、光化学的、生化的、免疫化学的、电子的、光学的 或者化学的方法检测的组分。有用的标记物包括荧光染料(如，异硫 氰酸荧光素，德克萨斯红，若丹明等等)，放射性标记物(如，3H，125I， 35S，14C，或32P)，酶(如，LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT(氯霉素乙酰 转移酶)，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，以及一般在EIA(酶免疫测 定)或者ELISA(酶联免疫吸附分析)中用作可检测酶的其它酶，和比 色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳， 等等)珠子。标记物可以根据本技术领域公知的方法直接或间接连接 到想要分析的组分上。如以上所示，许多标记物都可以使用，标记物 的选择取决于所需要的灵敏度，化合物偶联的容易性，稳定性要求， 可以获得的设备，和垃圾处理规定。
第二配体也可以直接连接到信号产生化合物上，如，通过与酶或 荧光基团相连。感兴趣的作为标记物的酶首选是水解酶，特别是磷酸 酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物 包括，但不局限于，萤光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰， 伞形花内酯，等等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢-2，3-二氮杂 萘二酮，如鲁米诺。
本技术领域的普通技术人员公知检测标记物的方法。所以，例如， 在标记物是放射性标记物的情况下，检测方法包括，但不局限于，用 闪烁计数器或照相胶片作放射自显影。当标记物是荧光标记物时，可 以通过用合适波长的光激发荧光，并且检测所得到的荧光来检测，如 通过显微镜、目测，通过照相胶片，通过使用电子探测器如电荷耦合 器件(CCDs)或光电倍增管，以及类似方法。类似地，酶标记物可以 通过提供合适的酶的底物，并且检测得到的反应产物进行检测。最后， 单一比色标记物可以简单地通过观察与标记物相关的颜色进行检测。 所以，在多种浸渍分析中，共轭金通常呈紫色，同时多种共轭珠子呈 珠子的颜色。
本发明的结合材料也可以用于除去或检测从固体样品材料提取到 溶液中的朊病毒蛋白或肽。例如，固体样品可以用含水溶液、有机溶 剂或临界液体提取，得到的上清可以与结合材料接触。固体样品的例 子包括，但不局限于，动物来源的产品，特别是那些暴露于传染朊病 毒的产品，如，来源于牛的骨粉。在一些实施方案中，结合材料可以 用于检测土壤中存在的朊病毒蛋白。其它的固体样品包括，但不局限 于，脑组织、角膜组织、粪便物、骨粉、牛副产品、羊、羊副产品、 鹿和驼鹿、鹿和驼鹿的副产品、以及别的动物或动物来源的产品。
可替代地，朊病毒或朊病毒结合材料复合物可以用蛋白酶K(PK) 处理。PrPc对PK高度敏感，同时PrPsc被部分消化形成PrPres。PrPres 分子本身对蛋白水解作用具有高度抗性，所以，PK处理将消化PrPc， 并且将把PK敏感的PrPsc转化为PrPres。除去PK后，PrPres可以变性， 被抗体如3F4检测出来。
在另一个实施方案中，根据本发明，结合材料可以用于把PrPc中 的PrPsc选择浓缩。
结合材料用于朊病毒定量
结合材料-朊病毒复合物或可替代地，朊病毒或结合材料-朊病毒复 合物的抗体可以通过本技术领域的普通技术人员已知的多种方法中的 任何一种方法进行检测和定量。这些方法包括但不局限于，分析生物 化学方法如分光光度法、放射照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相 色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、高扩散色谱法(hyperdiffusion chromatography)和类似方法，以及多种免疫方法，如但不局限于，液 体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫分析 (RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析和类似方法。
降低非特异性结合
当使用固体支持物作为分析组分来检测样品中的朊病毒蛋白时， 本技术领域的普通技术人员应该意识到，通常期望降低对固体支持物 的非特异结合。本技术领域的普通技术人员熟悉降低这样的非特异结 合的方法。一般地，这涉及用蛋白质组分把固体支持物进行包被。特 别地，蛋白质组分，如牛和人的血清白蛋白(BSA)，和明胶可以被广 泛使用。
本发明将通过具体的实施例进行更详细的描述。以下实施例用于 举例说明，并非以任何方式对发明进行限制或限定。
实施例1
朊病毒结合材料的确认
采用正常的仓鼠脑匀浆液，如以下描述的，使用NBT/BCIP发色团 (氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸-p-甲苯胺盐)，运用朊病毒珠上结 合实验，检验80种聚合物或无机粒子。结合结果见表1，其中“-”表示 没有结合，“+”表示阳性结合。粒子等级中的“+”越多，观察到的结合 就越强。具有至少“++”的12种粒子需要进一步评估。表2总结了12种 粒子结合正常仓鼠朊病毒蛋白的能力。越高的分值表示朊病毒结合的 量有所增加。
表1
筛选用于朊病毒蛋白结合的聚合材料或无机粒子 参考 序号 名称 制造商 结合 结果 1 ToyopearlTM Amino-650M Tosoh Bioscience (Montgomeryville，PA) +++ 1’ Acetylated Amino-650M 由North Carolina State University(NCSU)进行乙酰化， 使用ToyopearlTM Amino 650M - 2 TSK-GELTM Amino 750C Tosoh Bioscience +++ 3 ToyopearlTM Epoxy 700EC Tosoh Bioscience + 4 ToyopearlTM AF-Carboxy-650M Tosoh Bioscience - 5 ToyopearlTM AF-Heparin-650M Tosoh Bioscience + 6 AmberchromTM CG-71m Tosoh Bioscience - 7 AmberchromTM CG-300m Tosoh Bioscience - 8 ToyopearlTM HW-40C Tosoh Bioscience - 9 ToyopearlTM HW-50F Tosoh Bioscience - 10 ToyopearlTM AF-Chelate-650M Tosoh Bioscience - 11 ToyopearlTM DEAE-650M Tosoh Bioscience +
12 ToyopearlTM DEAE-650C Tosoh Bioscience - 13 ToyopearlTM Super Q-650M Tosoh Bioscience + 14 ToyopearlTM Super Q-650C Tosoh Bioscience + 15 ToyopearlTM QAE-550C Tosoh Bioscience - 16 ToyopearlTM CM-650M Tosoh Bioscience - 16’ ToyopearlTM CM-650C Tosoh Bioscience - 17 ToyopearlTM SP-650M Tosoh Bioscience - 18 ToyopearlTM SP-550C Tosoh Bioscience - 19 TSK-GELTM Ether-5PW Tosoh Bioscience - 20 TSK-GELTM Phenyl-5PW Tosoh Bioscience +++ 21 ToyopearlTM Butyl-650C Tosoh Bioscience ++ 22 ToyopearlTM Phenyl-650C Tosoh Bioscience ++ 23 ToyopearlTM Hexyl-650C Tosoh Bioscience - 24 TSK-GELTM DEAE-5PW Tosoh Bioscience +++ 25 TSK-GELTM Q-5PW Tosoh Bioscience + 26 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M Tosoh Bioscience ++ 27 AmberliteTM XAD-7HP Supelco (Bellefonte，PA) - 28 AmberliteTM XAD-1180 Supelco - 29 Diaion/sepabeadsTM HP 20SS Supelco - 30 Diaion/sepabeadsTM SP 207 Supelco + 31 MCI Gel CHP 20P Supelco - 32 Silica gel grade 7754 Supelco - 33 DavisilTM Silica gel grade 634 Supelco - 34 DavisilTM Silica gel grade 643 Supelco -
35 Blue rayon trisulfonated (syn：Copper Phthalocyamine) Supelco 没有 测试。 是blue rayon 纤维。 36 AmberliteTM IRC-718 Supelco - 37 DiaionTM CR 20 Supelco - 38 AmberliteTM IRA-958 Supelco - 39 DowexTM MSA-1 Supelco - 40 AmberliteTM IRA-910 Supelco + 41 DiaionTM PA418 Supelco - 42 FractogelTM EMD DMAE 650(S) E.Merck (Gibbstown，NJ) ++++ 43 FractogelTM EMD Phenyl 1 650(S) E.Merck - 44 FractogelTM EMD TMAE 650(S) E.Merck +++++ 45 FractogelTM EMD Propyl 650(S) E.Merck - 46 FractogelTM EMD Amino(M) E.Merck - 47 FractogelTM EMD SO3 2-650(S) E.Merck ++ 48 FractogelTM EMD COO-650(S) E.Merck + 49 PMMA Poly(methylmethacrylate) Bangs Laboratories (Fishers，IN) - 50 Aluminum oxide-100+325 Aldrich (Milwaukee，WI) ++ 51 Polyethylene Aldrich - 52 Aluminum oxide-100+400 Aldrich +
53 Poly(styrene/maleic anhydride) Sigma Chemical Co. (St.Louis，MO) - 54 Aminomethylpolystyrene resin Aldrich - 55 Aluminum oxide，activated Aldrich - 56 Silica，fumed Aldrich ++ 57 PVDF SOLVAY 1008/1001 Solvay (Aubum Hills，MI) ++++ (非特 异性)* 58 PVDF SOLVAY 1015/1001 Solvay +++ (非特 异性)* 59 Silica gel for column，35-70um Acros (Pittsburgh，PA) - 60 Silica gel 60-200mesh Acros - 61 PolyStyrene，0.93um Bangs 没有 实验， 乳液 62 Bangs Lab Silica，0.20um Bangs 没有 实验， 乳液 63 Bangs Lab Silica，0.97um Bangs 没有 实验， 乳液 64 1，2DAP1-Epoxy 700EC Aldrich - 65 1，3DAP-Epoxy 700EC Aldrich - 66 1，4DAB2-Epoxy 700EC Aldrich -
67 L-Lysine-Epoxy 700EC Aldrich + 68 TETA3-Epoxy 700EC Aldrich + 69 Prometic CG-1083 Prometic BioSciences (Cambridge，UK) ++++ (非特 异性)* 70 Prometic CG-1085 Prometic BioSciences (非特 异性)* 71 Prometic CG-1086 Prometic BioSciences + (非特 异性)* 72 Prometic CG-1082(紫色) Prometic BioSciences + (非特 异性)* 73 Prometic CG-1084(紫色) Prometic BioSciences ++ (非特 异性)* 74 Prometic CG-1087(紫色) Prometic BioSciences + (非特 异性)* 75 Prometic CG-1014(紫色) Prometic BioSciences ++ (非特 异性)* 78 Prometic CG-1107(紫色) Prometic BioSciences ++++ (非特 异性)*
79 Prometic CG-1108(紫色) Prometic BioSciences ++++ (非特 异性)* 76 Ethylenediamine， polymer-bound Aldrich - 77 Pharmacia Source 30Q Pharmacia (Piscataway，NJ) + 80 Clear-Base Resin(HCl) Peptide International (Louisville，KY) -
1DAP：二氨基丙烷
2DAB：二氨基丁烷
3TETA：三亚乙基四胺
4AmberchomTM是Rohm and Haas Company(Philadelphia，PA)的 注册商标
*Nonspecific：指没有抗体3F4的阴性对照，具有与用抗体3F4检 测的信号相同的信号。
表2
聚合结合材料结合一般仓鼠朊病毒(HaPrPc)的能力 聚合物化合物 基本树脂 制造商 HaPrPc FractogelTM EMD TMAE 650(S) PMMA** E.Merck 5 FractogelTM EMD SO3 2- 650(S) PMMA E.Merck 2 FractogelTM EMD DMAE 650(S) PMMA E.Merck 4
ToyopearlTM Amino-650M PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM Amino 750C PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM Phenyl-5PW PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM DEAE-5PW PMMA Tosoh Bioscience 3 ToyopearlTM Butyl-650C PMMA Tosoh Bioscience 2 ToyopearlTM Phenyl-650C PMMA Tosoh Bioscience 2 Aluminum oxide-100+325 Al2O3 Aldrich 2 Aldrich silica，fumed SiO2 Aldrich 2 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M PMMA Tosoh Bioscience 2
**PMMA：聚合的甲基丙烯酸酯
如下进行使用NBT/BCIP的朊病毒珠上结合实验(prion binding on-beads test)。从10％的仑鼠脑组织匀浆中获得正常PrP，样品于室 温在搅拌器中溶于0.5％十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)(200μL的10％ 到4ml脑组织)中30分钟。样品以14,000rpm离心5分钟。弃上清， 并且将其用所需的培养基稀释。将96孔微量滴定平板(Cat.No.3075， Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore MultiScreen-DV板 (Cat.No.MADV N6510，Millipore公司，Bedford，MA)，首先用购自 Pierce(Rockford，IL)的1％(W/V)酪蛋白以200μL/孔于65℃封闭1 小时。10毫克(10mg)干珠子在1ml的10mM PBS pH 7.4中溶胀， 洗涤2次。倒空微量滴定板，每孔加入20-30μl溶涨珠子的悬液。悬 液沉降，弃去多余的水分。
将正常仑鼠脑匀浆物予以稀释，是以1∶10稀释在5％的人血清白蛋 白(Alpha Therapeutic Corp.Los Angeles，CA)中，其中5％的人血清白 蛋白已经在60℃下被热处理10小时。每孔加入150μL体积的悬液， 与珠子室温孵育1.5小时。弃去未结合的蛋白溶液，往每孔中加入100 μL的、以1∶4000稀释在1％酪蛋白中的3F4单克隆抗体(Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)。对照孔含有100μl的1％酪蛋白。珠 子用3F4孵育，于4℃轻微摇晃过夜。
然后珠子用10mM pH 7.4的PBS+10μM CuCl2洗涤2次。将第二 抗体，即结合了碱性磷酸酶的抗鼠IgG偶联物(#A3688，Sigma，St. Louis，MO)，以1∶1000在1％酪蛋白中稀释，并以100μl/孔的体积加入 孔中。样品室温振荡孵育1小时。将所有的珠子转移到Millipore (Bedford，MA)MultiScreen-DV板进行洗涤。样品用pH 7.4的 PBS+Cu2++Tween 20(0.05％)洗涤3次，用PBS+Cu2+洗涤3次，用 1M NaCl洗涤2次，用pH 9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2 次。
将1步骤NBT/BCIP底物混匀，将100μl直接加入每一孔中，直 到得到理想的显色(亮紫)。一般孵育5-15分钟。滤纸(#1703932， BioRad，Hercules，CA)裁成合适形状，用蒸馏水湿润。珠子悬液真空 下加入到S & S Minifold I Dot-Blot系统(Schleicher-Schuell Bioscience， Keene，NH)的印迹孔中。孔用水漂洗，将结果扫描到计算机中。
实施例2
朊病毒结合材料的确定
使用两种不同的检测系统，用仑鼠脑匀浆物以成批模式进行朊病 毒结合材料的鉴定。首先，用靶材料孵育后对珠子进行染色检测朊病 毒结合到材料的量。第二种方法检测流出液中含有的未结合成分中存 在的朊病毒量，并且用SDS-PAGE和western印迹洗涤样品。每种方 法的详细描述如下。
如以下表3所示，ToyopearlTM Amino-650M，TSK-GELTM Amino 750C和TSK-GELTM Phenyl-5PW提供了仑鼠脑PrPc的最特异的结合。
表3
第二次筛选的结果 聚合物颗粒 通过使用 NBT/BCIP的珠上 实验评价结合作用 通过用 ECL-plus的 Western印迹 评价结合作用 ToyopearlTM Amino-650M +++ +++ TSK-GELTM Amino 750C +++ +++ TSK-GELTM Phenyl-5PW +++ ++++ ToyopearlTM Butyl-650C ++ + ToyopearlTM Phenyl-650C ++ + TSK-GELTM DEAE-5PW +++ 5+(非特异性) ToyopearlTM AF-Tresyl 650M ++ - FractogelTM EMD DMAE 650(S) ++++ 5+(非特异性) FractogelTM EMD TMAE 650(S) +++++ 5+(非特异性) FractogelTM EMD SO3 2-650(S) ++ +++ Aluminum oxide-100+325 ++ + Aldrich silica，fumed ++ 5+(非特异性)
对于珠上检测方法，将96孔微粒滴定板(Cat.no.3075，Falcon， Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore Multiscreen-DV板 (Cat.no.MADV N6510，Millipore，Bedford，MA)用1％(w/v)酪蛋 白以200μL/孔于65℃封闭1小时。将每份10毫克的每种聚合物浸泡 于1mL的pH 7.4的10mM PBS中，洗涤2次。排空96孔板，每孔加 入20-30μL的树脂悬液。树脂沉降，弃去多余溶液。往树脂中加入150 μl以1∶10溶于5％人血清白蛋白中的正常仓鼠脑匀浆溶液。混合物室 温孵育1.5小时。排空孔，往每孔中加入处于1％酪蛋白中的100μl 3F4 抗体(1∶4000)，冰箱中轻微振荡过夜孵育。然后珠子用100mM pH 7.4 的PBS+10μM CuCl2洗涤2次，然后以100μl/孔加入结合了碱性磷酸 酶的第二抗体(Cat no.A3688，Sigma，St.Louis，MO)，轻微振荡，室温 孵育1小时。
排空所有的孔，将珠子转移到Multi-Screen板中，在该板上用pH 7.4的10mM PBS+10μM CuCl2+0.05％Tween 20将珠子洗涤3次， 然后用10mM PBS+10μM CuCl2洗涤，用1M NaCl洗涤2次，用pH 9. 5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2次。
然后已经洗涤的珠子与100μL NBT/BCIP底物反应5-15分钟以显 色。使用S&S Minifold I Dot-Blot系统将珠子转移到滤纸上，进行所形 成颜色的测定。
对于未结合部分的测定，100μL的每种珠子样品预先用pH 7.4的 10mM PBS于4℃过夜湿润，置于微量离心管中。用PBS至少洗涤4 次后，转移珠子至Ultrafree-MC 0.45μm过滤单元(UFC30HVNB， Millipore，Bedford，MA)中，用PBS再次洗涤。用0.5％十二烷基肌氨 酸钠处理10％的仓鼠脑匀浆液(HBH)，用PBS以1∶10和1∶20稀释。 将其往每种珠子样品中加入200μl，振荡孵育8分钟，然后以10,000rpm 离心2分钟，回收未结合部分。将26-μL的流出液置于0.7mL微量离 心管中，-20℃储存，进行Western印迹分析。
进行Western印迹前解冻样品，加入10μL样品缓冲液(NuPAGE， SDS样品缓冲液，NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA)和4μL还原剂 (NuPAGE样品还原剂，NP0004，Invitrogen)(DTT，1M，溶于H2O中)。 溶液90-100℃孵育10分钟。将样品加到15孔的NuPAGE 4-12％Bis-Tris 凝胶(NP0323，Invitrogen)上。对于每孔凝胶，western印迹分析使用 17μL样品，蛋白质染色凝胶使用14μL样品。分子量标记物的体积 (MultiMark Multi-Colored Standard，LC5725，Invitrogen)是5μL。 Western印迹使用PVDF膜，1％酪蛋白作为封闭剂，1∶10,000的3F4 作为一抗，1∶3000的连接有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠抗体作 为二抗，ECL+作为底物。胶片曝光6分钟。
结合到结合材料上的、具有高PrP的样品在流出物中不产生信号， 值为“5+”。没有结合的样品的值为“-”。其它样品的值介于这两个值之 间。
实施例3
确定朊病毒蛋白结合特异性
一般来说，将由不同结合材料组成的潮湿珠子定量地置于单独的 一次性使用的柱子中。含有玻璃材料的柱子小得只能保留珠子，但大 到足以让活化溶液(challenge solution)流过。活化溶液是含有朊病毒 蛋白的脑匀浆液，溶于十二烷基肌氨酸钠(Sigma)中；掺入到红细胞 浓缩共混物中。更具体而言，活化溶液含有TSE传染性人脑匀浆液、 传染性仓鼠脑匀浆液、非传染性人脑匀浆液或者非传染性仓鼠脑匀浆 液。允许活化溶液在确定的时间期间内通过靶结合材料，同时收集流 出液。然后冲洗珠子，从装珠子的柱子定量转移到收集瓶中，这样为 了随后确定特异朊病毒蛋白结合和非特异的蛋白结合的处理，从收集 瓶中除去已知量的珠子。储存流出液和剩余的反应珠子，以便以后可 能的分析。
使用以下描述更为详细的方法，确定七种朊病毒蛋白结合材料的 结合活性，如表4中描述。结合材料以结合正常的或者传染性人或者 仓鼠朊病毒蛋白的结合能力来分级(表现出结合最大量朊病毒蛋白的 结合材料的级别是1)。例如，FractogelTM EMD TMAE 650(S)结合材 料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-CH2-CH2-N+(CH3)3)结合最大量的 仓鼠和人传染性朊病毒蛋白(PrPsc)，FractogelTM EMD SO3 2-650(S) 结合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-SO3 2-)结合最大量的仓鼠和 人正常朊病毒蛋白。这些数量是通过如下方法确定的，将结合的蛋白 从朊病毒结合材料上释放下来，电泳分离释放的蛋白质，使用Western 印迹分析从结合材料上释放而来的蛋白质的免疫活性，采用朊病毒特 异的单克隆抗体进行。抗体对朊病毒蛋白的结合通过化学发光检测。 通过比较胶片上的电泳条带的暗度进行定量(指示与已经结合到结合 材料上的朊病毒蛋白相结合的抗体)，对照条带是2ng，10ng和50ng 鼠IgG，从而对结合材料确定分值。通过互相直接地比较样品带，确定 具有相同分数的结合材料的等级。
表4
11种聚合化合物的分级
二次筛选后，基于它们与正常仓鼠朊病毒(HaPrPc)，正常人朊病 毒(HuPrPc)，传染性仓鼠朊病毒(HaPrPsc)和传染性人朊病毒(HuPrPsc) 的结合能力进行分级。 聚合物化合物 和功能团 基础 树脂 制造商 HaPr Pc HuP rPc HaPr Psc HuP rPsc FractogelTM EMD TMAE 650(S) -CH2-CH2-N+(CH3)3 PMMA E.Merck 2 2 1 1 FractogelTM EMD PMMA E.Merck 1 1 10 9
SO3 2-650(S)-SO3 2- FractogelTM EMD DMAE 650(S) -CH2-CH2-N+H(CH3)2 PMMA E.Merck 3 3 2 7 ToyopearlTM Amino-650M -CH2-CHOH-CH2NH2 PMMA Tosoh Bioscience 6 10 4 4 TSK-GELTM Amino 750C -CH2-CHOH-CH2NH2 PMMA Tosoh Bioscience 5 9 3 3 TSK-GELTM Phenyl-5PW-C6H5 PMMA Tosoh Bioscience 7 5 5 2 TSK-GELTM DEAE-5PW -CH2-CH2-N+H(C2H5)2 PMMA Tosoh Bioscience 4 7 6 8 ToyopearlTM Butyl-650C -(CH2)3-CH3 PMMA Tosoh Bioscience 8 4 8 5 ToyopearlTM Phenyl-650C C6H5 PMMA Tosoh Bioscience 9 6 9 6 Aluminum oxide-100+325 Al2O3 Aldrich 10 8 7 10 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M SO2-CH2-CF3 PMMA Tosoh Bioscience 11 11 11 11
制备无水珠子
通过把珠子用水配制的20％甲醇溶液湿润，大量制备无水珠子。 使用前将珠子静置至少24小时。当无水珠子的最初量在0.5g到2.5g 之间时，预湿的珠子浆液转移到50ml塑料锥形管中。弃去多余液体， 加入25ml 20％的甲醇。然后样品轻微振荡或者颠倒30秒。当最初的 珠子重量超出前述范围时，调节甲醇的体积，少于0.5g的树脂使用10 ml甲醇，2.5到4.0g树脂使用40ml甲醇。珠子通过重力沉降大约12-15 分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心地提取并且弃去上清溶 液(包括细碎物)。将甲醇洗涤一次以上，然后加入20％甲醇，成为 1∶1(v/v)的珠子浆液。珠子于4℃储存。
制备珠子浆液
转移440微升(440μl)珠子浆液至15ml塑料锥形管中(每个柱 子使用220μl湿珠子)，加入10ml工作缓冲液(20mM柠檬酸缓冲 液/140mM NaCl，pH 7.0)。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重 力沉降大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心吸除并 且弃去上清溶液(包括细碎物)。将工作缓冲液重复冲洗2次以上， 加入足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒 30秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓 冲液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
制备预先水合的珠子
AminoToyopearlTM和别的珠子以20％乙醇中的湿浆液的形式获得， 不需要进行额外的水合步骤。然而，要如下平衡至工作缓冲液。生产 商估计商品化浆液含有体积百分比为大约72％的树脂，并且每柱子使 用300μL浆液。转移珠子至15毫升塑料管(例如Falcon)中，加入 10ml工作缓冲液。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重力沉降 大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心提取并且弃去 上清溶液(包括细碎物质)。将工作缓冲液重复冲洗至少2次，加入 足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒30 秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓冲 液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
红细胞的制备和处理
将一袋110ml的AdsolTM(Baxter，Bloomington，IN)加到大约250ml 一袋的含有大约250-300ml RBC和残留白细胞和血小板的红细胞浓缩 液(RBC)中。得到的血细胞比容(红细胞(RBC)体积/总体积)大约 为50-55％。AdsolTM：CPD(柠檬酸磷酸右旋糖)和RBCs颠倒混合。然 后将来自收集的混合物室温下八小时内通过Pall leukoreduction滤器 (Pall Corporation，East Hills，NY)，置于新的袋中。此过程减少了RBC 混合物中白细胞的量。过滤掉白细胞的RBC于4℃在新袋中可以保存长 达42天。此制剂中缓冲液混合物的最终组分是30.6％Adsol/8.5％CPD v∶v。使用前，检测RBC制剂的溶血百分率，通过测量离心后的上清在 415nm处的吸光度来进行。相对于制备后立即获得的溶血值，溶血值的 增量大于2％的RBC制剂不被使用。
脑匀浆液的制备和处理
正常的仓鼠脑匀浆液(10％w/v)由马里兰大学(the University of Maryland)的Dr.Robert Rohwer和同事根据他们建立的方法制备。以1.8 ml体积制备等份溶液，于-80℃冷冻保存或者液氮保存，直到使用。可 选择地，匀浆液融化一次进行分装。每次实验每柱子使用60微升的脑 匀浆液。
脑匀浆液样品融化后，样品置于湿冰上。然后向每60μl融化的脑 匀浆液的等份溶液中加入6.6μl的5％十二烷基肌氨酸钠试剂(将0.5g 十二烷基肌氨酸钠溶于9.5ml的CPD∶Adsol缓冲液中(8.5％CPD，30.6％ Adsol和60.9％PBS v∶v∶v))。样品轻微地在湿冰上旋涡振荡30分钟，进 行变性。然后样品在微型离心机中4℃，14,000rpm离心5分钟。转移上 清至新管中，弃去沉淀物。然后上清置于湿冰上，最长1小时。得到的 上清是含有0.5％十二烷基肌氨酸钠试剂的10％脑匀浆液。将得到的分 装物于制备后1小时内加到柱子上，处理过程中置于湿冰上。
水合珠子定量转移到柱子上
往每个空柱子上加入750μL0.1％TweenTM 20溶液。然后往每个柱 子上加入1毫升20％的乙醇(v∶v)，使其在重力下流过。再往每柱子上 加入2×1ml除气的去离子水，以洗掉乙醇溶液，除去任何捕获在玻璃料 中的空气。使用定量吸移管管理器，把400μl的水合珠子悬液转移到柱 子中。多余的工作缓冲液依靠重力流过经转移的湿珠子，然后在导入 样品前，用1ml工作缓冲液将柱子洗涤3次。
制备RBC共混物(活化溶液)
用注射器和18号(或者更大号的)针头，把540μl的RBC/柱子置 于聚丙烯圆锥管中。为了把AdsolTM层分离于上部，将管子以3,000rpm 离心10分钟。然后往上部AdsolTM层上加上60μl的10％处理过的脑匀浆 液，从而减少RBC制剂和高浓度掺入材料，即脑匀浆液和十二烷基肌 氨酸钠去垢剂之间的直接接触。共混物颠倒混合，置于湿冰上，在制 备的4小时内使用。在柱分析使用前，使混合物恢复到室温，保持10分 钟。
将活化溶液加到柱子中
当所有的柱子都填充了水合珠子后，混合活化溶液，将其非常仔 细地以0.5ml/柱的体积分层加到珠子上。使溶液靠重力通过柱子。总的 流经时间在大约5到20分钟之间。
将最初0.5ml的流出活化溶液收集入2ml冷冻管中。往每个柱中再加 入0.5ml工作缓冲液，流出液再收集入相同的冷冻管中。将装有珠子的 柱子用1毫升工作缓冲液洗涤5次，其中珠子通过移液操作连续地重悬， 以确保彻底和均匀的洗涤。然后，按照如下所述将珠子从柱中回收。
定量回收结合的珠子
往每柱中加入0.75ml工作缓冲液。用移液管冲洗柱子以悬浮珠子， 将悬液快速转移到刻度管中。珠子悬液在管中沉降，尽量除去上清而 不扰动珠子层。然后上清加回到相同的柱子中，将以上步骤重复2次， 以便把柱子中剩下的任何珠子转移到管中。然后允许珠子通过重力沉 降10分钟，记录带刻度的管子中的珠子层体积。
制备用于分析的结合珠子
首先，将每管中的工作缓冲液水平调节到1ml，然后通过轻微旋涡 管子制得珠子悬液。使用移液管移出500μl的悬液，转移到小的 EppendorfTM(Brinkmann instruments，Westbury，NY)微量离心管中。让 悬液沉降10分钟，将沉降的珠子的体积调节到100μL。然后离心转移后 的珠子，除去上清。立即制备珠子等份溶液，进行电泳和western印迹 分析。
无水珠子与水合珠子的定量比较
以沉降珠子的体积为基础计算干重，膨胀率如下：
珠子干重＝沉降体积/膨胀率
膨胀率＝水合珠子体积(μL)/干重(mg)
对于ToyopearlTM，42.5mg干重＝在20％甲醇中的200μL湿珠子
膨胀率(在20％甲醇中)＝200/42.5＝4.71
实施例4
Western印迹分析
以下的Western印迹程序，设计用于评估来自掺入红细胞浓缩液 (RBC)的脑匀浆液溶液中回收或去掉传染性或非传染性朊病毒蛋白。 这些程序用于从以上实施例3中描述的柱子朊病毒结合分析中获得的 样品，包括暴露于活化溶液的珠子样品和流过柱子的活化溶液样品， 并且收集这些样品。
一般地，靶向结合材料的珠子与含有朊病毒的溶液反应，样品来 源于这样的珠子的柱子结合分析，或者来源于这些反应的流出液。然 后通过Western印迹来分析制备的样品中朊病毒蛋白质的存在。使用对 朊病毒蛋白特异的鼠单克隆抗体作为一抗进行朊病毒蛋白的荧光检 测。然后用结合有碱性磷酸酶的二抗检测这些朊病毒的免疫复合物， 用X光片对化学发光反应进行显影。
样品制剂的凝胶电泳
在实施例3中描述的柱子分析之后，优选地立即进行以下步骤。
对每个制备的柱子珠子样品，通过涡流把100μL的悬浮好的珠子与 100μL的Invitrogen 2X样品缓冲液进行混合。同样通过把柱分析中得到 的未使用的脑匀浆液(正常的人脑，散发性CJD脑，正常的仓鼠脑，羊 骚痒症仓鼠脑，等等)与Invitrogen 2X样品缓冲液混合制备对照组。更 特异地，往40μL的2X样品缓冲液中加入20μL脑匀浆液。
同样如下制备鼠IgG对照。通过把20μl的2.5mg/ml的鼠IgG与480μl 的PBS混合，制备每泳道50ng的标准物，相当于100μl/ml。把25的这种 混合物加到475的2X Invitrogen样品缓冲液中，得到5ng/ml溶液。对于 高浓度的直接上样凝胶标准物，以每泳道10μl使用该标准物，给出50ng/ 泳道。将5微升100μg/mL的鼠IgG溶液与495μl 2X Invitrogen还原样品缓 冲液混合。这产生了1ng/μL的鼠IgG；每泳道使用10μl这种混合物，得 到10ng/泳道(高浓度直接上样凝胶标准物)(10ng/泳道)。也通过稀释 前述步骤的中浓度标准物制备鼠IgG低浓度直接上样凝胶标准物(2ng/ 泳道)，前述步骤的中浓度标准物即通过将溶于上样缓冲液的50μL的 1ng/μL鼠IgG与200μL的Invitrogen 2X样品缓冲液混合来得到(产生 0.2ng/μL)。每孔上样10μL即2ng/泳道。也可以如生产商指导的制备 Invitrogen SeeBlue Plus2 Pre-Stained分子量标准物。
所有样品在Invitrogen缓冲液中90℃加热10分钟。然后短暂离心样 品，-20℃存储过夜。第二天上午在将样品应用于SDS-PAGE凝胶前重 复加热程序。
免疫反应程序
当12％Bis Tris NuPAGE SDS-PAGE凝胶用如以上描述的样品上样 后，凝胶以恒压200V电泳45分钟，进行电印迹转移程序。将蛋白质转 移到其上的膜置于Fisher方形皿中，在摇床上用25ml Western Breeze封 闭剂(12.5ml水，5ml稀释剂A和7.5ml稀释剂B)室温孵育1小时。弃去 封闭溶液。
膜在以1∶5,000稀释于20ml新鲜的Western Breeze一抗稀释液(14ml 水，4ml稀释液A，2ml稀释液B)中的Signet 3F4一抗溶液中孵育。一抗预 先以1∶1稀释于甘油中，所以，工作稀释度是1∶10,000。膜在冷冻条件下 在摇床上孵育。
弃去一抗溶液，将膜洗涤3次，每次用20ml Western BreezeTM抗体 洗涤溶液(将1.25ml抗体洗涤溶液(16×)溶于18.75ml水中)于室温在摇 床上洗涤10分钟。然后膜用AP3(KPL，Gaithersburg，MD)二抗孵育， 二抗是以1∶10,000稀释于20ml Western Breeze一抗稀释液中得到的溶 液，室温在摇床上孵育60分钟。弃去二抗溶液，用如上描述的Western Breeze Antibody Wash洗涤膜。然后用20ml pH 9.8的20mM Tris-HCl， 1mM MgCl2室温将膜洗涤10分钟。
化学发光产生程序
转移膜至干燥的托盘中，浸泡于5ml Western Breeze预混的化学发 光底物(CDP StarTM substrate，Applied Biosystems，Foster City，CA)中轻 轻搅动5分钟。用纸巾轻轻吸干膜，然后置于保护纸中。接着将膜从保 护纸中转移到暗盒中(没有增感屏)，室温保持30分钟，室温暴露于放 射显影5分钟。
实施例5
从人血浆中结合内源PrPc
为了表现朊病毒结合树脂从人血浆中除去PrPc的能力，进行以下 实验，所述人血浆是内源的、未穿入PrPc的人血浆。
对于通过朊病毒结合材料结合内源PrPc的作用，使用的是未稀释 的、新鲜的、汇合的人血浆。冷冻混合的人血浆37℃解冻，通过0.45μm 滤器过滤，加入十二烷基肌氨酸钠至终浓度为0.05％。如本说明书中其 它地方描述的，进行血浆与柱子的结合，以及朊病毒的检测。
从人血浆中结合内源PrPc的实验结果在图1中描述。组A描述在没 有十二烷基肌氨酸钠时，珠子洗脱液中朊病毒蛋白的Western印迹检测 结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度 鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的人血小板；第6-7道-树 脂a；第8-9道-树脂b；第10-11道-Amino 650-M；第12-13道-乙酰化 Amino 650)。组B描述组A中样品的未结合部分的Western印迹检测结果 (第1道-分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG； 第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的仓鼠脑(nHB)；第6道-正常的人 血小板，第7-8道-树脂a；第9-10道-树脂b；第11-12道-Amino 650-M； 第13-14道-乙酰化Amino 650)。组C表示在存在十二烷基肌氨酸钠时， 朊病毒蛋白的Western印迹检测结果(第1道是分子量标记物；第2道- 低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道- 正常的仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨 酸钠，1∶10；第8道-树脂a；第9道-树脂a；第10道-树脂b；第11道 -树脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。组D表示在 存在十二烷基肌氨酸钠时，通过朊病毒蛋白的Western印迹，检测组C 样品中的未结合部分的结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度 鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的 仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨酸钠； 第8道-树脂a；第9道-树脂a；第10道-树脂b；第11道-树脂b；第12 道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。
参考图1，组A，第10和11道，和组C，第12和13道，检测PrPc结合 到ToyopearlTM Amino 650-M树脂上的结合作用；假如通过乙酰化作用 除去氨基上的电荷，那么就不能进行结合(结果如组A，第12和13道所 示)。
实验结果表明了树脂从人血浆中结合内源性PrPc的能力，从而提 供树脂可以用于从人或动物中除去PrP样品的证据。
实施例6
从血成分中结合PrPsc的间隔物要求
如图1所示，ToyopearlTM Amino 650-M树脂从人血浆中结合内源 PrPc。至少此树脂的一部分含有间隔臂或者基团，为TosohTM所专有。 研究间隔物对PrPsc结合的重要性。
如下填充四个(4)用于确定吸收剂的蛋白质分离试剂盒(PIKSITM) 柱子(0.5ml/每个)：每个实验样品两个柱子，一个是缺少间隔物的 ToyopearlTM Amino 650M，一个是商品化的有间隔物的ToyopearlTM Amino 650M树脂。同时也检测没有间隔物的ToyopearlTM Amino 650C 树脂。
用0.5％十二烷基肌氨酸钠处理2毫升(2ml)10％羊骚痒症脑匀浆 液(SBH)。通过把3ml SBH加到297ml工作缓冲液中，对十二烷基肌氨 酸钠处理过的上清用工作缓冲液稀释(1∶100)，柱子用这样的十二烷基 肌氨酸钠处理过的上清进行活化。柱子用10ml稀释于缓冲液的SBH， 通过以0.5ml/min的流速上样，活化2次。收集流出液，从每个柱子中 除去树脂等份物，用10ml工作缓冲液洗涤。
用每种树脂和缓冲液中的活化溶液对每种样品的其中一半用蛋白 酶K消化。样品，如在本文其它地方描述的那样，进行Western印迹检 测。得到的结果如图2所示(第1道是分子量标记物；第2道是用缓冲液 配制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道是用缓冲液配 制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH+PK；第4道是MWM；第5 道是Amino 650M(商品化的)-PK(1)；第6道是Amino 650M(商品化 的)-PK(2)；第7道是Amino 650M(商品化的)+PK(1)；第8道是Amino 650M(商品化的)+PK(2)；第9道是Amino 650M(试验的)+PK(1)；第10 道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第11道是Amino 650M(实验 的)+PK(1)；第12道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第13道是Amino 650C-PK(1)；第14道是Amino 650C-PK(2)；第15道是Amino 650C+PK(1)；第16道是Amino 650C+PK(2))。如图2所示的实验结果清 楚地表明，间隔臂的存在对于Amino 650-M树脂的PrPsc结合作用是必 要的。
实施例7
在存在高浓度的人血清白蛋白(HSA)下捕获PrPc
为了举例说明树脂从含有多种蛋白质的治疗产品中除去PrP的能 力，研究了存在人血清白蛋白时，从中结合PrPc的作用。
将四根Bio-RadTM柱子，用ToyopearlTM Amino 650M氨基树脂填充。 树脂床高1cm，体积为0.5ml。树脂用工作缓冲液充分冲洗。柱子上加 载的样品如下：
柱子I-工作缓冲液中的1％nHaBH(正常仓鼠脑匀浆液)；
柱子II-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)；
柱子III-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)和20 mM N-Ac-Trp(Acros Organics，Belgium)；
柱子IV-1％HaBH，American Red Cross制剂(ARC制剂)。
将20mM N-Ac-Trp溶于用工作缓冲液配制的25％HSA中，振荡， 37℃加热45分钟。如以上描述的制备10％nHaBH上清，以1∶10稀释于 选择的材料中(步骤2)，得到1％的nHaBH。
每个柱子的底部与4通道的蠕动泵相连。以上步骤制备的5毫升(5 ml)1％nHaBH以0.5ml/min的流速通过柱子I-IV。柱子被洗涤，以10ml 工作缓冲液/柱子、以0.5ml/min的流速洗涤。回收树脂，如以上描述制 备样品，跑12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。
使用3F4一抗的Western印迹被用于检测已经被树脂捕获的PrPc。印 迹的照片如图3所示(第1道-低浓度鼠对照组；第2道-中浓度鼠IgG 对照组；第3道-nHaBH对照组；第4道-1％HaBH柱子；第5道-1％ HaBH，25％HSA柱子；第6道-1％HaBH，25％HSA，20mM N-AC-Trp 柱子；第7道-1％HaBH，ARC制剂柱子)。在每道中可以见到大约相 同密度的条带，这表明：ToyopearlTM 650-M氨基树脂，在从多种途径 获得的25％人血清白蛋白存在的条件下，捕获了仓鼠脑匀浆液中的 PrPc。
如图3所示的实验结果表明：树脂从含有HAS的样品中结合朊病毒 蛋白的能力，从而提供了树脂可以用于在多种治疗产品中结合朊病毒 蛋白，并且确保使用血蛋白的治疗产品，例如作为稳定剂或治疗剂， 以及可以受到PrP污染的治疗产品的安全性的证据。
实施例8
在人血清白蛋白中，PrPsc结合到氨基树脂上
在以下描述的实验中，说明了在掺入在白蛋白中的传染性PrPsc的 结合作用。将12个PIKSI柱子用ToyopearlTM Amino 650M树脂进行填 充，每个0.5ml。将2ml 10％SBH(羊骚痒症脑匀浆液)用0.5％十二 烷基肌氨酸钠处理。
按照如下概述，制备以下六种活化物。
1.用缓冲液配制的SBH活化物：用工作缓冲液稀释(1∶100)经 过十二烷基肌氨酸钠处理的上清；将0.22ml SBH加到22ml工作缓冲 液中。
2.用HSA(American Red Cross(ARC)制剂)配制的SBH活化物： 将十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HAS稀释(1∶100)；将0.22ml SBH加到22ml HSA(American Red Cross制剂)中。
3.用含有N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH 活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用含有20mM N-乙酰-色氨 酸和20mM辛酸酯的25％HSA稀释(1∶100)；白蛋白从sigma购买，不 含添加剂；将0.22ml的SBH加到22ml的HSA溶液中。
4.用含有N-乙酰-色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把 十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的 SBH加到22ml含有N-乙酰-色氨酸的HSA中。
5.用含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷 基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的SBH加 到22ml含有20mM辛酸酯的HSA溶液中。
6.用单独的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨 酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml SBH加到22ml 的HSA溶液(Sigma)中。
每种树脂用10ml溶液重复活化2次。柱子以0.5ml/min的流速上样， 以蠕动泵控制流速。收集流出溶液，以及收集来自每个柱子的树脂。 对每种树脂和缓冲液中的活化物导入蛋白酶K消化液。根据在此描述的 方法，样品进行Western印迹。印迹在图4中描述(组A：第1道-分子 量标准物；第2道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的 SBH-PK；第3道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的 SBH+PK；第四道-缓冲液配制的SBH-PK(1)；第5道-缓冲液配制的 SBH-PK(2)；第6道-缓冲液配制的SBH+PK(1)；第7道-缓冲液配制的 SBH+PK(2)；第8道-HSA(ARC组成)配制的SBH-PK(1)；第9道-HSA (ARC组成)配制的SBH-PK(2)；第10道-HSA(ARC组成)配制的 SBH+PK(1)；第11道-HSA(ARC组成)配制的SBH+PK(2)；第12道-HSA (Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)； 第14道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-HSA(Sigma)配制的 SBH+PK(2)；列；组B：第1道-分子量标准物；第2道-缓冲液配制的 0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道-缓冲液配制的 0.1％Sark处理的SBH+PK；第4道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制 的SBH-PK(1)；第5道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的 SBH-PK(2)；第6道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)； 第7道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第8道-含 有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第9道-含有辛酸酯的HSA (Sigma)配制的SBH-PK(2)；第10道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的 SBH+PK(1)；第11道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)； 第12道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第 13道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第 14道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第 15道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)。
图4中所示的结果表明，当与人血清白蛋白混合时，传染性PrPres 可以结合到氨基树脂上，并且多种添加剂不会干扰结合。
实施例9
筛选用于结合和去除朊病毒蛋白的树脂
目的
该研究用来评价由PRDT(病毒去除和诊断科技公司)选择的树脂 形式提供的可传播性海绵状脑病传染性去除的水平。对该树脂的活化 是掺入了瘙痒症仓鼠脑匀浆液的白细胞减少的人红细胞浓缩物单元。
背景
可传播性海绵状脑病(TSE)传染性已经在几个实验室的实验性和 天然感染的动物的血液中得到证实。BREF/UM一致且可重现地测量 4-20ID(传染剂量)的传染性每毫升被263K瘙痒症菌株(263K strain of scrapie)感染的仓鼠全血。此外，已经报道了经由vCJD(人类形式的TSE) 的血液从人到人传播的两例可疑性案例。这些结果引发了通过血液和 血液产品将TSE传播给人类的潜在风险的问题。由于TSE药剂对传统 病原体灭活方法的抗性以及缺乏灵敏的潜伏期TSE诊断试验，去除该 药剂是解决TSE经血液传播的最有希望的方案。
PRDT的策略采用从化学品和肽库中产生潜在的配体。该库经过一 级和二级筛选用于具有PrPres结合性质的配体，由树脂结合蛋白的 Western印迹以及流出物中的PrPres的ELISA分析。PrPres被认为是 TSE传染性的生化标记。这些筛余物鉴别了几种对TSE去除有效的配 体。此项研究的目的是确定由这些选择的配体在用于从白细胞减少的 红细胞浓缩物(RBCC)中除去TSE传染性的设备中使用时提供的TSE 传染性去除的水平。选择八种PRDT树脂从掺在人RBCC中的人(散发 性CJD)和仓鼠(263K瘙痒症菌株)感染的脑溶液中特异性捕获PrPres。 这些选择的树脂是：SYA，Amino 650M，Phenyl 650M，TMAE 650，DVR， YVHEA，WFDEA，和(D)ES(nal)PRQ-Eaca。还包括两种阴性对照物： 乙酰化SYA和乙酰化Amino 650M。代码编号示于表5中。(在此使用 氨基酸的标准简写)。先前已经发现大量的乙酰化乙酸酐抑制朊病毒结 合。
表5树脂代码
树脂 代码
SYA R1
Ac.SYA R2
Amino 650 R3
Ac.Amino 650 R4
TMAE R5
Phenyl 650M R6
DVR R7
YVHEA R8
WFDEA R9
(D)ES(nal)PRQ-Eaca R10
实验设计
树脂兼容性-在初步研究中，首先测试每个树脂备选物与当前说 明的(current specifications)RBCC功能和稳定性的兼容性。所有树 脂与RBCC兼容并用于TSE传染性去除研究。在一个实施方式中， PRDT树脂用两个柱子串联测试。每个柱子(或设备)含有大约10mL树 脂。串联柱子的基本原理是用来确定去除的类型并区别随机的或选择 性的捕获机理。假设树脂不是在饱和条件下，在随机机理中，第二设 备除去额外的传染性。在选择性机理中，第二设备不除去额外的传染 性。在一个实施例中，两个串联的TMAE树脂柱用一个单元的掺入了 1％瘙痒症脑匀浆液的RBCC来对比评价。选择该TMAE树脂是由于其 有效性。这些树脂表明第二柱子除去了与第一柱子一样多的PrPres且 经过第二柱子的液流可能含有更多的PrPres。根据这些结果，可以得出 结论，第一设备是饱和的。每个树脂的PrPres去除水平通过Western 印迹确定，并测定显示PrPres去除水平低于Western印迹检测水平的树 脂。
在一个实施方式中，整个实验在一天内完成，一组血液被立刻掺 入并用作对每个试验用PRDT配体的活化。此策略以最小的成本增长 有效的增加了该研究的价值。该研究还设计为用一个单元的掺杂RBCC 活化每个树脂来模拟设备的实际可能的最终应用。
选择瘙痒症仓鼠脑匀浆液作为RBCC的掺入物。该决定的基本原 理基于：1)瘙痒症仓鼠脑匀浆液对于掺入研究具有高测定量理想值， 其中掺入物必须稀释几倍，2)在TSE菌株的不同实验模型中仓鼠模型 具有最短的培养期，3)选择的配体已经从瘙痒症仓鼠脑匀浆液中筛选 用于PrPres的结合，和4)仓鼠模型在实验室已经确立好且大量掺入物 可以容易的制备。
树脂容量(capacity)-理论树脂容量的计算在传染性研究之后进 行。通常，用于研究的树脂理论上能够结合30-40mg蛋白每克树脂(4.7 mL溶胀树脂)。在活化物中选择该容量来结合全部(PrPc+PrPres)。然 而，以理想行为(如在树脂珠孔内/外分离)对于蛋白计算该容量。PrP在 该活化物中时不是理想的蛋白，即使在以各种尺度的集合形式或与其 他蛋白的复合进行清洁处理后。还显示了，PrP不会穿透珠孔且其只结 合到树脂珠的表面。尽管有此局限性，但是发现50mL树脂(组合的 五台设备的总体积)足以结合活化物中的所有PrP。过滤的目标流速是 10mL/min。此流速来源于在40min内过滤一个单元血液的要求。在这 些条件下，接触时间为大约1mL/min，且对于传染性来说认为其足以 结合配体。树脂结合PrPres的Western印迹和ELISA分析在液流中进 行。
实验程序
血液汇合-十单元的人RBCC收集于ARC(Holland实验室)并根 据本领域公知的标准程序在Pall过滤器上过滤白细胞。袋子里的血液 在实验前一天送到实验室并在40℃的冰箱里储存过夜。实验当天，将 血液汇合到大的血袋中。所有的稀释和体积测量以重量进行并使用 1.06g/mL作为RBCC的密度转化成体积。
掺杂制备物，血液的掺杂和再分配-未掺杂的血液组(blood pool) 中一等份取出并用作浓度测定用连续稀释制备中的稀释剂。PRDT瘙痒 症脑匀浆液(SBH)组中的一等份用0.5％十二烷基肌氨酸钠在冰上处理 30分钟。将该样品离心分离，移出上清液“十二烷基肌氨酸钠处理的 10％SBH”并缓慢与血液组混合。掺入物的体积基于血液重量计算并 使得血液中的终浓度为0.1％w/v(10％SBH的1∶100稀释物)。掺杂的 血液认真混合后，血液汇合袋(blood pool bag)连接到预先做的歧管 (manifold)并将掺杂的血液再分配到十个血袋，每个大约一个单元。传 送通过重力进行并将装满的袋子置于天平上称重。大约一个单元重量 的血液被传送到每个袋子中，将最终重量记录为Challenge 1。取出一 等份掺杂的血液用于浓度测定。
过滤-含有掺杂RBCC的每个血袋连接于预先做的过滤装置。每 个过滤装置含有串联的五个柱子的同样树脂(～10mL树脂每柱)和五个 血袋以收集从每个过滤器经过的液流。悬挂血袋，用钳子固定柱子垂 直于液流，接收袋在表面上平放。松开恰好置于柱子上方和下方的两 个钳子过滤开始。每个柱子的过滤进行计时，并记录袋子和柱子之间 的高度。应当注意，柱子和接收袋之间的距离对于所有过滤装置是相 同的。在同样情况下，在过滤过程中，降低或增加血袋和柱子之间的 高度来调节流速。每个柱子过滤后，称重接收袋，取出一等份液流， 再次称重袋子并为下次过滤准备。
树脂的去除-每次过滤后，将柱子与装置的其他部分分离并置于 旁边用于随后去除树脂。通过缓慢汇合缓冲液到柱子中并等待树脂出 来，可以从每个柱子的大约60mL缓冲液中收集全部十毫升树脂。将 大约3-5mL树脂转送到一次性色谱柱并用柠檬酸盐缓冲液洗涤。丢弃 剩余的树脂。
生化特性-通过Western印迹分析树脂对于PrPres的捕获。结果 表明SYA，Amino 650M，DVR，YVHEA和(D)ES(nal)PRQ-Eaca通过第 二柱子除去PrPres到检测限。换句话说，没有PrPres信号在第三、第 四和第五柱子中可检测到。
在小规模试验中对来自四种树脂：DVR、苯基树脂、氨基树脂和 TMAE的五个流出液进行ELISA分析。样品制备的程序是：添加2体 积的水，添加2％SDS(终浓度)并在1000℃加热10分钟(TSE灭活程 序)。在应用至ELISA之前，将样品用分析缓冲液稀释50倍。最终样 品稀释是150倍。这些结果与Western印迹结果的一般趋势相配。根据 ELISA结果的最好树脂是氨基树脂，然后是DVR、TMAE和苯基树脂。
浓度测定
浓度测定用树脂和液流的选择-基于树脂结合PrPres的Western 印迹结果，发现第三柱子后五种配体已经去除PrPres至检测限。这五 种配体是：DVR，Amino 650M，SYA，YVHEA和(D)ES(nal)PRQ-Eaca。 这五种配体的传染性去除与作为对照物的TMAE和乙酰化SYA树脂一 起进行。为降低研究中动物的总数量，并非每股流出液都进行浓度测 定。基于Western印迹结果，丢弃液流#1，因为柱2中的强PrPres信号 表明并非所有的PrPres和可能的传染性被柱1去除。选择的测试用流 出液是2和5。选择流出液2是因为在所有情况下(除对照物外)柱3几 乎不显示信号，表明液流2中PrPres浓度有明显降低。选择液流5是 因为它有最好的去除所有传染性的机会。在后来的研究中，流出液3 和4也进行浓度测定。然而，此报告仅涉及第一次传染性研究。
通过培养期方法的浓度测定-流出液的浓度测定利用培养期方 法进行。该方法不足以十分准确的区别两个相近的浓度测定量(2-log10 或更低)，但是它可以理想的用于差异为至少3-log10传染性的浓度测定， 因为它快速且与更准确的末端浓度测定方法相比要求更少的动物。由 于该研究的目的是选择去除大于3-log10传染性的树脂，认为培养期是 正确的选择。培养期与接种到仓鼠的传染性剂量成反比。该关系对于 高传染性剂量来说是线性的且该线性与低传染性剂量是分开的。掺杂 的RBCC稀释成未掺杂RBCC的两个独立的十倍稀释系列(相对于整 个脑从10-3到10-11)进行浓度测定并根据培养期产生两个剂量反应曲线。
将动物分离成等同确定改善了培养期值以及末端稀释浓度测定的 统计真实性。校正曲线的结果确定了对于每次稀释从活化物(10-3)作为 最高浓度开始和10-4、10-5等的疾病的平均培养期。使用相同的两个连 续稀释通过末端浓度测定法来确定掺入物的准确浓度测定。经过树脂 的最终去除利用从连续稀释challenge的培养期实验获得的剂量反应曲 线等式确定。
末端浓度测定-在相同实验里，10％瘙痒症脑匀浆液以及十二烷 基肌氨酸钠上清液用末端浓度测定法进行浓度测定。这些增加的浓度 测定的基本原理是为了得到PRDT SBH pool的起始浓度测定和不含 RBCC的实际掺入物的浓度测定的准确测量。
接种-流出液不经稀释进行接种。两笼动物(8只仓鼠)用流出液 进行接种，4笼动物(16只仓鼠)用challenge溶液接种。含氨基树脂的 液流2在4个笼子(16只仓鼠)里接种。制备剂量反应曲线的两个独立 的稀释系列。两笼动物用从10-3开始到10-11的每个稀释液(稀释液以整 个脑作为100稀释)接种。对于SBH和十二烷基肌氨酸钠SBH的浓度 测定，1笼动物用10-1到10-11的稀释液接种。
重量数据-先前的工作显示患瘙痒症动物的体重随着疾病的发 展下降。决定使用该标准来确定培养的末端。动物体重下降到最大体 重的80％的那天确定为培养期的末端。该方法的优势在于它没有偏倚 且不受人为失误影响。每个动物每周称重，一有疾病迹象就每周称重 两次，记录体重并为每个动物基于接种后天数作图。用流出液接种的 每个动物和标准曲线中的动物的最终培养期并入最后一栏，标题为 “80％最大”。记录的接种后天数在“PI天数”一栏，且“80％最大” 并非总是相对应，因为一些动物在体重降到80％最大体重时没有死去， 而是在几天之后。然而，在达到目标体重之前没有动物死去。“80％最 大”栏里的接种后天数根据表明动物达到目标体重的第一天的体重表 确定。这些数值的平均数和标准偏差也进行测量并列于下表6中。
临床数据-用流出液接种的动物在接种后239天死亡。末端浓度 测定继续进行，并将连续365天来确定SBH的准确浓度测定。然而， 这些剩下的动物不再称重。没有并发死亡且7只动物由于血液毒性而 在接种后前两周死亡。这些动物从最后浓度测定计算中去除。
用或不用十二烷基肌氨酸钠处理的SBH的浓度测定通过一周两次 对动物的临床评分进行，直到动物不能站立，此时动物死去。该动物 症状记录被扫描并提交。
表6每个稀释液在剂量反应曲线中的培养期 RBCC中SBH 的稀释log10 (I) (II) 平均值 SD 平均值 SD -3 -4 -5 -6 -7 94 105 114 128 137 4.2 8 5.2 9.4 15 99 104 111 117 158 5.4 6 3.8 4.8 54
-8 -9 -10 227 147 151 49 - - 182 206.5 0 73 104 -
计算和结果
末端浓度测定-SBH浓度测定的计算利用Reed and Muench方法 以1g脑进行。在末端浓度测定法中产生了四组数据：两个标准曲线、 一个10％SBH的稀释和一个经十二烷基肌氨酸钠处理的10％SBH上 清液的稀释。后者是RBCC中的实际掺入物。表7显示了浓度测定的 列表结果。PRDT 10％SBH pool的浓度测定量是109.18ID/mL。经十二 烷基肌氨酸钠处理并除去不溶颗粒后，浓度测定量降至108.10ID/mL， 表明尽管有增溶程序离心法除去了大约1-log的传染性(90％)。 Challenge溶液(0.1％SBH)的浓度测定进行两次显示很好的匹配，两次 浓度测定量都是106.72ID/mL。该浓度测定量略微高于在缓冲液中稀释 100倍至0.1％的十二烷基肌氨酸钠处理的SBH的计算浓度测定量。还 不清楚什么原因引起该差异。
表7末端稀释法的浓度测定量 浓度测定量，log10 10％SBH 母液 10％SBH十二烷基肌氨酸钠上清液 在RBCC中的0.1％SBH(I) 在RBCC中的0.1％SBH(II) 9.18 8.10 6.72 6.72
培养期浓度测定-在培养期浓度测定中，使用稀释的log10。剂 量反应曲线利用活化物从10-3到10-8的每个稀释液的实验培养期确定。 将表6记录的两个曲线的平均值进行平均(表8)。
表8两个曲线平均的培养期 -3 -4 -5 -6 -7 -8 96.5 104.5 112.5 122.5 148.5 204.5
抽出最适合表8中数值的曲线且其对应如下等式的指数曲线：
y＝a+b(-x/c)
其中，a，b和c是具有报道数值的常数，y是涉及整个脑的稀释(即， 0.1％SBH是10-3整个脑稀释)且x是培养期。液流培养期的平均值和标 准偏差示于表9。对应于每个培养期的稀释利用上述等式计算。每股液 流的稀释和活化物稀释的差异计算为去除。
去除结果(表9)表明液流2捕获一或小于1-log10的传染性，其中 R3FT2(Amino 650M树脂)最好。还有阴性对照物树脂，R4FT2(乙酰 化氨基树脂)不除去传染性而R5FT2(TMAE)仅去除0.5-log的传染性。 另一方面，液流5显示R1，R3，R7和R8(分别是SYA，Amino 650M， DVR和YVHEA)全部去除大于3-log10的传染性，其中SYA最好，为 4.2-log10去除。
表9TSE传染性去除 树脂 DPI* SD 稀释 (log10) 去除 (log10) R1FT2 R3FT2 R4FT2 R5FT2 活化物 SYA Amino 650M 乙酰化Amino 650M TMAE 89 102 104 92 95 2.6 7.9 4.2 3.6 6.7 3 3.7 4.0 3.0 3.0 - 0.7 1.0 0.0 0.0
R7FT2 R8FT2 R10FT2 DVR WFDEA (D)ES(nal)PRQ-Eaca 102 100 98 2.7 5.0 1.4 3.7 3.6 3.3 0.7 0.6 0.3 R1FT5 R3FT5 R4FT5 R5FT5 R7FT5 R8FT5 R10FT5 SYA Amino 650M 乙酰化Amino 650M TMAE DVR WFDEA (D)ES(nal)PRQ-Eaca 151 142 95 99 130 139 123 34.1 35.3 3.6 3.5 7.7 27.8 11.5 7.2 6.9 3.0 3.4 6.4 6.8 5.8 4.2 3.9 0.0 0.4 3.4 3.8 2.8
*DPI＝接种后天数
结论
该研究鉴别了选自用于有效TSE去除的二级筛选的这些当中最好 的PRDT配体。二级筛选确定了PrPres的捕获和去除的同时，该研究 还确认了相同配体去除掺杂RBCC的传染性。这些树脂实现了该研究 的目的，由于大多数配体去除大于3-log10的来自脑的传染性，而Amino 650M和SYA去除大约4-log10。此外，该去除是特异性的，且非通过 尺寸排除大的聚集体，由于阴性对照物配体没有去除任何传染性。数 据还显示配体没有去除存在于活化物中的全部传染性。这并不奇怪， 由于树脂被非常高浓度的传染性活化。基于Reed and Muench方法测量 的活化物的浓度测定量，将树脂曝露于106.72ID/mL，其是在TSE感染 的啮齿动物模型的血液中测量的传染性水平(10ID/mL)的100,000倍。
总之，SYA，Amino 650M，DVR和YVHEA全部表现很好，其中 SYA和Amino 650M可能略微偏好。这些树脂去除3-4-log10的TSE传 染性。该去除水平足以捕获来自血液的全部传染性，由于一个单元的 感染血液(在仓鼠模型中)含有大约5,000感染剂量。因而，如果脑中 的传染性与血液中的传染性相似，预期PRDT设备从血液中去除全部 TSE传染性。
实施例10
来自掺到缓冲液、过滤血浆和全血中的SBH中的PrPsc与Amino 650M 和Amino 650U结合的比较
Amino 650U是包括Amino 650M的不同珠子尺寸的混合物，其生 产成本低于650M。测试Amino 650U的内源性PrP及其结合所有当前 使用的基质(缓冲液、过滤血浆和全血)中的PrPsc的能力，并将其和 与用掺杂全血活化的Amino 650M的结合相比较。设计该实验用于对 比来自掺杂的缓冲液、血浆和全血的PrPsc与Amino 650U的结合，并 确立来自血浆和全血的内源性PrPc与Amino 650U的结合。另外，设 计该实验来确定PrPc去除中白细胞过滤(leukofiltration)的作用。
当存在于血浆或全血中时，没有发现650U或650M的朊病毒去 除的信号有差异。总之，Amino 650U和650M表现相同。白细胞过 滤去除的PrPc的量大于血小板和白细胞一起时的估计量。因而，白细 胞过滤还可能捕获部分血浆来源的PrPc。已经显示，在捕获人和仓鼠 血浆来源的PrPc时白细胞过滤器的作用方式有所不同。在仓鼠血浆 PrPc不被过滤器捕获时，人血浆PrPc可能被捕获。最后，还有可能， 两个结果的差异是由于PrPc和传染性之间缺少相关性。
实施例11仓鼠脑PrPsc与AMN树脂的结合
对一系列树脂(如，AMN-13，14，15，16，和17，Amino 650M和 Amino 650U)进行可比的结合实验。这些树脂结合到来自掺杂的缓冲 液、血浆和全血的PrPsc。结果证实了当用掺杂的缓冲液和掺杂的全血 两者同时活化时，全部AMN树脂结合的一样好。此外，AMN树脂的 信号与Amino 650M和650U的信号相同。对比来自掺杂的血浆中的 PrP的树脂结合发现，Amino 650M比所有其他树脂的信号略强。在 AMN树脂中，#13显示具有弱PrP信号，但与Amino 650U非常相当， 而#15，16，17全部表现好于Amino 650U。在AMN 14，15，16，17树脂 间没有发现明显的差异。
总之，该研究证实树脂间的更多相似性，且非常重要的，它显示 了与Amino 650U的相关性比650M更接近。观察到的与血浆的差异 表明至少与降低取代水平的活化物的差异也许是有利的，且树脂表现 的更接近于Amino 650M。
实施例12结合至树脂植入的膜的蛋白的提取以及来自正常仓鼠脑匀 浆液的PrPc结合的确定
使用树脂植入的压延膜的新设备的发展要求开发从树脂提取结合 蛋白的新方法。必须改变对材料的处理，以及提取液的组成、浓度和 体积。实验还设计成用来以新形式进行结合评价，使用Toyopearl Amino 650M植入的膜及其乙酰化形式。
正常仓鼠脑匀浆液(HaBH)用十二烷基肌氨酸钠处理并旋转。形成 的上清液用工作缓冲液或人全血稀释成终浓度为1％。50毫升掺杂的溶 液流经47mm Swinnex过滤器支撑物(Millipore)，其含有4个植入了4 mg/cm2的Toyopearl Amino 650M或其乙酰化形式的压延膜的夹层结 构。使用的流速是0.5mL/min，使用蠕动泵。对于每个掺杂的溶液和 膜类型收集十个等份，每个5mL。用掺杂的缓冲液活化的膜的液流样 品用ELISA分析。含有乙酰化树脂并用掺杂的全血活化的膜使用工作 缓冲液清洗。
膜断片(在某些情况下为整块)用SDS-PAGE样品缓冲液或99％甲 酸处理。用甲酸的处理包括把0.5mL 99％的甲酸和10μL 20％SDS加 入到四分之一的膜夹层结构，接着培养1小时去除液体，使用SpeedVac 蒸发。使用水将样品的体积调节到15μL，接着加入15μL 2X样品缓 冲液。使用样品缓冲液的处理包括将3mL 1X样品缓冲液加入到整块 膜中，接着培养30分钟，并沸腾7分钟。不挤压膜收取溶液，简单离 心除去所有树脂。还测试了上述处理的变化。它包括将1mL 2X样品 缓冲液加入到对应于1A过滤器的两块分离的膜中，培养1小时，接着 只沸腾它们中的一个。如果利用传染性时拆分过滤器支撑物变得很危 险，用样品缓冲液的洗提而不沸腾可以使用。
测试的最后条件是用样品缓冲液培养膜的断片(1/4)来核实与第 一、第二、第三和第四膜的结合以接触活化溶液。然后将样品在 SDS-PAGE凝胶上运行并对整个蛋白染色。也进行Western印迹。过滤 器支撑物的空闲体积大约是7mL。使50mL活化溶液流经每个过滤器 后，然后是空气流过，回收的活化溶液对于全血是45和47mL。当使 用掺杂的缓冲液时，回收的体积是46和46mL。当使用不同活化溶液 时没有注意到明显的差异。
要打开的第一过滤器支撑物是含有带乙酰化Toyopearl的膜的那 个，其用掺杂的全血活化。注意到，尽管流过空气并用缓冲液清洗， 过滤器中仍有一些血液。在试图用缓冲液清洗膜的过程中，树脂有明 显损失，丢弃膜。
带有用全血活化的Toyopearl Amino 650M的过滤器支撑物使用额 外200mL缓冲液清洗。流速高于最大值(刻度盘为999)。打开支撑物 时，注意到在各层里特别是各层之间仍有一些血液。还注意到，在洗 涤过程中绕过了由射线分配器勾画的一对断片。
膜块被切成4个等份。一片具有分离的且用样品缓冲液处理的四 层以确定不同层是否具有不同结合。另一个等份也被分成小片并用甲 酸处理。剩余的两个等份用来比较加热和不加热的处理。
两个用掺杂的缓冲液活化的过滤器每个使用200mL工作缓冲液 清洗。打开过滤器并将整块转送到小玻璃瓶中，在其中加入3mL样品 缓冲液。
植入到压延膜的树脂表现出在柱形式的树脂中维持相同的PrP结 合性质。乙酰化氨基树脂显示与氨基树脂信号相当的弱膜结合PrP信 号，证实如下结论：乙酰化氨基树脂不会有效结合PrP以及两种信号 间的差异对氨基树脂具有特异性。通常，树脂表明50％乙酰化，无论 是混合形式还是化学合成，降低PrPres结合。
实施例13PrPsc与来自SBH掺杂的血浆和全血的D4的结合
进行实验来比较来自掺杂的缓冲液、过滤的血浆和全血的PrPres 与D4树脂的结合以及内源性PrPc与D4的结合。在用掺杂的RBCC (UM-R-T-SE-180603)测试的Prometic模拟树脂中，D4显示出与PrPsc 的最好结合。将该树脂进行内源性传染性研究。与掺杂的脑来源PrPres 的D4结合性能在血浆、全血存在下进行测试，缓冲液作为对照物。该 测试还仅用来自血浆或全血的内源性PrPc来活化D4。
Western印迹信号表明D4结合血浆和全血中的掺杂的PrPres。D4 还可能结合来自全血的内源性PrPc，可能好于Amino 650M。
实施例14不同乙酰化树脂对PrPres的捕获
该研究比较Amino 650M的乙酰化对结合至PrPres的影响。不同 程度的乙酰化如下实现(1)完全乙酰化和非乙酰化树脂的混合物和(2) 通过在相同珠子上进行部分化学反应。该结果表明树脂可经受由化学 反应实现的20％乙酰化，仍结合PrP。此外，50％乙酰化树脂的混合物 对于结合PrP也是令人满意的。
虽然本发明的实践或检验中可以使用与在此描述的方法和材料相 似或相当的方法和材料，但是以上描述的是合适的方法和材料。所有 的出版物、专利申请、专利和在此提及的其它引述的参考资料被完整 地引用于此，作为参考。另外，材料、方法和实施例仅仅是例证性的， 其目的不在于限制。
上述的描述用于描述与发明有关的几个实施方案。可以对实施方 案和结构进行多处修正、添加和删除，只要不脱离发明的范围和精神。
序列表
<110>美国红十字会
北卡罗莱纳州立大学
普洛麦提生命科学有限公司
<120>朊病毒蛋白结合材料及其使用方法
<130>51821-0111WP(51821-299536)
<150>US 60/460,474
<151>2003-04-04
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>1
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
1 5
结合材料与样品中的朊病毒蛋白形成复合物，可以在从样品或在 样品中检测、结合、分离、去除、排除、提取或者分离朊病毒蛋白的 方法中使用，其中该样品如人或者动物来源的组织、器官、或者生物 液体或者环境样品。本发明还提供了在人或者动物中，或者其组织、 器官或者生物液体中诊断或者监控朊病毒疾病的方法。例如，在此描 述的结合材料可以通过测定生物样品如全血、来源于血液的组合物或 者组分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、眼泪、扁 桃体、大脑、阑尾以及其它，从而用于检测或者诊断诸如CJD、vCJD、 GSS、致命性失眠症、骚痒症、BSE和CWD和其它TSEs的病理。在 血液、组织或者器官移植前，对动物或者个体中的朊病毒蛋白传染进 行测定的重要性是显而易见的。结合材料可以特别地从样品或者生物 液体如全血、血液组分、血清、血浆、血浆衍生物以及类似物中去除 朊病毒蛋白。在生物液体传播给其它的动物或者人的情况下，如在输 血或者施用如凝血因子的血液制品中，朊病毒蛋白的去除是非常必要 的。结合材料可以从样品中去除或者检测所有不同形式的朊病毒蛋白， 或者可以选择性地选取来去除或者检测单一形式的朊病毒蛋白，并且 可以因此区分样品中的传染性和非传染性朊病毒蛋白。
定义
在此应用的术语“一个”、“一种”和“该”的定义是指“一个或多个”， 并且还包括复数，除非在上下文中认为不适当。
术语“3F4抗体”是指对于PrPc的天然形式，而不是天然PrPsc或 者PrPres，具有特异性的单克隆抗体。该抗体对于变性形式的仓鼠和人 PrPc、PrPsc和PrPres有特异性。
正如在此所应用的，术语“来源于血液的组合物”、“血液组分”以及 “血液组合物”可以互相交互使用，并意欲包括全血，红细胞浓缩物， 血浆，血清，富集或者缺乏血小板的部分，血小板浓缩物，白血细胞， 血浆沉淀物，血浆分级沉淀物以及上清，免疫球蛋白制剂包括IgA、IgE、 IgG和IgM，纯化的凝结因子浓缩物，纤维蛋白原浓缩物，血浆分级中 间物，白蛋白制剂，或者来源于人或者动物血液的其它不同的物质。 这些术语也包括通过本技术领域内不同的常用方法如离子交换、亲和、 凝胶透过、和/或者疏水层析或者通过用乙醇或者聚乙二醇示差沉淀纯 化的来源于血液的蛋白。
术语“PrPc”是指天然朊病毒蛋白分子，其天然并广泛地表达于哺乳 动物的体内。其结构高度保守并且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”是指PrPc分子的构象改变形式，本技术领域的普通技 术人员认为该分子与诸如TSE/朊病毒蛋白的疾病包括vCJD、CJD、库 鲁病、致命失眠、GSS、骚痒症、BSE、CWD以及其它的TSEs相关， 包括捕获和实验动物中稀有的TSEs。PrPsc具有与正常的、细胞PrPc 相同的氨基酸序列，但其中一部分α螺旋变成了β折叠，这一转变与 疾病状态相关。
术语“PrPres”是指分子量为27-30kDa的PrPsc蛋白的蛋白酶抗性衍 生物，其在蛋白酶K(PK)部分消化PrPsc后仍然存在。
术语“PrPr”是指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语“PrP”是指朊病毒蛋白的总称。
术语“珠子”是指固相颗粒或者微粒，其可以结合反应基团或者结 合成分。珠子具有不规则的形状，包括有球形、椭圆形、杆状或者甚 至是带角的形状，这些都属于该术语的范围。
术语“树脂”是指聚合介质。
在此应用的术语“聚合”描述的是由几种较小的、重复性化学或者 结构单元(单体)组成的化合物或者分子。
样品
在此应用的术语“样品”是指任何溶液、悬液、提取物、组合物、 制剂、产品、组分、组织、器官、细胞、或者其它的实物，它们按照 本发明的某些方面和实施方案的方法与朊病毒蛋白结合材料相接触。 按照本发明的某些方面和实施方案，样品包括但不限于，生物样品、 食品、环境样品或者水样品。生物样品包括但不限于：来源于血液的 样品；来源于脑的样品；体液，例如但不限于，血液、血浆、血清、 脑脊液、尿液、唾液、奶、管液、眼泪或者精液；生物提取物，如胶 原提取物、腺体提取物、或者组织匀浆物或者提取物。生物样品来源 于人或者动物，包括但不限于牛、绵羊、猪、马、鼠或者鹿科(Cervidae) 动物。来源于血液的样品包括，但是不限于，血小板浓缩物、血浆蛋 白制剂、免疫球蛋白制剂、纤维蛋白原制剂、因子XIII制剂、凝血酶 制剂、因子VIII制剂、von Willebrand因子制剂、蛋白C制剂或者活 化的蛋白C制剂。按照本发明的某些方面和实施方案的样品也包括， 但不限于药物组合物、治疗剂组合物、化妆品组合物以及产品、食物 或者食品、或者营养滋补组合物。食品样品的例子包括，但不限于明 胶、果冻、奶、乳制品、胶原或者婴儿配方食品。
按照本发明的某些方面和优选的实施方案，样品也包括含有不同 种蛋白的蛋白溶液，包括但不限于，人或者动物血清白蛋白。例如， 样品包括但不限于，含有人血清白蛋白的治疗剂产品；人或者动物的 血清白蛋白制剂；或者含有人或者动物血清白蛋白作为稳定剂的制剂。 按照本发明的某些优选的实施方案，样品也可以含有浓度高达大约 50％(w/v)的人或者动物的血清白蛋白，或者浓度从大约1％到大约 50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在本发明的优选实施 方案中，本发明出人意料地并有利地可以从具有高浓度蛋白的样品或 在其中去除、分离或者结合朊病毒蛋白，特别地从血液蛋白中，如血 清白蛋白。
环境样品包括但不限于土壤、污水或者水，如来自小溪、河流、 含水土层、井、水处理设备的水或者休养用水。
样品包括但不限于，液体样品、固体样品或者胶质样品。固体样 品可以用液相溶剂、有机溶剂或者临界流体提取得到，并且得到的上 清可以与结合材料相互接触。固体样品的例子包括，但不限于来源于 动物的产品，特别是那些暴露于传播朊病毒蛋白的试剂的样品，如来 源于牛的骨粉、脑组织、角膜组织、排泄物、骨粉、牛肉副产品、羊、 羊副产品、鹿和驼鹿、以及鹿和驼鹿副产品、以及其它动物和来源于 其它动物的副产品。
材料
在此提供的结合材料结合于来源于朊病毒蛋白的肽或者多肽，或 者完整的朊病毒蛋白分子，它们可以用于各种不同的分离程序，包括 但不限于层析，例如但不限于，薄层层析、柱层析以及分批层析；固 相支持物以及膜分离；反应器分离；磁性分离；免疫分离；以及胶体 分离。在一个优选的实施方案中，在如层析柱的柱子中包含结合材料， 加入样品，并且使其通过柱子以便样品中的朊病毒蛋白结合于结合材 料上，并且保留在柱子中。样品中的其它成分通过柱子，并且可以进 行收集。应当认识到在此描述的结合材料的应用并不限于分批层析或 者柱层析。预想了用于结合朊病毒蛋白的结合材料的应用的各种不同 的构造、修饰以及变化，并且这也属于本发明的范围。这样的变化和 修饰包括，但不限于：分批过程，连续过程；移动床层析过程；低压、 中压或高压过程；或者小、中或大规模过程。在可选择的实施方案中， 结合材料可以位于膜上、纤维上、珠子上，注入非机织筛网中，涂覆 纤维，包括在过滤器壳体之中，等等。
无机组分
在第一个实施方案中，结合材料含有无机化合物或者组分，例如 但不限于，铝或者氧化硅。优选地，铝是氧化铝，氧化硅是热解法二 氧化硅。最优选地，无机化合物是Al2O3；或者SiO2。这些结合材料 可以以不同的形式提供，包括但不限于，珠子或者树脂。结合材料可 以用于很多不同的分离过程，并且可能位于或者加入到层析柱中、膜 中、或者任何合适的分离仪器和工具中，或者可以用于批量过程，或 者在允许形成朊病毒蛋白结合材料和朊病毒蛋白的条件下，使得样品 与材料相接触而用于任何分离过程。含有无机化合物的结合材料可以 包括多个功能团。功能团是亲水性的，如带正电荷、带负电荷、不带 电荷或者中性、疏水性的、两性的或者它们的组合。以下详细说明了 特异的功能团。应该理解到，功能团可以是在无机化合物中固有存在 的，或者通过修饰使得无机化合物包含了功能团。功能团包括有机和 无机功能团。
聚合物组分
在第二个实施方案中，结合材料包括聚合材料或者组分，并且优 选地包括聚合物基质，同时也称为聚合物基质骨架。任选地，一个或 者多个功能团结合于聚合物基质中。在优选的实施方案中，聚合材料 是树脂，优选地是，层析树脂。聚合性聚合物基质骨架优选的是甲基 丙烯酸骨架，正如以下所述，但不限于，市售的TSKTM，和 TOYOPEARLTM或者FRACTOGELTM树脂(Tosoh Bioscience， Montgomeryville，PA)。这些包括，但不限于，带正电的、带负电的、 不带电的、疏水功能团或者它们的组合。特别优选的功能团在以下有 更详细的说明。
结合材料可以是任何形式，或者可以制造、加工成形、在形式上 制成，或者用于任何固体表面的支持物上，包括，但不限于，珠子、 膜、筒、滤器、浸量尺、微量滴定板、试管、固体粉末、浇铸或者挤 压成型模具、筛网、磁珠复合材料、或者任何其它的用如下材料包被 的固体材料，如聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚丙 烯酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、人造丝、尼龙、聚(乙烯基丁酸盐)、 聚偏乙烯双氟化物(PVDF)、硅酮、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、 硝化纤维、以及类似物。可选择地，可以应用形成凝胶的物质，如蛋 白(如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺。形成多个水 相的聚合物也是适合的，如葡聚糖、聚烷撑乙二醇或者表面活性剂， 如磷脂、长链(12-24个碳原子)的烷基铵盐以及类似物。结合材料任 选地分布于这些组分中。
结合材料特别优选地，是颗粒、微粒或者珠子形式。微粒结合材 料优选地具有大小从大约1μm到500μm的范围，更优选地是从大约 20μm到150μm的颗粒或者珠子。
功能团
按照本发明的某些方面和实施方案的朊病毒蛋白结合材料包括功 能团。在此应用的术语“功能团”是指化学基团、亚基、或者亚结构， 它们对分子或者材料赋予化学、物理或者物理化学特征。在此说明的 功能团包括，但不限于，亲水性的功能团，如带正电的、带负电的或 者不带电的或者中性的、或者疏水的功能团。也预想了两性分子或者 多功能性的功能团，并且它们也属于本发明的范围。功能团包括有机 的和无机的功能团。优选的功能团含有胺、苯基或者亚硫酸盐基团。 优选的胺基是伯胺、仲胺、叔胺或者季铵离子，如二甲基氨基乙基 (DMAE)或者三甲基氨基乙基(TMAE)。其它的例证性功能团包括， 但不限于：-CH2-CHOH-CH2NH2；-C6H5；-(CH2)3-CH3； -CH2-CH2-N+H(C2H5)2；-SO2-CH2-CF3；-CH2-CH2-N+H(CH3)2； -CH2-CH2-N+(CH3)3；-SO3 2-。另一些可用的功能团包括磺酰基和2，2，2- 三氟乙烷磺酰基(tresyl)。
尽管并不想要受限于本叙述，但应该想到朊病毒蛋白具有三种不 同的结合区域，它们分别与带正电的功能团、带负电的功能团和疏水 的功能团结合。因此，应用一种或者几种结合材料，每一种包括一个 或者多个类型的功能团，用于增加和/或更加特异地鉴定或去除样品中 的朊病毒蛋白。当应用两个或者更多个结合材料时，样品与两种或者 多种结合材料同时接触，或者一个接一个，或者以任意次序相接触。 因此，结合材料优选地由两种或者更多种结合材料组成，每一种或者 含有带正电的功能团、带负电的功能团、不带电的功能团，或者含有 疏水的功能团。当结合材料是以微粒形式并且采用柱层析时，每一种 不同类型的结合材料可以在同一个柱子中或者分别在不同的柱子中。 在更为优选的实施方案中，应用三种结合材料，一种是具有带正电的 功能团，一种是具有带负电的功能团，一种是具有疏水性的功能团。
正如在此所应用的，术语“带正电的功能团”是指带有净正电荷的 化学成分。正电荷功能团的非限定性例子包括，含有氨基的基团，如 伯胺、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、三甲基氨基乙基和四级氨 基基团。术语“带负电的功能团”在此是指带有净负电荷的化学成分。 术语“不带电荷的功能团”在此是指中性的或者不带电荷的任何化学成 分。带负电荷的功能团的非限定性实例包括含有亚硫酸盐的基团。此 外，术语“疏水功能团”是指对于用水浸湿有抗性的任何基团，包括烷 基、芳香基团、硅氧烷和氟化的基团。疏水功能团的非限定性实例是 含有苯基和丁基的基团。术语“两性的功能团”是指同时疏水和亲水的 基团。
本发明的某些方面和实施方案中，朊病毒结合材料含有带正电荷 的功能团、带负电荷的功能团、和无电荷或中性的功能团、疏水的功 能团或者两者都有。带负电荷的功能团的一个例子是含亚硫酸的基团。 带正电荷的功能团的一个例子是氨基基团。不带电荷的功能团的一个 例子是苯基或丁基基团。疏水功能团的例子是苯基基团或丁基基团。 根据本发明的某些方面和实施方案，使用氨基基团，包括结合材料中 的伯胺、仲胺、叔胺或季铵基团都是对朊病毒结合有独特优势的。然 而，使用不同的基团，这依赖于特定的朊病毒蛋白，样品，以及样品 与结合材料接触的条件都在本发明的范围内。
很多种不同的物质可任选地用于结合材料，如薄层，例如，为了 赋予结合材料不同的期望特征。例如，蛋白包被，例如，明胶可以用 于避免非特异结合并且增强信号的检测或者其它类似的特性。
表面功能化以及间隔基
在优选的实施方案中，结合材料在它们的表面具有不同的功能团。 应当理解到，这些功能团固有地存在于结合材料的表面，或者可以通 过本技术领域熟练技术人员已知的程序加入到结合材料的表面。连接 各种不同的基团或者化合物于不同的表面的技术方法是公知的，并且 这些方法详细地描述于参考文献中。
功能团是用于结合朊病毒蛋白的，按照在此描述的方法，用于连 接另外的功能团，或者用于任何物理、化学或者物理化学特性的任何 修饰，物质的特性，例如但不限于，其离子特性或者疏水性。存在于 优选的结合材料表面的功能团包括，但不限于，羧酸、醛、氨基、氰 基、烯基、羟基、巯基、环氧基及其类似基团。
在优选的实施方案中，功能团可以包括间隔基。间隔基是在也被 称作基质或者支持物的材料和功能团之间提供空间和距离的基团。间 隔基优选地由碳、氮或氧原子组成。一方面，间隔基被用于更好地改 变朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白结合属性。按照某些实施方案， 间隔基的长度可以是多至20个原子，或者多至15个原子，或者5个 到10个原子。间隔基优选地，但不限于由烷基、聚乙二醇(PEG)、 碳水化合物基团、氨基酸、长至20个氨基酸长度的肽或者从1到10 个氨基酸长度的肽或者其混合物组成。最优选地，间隔基含有烷基和 PEG的组合。
市售层析树脂
优选地，结合材料是一种或者多种以下的市售层析树脂： FRACTOGELTM EMD；TOYOPEARLTM Amino、Butyl、Phenyl、或者 AF-Tresyl；或者TSK-GELTM Amino，Phenyl或者DEAE树脂。更加优 选地，结合材料包括，但不限于：FRACTOGELTM EMD TMAE， FRACTOGELTM EMD SO3 2-，FRACTOGELTM EMD DMAE，ToyopearlTM Amino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTM Phenyl，TSK-GELTM DEAE， TOYOPEARLTM Butyl，TOYOPEARLTM Phenyl，氧化铝， TOYOPEARLTM AF-Tresyl，以及硅土树脂。在最优选的实施方案中， 结合材料是TOYOPEARLTM Amino，TSK-GELTM Amino，TSK-GELTM Phenyl或者FRACTOGELTM EMD SO3 2-。已经预想了应用其它市售层 析树脂以及支持物，包括无机支持物，其也属于本发明的范围。
在本发明优选的实施方案中，结合材料包括聚甲基丙烯酸酯，羟 基聚甲基丙烯酸酯，或者AMINO 650TM树脂(Tosoh Biosciences)，以 及氨基，如伯胺、仲胺、或者叔胺。按照优选的实施方案的结合材料 可以进一步包括如结构式O-R-O-CH2-CHOH-CH2的间隔基，其中R的 长度是1-10个碳。结合材料可任选地涂覆到或者图案化施加到固体支 持物上，如珠子、膜或者层析树脂。
结合材料的鉴定
除了以上列出的结合材料外，可以按照如下所述，鉴定另外的结 合材料。筛选结合材料结合朊病毒分析物的能力。在此使用的术语“分 析物”或“多个分析物”是指多种分子，包括，但不局限于，蛋白质、多 糖和它们的任何聚集体或混合物。结合材料用已知含有朊病毒蛋白的 样品孵育，除去未结合的蛋白质，使用常规方法例如对朊病毒蛋白特 异的标记抗体检测结合的蛋白质。分析物已经与其结合的结合材料被 鉴定出是合适的结合材料。没有一抗或二抗的对照组也用于除去非特 异结合的材料。
在优选的实施方案中，被鉴定的结合材料与其结合的朊病毒分析 物是在来源于人或动物的血或脑样品中发现的朊病毒蛋白。更优选地， 分析物是在血或来源于血的产物中发现的。进一步优选地，分析物与 人或动物的TSE或者TSE的诱发因子相关。
使用结合材料除去朊病毒蛋白
结合朊病毒蛋白或者朊病毒蛋白片断的结合材料在多种分析、制 备和诊断应用中有用。在一些实施方案中，结合材料含有固相，或者 固体表面，以珠子或膜的形式存在，可以用于从样品中结合和除去朊 病毒蛋白或肽。结合材料可以接触样品，例如生物液体，在足以导致 形成朊病毒蛋白结合材料复合物的条件下，样品中的朊病毒蛋白结合 到结合材料上。然后结合材料从样品中分离，从而除去与样品的配体 结合的朊病毒蛋白。使用用于结合蛋白的珠子和膜的方法在技术领域 是公知的，例如在Baumbach等人的美国专利U.S.5,834,318和 PCT/US01/11150中描述的。
在本发明的一些实施方案中，基本上所有朊病毒蛋白都可以从样 品中除去。“基本上所有”的意思是朊病毒蛋白的浓度显著降低。换句 话说，把所有样品或部分样品转移到健康患者身上只能带来在公众健 康指导方针下可以接受的低的朊病毒传染的风险。使用单一结合材料 或者多种结合材料，基本上所有朊病毒蛋白可以同时或者连续地从样 品中除去。当使用多种结合材料时，优选地，如以上描述的，使用两 种或者更多种结合材料，每种含有正电荷功能团、负电荷功能团或者 疏水功能团。在更优选的实施方案中，使用两种或多种结合材料，每 种含负电荷功能团或者疏水功能团。样品接连地以任何顺序与两种或 多种结合材料接触。在优选实施方案中，使用三种结合材料，每一种 含有一种正电荷功能团、负电荷功能团和疏水功能团。
在其他的实施方案中，只有特定的朊病毒材料从样品中除去。例 如，只有传染性朊病毒(PrPsc)从样品中除去或者只有非传染性朊病 毒(PrPc)从样品中除去。在此描述的一个重要发现是多种具有不同 朊病毒特异性的结合材料的鉴定。表4所示为几种结合材料和它们对 仓鼠和人，非传染性和传染性朊病毒的特异性。选择性除去人PrPsc 的优选结合材料含有氨基基团，例如包括在ToyopearlTM Amino-650M 或者TSK-GELTM-Amino 750C色谱柱树脂或其功能相当物中的氨基基 团，或者含有苯基基团，例如在TSK-GELTM Phenyl-5PW或功能相当 物中含有的苯基基团。
优选地，结合材料是填充在柱子例如色谱柱中的珠子。然后样品 溶液、匀浆液或悬液或者由于重力或者由于压力通过柱子，例如高压 液相色谱柱子。样品中的朊病毒蛋白将如在此描述的结合到柱子中的 结合材料上。收集通过柱子的样品，除去朊病毒污染或者至少减少朊 病毒物质的水平。
一旦样品通过柱子，洗脱结合的朊病毒蛋白，并且将其收集用于 分析，或者如果需要的话，用于诊断或预示目的。假如期望从结合材 料中除去朊病毒蛋白，柱子的流动相可以首先变为除去弱结合杂质的 缓冲液，从而洗涤柱子。然后通过煮沸或者通过加入含有强去污剂例 如十二烷基肌氨酸钠去垢剂(十二烷基肌氨酸钠，Shelton Scientific-IBI， Shelton，CT)或者十二烷基硫酸钠(SDS)，离液剂例如盐酸胍，或低 pH的试剂例如乙酸，或者通过结合配体的化学修饰例如氨基基团的乙 酰化作用从柱子上除去朊病毒蛋白。
从其中除去朊病毒的生物样品的例子包括，但不局限于，全血、 来源于血液的组合物或组分、血清、脑脊液、尿、唾液、奶、肠液、 眼泪、精液或者人或动物的脑源组分。别的生物样品包括那些含有胶 原或腺体提取物的生物样品。在一个实施方案中，朊病毒通过使用含 有一种或多种在此描述的结合材料的血液透析环从人或动物的血中除 去。在该实施方案中，血液从人或动物中除去，直接注入含有一种或 多种在此描述的结合材料的设备中，其中朊病毒蛋白从血液中除去是 由于它们结合到结合材料上，然后无朊病毒的血液或朊病毒减少的血 液直接导入返回至人或动物体中。
朊病毒蛋白也可以使用在此描述的结合材料从(或者用于动物或 者用于人的消耗的)生物样品例如食品中除去。例如，样品含有来源 于动物的或者从动物获得的动物材料，包括，但不局限于，牛、羊、 猪、马、鼠、仓鼠或者鹿科动物。可替代地，样品材料可以是指人； 牛科；羊科；猪科；马科；鼠科，例如来源于鼠和仓鼠；和来源于鹿 科的材料，例如鹿和驼鹿。朊病毒蛋白可以根据本发明的某些方面和 实施方案所涉及的方法从其中除去的来源于动物的材料包括，但不局 限于明胶、果冻、奶、胶原和婴儿配方食品。朊病毒蛋白根据本发明 的某些方面和实施方案所涉及的方法从其中根据除去的样品也包括， 但不局限于，药品组分、治疗组分、营养添加组分、食品或者化妆品 组分。
根据优选的实施方案，样品是蛋白溶液，含有多种蛋白质，包括， 但不局限于，人或动物的血清白蛋白。例如，样品可以是，但不局限 于，含有人血清白蛋白作为稳定剂的血浆蛋白制剂、免疫球蛋白制剂、 纤维蛋白原制剂、凝血因子XIII制剂、凝血酶制剂、凝血因子VIII制 剂、冯·维勒布兰德凝血因子制剂(von Willebrand factor preparation)、 蛋白质C制剂、激活蛋白C制剂或者前述的任何组合制剂或改变；含有 人血清白蛋白的治疗产品；人或动物血清白蛋白制剂；以及含有人或 动物血清白蛋白作为稳定剂的稀释蛋白制剂。根据优选实施方案，样 品含有人或动物血清白蛋白的浓度高达大约50％(w/v)，或者从大约1％ 到大约50％，或者从大约5％到大约25％。在一个方面，在优选实施方 案中，本发明出乎意料地并且有利地从具有高浓度的蛋白质，特别是 血蛋白，例如血清白蛋白的样品中或在其中除去、分离或结合朊病毒 蛋白。
在此描述的结合材料也用于从环境样品如来源于诸如溪流、河、 蓄水池、井、水处理设备或消遣用水的水中除去朊病毒蛋白。
使用结合材料检测朊病毒
在此描述的结合材料也在检测生物或环境样品中存在朊病毒蛋白 或肽或者量化朊病毒蛋白或肽的方法中使用。在其中检测朊病毒蛋白 的生物样品包括，但不局限于，全血、来源于血液的组合物或组分、 血清、脑脊液、尿液、唾液、奶、肠液、眼泪、精液、来源于脑的组 合物、粪便、或胶原的提取物或匀浆、腺体、组织(例如扁桃体或盲 肠)或器官。定性和定量的检测方法都被预想到，并且都在本发明的 某些方面和实施方案的范围内。
如以上描述的关于朊病毒蛋白的去除，结合材料也用于检测作为 食品的来源于动物的材料中朊病毒蛋白的存在。对于检测目的，术语 “来源于动物的材料”是指以上描述的材料和含有动物部件的材料，例 如肌肉、结缔组织或者器官组织。来源于动物的材料进一步包括，但 不局限于，骨粉、牛肉、牛肉副产品、羊、羊副产品、鹿、鹿副产品、 猪肉、猪肉副产品、香肠、火腿和婴幼儿食品。
在此描述的结合材料也用于检测环境样品，例如那些以上描述的 环境样品和土壤提取物中的朊病毒蛋白。
由于发现多种具有不同朊病毒结合特性的结合材料，所以结合材 料在单一样品中或样品之间区别传染性和非传染性朊病毒的方法中有 用。因此，提供了用于诊断和预测人或动物的朊病毒疾病的方法。朊 病毒疾病包括，但不局限于，可传播的海绵状脑病(TSEs)，例如骚痒 症，该疾病可以影响绵羊和山羊；牛海绵状脑病(BSE)，可以影响牛； 可传播的水貂脑病，猫的海绵状脑病，和长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和 驼鹿的慢性消瘦病(CWD)；苦鲁病，皮层-基底节-脊髓变性症候群 (CJD)，格-施-沙综合征(GSS)，致命性不眠症和变异的皮层-基底节 -脊髓变性症候群(vCJD)，这些疾病都会影响人类。
在一个实施方案中，使样品通过对PrPsc比对PrPc有更高特异性的 结合材料，使用以下描述的方法检测结合的PrPsc朊病毒。然后使相同 的样品通过对PrPc比对PrPsc有更高特异性的结合材料，使用以下描述 的方法检测结合的PrPc。表4提供了几种结合PrPc和PrPsc的结合材料的 特异性。优选地，选择性检测人PrPsc的结合材料含有类似于 TOYOPEARLTM TSK-GELTM-Amino 750C Amino-650M或 TSK-GELTM-Amino 750C化合物中含有的氨基基团，或者含有类似于 TSK-GELTM Phenyl-5PW(所有树脂来自Tosoh Biosciences， Montgomeryville，PA)中含有的苯基。
当使用在此提供的方法检测样品中的朊病毒时，样品与结合材料 在足以造成朊病毒蛋白和结合材料之间形成复合物的条件下接触。然 后用常规方法检测复合物，从而检测样品中朊病毒的存在。例如，结 合材料(第一配体)可以用可检测的标记物进行标记。作为可替代的 例子，复合物可以通过标记第二配体，例如抗体或别的蛋白质，把标 记的第二配体与样品在存在结合材料的条件下进行结合，检测标记了 的第二配体-朊病毒-结合材料复合物进行检测。第二配体可以共价地或 者非共价地结合于朊病毒。已知有多种标记物和结合技术，并且广泛 地在科学和专利文献中被报导。在一个实施方案中，第二配体在生产 的过程中被标记。合适的标记物包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因 子、抑制剂、荧光成分、化学发光组分、磁性颗粒以及类似物。
结合于朊病毒蛋白结合材料的朊病毒蛋白，或者朊病毒蛋白-朊病 毒结合材料复合物的定性和定量的检测方法包括在本发明的某些方面 和实施方案的范围内。形成复合物的朊病毒结合材料可以被填充到或 在制成柱子、膜或过滤器，或者结合到或制成或固定在固体支持物上。 定性和定量地检测结合的朊病毒蛋白，并且随后从朊病毒结合材料上 释放的方法也包括在本发明的某些方面和实施方案的范围内。
检测可以用任何方法进行，包括免疫印迹、Western分析、凝胶移 位分析、放射性或生物发光标记物的示踪法、核磁共振、电子顺磁共 振、停流光谱法、柱色谱法、毛细管电泳或者别的基于大小或电荷， 或两者的变化的分子示踪方法。检测前，第二配体-朊病毒复合物可以 或者可以不与结合材料分离。其它测定分析方法包括，但不局限于， 脂质体免疫测定法(LIAs)，这种方法使用设计用于结合特异分子(如 第二配体)的脂质体，并且释放被包被的试剂或标记物。然后释放的 化学药物根据标准技术进行检测。
非放射性标记物通常用间接的方法加上。一般地，第二配体分子 (如，生物素)共价结合于结合材料(第一配体)上。然后第二配体 结合于第三配体(如，链菌抗生物素)分子，该第三配体分子或者固 有的可检测，或者共价结合于信号系统，如可检测的酶、荧光化合物、 或者化学发光化合物。可以使用多种第二和第三配体。当第二配体具 有天然的第三配体，例如，生物素、甲状腺素和皮质醇，第二配体可 以用于与标记的、天然发生的第三配体结合。可替代地，任何半抗原 或抗原化合物可以与抗体结合。
用于检测结合材料-朊病毒复合物的特定标记物或可检测基团并不 是关键的。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材 料。这样的可检测标记物已经得到了很好的发展，一般地，在这些方 法中使用的任何标记物可以运用于本方法中。所以，标记物可以是任 何可以被分光镜、光化学的、生化的、免疫化学的、电子的、光学的 或者化学的方法检测的组分。有用的标记物包括荧光染料(如，异硫 氰酸荧光素，德克萨斯红，若丹明等等)，放射性标记物(如，3H，125I， 35S，14C，或32P)，酶(如，LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT(氯霉素乙酰 转移酶)，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，以及一般在EIA(酶免疫测 定)或者ELISA(酶联免疫吸附分析)中用作可检测酶的其它酶，和比 色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳， 等等)珠子。标记物可以根据本技术领域公知的方法直接或间接连接 到想要分析的组分上。如以上所示，许多标记物都可以使用，标记物 的选择取决于所需要的灵敏度，化合物偶联的容易性，稳定性要求， 可以获得的设备，和垃圾处理规定。
第二配体也可以直接连接到信号产生化合物上，如，通过与酶或 荧光基团相连。感兴趣的作为标记物的酶首选是水解酶，特别是磷酸 酯酶、酯酶和糖苷酶或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物 包括，但不局限于，萤光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰， 伞形花内酯，等等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢-2，3-二氮杂 萘二酮，如鲁米诺。
本技术领域的普通技术人员公知检测标记物的方法。所以，例如， 在标记物是放射性标记物的情况下，检测方法包括，但不局限于，用 闪烁计数器或照相胶片作放射自显影。当标记物是荧光标记物时，可 以通过用合适波长的光激发荧光，并且检测所得到的荧光来检测，如 通过显微镜、目测，通过照相胶片，通过使用电子探测器如电荷耦合 器件(CCDs)或光电倍增管，以及类似方法。类似地，酶标记物可以 通过提供合适的酶的底物，并且检测得到的反应产物进行检测。最后， 单一比色标记物可以简单地通过观察与标记物相关的颜色进行检测。 所以，在多种浸渍分析中，共轭金通常呈紫色，同时多种共轭珠子呈 珠子的颜色。
本发明的结合材料也可以用于除去或检测从固体样品材料提取到 溶液中的朊病毒蛋白或肽。例如，固体样品可以用含水溶液、有机溶 剂或临界液体提取，得到的上清可以与结合材料接触。固体样品的例 子包括，但不局限于，动物来源的产品，特别是那些暴露于传染朊病 毒的产品，如，来源于牛的骨粉。在一些实施方案中，结合材料可以 用于检测土壤中存在的朊病毒蛋白。其它的固体样品包括，但不局限 于，脑组织、角膜组织、粪便物、骨粉、牛副产品、羊、羊副产品、 鹿和驼鹿、鹿和驼鹿的副产品、以及别的动物或动物来源的产品。
可替代地，朊病毒或朊病毒结合材料复合物可以用蛋白酶K(PK) 处理。PrPc对PK高度敏感，同时PrPsc被部分消化形成PrPres。PrPres 分子本身对蛋白水解作用具有高度抗性，所以，PK处理将消化PrPc， 并且将把PK敏感的PrPsc转化为PrPres。除去PK后，PrPres可以变性， 被抗体如3F4检测出来。
在另一个实施方案中，根据本发明，结合材料可以用于把PrPc中 的PrPsc选择浓缩。
结合材料用于朊病毒定量
结合材料-朊病毒复合物或可替代地，朊病毒或结合材料-朊病毒复 合物的抗体可以通过本技术领域的普通技术人员已知的多种方法中的 任何一种方法进行检测和定量。这些方法包括但不局限于，分析生物 化学方法如分光光度法、放射照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相 色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、高扩散色谱法(hyperdiffusion chromatography)和类似方法，以及多种免疫方法，如但不局限于，液 体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫分析 (RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析和类似方法。
降低非特异性结合
当使用固体支持物作为分析组分来检测样品中的朊病毒蛋白时， 本技术领域的普通技术人员应该意识到，通常期望降低对固体支持物 的非特异结合。本技术领域的普通技术人员熟悉降低这样的非特异结 合的方法。一般地，这涉及用蛋白质组分把固体支持物进行包被。特 别地，蛋白质组分，如牛和人的血清白蛋白(BSA)，和明胶可以被广 泛使用。
本发明将通过具体的实施例进行更详细的描述。以下实施例用于 举例说明，并非以任何方式对发明进行限制或限定。
实施例1
朊病毒结合材料的确认
采用正常的仓鼠脑匀浆液，如以下描述的，使用NBT/BCIP发色团 (氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸-p-甲苯胺盐)，运用朊病毒珠上结 合实验，检验80种聚合物或无机粒子。结合结果见表1，其中“-”表示 没有结合，“+”表示阳性结合。粒子等级中的“+”越多，观察到的结合 就越强。具有至少“++”的12种粒子需要进一步评估。表2总结了12种 粒子结合正常仓鼠朊病毒蛋白的能力。越高的分值表示朊病毒结合的 量有所增加。
表1
筛选用于朊病毒蛋白结合的聚合材料或无机粒子 参考 序号 名称 制造商 结合 结果 1 ToyopearlTM Amino-650M Tosoh Bioscience (Montgomeryville，PA) +++ 1’ Acetylated Amino-650M 由North Carolina State University(NCSU)进行乙酰化， 使用ToyopearlTM Amino 650M - 2 TSK-GELTM Amino 750C Tosoh Bioscience +++ 3 ToyopearlTM Epoxy 700EC Tosoh Bioscience + 4 ToyopearlTM AF-Carboxy-650M Tosoh Bioscience - 5 ToyopearlTM AF-Heparin-650M Tosoh Bioscience + 6 AmberchromTM CG-71m Tosoh Bioscience - 7 AmberchromTM CG-300m Tosoh Bioscience - 8 ToyopearlTM HW-40C Tosoh Bioscience - 9 ToyopearlTM HW-50F Tosoh Bioscience - 10 ToyopearlTM AF-Chelate-650M Tosoh Bioscience - 11 ToyopearlTM DEAE-650M Tosoh Bioscience +
12 ToyopearlTM DEAE-650C Tosoh Bioscience - 13 ToyopearlTM Super Q-650M Tosoh Bioscience + 14 ToyopearlTM Super Q-650C Tosoh Bioscience + 15 ToyopearlTM QAE-550C Tosoh Bioscience - 16 ToyopearlTM CM-650M Tosoh Bioscience - 16’ ToyopearlTM CM-650C Tosoh Bioscience - 17 ToyopearlTM SP-650M Tosoh Bioscience - 18 ToyopearlTM SP-550C Tosoh Bioscience - 19 TSK-GELTM Ether-5PW Tosoh Bioscience - 20 TSK-GELTM Phenyl-5PW Tosoh Bioscience +++ 21 ToyopearlTM Butyl-650C Tosoh Bioscience ++ 22 ToyopearlTM Phenyl-650C Tosoh Bioscience ++ 23 ToyopearlTM Hexyl-650C Tosoh Bioscience - 24 TSK-GELTM DEAE-5PW Tosoh Bioscience +++ 25 TSK-GELTM Q-5PW Tosoh Bioscience + 26 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M Tosoh Bioscience ++ 27 AmberliteTM XAD-7HP Supelco (Bellefonte，PA) - 28 AmberliteTM XAD-1180 Supelco - 29 Diaion/sepabeadsTM HP 20SS Supelco - 30 Diaion/sepabeadsTM SP 207 Supelco + 31 MCI Gel CHP 20P Supelco - 32 Silica gel grade 7754 Supelco - 33 DavisilTM Silica gel grade 634 Supelco - 34 DavisilTM Silica gel grade 643 Supelco -
35 Blue rayon trisulfonated (syn：Copper Phthalocyamine) Supelco 没有 测试。 是blue rayon 纤维。 36 AmberliteTM IRC-718 Supelco - 37 DiaionTM CR 20 Supelco - 38 AmberliteTM IRA-958 Supelco - 39 DowexTM MSA-1 Supelco - 40 AmberliteTM IRA-910 Supelco + 41 DiaionTM PA418 Supelco - 42 FractogelTM EMD DMAE 650(S) E.Merck (Gibbstown，NJ) ++++ 43 FractogelTM EMD Phenyl 1 650(S) E.Merck - 44 FractogelTM EMD TMAE 650(S) E.Merck +++++ 45 FractogelTM EMD Propyl 650(S) E.Merck - 46 FractogelTM EMD Amino(M) E.Merck - 47 FractogelTM EMD SO3 2-650(S) E.Merck ++ 48 FractogelTM EMD COO-650(S) E.Merck + 49 PMMA Poly(methylmethacrylate) Bangs Laboratories (Fishers，IN) - 50 Aluminum oxide-100+325 Aldrich (Milwaukee，WI) ++ 51 Polyethylene Aldrich - 52 Aluminum oxide-100+400 Aldrich +
53 Poly(styrene/maleic anhydride) Sigma Chemical Co. (St.Louis，MO) - 54 Aminomethylpolystyrene resin Aldrich - 55 Aluminum oxide，activated Aldrich - 56 Silica，fumed Aldrich ++ 57 PVDF SOLVAY 1008/1001 Solvay (Aubum Hills，MI) ++++ (非特 异性)* 58 PVDF SOLVAY 1015/1001 Solvay +++ (非特 异性)* 59 Silica gel for column，35-70um Acros (Pittsburgh，PA) - 60 Silica gel 60-200mesh Acros - 61 PolyStyrene，0.93um Bangs 没有 实验， 乳液 62 Bangs Lab Silica，0.20um Bangs 没有 实验， 乳液 63 Bangs Lab Silica，0.97um Bangs 没有 实验， 乳液 64 1，2DAP1-Epoxy 700EC Aldrich - 65 1，3DAP-Epoxy 700EC Aldrich - 66 1，4DAB2-Epoxy 700EC Aldrich -
67 L-Lysine-Epoxy 700EC Aldrich + 68 TETA3-Epoxy 700EC Aldrich + 69 Prometic CG-1083 Prometic BioSciences (Cambridge，UK) ++++ (非特 异性)* 70 Prometic CG-1085 Prometic BioSciences (非特 异性)* 71 Prometic CG-1086 Prometic BioSciences + (非特 异性)* 72 Prometic CG-1082(紫色) Prometic BioSciences + (非特 异性)* 73 Prometic CG-1084(紫色) Prometic BioSciences ++ (非特 异性)* 74 Prometic CG-1087(紫色) Prometic BioSciences + (非特 异性)* 75 Prometic CG-1014(紫色) Prometic BioSciences ++ (非特 异性)* 78 Prometic CG-1107(紫色) Prometic BioSciences ++++ (非特 异性)*
79 Prometic CG-1108(紫色) Prometic BioSciences ++++ (非特 异性)* 76 Ethylenediamine， polymer-bound Aldrich - 77 Pharmacia Source 30Q Pharmacia (Piscataway，NJ) + 80 Clear-Base Resin(HCl) Peptide International (Louisville，KY) -
1DAP：二氨基丙烷
2DAB：二氨基丁烷
3TETA：三亚乙基四胺
4AmberchomTM是Rohm and Haas Company(Philadelphia，PA)的 注册商标
*Nonspecific：指没有抗体3F4的阴性对照，具有与用抗体3F4检 测的信号相同的信号。
表2
聚合结合材料结合一般仓鼠朊病毒(HaPrPc)的能力 聚合物化合物 基本树脂 制造商 HaPrPc FractogelTM EMD TMAE 650(S) PMMA** E.Merck 5 FractogelTM EMD SO3 2- 650(S) PMMA E.Merck 2 FractogelTM EMD DMAE 650(S) PMMA E.Merck 4
ToyopearlTM Amino-650M PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM Amino 750C PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM Phenyl-5PW PMMA Tosoh Bioscience 3 TSK-GELTM DEAE-5PW PMMA Tosoh Bioscience 3 ToyopearlTM Butyl-650C PMMA Tosoh Bioscience 2 ToyopearlTM Phenyl-650C PMMA Tosoh Bioscience 2 Aluminum oxide-100+325 Al2O3 Aldrich 2 Aldrich silica，fumed SiO2 Aldrich 2 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M PMMA Tosoh Bioscience 2
**PMMA：聚合的甲基丙烯酸酯
如下进行使用NBT/BCIP的朊病毒珠上结合实验(prion binding on-beads test)。从10％的仑鼠脑组织匀浆中获得正常PrP，样品于室 温在搅拌器中溶于0.5％十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)(200μL的10％ 到4ml脑组织)中30分钟。样品以14,000rpm离心5分钟。弃上清， 并且将其用所需的培养基稀释。将96孔微量滴定平板(Cat.No.3075， Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore MultiScreen-DV板 (Cat.No.MADV N6510，Millipore公司，Bedford，MA)，首先用购自 Pierce(Rockford，IL)的1％(W/V)酪蛋白以200μL/孔于65℃封闭1 小时。10毫克(10mg)干珠子在1ml的10mM PBS pH 7.4中溶胀， 洗涤2次。倒空微量滴定板，每孔加入20-30μl溶涨珠子的悬液。悬 液沉降，弃去多余的水分。
将正常仑鼠脑匀浆物予以稀释，是以1∶10稀释在5％的人血清白蛋 白(Alpha Therapeutic Corp.Los Angeles，CA)中，其中5％的人血清白 蛋白已经在60℃下被热处理10小时。每孔加入150μL体积的悬液， 与珠子室温孵育1.5小时。弃去未结合的蛋白溶液，往每孔中加入100 μL的、以1∶4000稀释在1％酪蛋白中的3F4单克隆抗体(Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)。对照孔含有100μl的1％酪蛋白。珠 子用3F4孵育，于4℃轻微摇晃过夜。
然后珠子用10mM pH 7.4的PBS+10μM CuCl2洗涤2次。将第二 抗体，即结合了碱性磷酸酶的抗鼠IgG偶联物(#A3688，Sigma，St. Louis，MO)，以1∶1000在1％酪蛋白中稀释，并以100μl/孔的体积加入 孔中。样品室温振荡孵育1小时。将所有的珠子转移到Millipore (Bedford，MA)MultiScreen-DV板进行洗涤。样品用pH 7.4的 PBS+Cu2++Tween 20(0.05％)洗涤3次，用PBS+Cu2+洗涤3次，用 1M NaCl洗涤2次，用pH 9.5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2 次。
将1步骤NBT/BCIP底物混匀，将100μl直接加入每一孔中，直 到得到理想的显色(亮紫)。一般孵育5-15分钟。滤纸(#1703932， BioRad，Hercules，CA)裁成合适形状，用蒸馏水湿润。珠子悬液真空 下加入到S & S Minifold I Dot-Blot系统(Schleicher-Schuell Bioscience， Keene，NH)的印迹孔中。孔用水漂洗，将结果扫描到计算机中。
实施例2
朊病毒结合材料的确定
使用两种不同的检测系统，用仑鼠脑匀浆物以成批模式进行朊病 毒结合材料的鉴定。首先，用靶材料孵育后对珠子进行染色检测朊病 毒结合到材料的量。第二种方法检测流出液中含有的未结合成分中存 在的朊病毒量，并且用SDS-PAGE和western印迹洗涤样品。每种方 法的详细描述如下。
如以下表3所示，ToyopearlTM Amino-650M，TSK-GELTM Amino 750C和TSK-GELTM Phenyl-5PW提供了仑鼠脑PrPc的最特异的结合。
表3
第二次筛选的结果 聚合物颗粒 通过使用 NBT/BCIP的珠上 实验评价结合作用 通过用 ECL-plus的 Western印迹 评价结合作用 ToyopearlTM Amino-650M +++ +++ TSK-GELTM Amino 750C +++ +++ TSK-GELTM Phenyl-5PW +++ ++++ ToyopearlTM Butyl-650C ++ + ToyopearlTM Phenyl-650C ++ + TSK-GELTM DEAE-5PW +++ 5+(非特异性) ToyopearlTM AF-Tresyl 650M ++ - FractogelTM EMD DMAE 650(S) ++++ 5+(非特异性) FractogelTM EMD TMAE 650(S) +++++ 5+(非特异性) FractogelTM EMD SO3 2-650(S) ++ +++ Aluminum oxide-100+325 ++ + Aldrich silica，fumed ++ 5+(非特异性)
对于珠上检测方法，将96孔微粒滴定板(Cat.no.3075，Falcon， Becton Dickinson，Franklin Lanes，NJ)和Millipore Multiscreen-DV板 (Cat.no.MADV N6510，Millipore，Bedford，MA)用1％(w/v)酪蛋 白以200μL/孔于65℃封闭1小时。将每份10毫克的每种聚合物浸泡 于1mL的pH 7.4的10mM PBS中，洗涤2次。排空96孔板，每孔加 入20-30μL的树脂悬液。树脂沉降，弃去多余溶液。往树脂中加入150 μl以1∶10溶于5％人血清白蛋白中的正常仓鼠脑匀浆溶液。混合物室 温孵育1.5小时。排空孔，往每孔中加入处于1％酪蛋白中的100μl 3F4 抗体(1∶4000)，冰箱中轻微振荡过夜孵育。然后珠子用100mM pH 7.4 的PBS+10μM CuCl2洗涤2次，然后以100μl/孔加入结合了碱性磷酸 酶的第二抗体(Cat no.A3688，Sigma，St.Louis，MO)，轻微振荡，室温 孵育1小时。
排空所有的孔，将珠子转移到Multi-Screen板中，在该板上用pH 7.4的10mM PBS+10μM CuCl2+0.05％Tween 20将珠子洗涤3次， 然后用10mM PBS+10μM CuCl2洗涤，用1M NaCl洗涤2次，用pH 9. 5的50mM Tris-HCl+5mM MgCl2洗涤2次。
然后已经洗涤的珠子与100μL NBT/BCIP底物反应5-15分钟以显 色。使用S&S Minifold I Dot-Blot系统将珠子转移到滤纸上，进行所形 成颜色的测定。
对于未结合部分的测定，100μL的每种珠子样品预先用pH 7.4的 10mM PBS于4℃过夜湿润，置于微量离心管中。用PBS至少洗涤4 次后，转移珠子至Ultrafree-MC 0.45μm过滤单元(UFC30HVNB， Millipore，Bedford，MA)中，用PBS再次洗涤。用0.5％十二烷基肌氨 酸钠处理10％的仓鼠脑匀浆液(HBH)，用PBS以1∶10和1∶20稀释。 将其往每种珠子样品中加入200μl，振荡孵育8分钟，然后以10,000rpm 离心2分钟，回收未结合部分。将26-μL的流出液置于0.7mL微量离 心管中，-20℃储存，进行Western印迹分析。
进行Western印迹前解冻样品，加入10μL样品缓冲液(NuPAGE， SDS样品缓冲液，NP0007，Invitrogen，Carlsbad，CA)和4μL还原剂 (NuPAGE样品还原剂，NP0004，Invitrogen)(DTT，1M，溶于H2O中)。 溶液90-100℃孵育10分钟。将样品加到15孔的NuPAGE 4-12％Bis-Tris 凝胶(NP0323，Invitrogen)上。对于每孔凝胶，western印迹分析使用 17μL样品，蛋白质染色凝胶使用14μL样品。分子量标记物的体积 (MultiMark Multi-Colored Standard，LC5725，Invitrogen)是5μL。 Western印迹使用PVDF膜，1％酪蛋白作为封闭剂，1∶10,000的3F4 作为一抗，1∶3000的连接有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠抗体作 为二抗，ECL+作为底物。胶片曝光6分钟。
结合到结合材料上的、具有高PrP的样品在流出物中不产生信号， 值为“5+”。没有结合的样品的值为“-”。其它样品的值介于这两个值之 间。
实施例3
确定朊病毒蛋白结合特异性
一般来说，将由不同结合材料组成的潮湿珠子定量地置于单独的 一次性使用的柱子中。含有玻璃材料的柱子小得只能保留珠子，但大 到足以让活化溶液(challenge solution)流过。活化溶液是含有朊病毒 蛋白的脑匀浆液，溶于十二烷基肌氨酸钠(Sigma)中；掺入到红细胞 浓缩共混物中。更具体而言，活化溶液含有TSE传染性人脑匀浆液、 传染性仓鼠脑匀浆液、非传染性人脑匀浆液或者非传染性仓鼠脑匀浆 液。允许活化溶液在确定的时间期间内通过靶结合材料，同时收集流 出液。然后冲洗珠子，从装珠子的柱子定量转移到收集瓶中，这样为 了随后确定特异朊病毒蛋白结合和非特异的蛋白结合的处理，从收集 瓶中除去已知量的珠子。储存流出液和剩余的反应珠子，以便以后可 能的分析。
使用以下描述更为详细的方法，确定七种朊病毒蛋白结合材料的 结合活性，如表4中描述。结合材料以结合正常的或者传染性人或者 仓鼠朊病毒蛋白的结合能力来分级(表现出结合最大量朊病毒蛋白的 结合材料的级别是1)。例如，FractogelTM EMD TMAE 650(S)结合材 料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-CH2-CH2-N+(CH3)3)结合最大量的 仓鼠和人传染性朊病毒蛋白(PrPsc)，FractogelTM EMD SO3 2-650(S) 结合材料(具有甲基丙烯酸骨架和功能团-SO3 2-)结合最大量的仓鼠和 人正常朊病毒蛋白。这些数量是通过如下方法确定的，将结合的蛋白 从朊病毒结合材料上释放下来，电泳分离释放的蛋白质，使用Western 印迹分析从结合材料上释放而来的蛋白质的免疫活性，采用朊病毒特 异的单克隆抗体进行。抗体对朊病毒蛋白的结合通过化学发光检测。 通过比较胶片上的电泳条带的暗度进行定量(指示与已经结合到结合 材料上的朊病毒蛋白相结合的抗体)，对照条带是2ng，10ng和50ng 鼠IgG，从而对结合材料确定分值。通过互相直接地比较样品带，确定 具有相同分数的结合材料的等级。
表4
11种聚合化合物的分级
二次筛选后，基于它们与正常仓鼠朊病毒(HaPrPc)，正常人朊病 毒(HuPrPc)，传染性仓鼠朊病毒(HaPrPsc)和传染性人朊病毒(HuPrPsc) 的结合能力进行分级。 聚合物化合物 和功能团 基础 树脂 制造商 HaPr Pc HuP rPc HaPr Psc HuP rPsc FractogelTM EMD TMAE 650(S) -CH2-CH2-N+(CH3)3 PMMA E.Merck 2 2 1 1 FractogelTM EMD PMMA E.Merck 1 1 10 9
SO3 2-650(S)-SO3 2- FractogelTM EMD DMAE 650(S) -CH2-CH2-N+H(CH3)2 PMMA E.Merck 3 3 2 7 ToyopearlTM Amino-650M -CH2-CHOH-CH2NH2 PMMA Tosoh Bioscience 6 10 4 4 TSK-GELTM Amino 750C -CH2-CHOH-CH2NH2 PMMA Tosoh Bioscience 5 9 3 3 TSK-GELTM Phenyl-5PW-C6H5 PMMA Tosoh Bioscience 7 5 5 2 TSK-GELTM DEAE-5PW -CH2-CH2-N+H(C2H5)2 PMMA Tosoh Bioscience 4 7 6 8 ToyopearlTM Butyl-650C -(CH2)3-CH3 PMMA Tosoh Bioscience 8 4 8 5 ToyopearlTM Phenyl-650C C6H5 PMMA Tosoh Bioscience 9 6 9 6 Aluminum oxide-100+325 Al2O3 Aldrich 10 8 7 10 ToyopearlTM AF-Tresyl 650M SO2-CH2-CF3 PMMA Tosoh Bioscience 11 11 11 11
制备无水珠子
通过把珠子用水配制的20％甲醇溶液湿润，大量制备无水珠子。 使用前将珠子静置至少24小时。当无水珠子的最初量在0.5g到2.5g 之间时，预湿的珠子浆液转移到50ml塑料锥形管中。弃去多余液体， 加入25ml 20％的甲醇。然后样品轻微振荡或者颠倒30秒。当最初的 珠子重量超出前述范围时，调节甲醇的体积，少于0.5g的树脂使用10 ml甲醇，2.5到4.0g树脂使用40ml甲醇。珠子通过重力沉降大约12-15 分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心地提取并且弃去上清溶 液(包括细碎物)。将甲醇洗涤一次以上，然后加入20％甲醇，成为 1∶1(v/v)的珠子浆液。珠子于4℃储存。
制备珠子浆液
转移440微升(440μl)珠子浆液至15ml塑料锥形管中(每个柱 子使用220μl湿珠子)，加入10ml工作缓冲液(20mM柠檬酸缓冲 液/140mM NaCl，pH 7.0)。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重 力沉降大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心吸除并 且弃去上清溶液(包括细碎物)。将工作缓冲液重复冲洗2次以上， 加入足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒 30秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓 冲液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
制备预先水合的珠子
AminoToyopearlTM和别的珠子以20％乙醇中的湿浆液的形式获得， 不需要进行额外的水合步骤。然而，要如下平衡至工作缓冲液。生产 商估计商品化浆液含有体积百分比为大约72％的树脂，并且每柱子使 用300μL浆液。转移珠子至15毫升塑料管(例如Falcon)中，加入 10ml工作缓冲液。样品轻微振荡或者颠倒30秒。珠子通过重力沉降 大约12-15分钟，或者直到大部分全珠沉降到管底。小心提取并且弃去 上清溶液(包括细碎物质)。将工作缓冲液重复冲洗至少2次，加入 足量的工作缓冲液，使体积比为1∶1。样品再次轻微振荡或者颠倒30 秒，沉降，室温静置过夜。通过加入必要的工作缓冲液保持工作缓冲 液的体积为1∶1，将水合珠子于4℃保持在缓冲液中，直到使用。
红细胞的制备和处理
将一袋110ml的AdsolTM(Baxter，Bloomington，IN)加到大约250ml 一袋的含有大约250-300ml RBC和残留白细胞和血小板的红细胞浓缩 液(RBC)中。得到的血细胞比容(红细胞(RBC)体积/总体积)大约 为50-55％。AdsolTM：CPD(柠檬酸磷酸右旋糖)和RBCs颠倒混合。然 后将来自收集的混合物室温下八小时内通过Pall leukoreduction滤器 (Pall Corporation，East Hills，NY)，置于新的袋中。此过程减少了RBC 混合物中白细胞的量。过滤掉白细胞的RBC于4℃在新袋中可以保存长 达42天。此制剂中缓冲液混合物的最终组分是30.6％Adsol/8.5％CPD v∶v。使用前，检测RBC制剂的溶血百分率，通过测量离心后的上清在 415nm处的吸光度来进行。相对于制备后立即获得的溶血值，溶血值的 增量大于2％的RBC制剂不被使用。
脑匀浆液的制备和处理
正常的仓鼠脑匀浆液(10％w/v)由马里兰大学(the University of Maryland)的Dr.Robert Rohwer和同事根据他们建立的方法制备。以1.8 ml体积制备等份溶液，于-80℃冷冻保存或者液氮保存，直到使用。可 选择地，匀浆液融化一次进行分装。每次实验每柱子使用60微升的脑 匀浆液。
脑匀浆液样品融化后，样品置于湿冰上。然后向每60μl融化的脑 匀浆液的等份溶液中加入6.6μl的5％十二烷基肌氨酸钠试剂(将0.5g 十二烷基肌氨酸钠溶于9.5ml的CPD∶Adsol缓冲液中(8.5％CPD，30.6％ Adsol和60.9％PBS v∶v∶v))。样品轻微地在湿冰上旋涡振荡30分钟，进 行变性。然后样品在微型离心机中4℃，14,000rpm离心5分钟。转移上 清至新管中，弃去沉淀物。然后上清置于湿冰上，最长1小时。得到的 上清是含有0.5％十二烷基肌氨酸钠试剂的10％脑匀浆液。将得到的分 装物于制备后1小时内加到柱子上，处理过程中置于湿冰上。
水合珠子定量转移到柱子上
往每个空柱子上加入750μL0.1％TweenTM 20溶液。然后往每个柱 子上加入1毫升20％的乙醇(v∶v)，使其在重力下流过。再往每柱子上 加入2×1ml除气的去离子水，以洗掉乙醇溶液，除去任何捕获在玻璃料 中的空气。使用定量吸移管管理器，把400μl的水合珠子悬液转移到柱 子中。多余的工作缓冲液依靠重力流过经转移的湿珠子，然后在导入 样品前，用1ml工作缓冲液将柱子洗涤3次。
制备RBC共混物(活化溶液)
用注射器和18号(或者更大号的)针头，把540μl的RBC/柱子置 于聚丙烯圆锥管中。为了把AdsolTM层分离于上部，将管子以3,000rpm 离心10分钟。然后往上部AdsolTM层上加上60μl的10％处理过的脑匀浆 液，从而减少RBC制剂和高浓度掺入材料，即脑匀浆液和十二烷基肌 氨酸钠去垢剂之间的直接接触。共混物颠倒混合，置于湿冰上，在制 备的4小时内使用。在柱分析使用前，使混合物恢复到室温，保持10分 钟。
将活化溶液加到柱子中
当所有的柱子都填充了水合珠子后，混合活化溶液，将其非常仔 细地以0.5ml/柱的体积分层加到珠子上。使溶液靠重力通过柱子。总的 流经时间在大约5到20分钟之间。
将最初0.5ml的流出活化溶液收集入2ml冷冻管中。往每个柱中再加 入0.5ml工作缓冲液，流出液再收集入相同的冷冻管中。将装有珠子的 柱子用1毫升工作缓冲液洗涤5次，其中珠子通过移液操作连续地重悬， 以确保彻底和均匀的洗涤。然后，按照如下所述将珠子从柱中回收。
定量回收结合的珠子
往每柱中加入0.75ml工作缓冲液。用移液管冲洗柱子以悬浮珠子， 将悬液快速转移到刻度管中。珠子悬液在管中沉降，尽量除去上清而 不扰动珠子层。然后上清加回到相同的柱子中，将以上步骤重复2次， 以便把柱子中剩下的任何珠子转移到管中。然后允许珠子通过重力沉 降10分钟，记录带刻度的管子中的珠子层体积。
制备用于分析的结合珠子
首先，将每管中的工作缓冲液水平调节到1ml，然后通过轻微旋涡 管子制得珠子悬液。使用移液管移出500μl的悬液，转移到小的 EppendorfTM(Brinkmann instruments，Westbury，NY)微量离心管中。让 悬液沉降10分钟，将沉降的珠子的体积调节到100μL。然后离心转移后 的珠子，除去上清。立即制备珠子等份溶液，进行电泳和western印迹 分析。
无水珠子与水合珠子的定量比较
以沉降珠子的体积为基础计算干重，膨胀率如下：
珠子干重＝沉降体积/膨胀率
膨胀率＝水合珠子体积(μL)/干重(mg)
对于ToyopearlTM，42.5mg干重＝在20％甲醇中的200μL湿珠子
膨胀率(在20％甲醇中)＝200/42.5＝4.71
实施例4
Western印迹分析
以下的Western印迹程序，设计用于评估来自掺入红细胞浓缩液 (RBC)的脑匀浆液溶液中回收或去掉传染性或非传染性朊病毒蛋白。 这些程序用于从以上实施例3中描述的柱子朊病毒结合分析中获得的 样品，包括暴露于活化溶液的珠子样品和流过柱子的活化溶液样品， 并且收集这些样品。
一般地，靶向结合材料的珠子与含有朊病毒的溶液反应，样品来 源于这样的珠子的柱子结合分析，或者来源于这些反应的流出液。然 后通过Western印迹来分析制备的样品中朊病毒蛋白质的存在。使用对 朊病毒蛋白特异的鼠单克隆抗体作为一抗进行朊病毒蛋白的荧光检 测。然后用结合有碱性磷酸酶的二抗检测这些朊病毒的免疫复合物， 用X光片对化学发光反应进行显影。
样品制剂的凝胶电泳
在实施例3中描述的柱子分析之后，优选地立即进行以下步骤。
对每个制备的柱子珠子样品，通过涡流把100μL的悬浮好的珠子与 100μL的Invitrogen 2X样品缓冲液进行混合。同样通过把柱分析中得到 的未使用的脑匀浆液(正常的人脑，散发性CJD脑，正常的仓鼠脑，羊 骚痒症仓鼠脑，等等)与Invitrogen 2X样品缓冲液混合制备对照组。更 特异地，往40μL的2X样品缓冲液中加入20μL脑匀浆液。
同样如下制备鼠IgG对照。通过把20μl的2.5mg/ml的鼠IgG与480μl 的PBS混合，制备每泳道50ng的标准物，相当于100μl/ml。把25的这种 混合物加到475的2X Invitrogen样品缓冲液中，得到5ng/ml溶液。对于 高浓度的直接上样凝胶标准物，以每泳道10μl使用该标准物，给出50ng/ 泳道。将5微升100μg/mL的鼠IgG溶液与495μl 2X Invitrogen还原样品缓 冲液混合。这产生了1ng/μL的鼠IgG；每泳道使用10μl这种混合物，得 到10ng/泳道(高浓度直接上样凝胶标准物)(10ng/泳道)。也通过稀释 前述步骤的中浓度标准物制备鼠IgG低浓度直接上样凝胶标准物(2ng/ 泳道)，前述步骤的中浓度标准物即通过将溶于上样缓冲液的50μL的 1ng/μL鼠IgG与200μL的Invitrogen 2X样品缓冲液混合来得到(产生 0.2ng/μL)。每孔上样10μL即2ng/泳道。也可以如生产商指导的制备 Invitrogen SeeBlue Plus2 Pre-Stained分子量标准物。
所有样品在Invitrogen缓冲液中90℃加热10分钟。然后短暂离心样 品，-20℃存储过夜。第二天上午在将样品应用于SDS-PAGE凝胶前重 复加热程序。
免疫反应程序
当12％Bis Tris NuPAGE SDS-PAGE凝胶用如以上描述的样品上样 后，凝胶以恒压200V电泳45分钟，进行电印迹转移程序。将蛋白质转 移到其上的膜置于Fisher方形皿中，在摇床上用25ml Western Breeze封 闭剂(12.5ml水，5ml稀释剂A和7.5ml稀释剂B)室温孵育1小时。弃去 封闭溶液。
膜在以1∶5,000稀释于20ml新鲜的Western Breeze一抗稀释液(14ml 水，4ml稀释液A，2ml稀释液B)中的Signet 3F4一抗溶液中孵育。一抗预 先以1∶1稀释于甘油中，所以，工作稀释度是1∶10,000。膜在冷冻条件下 在摇床上孵育。
弃去一抗溶液，将膜洗涤3次，每次用20ml Western BreezeTM抗体 洗涤溶液(将1.25ml抗体洗涤溶液(16×)溶于18.75ml水中)于室温在摇 床上洗涤10分钟。然后膜用AP3(KPL，Gaithersburg，MD)二抗孵育， 二抗是以1∶10,000稀释于20ml Western Breeze一抗稀释液中得到的溶 液，室温在摇床上孵育60分钟。弃去二抗溶液，用如上描述的Western Breeze Antibody Wash洗涤膜。然后用20ml pH 9.8的20mM Tris-HCl， 1mM MgCl2室温将膜洗涤10分钟。
化学发光产生程序
转移膜至干燥的托盘中，浸泡于5ml Western Breeze预混的化学发 光底物(CDP StarTM substrate，Applied Biosystems，Foster City，CA)中轻 轻搅动5分钟。用纸巾轻轻吸干膜，然后置于保护纸中。接着将膜从保 护纸中转移到暗盒中(没有增感屏)，室温保持30分钟，室温暴露于放 射显影5分钟。
实施例5
从人血浆中结合内源PrPc
为了表现朊病毒结合树脂从人血浆中除去PrPc的能力，进行以下 实验，所述人血浆是内源的、未穿入PrPc的人血浆。
对于通过朊病毒结合材料结合内源PrPc的作用，使用的是未稀释 的、新鲜的、汇合的人血浆。冷冻混合的人血浆37℃解冻，通过0.45μm 滤器过滤，加入十二烷基肌氨酸钠至终浓度为0.05％。如本说明书中其 它地方描述的，进行血浆与柱子的结合，以及朊病毒的检测。
从人血浆中结合内源PrPc的实验结果在图1中描述。组A描述在没 有十二烷基肌氨酸钠时，珠子洗脱液中朊病毒蛋白的Western印迹检测 结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度 鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的人血小板；第6-7道-树 脂a；第8-9道-树脂b；第10-11道-Amino 650-M；第12-13道-乙酰化 Amino 650)。组B描述组A中样品的未结合部分的Western印迹检测结果 (第1道-分子量标记物；第2道-低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG； 第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的仓鼠脑(nHB)；第6道-正常的人 血小板，第7-8道-树脂a；第9-10道-树脂b；第11-12道-Amino 650-M； 第13-14道-乙酰化Amino 650)。组C表示在存在十二烷基肌氨酸钠时， 朊病毒蛋白的Western印迹检测结果(第1道是分子量标记物；第2道- 低浓度鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道- 正常的仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨 酸钠，1∶10；第8道-树脂a；第9道-树脂a；第10道-树脂b；第11道 -树脂b；第12道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。组D表示在 存在十二烷基肌氨酸钠时，通过朊病毒蛋白的Western印迹，检测组C 样品中的未结合部分的结果(第1道是分子量标记物；第2道-低浓度 鼠IgG；第3道-中浓度鼠IgG；第4道-高浓度鼠IgG；第5道-正常的 仓鼠脑；第6道-人血小板，第7道-正常人血浆+十二烷基肌氨酸钠； 第8道-树脂a；第9道-树脂a；第10道-树脂b；第11道-树脂b；第12 道-Amino 650-1；第13道-Amino 650-2)。
参考图1，组A，第10和11道，和组C，第12和13道，检测PrPc结合 到ToyopearlTM Amino 650-M树脂上的结合作用；假如通过乙酰化作用 除去氨基上的电荷，那么就不能进行结合(结果如组A，第12和13道所 示)。
实验结果表明了树脂从人血浆中结合内源性PrPc的能力，从而提 供树脂可以用于从人或动物中除去PrP样品的证据。
实施例6
从血成分中结合PrPsc的间隔物要求
如图1所示，ToyopearlTM Amino 650-M树脂从人血浆中结合内源 PrPc。至少此树脂的一部分含有间隔臂或者基团，为TosohTM所专有。 研究间隔物对PrPsc结合的重要性。
如下填充四个(4)用于确定吸收剂的蛋白质分离试剂盒(PIKSITM) 柱子(0.5ml/每个)：每个实验样品两个柱子，一个是缺少间隔物的 ToyopearlTM Amino 650M，一个是商品化的有间隔物的ToyopearlTM Amino 650M树脂。同时也检测没有间隔物的ToyopearlTM Amino 650C 树脂。
用0.5％十二烷基肌氨酸钠处理2毫升(2ml)10％羊骚痒症脑匀浆 液(SBH)。通过把3ml SBH加到297ml工作缓冲液中，对十二烷基肌氨 酸钠处理过的上清用工作缓冲液稀释(1∶100)，柱子用这样的十二烷基 肌氨酸钠处理过的上清进行活化。柱子用10ml稀释于缓冲液的SBH， 通过以0.5ml/min的流速上样，活化2次。收集流出液，从每个柱子中 除去树脂等份物，用10ml工作缓冲液洗涤。
用每种树脂和缓冲液中的活化溶液对每种样品的其中一半用蛋白 酶K消化。样品，如在本文其它地方描述的那样，进行Western印迹检 测。得到的结果如图2所示(第1道是分子量标记物；第2道是用缓冲液 配制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道是用缓冲液配 制的用0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH+PK；第4道是MWM；第5 道是Amino 650M(商品化的)-PK(1)；第6道是Amino 650M(商品化 的)-PK(2)；第7道是Amino 650M(商品化的)+PK(1)；第8道是Amino 650M(商品化的)+PK(2)；第9道是Amino 650M(试验的)+PK(1)；第10 道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第11道是Amino 650M(实验 的)+PK(1)；第12道是Amino 650M(实验的)+PK(2)；第13道是Amino 650C-PK(1)；第14道是Amino 650C-PK(2)；第15道是Amino 650C+PK(1)；第16道是Amino 650C+PK(2))。如图2所示的实验结果清 楚地表明，间隔臂的存在对于Amino 650-M树脂的PrPsc结合作用是必 要的。
实施例7
在存在高浓度的人血清白蛋白(HSA)下捕获PrPc
为了举例说明树脂从含有多种蛋白质的治疗产品中除去PrP的能 力，研究了存在人血清白蛋白时，从中结合PrPc的作用。
将四根Bio-RadTM柱子，用ToyopearlTM Amino 650M氨基树脂填充。 树脂床高1cm，体积为0.5ml。树脂用工作缓冲液充分冲洗。柱子上加 载的样品如下：
柱子I-工作缓冲液中的1％nHaBH(正常仓鼠脑匀浆液)；
柱子II-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)；
柱子III-1％HaBH，用工作缓冲液配制的25％HSA(Sigma)和20 mM N-Ac-Trp(Acros Organics，Belgium)；
柱子IV-1％HaBH，American Red Cross制剂(ARC制剂)。
将20mM N-Ac-Trp溶于用工作缓冲液配制的25％HSA中，振荡， 37℃加热45分钟。如以上描述的制备10％nHaBH上清，以1∶10稀释于 选择的材料中(步骤2)，得到1％的nHaBH。
每个柱子的底部与4通道的蠕动泵相连。以上步骤制备的5毫升(5 ml)1％nHaBH以0.5ml/min的流速通过柱子I-IV。柱子被洗涤，以10ml 工作缓冲液/柱子、以0.5ml/min的流速洗涤。回收树脂，如以上描述制 备样品，跑12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。
使用3F4一抗的Western印迹被用于检测已经被树脂捕获的PrPc。印 迹的照片如图3所示(第1道-低浓度鼠对照组；第2道-中浓度鼠IgG 对照组；第3道-nHaBH对照组；第4道-1％HaBH柱子；第5道-1％ HaBH，25％HSA柱子；第6道-1％HaBH，25％HSA，20mM N-AC-Trp 柱子；第7道-1％HaBH，ARC制剂柱子)。在每道中可以见到大约相 同密度的条带，这表明：ToyopearlTM 650-M氨基树脂，在从多种途径 获得的25％人血清白蛋白存在的条件下，捕获了仓鼠脑匀浆液中的 PrPc。
如图3所示的实验结果表明：树脂从含有HAS的样品中结合朊病毒 蛋白的能力，从而提供了树脂可以用于在多种治疗产品中结合朊病毒 蛋白，并且确保使用血蛋白的治疗产品，例如作为稳定剂或治疗剂， 以及可以受到PrP污染的治疗产品的安全性的证据。
实施例8
在人血清白蛋白中，PrPsc结合到氨基树脂上
在以下描述的实验中，说明了在掺入在白蛋白中的传染性PrPsc的 结合作用。将12个PIKSI柱子用ToyopearlTM Amino 650M树脂进行填 充，每个0.5ml。将2ml 10％SBH(羊骚痒症脑匀浆液)用0.5％十二 烷基肌氨酸钠处理。
按照如下概述，制备以下六种活化物。
1.用缓冲液配制的SBH活化物：用工作缓冲液稀释(1∶100)经 过十二烷基肌氨酸钠处理的上清；将0.22ml SBH加到22ml工作缓冲 液中。
2.用HSA(American Red Cross(ARC)制剂)配制的SBH活化物： 将十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HAS稀释(1∶100)；将0.22ml SBH加到22ml HSA(American Red Cross制剂)中。
3.用含有N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH 活化物：把十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用含有20mM N-乙酰-色氨 酸和20mM辛酸酯的25％HSA稀释(1∶100)；白蛋白从sigma购买，不 含添加剂；将0.22ml的SBH加到22ml的HSA溶液中。
4.用含有N-乙酰-色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把 十二烷基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的 SBH加到22ml含有N-乙酰-色氨酸的HSA中。
5.用含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷 基肌氨酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml的SBH加 到22ml含有20mM辛酸酯的HSA溶液中。
6.用单独的HSA(Sigma)配制的SBH活化物：把十二烷基肌氨 酸钠处理过的上清用25％HSA稀释(1∶100)；将0.22ml SBH加到22ml 的HSA溶液(Sigma)中。
每种树脂用10ml溶液重复活化2次。柱子以0.5ml/min的流速上样， 以蠕动泵控制流速。收集流出溶液，以及收集来自每个柱子的树脂。 对每种树脂和缓冲液中的活化物导入蛋白酶K消化液。根据在此描述的 方法，样品进行Western印迹。印迹在图4中描述(组A：第1道-分子 量标准物；第2道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的 SBH-PK；第3道-缓冲液配制的0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的 SBH+PK；第四道-缓冲液配制的SBH-PK(1)；第5道-缓冲液配制的 SBH-PK(2)；第6道-缓冲液配制的SBH+PK(1)；第7道-缓冲液配制的 SBH+PK(2)；第8道-HSA(ARC组成)配制的SBH-PK(1)；第9道-HSA (ARC组成)配制的SBH-PK(2)；第10道-HSA(ARC组成)配制的 SBH+PK(1)；第11道-HSA(ARC组成)配制的SBH+PK(2)；第12道-HSA (Sigma)配制的SBH-PK(1)；第13道-HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)； 第14道-HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第15道-HSA(Sigma)配制的 SBH+PK(2)；列；组B：第1道-分子量标准物；第2道-缓冲液配制的 0.1％十二烷基肌氨酸钠处理的SBH-PK；第3道-缓冲液配制的 0.1％Sark处理的SBH+PK；第4道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制 的SBH-PK(1)；第5道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的 SBH-PK(2)；第6道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)； 第7道-含有乙酰色氨酸的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)；第8道-含 有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第9道-含有辛酸酯的HSA (Sigma)配制的SBH-PK(2)；第10道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的 SBH+PK(1)；第11道-含有辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)； 第12道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(1)；第 13道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH-PK(2)；第 14道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(1)；第 15道-含有乙酰色氨酸和辛酸酯的HSA(Sigma)配制的SBH+PK(2)。
图4中所示的结果表明，当与人血清白蛋白混合时，传染性PrPres 可以结合到氨基树脂上，并且多种添加剂不会干扰结合。
实施例9
筛选用于结合和去除朊病毒蛋白的树脂
目的
该研究用来评价由PRDT(病毒去除和诊断科技公司)选择的树脂 形式提供的可传播性海绵状脑病传染性去除的水平。对该树脂的活化 是掺入了瘙痒症仓鼠脑匀浆液的白细胞减少的人红细胞浓缩物单元。
背景
可传播性海绵状脑病(TSE)传染性已经在几个实验室的实验性和 天然感染的动物的血液中得到证实。BREF/UM一致且可重现地测量 4-20ID(传染剂量)的传染性每毫升被263K瘙痒症菌株(263K strain of scrapie)感染的仓鼠全血。此外，已经报道了经由vCJD(人类形式的TSE) 的血液从人到人传播的两例可疑性案例。这些结果引发了通过血液和 血液产品将TSE传播给人类的潜在风险的问题。由于TSE药剂对传统 病原体灭活方法的抗性以及缺乏灵敏的潜伏期TSE诊断试验，去除该 药剂是解决TSE经血液传播的最有希望的方案。
PRDT的策略采用从化学品和肽库中产生潜在的配体。该库经过一 级和二级筛选用于具有PrPres结合性质的配体，由树脂结合蛋白的 Western印迹以及流出物中的PrPres的ELISA分析。PrPres被认为是 TSE传染性的生化标记。这些筛余物鉴别了几种对TSE去除有效的配 体。此项研究的目的是确定由这些选择的配体在用于从白细胞减少的 红细胞浓缩物(RBCC)中除去TSE传染性的设备中使用时提供的TSE 传染性去除的水平。选择八种PRDT树脂从掺在人RBCC中的人(散发 性CJD)和仓鼠(263K瘙痒症菌株)感染的脑溶液中特异性捕获PrPres。 这些选择的树脂是：SYA，Amino 650M，Phenyl 650M，TMAE 650，DVR， YVHEA，WFDEA，和(D)ES(nal)PRQ-Eaca。还包括两种阴性对照物： 乙酰化SYA和乙酰化Amino 650M。代码编号示于表5中。(在此使用 氨基酸的标准简写)。先前已经发现大量的乙酰化乙酸酐抑制朊病毒结 合。
表5树脂代码
树脂 代码
SYA R1
Ac.SYA R2
Amino 650 R3
Ac.Amino 650 R4
TMAE R5
Phenyl 650M R6
DVR R7
YVHEA R8
WFDEA R9
(D)ES(nal)PRQ-Eaca R10
实验设计
树脂兼容性-在初步研究中，首先测试每个树脂备选物与当前说 明的(current specifications)RBCC功能和稳定性的兼容性。所有树 脂与RBCC兼容并用于TSE传染性去除研究。在一个实施方式中， PRDT树脂用两个柱子串联测试。每个柱子(或设备)含有大约10mL树 脂。串联柱子的基本原理是用来确定去除的类型并区别随机的或选择 性的捕获机理。假设树脂不是在饱和条件下，在随机机理中，第二设 备除去额外的传染性。在选择性机理中，第二设备不除去额外的传染 性。在一个实施例中，两个串联的TMAE树脂柱用一个单元的掺入了 1％瘙痒症脑匀浆液的RBCC来对比评价。选择该TMAE树脂是由于其 有效性。这些树脂表明第二柱子除去了与第一柱子一样多的PrPres且 经过第二柱子的液流可能含有更多的PrPres。根据这些结果，可以得出 结论，第一设备是饱和的。每个树脂的PrPres去除水平通过Western 印迹确定，并测定显示PrPres去除水平低于Western印迹检测水平的树 脂。
在一个实施方式中，整个实验在一天内完成，一组血液被立刻掺 入并用作对每个试验用PRDT配体的活化。此策略以最小的成本增长 有效的增加了该研究的价值。该研究还设计为用一个单元的掺杂RBCC 活化每个树脂来模拟设备的实际可能的最终应用。
选择瘙痒症仓鼠脑匀浆液作为RBCC的掺入物。该决定的基本原 理基于：1)瘙痒症仓鼠脑匀浆液对于掺入研究具有高测定量理想值， 其中掺入物必须稀释几倍，2)在TSE菌株的不同实验模型中仓鼠模型 具有最短的培养期，3)选择的配体已经从瘙痒症仓鼠脑匀浆液中筛选 用于PrPres的结合，和4)仓鼠模型在实验室已经确立好且大量掺入物 可以容易的制备。
树脂容量(capacity)-理论树脂容量的计算在传染性研究之后进 行。通常，用于研究的树脂理论上能够结合30-40mg蛋白每克树脂(4.7 mL溶胀树脂)。在活化物中选择该容量来结合全部(PrPc+PrPres)。然 而，以理想行为(如在树脂珠孔内/外分离)对于蛋白计算该容量。PrP在 该活化物中时不是理想的蛋白，即使在以各种尺度的集合形式或与其 他蛋白的复合进行清洁处理后。还显示了，PrP不会穿透珠孔且其只结 合到树脂珠的表面。尽管有此局限性，但是发现50mL树脂(组合的 五台设备的总体积)足以结合活化物中的所有PrP。过滤的目标流速是 10mL/min。此流速来源于在40min内过滤一个单元血液的要求。在这 些条件下，接触时间为大约1mL/min，且对于传染性来说认为其足以 结合配体。树脂结合PrPres的Western印迹和ELISA分析在液流中进 行。
实验程序
血液汇合-十单元的人RBCC收集于ARC(Holland实验室)并根 据本领域公知的标准程序在Pall过滤器上过滤白细胞。袋子里的血液 在实验前一天送到实验室并在40℃的冰箱里储存过夜。实验当天，将 血液汇合到大的血袋中。所有的稀释和体积测量以重量进行并使用 1.06g/mL作为RBCC的密度转化成体积。
掺杂制备物，血液的掺杂和再分配-未掺杂的血液组(blood pool) 中一等份取出并用作浓度测定用连续稀释制备中的稀释剂。PRDT瘙痒 症脑匀浆液(SBH)组中的一等份用0.5％十二烷基肌氨酸钠在冰上处理 30分钟。将该样品离心分离，移出上清液“十二烷基肌氨酸钠处理的 10％SBH”并缓慢与血液组混合。掺入物的体积基于血液重量计算并 使得血液中的终浓度为0.1％w/v(10％SBH的1∶100稀释物)。掺杂的 血液认真混合后，血液汇合袋(blood pool bag)连接到预先做的歧管 (manifold)并将掺杂的血液再分配到十个血袋，每个大约一个单元。传 送通过重力进行并将装满的袋子置于天平上称重。大约一个单元重量 的血液被传送到每个袋子中，将最终重量记录为Challenge 1。取出一 等份掺杂的血液用于浓度测定。
过滤-含有掺杂RBCC的每个血袋连接于预先做的过滤装置。每 个过滤装置含有串联的五个柱子的同样树脂(～10mL树脂每柱)和五个 血袋以收集从每个过滤器经过的液流。悬挂血袋，用钳子固定柱子垂 直于液流，接收袋在表面上平放。松开恰好置于柱子上方和下方的两 个钳子过滤开始。每个柱子的过滤进行计时，并记录袋子和柱子之间 的高度。应当注意，柱子和接收袋之间的距离对于所有过滤装置是相 同的。在同样情况下，在过滤过程中，降低或增加血袋和柱子之间的 高度来调节流速。每个柱子过滤后，称重接收袋，取出一等份液流， 再次称重袋子并为下次过滤准备。
树脂的去除-每次过滤后，将柱子与装置的其他部分分离并置于 旁边用于随后去除树脂。通过缓慢汇合缓冲液到柱子中并等待树脂出 来，可以从每个柱子的大约60mL缓冲液中收集全部十毫升树脂。将 大约3-5mL树脂转送到一次性色谱柱并用柠檬酸盐缓冲液洗涤。丢弃 剩余的树脂。
生化特性-通过Western印迹分析树脂对于PrPres的捕获。结果 表明SYA，Amino 650M，DVR，YVHEA和(D)ES(nal)PRQ-Eaca通过第 二柱子除去PrPres到检测限。换句话说，没有PrPres信号在第三、第 四和第五柱子中可检测到。
在小规模试验中对来自四种树脂：DVR、苯基树脂、氨基树脂和 TMAE的五个流出液进行ELISA分析。样品制备的程序是：添加2体 积的水，添加2％SDS(终浓度)并在1000℃加热10分钟(TSE灭活程 序)。在应用至ELISA之前，将样品用分析缓冲液稀释50倍。最终样 品稀释是150倍。这些结果与Western印迹结果的一般趋势相配。根据 ELISA结果的最好树脂是氨基树脂，然后是DVR、TMAE和苯基树脂。
浓度测定
浓度测定用树脂和液流的选择-基于树脂结合PrPres的Western 印迹结果，发现第三柱子后五种配体已经去除PrPres至检测限。这五 种配体是：DVR，Amino 650M，SYA，YVHEA和(D)ES(nal)PRQ-Eaca。 这五种配体的传染性去除与作为对照物的TMAE和乙酰化SYA树脂一 起进行。为降低研究中动物的总数量，并非每股流出液都进行浓度测 定。基于Western印迹结果，丢弃液流#1，因为柱2中的强PrPres信号 表明并非所有的PrPres和可能的传染性被柱1去除。选择的测试用流 出液是2和5。选择流出液2是因为在所有情况下(除对照物外)柱3几 乎不显示信号，表明液流2中PrPres浓度有明显降低。选择液流5是 因为它有最好的去除所有传染性的机会。在后来的研究中，流出液3 和4也进行浓度测定。然而，此报告仅涉及第一次传染性研究。
通过培养期方法的浓度测定-流出液的浓度测定利用培养期方 法进行。该方法不足以十分准确的区别两个相近的浓度测定量(2-log10 或更低)，但是它可以理想的用于差异为至少3-log10传染性的浓度测定， 因为它快速且与更准确的末端浓度测定方法相比要求更少的动物。由 于该研究的目的是选择去除大于3-log10传染性的树脂，认为培养期是 正确的选择。培养期与接种到仓鼠的传染性剂量成反比。该关系对于 高传染性剂量来说是线性的且该线性与低传染性剂量是分开的。掺杂 的RBCC稀释成未掺杂RBCC的两个独立的十倍稀释系列(相对于整 个脑从10-3到10-11)进行浓度测定并根据培养期产生两个剂量反应曲线。
将动物分离成等同确定改善了培养期值以及末端稀释浓度测定的 统计真实性。校正曲线的结果确定了对于每次稀释从活化物(10-3)作为 最高浓度开始和10-4、10-5等的疾病的平均培养期。使用相同的两个连 续稀释通过末端浓度测定法来确定掺入物的准确浓度测定。经过树脂 的最终去除利用从连续稀释challenge的培养期实验获得的剂量反应曲 线等式确定。
末端浓度测定-在相同实验里，10％瘙痒症脑匀浆液以及十二烷 基肌氨酸钠上清液用末端浓度测定法进行浓度测定。这些增加的浓度 测定的基本原理是为了得到PRDT SBH pool的起始浓度测定和不含 RBCC的实际掺入物的浓度测定的准确测量。
接种-流出液不经稀释进行接种。两笼动物(8只仓鼠)用流出液 进行接种，4笼动物(16只仓鼠)用challenge溶液接种。含氨基树脂的 液流2在4个笼子(16只仓鼠)里接种。制备剂量反应曲线的两个独立 的稀释系列。两笼动物用从10-3开始到10-11的每个稀释液(稀释液以整 个脑作为100稀释)接种。对于SBH和十二烷基肌氨酸钠SBH的浓度 测定，1笼动物用10-1到10-11的稀释液接种。
重量数据-先前的工作显示患瘙痒症动物的体重随着疾病的发 展下降。决定使用该标准来确定培养的末端。动物体重下降到最大体 重的80％的那天确定为培养期的末端。该方法的优势在于它没有偏倚 且不受人为失误影响。每个动物每周称重，一有疾病迹象就每周称重 两次，记录体重并为每个动物基于接种后天数作图。用流出液接种的 每个动物和标准曲线中的动物的最终培养期并入最后一栏，标题为 “80％最大”。记录的接种后天数在“PI天数”一栏，且“80％最大” 并非总是相对应，因为一些动物在体重降到80％最大体重时没有死去， 而是在几天之后。然而，在达到目标体重之前没有动物死去。“80％最 大”栏里的接种后天数根据表明动物达到目标体重的第一天的体重表 确定。这些数值的平均数和标准偏差也进行测量并列于下表6中。
临床数据-用流出液接种的动物在接种后239天死亡。末端浓度 测定继续进行，并将连续365天来确定SBH的准确浓度测定。然而， 这些剩下的动物不再称重。没有并发死亡且7只动物由于血液毒性而 在接种后前两周死亡。这些动物从最后浓度测定计算中去除。
用或不用十二烷基肌氨酸钠处理的SBH的浓度测定通过一周两次 对动物的临床评分进行，直到动物不能站立，此时动物死去。该动物 症状记录被扫描并提交。
表6每个稀释液在剂量反应曲线中的培养期 RBCC中SBH 的稀释log10 (I) (II) 平均值 SD 平均值 SD -3 -4 -5 -6 -7 94 105 114 128 137 4.2 8 5.2 9.4 15 99 104 111 117 158 5.4 6 3.8 4.8 54
-8 -9 -10 227 147 151 49 - - 182 206.5 0 73 104 -
计算和结果
末端浓度测定-SBH浓度测定的计算利用Reed and Muench方法 以1g脑进行。在末端浓度测定法中产生了四组数据：两个标准曲线、 一个10％SBH的稀释和一个经十二烷基肌氨酸钠处理的10％SBH上 清液的稀释。后者是RBCC中的实际掺入物。表7显示了浓度测定的 列表结果。PRDT 10％SBH pool的浓度测定量是109.18ID/mL。经十二 烷基肌氨酸钠处理并除去不溶颗粒后，浓度测定量降至108.10ID/mL， 表明尽管有增溶程序离心法除去了大约1-log的传染性(90％)。 Challenge溶液(0.1％SBH)的浓度测定进行两次显示很好的匹配，两次 浓度测定量都是106.72ID/mL。该浓度测定量略微高于在缓冲液中稀释 100倍至0.1％的十二烷基肌氨酸钠处理的SBH的计算浓度测定量。还 不清楚什么原因引起该差异。
表7末端稀释法的浓度测定量 浓度测定量，log10 10％SBH 母液 10％SBH十二烷基肌氨酸钠上清液 在RBCC中的0.1％SBH(I) 在RBCC中的0.1％SBH(II) 9.18 8.10 6.72 6.72
培养期浓度测定-在培养期浓度测定中，使用稀释的log10。剂 量反应曲线利用活化物从10-3到10-8的每个稀释液的实验培养期确定。 将表6记录的两个曲线的平均值进行平均(表8)。
表8两个曲线平均的培养期 -3 -4 -5 -6 -7 -8 96.5 104.5 112.5 122.5 148.5 204.5
抽出最适合表8中数值的曲线且其对应如下等式的指数曲线：
y＝a+b(-x/c)
其中，a，b和c是具有报道数值的常数，y是涉及整个脑的稀释(即， 0.1％SBH是10-3整个脑稀释)且x是培养期。液流培养期的平均值和标 准偏差示于表9。对应于每个培养期的稀释利用上述等式计算。每股液 流的稀释和活化物稀释的差异计算为去除。
去除结果(表9)表明液流2捕获一或小于1-log10的传染性，其中 R3FT2(Amino 650M树脂)最好。还有阴性对照物树脂，R4FT2(乙酰 化氨基树脂)不除去传染性而R5FT2(TMAE)仅去除0.5-log的传染性。 另一方面，液流5显示R1，R3，R7和R8(分别是SYA，Amino 650M， DVR和YVHEA)全部去除大于3-log10的传染性，其中SYA最好，为 4.2-log10去除。
表9TSE传染性去除 树脂 DPI* SD 稀释 (log10) 去除 (log10) R1FT2 R3FT2 R4FT2 R5FT2 活化物 SYA Amino 650M 乙酰化Amino 650M TMAE 89 102 104 92 95 2.6 7.9 4.2 3.6 6.7 3 3.7 4.0 3.0 3.0 - 0.7 1.0 0.0 0.0
R7FT2 R8FT2 R10FT2 DVR WFDEA (D)ES(nal)PRQ-Eaca 102 100 98 2.7 5.0 1.4 3.7 3.6 3.3 0.7 0.6 0.3 R1FT5 R3FT5 R4FT5 R5FT5 R7FT5 R8FT5 R10FT5 SYA Amino 650M 乙酰化Amino 650M TMAE DVR WFDEA (D)ES(nal)PRQ-Eaca 151 142 95 99 130 139 123 34.1 35.3 3.6 3.5 7.7 27.8 11.5 7.2 6.9 3.0 3.4 6.4 6.8 5.8 4.2 3.9 0.0 0.4 3.4 3.8 2.8
*DPI＝接种后天数
结论
该研究鉴别了选自用于有效TSE去除的二级筛选的这些当中最好 的PRDT配体。二级筛选确定了PrPres的捕获和去除的同时，该研究 还确认了相同配体去除掺杂RBCC的传染性。这些树脂实现了该研究 的目的，由于大多数配体去除大于3-log10的来自脑的传染性，而Amino 650M和SYA去除大约4-log10。此外，该去除是特异性的，且非通过 尺寸排除大的聚集体，由于阴性对照物配体没有去除任何传染性。数 据还显示配体没有去除存在于活化物中的全部传染性。这并不奇怪， 由于树脂被非常高浓度的传染性活化。基于Reed and Muench方法测量 的活化物的浓度测定量，将树脂曝露于106.72ID/mL，其是在TSE感染 的啮齿动物模型的血液中测量的传染性水平(10ID/mL)的100,000倍。
总之，SYA，Amino 650M，DVR和YVHEA全部表现很好，其中 SYA和Amino 650M可能略微偏好。这些树脂去除3-4-log10的TSE传 染性。该去除水平足以捕获来自血液的全部传染性，由于一个单元的 感染血液(在仓鼠模型中)含有大约5,000感染剂量。因而，如果脑中 的传染性与血液中的传染性相似，预期PRDT设备从血液中去除全部 TSE传染性。
实施例10
来自掺到缓冲液、过滤血浆和全血中的SBH中的PrPsc与Amino 650M 和Amino 650U结合的比较
Amino 650U是包括Amino 650M的不同珠子尺寸的混合物，其生 产成本低于650M。测试Amino 650U的内源性PrP及其结合所有当前 使用的基质(缓冲液、过滤血浆和全血)中的PrPsc的能力，并将其和 与用掺杂全血活化的Amino 650M的结合相比较。设计该实验用于对 比来自掺杂的缓冲液、血浆和全血的PrPsc与Amino 650U的结合，并 确立来自血浆和全血的内源性PrPc与Amino 650U的结合。另外，设 计该实验来确定PrPc去除中白细胞过滤(leukofiltration)的作用。
当存在于血浆或全血中时，没有发现650U或650M的朊病毒去 除的信号有差异。总之，Amino 650U和650M表现相同。白细胞过 滤去除的PrPc的量大于血小板和白细胞一起时的估计量。因而，白细 胞过滤还可能捕获部分血浆来源的PrPc。已经显示，在捕获人和仓鼠 血浆来源的PrPc时白细胞过滤器的作用方式有所不同。在仓鼠血浆 PrPc不被过滤器捕获时，人血浆PrPc可能被捕获。最后，还有可能， 两个结果的差异是由于PrPc和传染性之间缺少相关性。
实施例11仓鼠脑PrPsc与AMN树脂的结合
对一系列树脂(如，AMN-13，14，15，16，和17，Amino 650M和 Amino 650U)进行可比的结合实验。这些树脂结合到来自掺杂的缓冲 液、血浆和全血的PrPsc。结果证实了当用掺杂的缓冲液和掺杂的全血 两者同时活化时，全部AMN树脂结合的一样好。此外，AMN树脂的 信号与Amino 650M和650U的信号相同。对比来自掺杂的血浆中的 PrP的树脂结合发现，Amino 650M比所有其他树脂的信号略强。在 AMN树脂中，#13显示具有弱PrP信号，但与Amino 650U非常相当， 而#15，16，17全部表现好于Amino 650U。在AMN 14，15，16，17树脂 间没有发现明显的差异。
总之，该研究证实树脂间的更多相似性，且非常重要的，它显示 了与Amino 650U的相关性比650M更接近。观察到的与血浆的差异 表明至少与降低取代水平的活化物的差异也许是有利的，且树脂表现 的更接近于Amino 650M。
实施例12结合至树脂植入的膜的蛋白的提取以及来自正常仓鼠脑匀 浆液的PrPc结合的确定
使用树脂植入的压延膜的新设备的发展要求开发从树脂提取结合 蛋白的新方法。必须改变对材料的处理，以及提取液的组成、浓度和 体积。实验还设计成用来以新形式进行结合评价，使用Toyopearl Amino 650M植入的膜及其乙酰化形式。
正常仓鼠脑匀浆液(HaBH)用十二烷基肌氨酸钠处理并旋转。形成 的上清液用工作缓冲液或人全血稀释成终浓度为1％。50毫升掺杂的溶 液流经47mm Swinnex过滤器支撑物(Millipore)，其含有4个植入了4 mg/cm2的Toyopearl Amino 650M或其乙酰化形式的压延膜的夹层结 构。使用的流速是0.5mL/min，使用蠕动泵。对于每个掺杂的溶液和 膜类型收集十个等份，每个5mL。用掺杂的缓冲液活化的膜的液流样 品用ELISA分析。含有乙酰化树脂并用掺杂的全血活化的膜使用工作 缓冲液清洗。
膜断片(在某些情况下为整块)用SDS-PAGE样品缓冲液或99％甲 酸处理。用甲酸的处理包括把0.5mL 99％的甲酸和10μL 20％SDS加 入到四分之一的膜夹层结构，接着培养1小时去除液体，使用SpeedVac 蒸发。使用水将样品的体积调节到15μL，接着加入15μL 2X样品缓 冲液。使用样品缓冲液的处理包括将3mL 1X样品缓冲液加入到整块 膜中，接着培养30分钟，并沸腾7分钟。不挤压膜收取溶液，简单离 心除去所有树脂。还测试了上述处理的变化。它包括将1mL 2X样品 缓冲液加入到对应于1A过滤器的两块分离的膜中，培养1小时，接着 只沸腾它们中的一个。如果利用传染性时拆分过滤器支撑物变得很危 险，用样品缓冲液的洗提而不沸腾可以使用。
测试的最后条件是用样品缓冲液培养膜的断片(1/4)来核实与第 一、第二、第三和第四膜的结合以接触活化溶液。然后将样品在 SDS-PAGE凝胶上运行并对整个蛋白染色。也进行Western印迹。过滤 器支撑物的空闲体积大约是7mL。使50mL活化溶液流经每个过滤器 后，然后是空气流过，回收的活化溶液对于全血是45和47mL。当使 用掺杂的缓冲液时，回收的体积是46和46mL。当使用不同活化溶液 时没有注意到明显的差异。
要打开的第一过滤器支撑物是含有带乙酰化Toyopearl的膜的那 个，其用掺杂的全血活化。注意到，尽管流过空气并用缓冲液清洗， 过滤器中仍有一些血液。在试图用缓冲液清洗膜的过程中，树脂有明 显损失，丢弃膜。
带有用全血活化的Toyopearl Amino 650M的过滤器支撑物使用额 外200mL缓冲液清洗。流速高于最大值(刻度盘为999)。打开支撑物 时，注意到在各层里特别是各层之间仍有一些血液。还注意到，在洗 涤过程中绕过了由射线分配器勾画的一对断片。
膜块被切成4个等份。一片具有分离的且用样品缓冲液处理的四 层以确定不同层是否具有不同结合。另一个等份也被分成小片并用甲 酸处理。剩余的两个等份用来比较加热和不加热的处理。
两个用掺杂的缓冲液活化的过滤器每个使用200mL工作缓冲液 清洗。打开过滤器并将整块转送到小玻璃瓶中，在其中加入3mL样品 缓冲液。
植入到压延膜的树脂表现出在柱形式的树脂中维持相同的PrP结 合性质。乙酰化氨基树脂显示与氨基树脂信号相当的弱膜结合PrP信 号，证实如下结论：乙酰化氨基树脂不会有效结合PrP以及两种信号 间的差异对氨基树脂具有特异性。通常，树脂表明50％乙酰化，无论 是混合形式还是化学合成，降低PrPres结合。
实施例13PrPsc与来自SBH掺杂的血浆和全血的D4的结合
进行实验来比较来自掺杂的缓冲液、过滤的血浆和全血的PrPres 与D4树脂的结合以及内源性PrPc与D4的结合。在用掺杂的RBCC (UM-R-T-SE-180603)测试的Prometic模拟树脂中，D4显示出与PrPsc 的最好结合。将该树脂进行内源性传染性研究。与掺杂的脑来源PrPres 的D4结合性能在血浆、全血存在下进行测试，缓冲液作为对照物。该 测试还仅用来自血浆或全血的内源性PrPc来活化D4。
Western印迹信号表明D4结合血浆和全血中的掺杂的PrPres。D4 还可能结合来自全血的内源性PrPc，可能好于Amino 650M。
实施例14不同乙酰化树脂对PrPres的捕获
该研究比较Amino 650M的乙酰化对结合至PrPres的影响。不同 程度的乙酰化如下实现(1)完全乙酰化和非乙酰化树脂的混合物和(2) 通过在相同珠子上进行部分化学反应。该结果表明树脂可经受由化学 反应实现的20％乙酰化，仍结合PrP。此外，50％乙酰化树脂的混合物 对于结合PrP也是令人满意的。
虽然本发明的实践或检验中可以使用与在此描述的方法和材料相 似或相当的方法和材料，但是以上描述的是合适的方法和材料。所有 的出版物、专利申请、专利和在此提及的其它引述的参考资料被完整 地引用于此，作为参考。另外，材料、方法和实施例仅仅是例证性的， 其目的不在于限制。
上述的描述用于描述与发明有关的几个实施方案。可以对实施方 案和结构进行多处修正、添加和删除，只要不脱离发明的范围和精神。
序列表
<110>美国红十字会
北卡罗莱纳州立大学
普洛麦提生命科学有限公司
<120>朊病毒蛋白结合材料及其使用方法
<130>51821-0111WP(51821-299536)
<150>US 60/460,474
<151>2003-04-04
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>1
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
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