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生物标志物及其用途

阅读:399发布:2021-09-11

专利汇可以提供生物标志物及其用途专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且公开了利用原核 生物 的16S核糖体RNA(16S rRNA)中的一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)和/或真核生物的5.8S核糖体RNA(5.8S rRNA)中的一种或更多种SNP鉴定和/或分类 微生物 的方法。还公开了可用于那些方法中的探针、引物和 试剂 盒 。还公开了基于这些SNP诊断败血症的方法。,下面是生物标志物及其用途专利的具体信息内容。

1.一种确定样品中细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自所述样品的核酸在16S 
rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置,其中:
当在位置396存在C和在位置398存在T、A或C时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;和
当在位置396存在A、T或G和在位置398存在C时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述细菌选自不动杆菌属(Acinetobacter spp.);放线杆菌属(Actinobaccillus spp.);杜拉放线菌属(Actinomadura spp.);放线菌属(Actinomyces spp.);游动放线菌属(Actinoplanes spp.);气单胞菌属(Aeromonas 
spp.);农杆菌属(Agrobacterium spp.);Alistipes spp.;Anaerococcus spp.;节杆菌属(Arthrobacter spp.);芽孢杆菌属(Bacillus spp.);布鲁氏菌属(Brucella spp.);
Bulleidia spp.;伯克氏菌属(Burkholderia spp.);心杆菌属(Cardiobacterium spp.);
柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.);梭菌属(Clostridium spp.);棒状杆菌属
(Corynebacterium spp.);嗜皮菌属(Dermatophilus spp.);Dorea spp.;爱德华菌属(Edwardsiella spp.);肠杆菌属(Enterobacter spp.);肠球菌属(Enterococcus spp.);
丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp.);埃希氏杆菌属(Escherichia spp.);真杆菌属
(Eubacterium spp.);柔嫩梭菌属(Faecalibacterium spp.);产线菌属(Filifactor spp.);大芬戈尔德菌属(Finegoldia spp.);黄杆菌属(Flavobacterium spp.);Gallicola spp.;嗜血杆菌属(Haemophilus spp.);创伤球菌属(Helcococcus spp.);霍尔德曼氏菌属(Holdemania spp.);生丝微菌属(Hyphomicrobium spp.);克雷伯菌属(Klebsiella 
spp.);乳杆菌属(Lactobacillus spp.);军团菌属(Legionella spp.);李斯特菌属
(Listeria spp.);甲基杆菌属(Methylobacterium spp.);微球菌属(Micrococcus spp.);
小单孢菌属(Micromonospora spp.);动弯杆菌属(Mobiluncus spp.);莫拉克斯氏菌属(Moraxella spp.);摩根氏菌属(Morganella spp.);分支杆菌属(Mycobacterium spp.);
奈瑟氏菌属(Neisseria spp.);诺卡氏菌属(Nocardia spp.);类芽孢杆菌属
(Paenibacillus spp.);副拟杆菌属(Parabacteroides spp.);巴斯德氏菌属
(Pasteurella spp.);Peptoniphilus spp.;消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.);
动性球菌属(Planococcus spp.);动性杆菌属(Planomicrobium spp.);邻单胞菌属
(Plesiomonas spp.);卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.);普雷沃氏菌属(Prevotella spp.);丙酸菌属(Propionibacterium spp.);变形杆菌属(Proteus spp.);Providentia spp.;假单胞菌属(Pseudomonas spp.);罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.);红球菌属
(Rhodococcus spp.);罗斯氏菌属(Roseburia spp.);瘤胃球菌属(Ruminococcus spp.);
氏菌属(Salmonella spp.);Sedimentibacter spp.;沙雷氏菌属(Serratia spp.);志贺氏菌属(Shigella spp.);Solobacterium spp.;鞘醇单胞菌属(Sphingomonas spp.);
Sporanaerobacter spp.;葡萄球菌属(Staphlococcus spp.);寡养单胞菌属
(Stenotrophomonas spp.);链球菌属(Steptococcus spp.);链霉菌属(Streptomyces spp.);天梭菌属(Tissierella spp.);弧菌属(Vibrio spp.);和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述细菌选自Bacterial ID No.1-1430。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 
aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus 
faecium)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus 
mutans)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)和口腔链球菌(Streptococcus oralis)、炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、链球菌(Streptococcus bovis)、血链球菌
(Streptococcus sanguinis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌
(Escherichia coli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、脆弱拟杆菌
(Bacteroides fragilis)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、肺炎克雷伯菌
(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌
(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、摩氏摩根菌(Morganella 
morganii)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria 
meningitidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)、颊普雷沃氏菌
(Prevotella buccae)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)和产黑色普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)。
5.一种确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,其中:
当在位置396存在C时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;和
当在位置396存在G时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
7.一种确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、396、398和648的位置,其中当:
在位置396存在C;
在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在G;
或在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在G时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;且当
在位置396存在G;
在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在C;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G和在位置286存在A;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A和在位置286存在A;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在A;或
在位置396存在A、在位置398存在C在位置278存在G在位置286存在G和在位置648存在T
或A时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、龋齿韦荣氏球菌
(Veillonella denticariosi)、琼脂韦荣氏球菌(Veillonella rogosae)、环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
9.如权利要求8所述的方法,还包括鉴定所述细菌或将所述细菌鉴定为一组细菌之一,其中:
在位置396的C指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴性细菌:产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴
性细菌:大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,琼脂韦荣氏球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;
在位置396的G指示,所述细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革
兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,粪肠球菌或屎肠球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,产气荚膜梭菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,所述细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
10.一种将样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌分类为七组哺乳动物(例
如,人类)败血症-相关的细菌之一的方法,包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,其中:
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌(Eubacterium desmolans)、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis,或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌(Veillonella dispar)的第1组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、马红球菌(Rhodococcus equi)、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、解脲棒状杆菌(Corynebacterium urealyticum)、克氏动弯杆菌(Mobiluncus curtisii)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和肺炎嗜性衣原体(Chlamydophila pneumoniae)的第2组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需细菌的第3组病原体,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌(Actinobacillus hominis)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus 
ducreyi)、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella 
multocida)、产普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、霍乱弧菌(Vibrio 
cholerae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌
(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、嗜气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌
(Shigella dysenteriae)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)和Flavobacterium ceti;
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时确定所述细菌为第5组病原体,嗜麦芽寡养单胞菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时确定所述细菌为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组病原体;或
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时确定所述细菌为第7组病原体,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。
11.如权利要求10所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第1组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、
495、496、500和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时确定所述细菌为1c组细菌,肠乳杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时确定所述细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1e组细菌,产气荚膜梭菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时确定所述细菌为1g组细菌,链状真杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时确定所述细菌为1h组细菌,殊异韦荣氏球菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1i组细菌,艰难梭菌;
其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为1j组细菌,红斑丹毒丝菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时确定细菌为1l组细菌Peptostreptococcus stomatis。
12.如权利要求10所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第2组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、
496、499和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为2a组细菌,白喉棒状杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时确定所述细菌为2d组细菌,问号钩端螺旋体;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时确定所述细菌为2e组细菌,结核分枝杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时确定所述细菌为2g组细菌,克氏动弯杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时确定所述细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的2h组细菌;且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时确定细菌为2j组细菌,Actinomyces massiliensis。
13.如权利要求10所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第3组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时确定所述细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时确定所述细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时确定所述细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时确定所述细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定所述细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时确定细菌为3f组细菌,流产布鲁氏菌;且
当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时确定所述细菌为3g组细菌
Flavobacterium ceti。
14.如权利要求10所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第4组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和499的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时确定所述细菌为4a组细菌,嗜肺军团菌;
当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时确定所述细菌为4b组细菌,洋葱伯克氏菌;且
当在位置490、491、496和499分别存在G、C、G和G时确定所述细菌为4c组细菌,
Cardiobacterium valvarum。
15.如权利要求10所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第6组的细菌,所述方法还
包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中
当在位置490、491和496分别存在C、A和T时确定所述细菌为6a组细菌,颊普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和C时确定所述细菌为6b组细菌,产黑色普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和T时确定细菌为6c组细菌,脆弱拟杆菌;且
当在位置490、491和496分别存在T、T和C时确定细菌为6b组细菌,中间普雷沃氏菌。
16.一种分类样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的方法,包括分析来自
所述样品的核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置和应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置399、400和401或位置278、286和648的位置的单核苷酸多态性(SNP);其中
如果位置396、398、399、400和401被评价,则所述细菌被分类为七组哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌之一;其中
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis,或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需氧细菌的第3组病原体,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和
Flavobacterium ceti;
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组病原体;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时确定所述细菌为第5组病原体,嗜麦芽寡养单胞菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时确定所述细菌为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组病原体;或
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时确定所述细菌为第7组病原体,牙龈卟啉单胞菌;且
如果位置278、286、396、398和648被评价,则所述细菌被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性;其中当
在位置396存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;且当
在位置396存在G;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
17.如权利要求16所述的方法,其中如果位置396、398、399、400和401被评价且所述细菌被确定为第1组细菌,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、495、496、500和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时确定所述细菌为1c组细菌,肠乳杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时确定所述细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1e组细菌,产气荚膜梭菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时确定所述细菌为1g组细菌,链状真杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时确定所述细菌为1h组细菌,殊异韦荣氏球菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1i组细菌,艰难梭菌;
其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为1j组细菌,红斑丹毒丝菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1l组细菌,Peptostreptococcus stomatis。
18.如权利要求16所述的方法,其中如果位置396、398、399、400和401被评价且所述细菌被确定为第2组细菌,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、496、499和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为2a组细菌,白喉棒状杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时确定所述细菌为2d组细菌,问号钩端螺旋体;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时确定所述细菌为2e组细菌,结核分枝杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时确定所述细菌为2g组细菌,克氏动弯杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时确定所述细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的组2h细菌;且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,和
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时确定所述细菌为2j组细菌,Actinomyces massiliensis。
19.如权利要求16所述的方法,其中如果位置396、398、399、400和401被评价且所述细菌被确定为第3组细菌,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时确定所述细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时确定所述细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时确定所述细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时确定所述细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定所述细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时确定所述细菌为3f组细菌,流产布鲁氏菌;且
当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时确定所述细菌为3g组细菌,
Flavobacterium ceti。
20.如权利要求16所述的方法,其中如果位置396、398、399、400和401被评价且所述细菌被确定为第4组的细菌,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的
16S rRNA基因的位置490、491、496和499的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时确定细菌为4a组细菌,嗜肺军团菌;
当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时确定细菌为4b组细菌,洋葱伯克氏菌;且
当在位置490、491、496和499分别存在G、C、G和G时确定细菌为4c组细菌,
Cardiobacterium valvarum。
21.如权利要求16所述的方法,其中如果位置396、398、399、400和401被评价且所述细菌被确定为第6组细菌,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中
当在位置490、491和496分别存在C、A和T时确定细菌为6a组细菌,颊普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和C时确定细菌为6b组细菌,产黑色普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和T时确定细菌为6c组细菌,脆弱拟杆菌;且
当在位置490、491和496分别存在T、T和C时确定细菌为6b组细菌,中间普雷沃氏菌。
22.如权利要求16所述的方法,其中如果位置278、286、396、398和648被评价,则所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
23.如权利要求22所述的方法,还包括鉴定所述细菌为一组细菌之一,其中:
在位置396的C指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴性细菌:产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴
性细菌:大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,琼脂韦荣氏球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;
在位置396的G指示,所述细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革
兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,粪肠球菌或屎肠球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,产气荚膜梭菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,所述细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
24.如权利要求1至23的任一项所述的方法,还包括确定所述细菌是否对一种或更多种
抗生素有抗性。
25.如权利要求1至24的任一项所述的方法,还包括分析所述样品以确定所述样品中真
菌的存在或不存在,该进一步分析包括分析所述核酸在5.8S rRNA基因内在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、
188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、245、251或256的位置的单核苷酸多态性(SNP),该SNP指示所述样品中真菌的存在,其中所述SNP选自在位置142的C;在位置144的A;在位置146的A;在位置147的A;在位置148的C;在位置154的T;在位置157的T;在位置164的C或G;在位置167的A;在位置185的G;在位置187的A;在位置188的A;在位置194的T;在位置197的G;在位置213的A;在位置215的T;在位置216的T;在位置219的G;在位置223的A;在位置231的G或A;在位置232的T;在位置236的T;在位置245的C或A;在位置251的C;和在位置
256的T。
26.如权利要求1至25的任一项所述的方法,还包括分析所述样品以确定所述样品中哺
乳动物(例如,人类)真菌病原体的存在和身份,该进一步分析包括分析所述核酸在5.8S rRNA基因内的至少四种SNP,其中:
所述至少四种SNP包括在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的
位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259的位置中的至少两个位置的SNP;
所述哺乳动物(例如,人类)真菌病原体选自白色念珠菌(Candida albicans)、热带念
珠菌(Candida tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克鲁斯念珠菌
(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、荚膜组织胞浆菌(Ajellomyces capsulatus)、葡萄穗霉属(Stachybotrys sp.)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium 
apiospermum)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans);且
所述病原体的存在和身份基于下表中列出的SNP的存在来确定:
27.如权利要求26所述的方法,其中所述至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254
的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、165、196、202、223、224或259的位置。
28.如权利要求26所述的方法,其中所述至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254
的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置223的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、224或259的位置。
29.如权利要求1至28的任一项所述的方法,还包括确定所述样品中细菌的数量。
30.如权利要求25至29的任一项所述的方法,还包括确定所述样品中真菌细胞的数量。
31.如权利要求1至30的任一项所述的方法,其中所述样品是来自展示有全身炎症反应
综合征(SIRS)或怀疑患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述生物样品是血液。
33.如权利要求1至32的任一项所述的方法,其中在分析之前从所述样品中提取所述核
酸。
34.如权利要求1至33的任一项所述的方法,其中所述分析包括扩增所述核酸。
35.如权利要求1至34的任一项所述的方法,其中所述分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
36.一种确定样品中真菌的存在或不存在的方法,包括分析来自所述样品的核酸在
5.8S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),该SNP指示所述样品中真菌的存在,其中所述SNP选自在位置142的C;在位置144的A;在位置146的A;在位置147的A;在位置148的C;在位置154的T;在位置157的T;在位置164的C或G;在位置167的A;在位置185的G;在位置187的A;
在位置188的A;在位置194的T;在位置197的G;在位置213的A;在位置215的T;在位置216的T;在位置219的G;在位置223的A;在位置231的G或A;在位置232的T;在位置236的T;在位置
245的C或A;在位置251的C;和在位置256的T。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述样品选自土壤、食物、水、表面擦拭物和来自受试者的生物样品。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述生物样品选自血液、组织、痰、灌洗液、粪便、尿液和唾液。
39.如权利要求36至38的任一项所述的方法,还包括确定所述样品中真菌细胞的数量。
40.如权利要求36至39的任一项所述的方法,其中在分析之前从所述样品提取所述核
酸。
41.如权利要求36至40的任一项所述的方法,其中所述分析包括扩增所述核酸。
42.如权利要求28至41的任一项所述的方法,其中所述分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
43.一种确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法,包括分析来自所述样品的核酸在5.8S rRNA基因内的至少四种SNP,其中:
所述至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置
160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259的位置中的至少两个位置;
所述哺乳动物(例如,人类)真菌病原体选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌;且
所述病原体的身份基于下表中列出的SNP的存在来确定:
44.如权利要求43所述的方法,其中所述至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254
的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、165、196、202、223、224或259的位置。
45.如权利要求43所述的方法,其中所述至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254
的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置223的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、224或259的位置。
46.如权利要求43至45的任一项所述的方法,还包括确定所述样品中哺乳动物(例如,
人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态,所述确定包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,其中:
当在位置396存在C时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;且
当在位置396存在G时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
48.如权利要求43至44的任一项所述的方法,还包括确定所述样品中哺乳动物(例如,
人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态,所述确定包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的SNP,其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、
286、396、398和648的位置,其中当:
在位置396存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时确定所述细菌为革兰氏阴性细菌;且当
在位置396存在G;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G或在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时确定所述细菌为革兰氏阳性细菌。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
50.如权利要求48或49所述的方法,还包括鉴定所述细菌或将所述细菌鉴定为一组细
菌之一,其中:
在位置396的C指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴性细菌:产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,所述细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,琼脂韦荣氏球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;
在位置396的G指示,所述细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革
兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,粪肠球菌或屎肠球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,产气荚膜梭菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,所述细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
51.如权利要求43至45的任一项所述的方法,还包括将所述样品中的哺乳动物(例如,
人类)败血症-相关的细菌分类为七组哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌之一,所述分类包括分析来自所述样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,其中:
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis,或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组细菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis,或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组细菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需氧细菌的第3组病原体,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和
Flavobacterium ceti;
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时确定所述细菌为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组细菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时确定所述细菌为第5组细菌,嗜麦芽寡养单胞菌;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时确定所述细菌为选自革兰氏阴性厌氧物种颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组细菌;或
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时确定所述细菌为第7组细菌,牙龈卟啉单胞菌。
52.如权利要求51所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第1组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、
495、496、500和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时确定所述细菌为1c组细菌,肠乳杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时确定所述细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1e组细菌,产气荚膜梭菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时确定所述细菌为1g组细菌,链状真杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时确定所述细菌为1h组细菌,殊异韦荣氏球菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1i组细菌,艰难梭菌;
其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为1j组细菌,红斑丹毒丝菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时确定细菌为1l组细菌Peptostreptococcus stomatis。
53.如权利要求51所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第2组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、
496、499和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为2a组细菌,白喉棒状杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时确定所述细菌为2d组细菌,问号钩端螺旋体;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时确定所述细菌为2e组细菌,结核分枝杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时确定所述细菌为2g组细菌,克氏动弯杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时确定所述细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的2h组细菌;且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时确定细菌为2j组细菌,Actinomyces massiliensis。
54.如权利要求51所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第3组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时确定所述细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时确定所述细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时确定所述细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时确定所述细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定所述细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时确定细菌为3f组细菌,流产布鲁氏菌;且
当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时确定所述细菌为3g组细菌,
Flavobacterium ceti。
55.如权利要求51所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第4组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和499的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时确定所述细菌为4a组细菌,嗜肺军团菌;
当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时确定所述细菌为4b组细菌,洋葱伯克氏菌;且
当在位置490、491、496和499分别存在G、C、G和G时确定所述细菌为4c组细菌,
Cardiobacterium valvarum。
56.如权利要求51所述的方法,其中如果所述细菌被确定为第6组细菌,所述方法还包
括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中
当在位置490、491和496分别存在C、A和T时确定细菌为6a组细菌,颊普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和C时确定细菌为6b组细菌,产黑色普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和T时确定细菌为6c组细菌,脆弱拟杆菌;且
当在位置490、491和496分别存在T、T和C时确定细菌为6d组细菌,中间普雷沃氏菌。
57.如权利要求43至56任一项所述的方法,还包括确定所述样品中真菌细胞的数量。
58.如权利要求46至57任一项所述的方法,还包括确定所述样品中细菌的数量。
59.如权利要求43至58任一项所述的方法,其中所述样品是来自哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述生物样品选自血液、组织、痰、灌洗液、粪便、尿液和唾液。
61.如权利要求59所述的方法,其中所述生物样品是血液。
62.如权利要求43至61任一项所述的方法,其中在分析之前从所述样品中提取所述核
酸。
63.如权利要求43至62任一项所述的方法,其中所述分析包括扩增所述核酸。
64.如权利要求43至63任一项所述的方法,其中所述分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
65.一种诊断受试者(例如,人类)中的败血症的方法,包括分析来自所述受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位
置,且其中当在位置396存在C时诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症,且当在位置396存在G时诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、
144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、
232、236、245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;
在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置167存在A;在位置185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;
在位置197存在G;在位置213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置223存在A;在位置231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时诊断为真菌感染导致的败血症。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
67.一种诊断受试者(例如,人类)中的败血症的方法,包括分析来自所述受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、
396、398和648的位置,且其中当:
在位置396存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症;且当
在位置396存在G;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8s rRNA基因的位置142、
144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、
232、236、245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;
在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置167存在A;在位置185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;
在位置197存在G;在位置213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置223存在A;在位置231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时诊断为真菌感染导致的败血症。
68.如权利要求67所述的方法,其中所述细菌感染是被选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的细菌感染。
69.如权利要求68所述的方法,还包括当败血症被确定为由革兰氏阳性细菌或革兰氏
阴性细菌导致时,鉴定所述细菌或将所述细菌鉴定为一组细菌之一,其中:
在位置396的C指示,所述细菌是选自以下的革兰氏阴性细菌:产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,所述细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌,琼脂韦荣氏球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,所述细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;
在位置396的G指示,所述细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革
兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌粪肠
球菌或屎肠球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,产气荚膜梭菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,所述细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,所述细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
70.一种诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自所述受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位
置,且其中当在位置396存在C时诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症,且当在位置396存在G时诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2
的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或
259的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
71.如权利要求70所述的方法,其中所述细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
72.一种诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、
396、398和648的位置,且其中当:
在位置396存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症;且当
在位置396存在G;
在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或
在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2
的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或
259的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
73.如权利要求72所述的方法,其中所述细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的细菌感染。
74.如权利要求73所述的方法,还包括当败血症被确定为由革兰氏阳性细菌或革兰氏
阴性细菌导致时,鉴定所述细菌或将所述细菌鉴定为一组细菌之一,其中:
在位置396的C指示,细菌是选自以下的革兰氏阴性细菌:产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌琼脂韦荣氏球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;
在位置396的G指示,细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革兰氏
阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌粪肠球菌
或屎肠球菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,细菌是革兰氏阳性细菌,产气荚膜梭菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌,表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且
在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
75.一种诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自所述受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、
399、400和401的位置,且其中:
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时诊断为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时诊断为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时诊断为选自革兰氏阴性需氧细菌的第3组细菌导致的败血症,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti;
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时诊断为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时诊断为第5组细菌,嗜麦芽寡养单胞菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时诊断为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时诊断为第7组细菌,牙龈卟啉单胞菌导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、
144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、
232、236、245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;
在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置167存在A;在位置185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;
在位置197存在G;在位置213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置223存在A;在位置231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时诊断为真菌感染导致的败血症。
76.如权利要求75所述的方法,其中如果由第1组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、
493、495、496、500和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时确定所述细菌为1c组细菌,肠乳杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时确定所述细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1e组细菌,产气荚膜梭菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时确定所述细菌为1g组细菌,链状真杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时确定所述细菌为1h组细菌,殊异韦荣氏球菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1i组细菌,艰难梭菌;
其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为1j组细菌,红斑丹毒丝菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时确定细菌为1l组细菌,Peptostreptococcus stomatis。
77.如权利要求75所述的方法,其中如果由第2组2细菌导致的败血症被诊断,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、
493、496、499和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为2a组细菌,白喉棒状杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时确定所述细菌为2d组细菌,问号钩端螺旋体;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时确定所述细菌为2e组细菌,结核分枝杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时确定所述细菌为2g组细菌克氏动弯杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时确定所述细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的2h组细菌;且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时确定细菌为2j组细菌,Actinomyces massiliensis。
78.如权利要求75所述的方法,其中如果由第3组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和
501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时确定所述细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时确定所述细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时确定所述细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时确定所述细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定所述细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时确定细菌为3f组细菌,流产布鲁氏菌;且
当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时确定所述细菌为3g组细菌
Flavobacterium ceti。
79.如权利要求75所述的方法,其中如果由第4组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和
499的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时确定所述细菌为4a组细菌,嗜肺军团菌;
当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时确定所述细菌为4b组细菌,洋葱伯克氏菌;且
当在位置490、491、496和499分别存在G、C、G和G时确定所述细菌为4c组细菌,
Cardiobacterium valvarum。
80.如权利要求75所述的方法,其中如果由第6组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中
当在位置490、491和496分别存在C、A和T时确定所述细菌为6a组细菌,颊普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和C时确定所述细菌为6b组细菌,产黑色普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和T时确定所述细菌为6c组细菌,脆弱拟杆菌;且当在位置490、491和496分别存在T、T和C时确定细菌为6b组细菌,中间普雷沃氏菌。
81.一种诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自所述受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中所述SNP的存在指示败血症,其中:
16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、
399、400和401的位置,且其中:
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时诊断为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时诊断为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时诊断为选自革兰氏阴性需氧细菌的第3组细菌导致的败血症,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti;
当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时诊断为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时诊断为第5组细菌,嗜麦芽寡养单胞菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时诊断为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组细菌导致的败血症;
当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时诊断为第7组细菌,牙龈卟啉单胞菌导致的败血症;且
5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2
的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或
259的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
82.如权利要求81所述的方法,其中如果由第1组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、
493、495、496、500和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时确定所述细菌为1c组细菌,肠乳杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时确定所述细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1e组细菌,产气荚膜梭菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时确定所述细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时确定所述细菌为1g组细菌,链状真杆菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时确定所述细菌为1h组细菌,殊异韦荣氏球菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时确定所述细菌为1i组细菌,艰难梭菌;
其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时确定所述细菌为1j组细菌,红斑丹毒丝菌;
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时确定所述细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且
当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时确定细菌为1l组细菌,Peptostreptococcus stomatis。
83.如权利要求81所述的方法,其中如果由第2组2细菌导致的败血症被诊断,所述方法还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、
493、496、499和501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为2a组细菌,白喉棒状杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时确定所述细菌为2d组细菌问号钩端螺旋体;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时确定所述细菌为2e组细菌,结核分枝杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时确定所述细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时确定所述细菌为2g组细菌,克氏动弯杆菌;
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时确定所述细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的2h组细菌;且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时确定所述细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,且
当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时确定细菌为2j组细菌,Actinomyces massiliensis。
84.如权利要求81所述的方法,其中如果由第3组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和
501的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时确定所述细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时确定所述细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时确定所述细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时确定所述细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定所述细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;
当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时确定细菌为3f组细菌,流产布鲁氏菌;和
当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时确定所述细菌为组3g细菌,
Flavobacterium ceti。
85.如权利要求81所述的方法,其中如果有第4组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和
499的位置的SNP,其中
当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时确定所述细菌为4a组细菌,嗜肺军团菌;
当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时确定所述细菌为4b组细菌,洋葱伯克氏菌;且
当在位置490、491、496和499分别存在G、C、G和G时确定所述细菌为4c组细菌,
Cardiobacterium valvarum。
86.如权利要求81所述的方法,其中如果由第6组细菌导致的败血症被诊断,所述方法
还包括分析所述核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中
当在位置490、491和496分别存在C、A和T时确定所述细菌为6a组细菌,颊普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和C时确定所述细菌为6b组细菌,产黑色普雷沃氏菌;
当在位置490、491和496分别存在T、A和T时确定所述细菌为6c组细菌,脆弱拟杆菌;且当在位置490、491和496分别存在T、T和C时确定细菌为6b组细菌,中间普雷沃氏菌。
87.一种确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法,包括分析来自所述样品的核酸在5.8S rRNA基因内的至少两种SNP,其中:所述至少两种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示,所述样品中的真菌病原体是念珠菌属的种。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述念珠菌属的种选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和光滑念珠菌。
89.一种确定样品中存在或不存在念珠菌属的种的方法,包括分析来自所述样品的核
酸在5.8S rRNA基因内的至少两种SNP,其中:所述至少两种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示,所述样品中存在念珠菌属的种,且其中在位置163不存在T和在位置164不存在C指示,所述样品中不存在念珠菌属的种。
90.如权利要求89所述的方法,其中所述念珠菌属的种选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和光滑念珠菌。
91.如权利要求65至90任一项所述的方法,还包括确定所述样品中细菌和/或真菌的数
量。
92.如权利要求65至91任一项所述的方法,其中在分析之前从所述样品中提取所述核
酸。
93.如权利要求65至92任一项所述的方法,其中所述分析包括扩增所述核酸。
94.如权利要求65至93任一项所述的方法,其中所述分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
95.如权利要求65至94任一项所述的方法,还包括向所述受试者施用治疗剂。
96.如权利要求95所述的方法,其中所述治疗剂是抗真菌剂或抗生素。
97.如权利要求1至92任一项所述的方法,还包括确定检测或鉴定的细菌或真菌病原体
对治疗剂是否有抗性。
98.如权利要求1至93任一项所述的方法,还包括确定检测或鉴定的细菌或真菌病原体
的毒
99.一种治疗患败血症的受试者的方法,所述方法包括根据权利要求65至94任一项所
述的方法确定所述受试者是否患败血症,和基于败血症在所述受试者中存在向所述受试者施用用于治疗败血症的疗法。
100.一种治疗患系统性炎症反应的受试者的方法,所述方法包括根据权利要求65至94
任一项所述的方法确定所述受试者是否具有败血症,和基于败血症在所述受试者中存在向所述受试者施用用于治疗败血症的疗法,或基于败血症在所述受试者中不存在向所述受试者施用用于治疗感染阴性的全身炎症反应综合征的疗法。
101.一种治疗受试者中的感染的方法,所述方法包括根据权利要求1至94任一项所述
的方法确定或诊断哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的病原体的存在、革兰氏状态、身份或分类,和基于所述受试者中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的病原体的存在、革兰氏状态、身份或分类向所述受试者施用疗法。
102.如权利要求101所述的方法,还包括确定检测或鉴定的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的病原体对治疗剂是否有抗性,其中向所述受试者施用的疗法不同于所述病原体对其有抗性的治疗剂。
103.一种试剂盒,所述试剂盒包含用在权利要求1至102任一项所述的方法中的试剂。
104.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述试剂是引物或探针。
105.如权利要求103或104所述的试剂盒,包含两种引物,其每一种与16S rRNA或5.8S rRNA基因、或其DNA拷贝的包含权利要求1至90任一项中限定的SNP的至少一部分杂交。
106.如权利要求103至105中任一项所述的试剂盒,包含与16S rRNA或5.8S rRNA基因、或其DNA拷贝的包含权利要求1至90任一项中限定的SNP的至少一部分杂交的探针。
107.如权利要求1至102任一项所述的方法,其中所述方法的全部或部分由处理系统进
行。
108.如权利要求1至102任一项所述的方法,其中所述样品选自来自受试者的生物样
品、空气、土壤、水、滤出物、食物、工业制品和擦拭物样品。

说明书全文

生物标志物及其用途

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年5月28日提交的题为“Microbial Markers and Uses Therefor”的澳大利亚临时申请号2013901907和2013年10月11日提交的题为“Microbial Markers and Uses Therefor”的澳大利亚临时申请号2013903914的优先权,其每一个的主题通过引用全文并入本文。
发明领域
[0003] 本发明大体上涉及利用原核生物的16S核糖体RNA(16S rRNA)中的一种或更多种单核苷酸多态性(SNP)和/或真核生物的5.8S核糖体RNA(5.8S rRNA)中的一种或更多种SNP鉴定和/或分类微生物的方法。本发明还涉及在本发明的方法中有用的探针、引物和试剂盒。
[0004] 发明背景
[0005] 原核生物是缺少细胞核或任何膜结合的细胞器并一般为单细胞的生物体。虽然大多数原核生物基于革兰氏阳性微生物细胞外壁的肽聚糖被结晶紫和番红(或石炭酸品红)染色可被广泛地分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性,但是一些原核生物具有可变的革兰氏染色。原核生物包含16S(Svedberg单位)rRNA,其是原核生物核糖体的30S小亚基的组成部分。16S rRNA长度是大约1500核苷酸,由16S rRNA基因(有时称为16S rDNA)编码,16S rRNA基因一般是还包含23S和5S rRNA基因的共转录操纵子的一部分。16S rRNA基因的DNA序列(以及因此16S rRNA分子的RNA序列)在原核生物之间是高度保守的,尽管存在变异区域
(Weisburg WG等人,(1991)J Bacteriol.173(2):697–703)。
[0006] 与之相比,真核生物是细胞内包含膜,特别是包含DNA的核膜的生物体,并可以是单细胞(例如大多数酵母)或多细胞的。所有真核生物包含5.8S rRNA,其是真核生物核糖体的大60S小亚基的组成部分。其长度因物种而异,但通常是大约160个核苷酸。5.8S rRNA基因(通常称为5.8S rDNA)是45S rDNA的一部分,45S rDNA还包含2个内部转录的间隔区分隔的18S和28S rRNA基因。在人类中,45S rDNA存在于5个不同染色体上的5个簇中,每个簇具有30-40个重复段。45S rDNA被RNA聚合酶I转录为一个转录单元(45S),其然后被加工以产生5.8S、18S和28S rRNA分子。5.8S rRNA基因的序列(以及因此5.8S rRNA分子的序列)在真核生物之间是高度保守的,尽管存在可用于系统发生研究的变异区域(Field K.等人,(1988)Science 239(4841):748-753)。
[0007] 对样品中的原核和真核微生物分类通常是期望的。例如,污染溶液、材料或食品并对其他生物体的健康或溶液或材料或食品的生产品质构成威胁的微生物的分类有助于鉴定病原体,和管理、控制、根除、消除、限制或去除此类微生物。确定样品的天然微生物群体(“微生物群(microbiome)”)也可能是期望的,诸如对于微生物多样性的生态学研究、谱系(phylum spectrum)、相对门丰度(relative phylum abundance)(Gehron,M.J.等人.(1984)J.Microbiol.Methods 2,165–176;Claesson,M.J.等人.(2010)Nucl Acids Res 38(22),e200),或为了确定或监测在病理状态下的微生物群与正常状态的平衡偏差,所述病理状态诸如肠性疾患(例如肠胃炎、瘤胃炎、结肠炎、盲肠炎;Bailey,S.R.,等人(2003)Appl.Environ.Microbiol.69,2087–2093)、呼吸道疾患(例如炎、支气管炎、粘膜炎)、泌尿性疾患(例如膀胱炎、肾炎、尿道炎)和皮肤疾患(例如创伤、瘙痒、皮炎、屑病),包括病毒、真菌、寄生虫和细菌感染。确定样品中响应于疗法或处理或调节诸如抗生素、类固醇、免疫调节剂、益生元益生菌土壤处理、过滤、灭菌程序、防腐剂的使用的微生物群也可能是有用的。
[0008] 现有的微生物分类法包括但不限于,表型、化学型(chemotypic)和基因型分类法。表型分类中有革兰氏染色、生长需求、生化反应、抗生素敏感性、血清学系统、环境储库(或此类微生物优先存活和生长的地方)的亚分类方法。化学型分类中有利用可包括分析由糖类、脂肪、蛋白质或矿物质组成的微生物成分的各种技术的亚分类方法。基因型分类中有限制性片段长度分析和核糖体RNA序列分析的亚分类方法,二者都依赖于对遗传物质的不同解释水平。
[0009] 表型分类方法可能苦于缺乏灵敏性和特异性,不快速或不简单,并具有有限的自动化能。化学型方法也缺乏灵敏性和特异性且目前不是成本上有效的。基因型方法通常更灵敏、快速,容易进行,成本上有效,并能够被自动化和多重化。
[0010] 已经进行了多种尝试以利用核酸分子技术区分革兰氏阳性和革兰氏阴性的原核生物(参见例如,Bispo,P.J.M.,等人,(2011)Ophthalmol.Vis.Sci.52,873–881;Klaschik,S.等人(2002)Journal of Clinical Microbiology 40,4304–4307;Shigemura,K.等人(2005)Clin Exp Med 4,196–201(2005);Carroll,N.M.等人(2005)Journal of Clinical Microbiology 38,1753–1757)。因为焦点在有限数目的特定病理学样本(血液、尿液、眼科)和病原体类型上,因此这些尝试的范围主要受限于它们检测和区分的病原体的数量。这一缺陷的影响可具有严重的下游波及,例如,具有原核生物感染的患者不能被检测。
[0011] 所报道的这些方法一般不是定量性的,这可能是重要的。样品很少由单一类型的生物体组成,且对于病理学样品,通常被可能不相关且非致病性的原核生物污染。此外,极少的溶液或材料或食品不含微生物,且正是所存在的微生物的数量决定了污染的水平、品质的不足、或对其他生物体的健康的威胁。存在定量微生物的多种方法,包括但不限于,铺板到生长培养基上并计数微生物群落,使用分光光度法确定浊度和使用纳米颗粒(Zhao X等人,A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.PNAS,101(42):15027-15032.2004.)。
[0012] 极少的现有方法将基因型分类与定量相组合。一个这样的实例是Spiro等人,2000(A bead-based method for multiplexed identification and quantitation of DNA sequences using flow cytometry.App Env Micro 66(10):4258-4265)。然而,此方法未描述微生物的基因型分类。而是,其证明珠技术鉴定异质混合物中特定DNA序列的能力。更近的发展诸如,下一代测序(NGS)为生成关于样品的微生物群的大量数据带来希望(Claesson,M.J.等人Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions.Nucl Acids Res 38(22),e200(2010))。然而,这些技术目前苦于许多缺陷,特别是关于确定样品的简单革兰氏状态,包括:缺乏灵敏性(样品需要在先的PCR扩增,且在一些情形中,在测序前需要制备文库)、成本、PCR偏差、测序不准确性、和解释生成的大量数据所需的复杂软件算法
[0013] 因此,在微生物学领域中,对宽泛微生物分类和定量的方法存在需求,所述方法适合地以单试验的形式,是区分性的、灵敏、特异、快速、容易进行和理解、廉价、适宜于自动化和以最小量多重化,且优先在实地、远程、或在患者旁边、或至少在实验室低花费地进行。该试验将允许快速和知情的管理、监测、计算、定量、区分、控制、根除、消除、限制或去除这些微生物。
[0014] 特别地,对健康上重要的微生物诸如在人类中导致败血症的那些的宽泛微生物分类和定量的方法存在需求。
[0015] 全身炎症反应综合征(SIRS)是压倒性的全身反应,其可具有感染性病因学或非感染性病因学(即感染阴性SIRS或inSIRS)。败血症是在感染期间发生的SIRS。在此情况下的败血症由临床医生(当怀疑存在感染时)或通过生物体的培养来诊断。SIRS和败血症二者都由许多非特异性宿主反应参数定义,所述参数包括心率和呼吸速率、体温和白细胞计数的改变(Levy等人,(2003)Critical Care Medicine 31:1250–1256.;Reinhart等人,(2012)Clinical Microbiology Reviews 25(4):609–634)。
[0016] 败血症和SIRS已经对全世界的保健系统产生日益增加的影响。在美国从1993至2009年,败血症相关的住院数目多于翻倍,增加了共153%,平均每年增加6%。在2009年,每天有4,600名新患者住院治疗败血症,且住院患者的近23分之一患有败血症。住院败血症死亡率是大约16%,该数目自2000年后未曾改变,且比其他住院的死亡率高出多于8倍。在美国在2009年,败血症也是住院治疗最昂贵的原因,在总住院费用中共计约$154亿。
[0017] SIRS可被许多损害触发,所述损害包括局部或全身感染、创伤、烧伤、手术和无菌性炎症,并由四种提名的临床标准(体温、心率、呼吸速率和白细胞)中的至少两种的畸变组成。在Rangel-Fausto等人进行的综合调查中,经过9个月的时间段,68%的住院患者(admitted patient)满足SIRS的至少两个标准,且所调查的跨不同病房的住院患者中SIRS发病密度被确定为每1000患者天320和857次发作之间(Rangel-Frausto等人(1995)JAMA 
273(2):117-123。因此,SIRS在医院中具有高发生率。
[0018] 败血症的诊断的确认通常要求利用培养从血液样品分离和鉴定活病原体,但这一技术有其缺陷。微生物培养通常花费数天来获得阳性结果并需要超过五天来确认阴性结果。进一步地,培养物在有关灵敏性、特异性和预测价值方面具有可靠性的问题(Jean-Louis Vincent等人,(2006)Critical Care Medicine 34:344–353;Lamy等人,(2002)Clinical Infectious Diseases 35:842-850。大百分比的取自怀疑具有败血症的患者的血液培养物是阴性的或被污染的(Coburn等人(2012)JAMA 308,502–511)。取自患者的所有血液培养物的超过90%是阴性的。在小百分比(4-7%)的为阳性的血液培养物中,多达一半是由于差的取样技术造成的污染物(假阳性)引起的。假阳性血液培养物可导致总住院费用的增加、住院的中值长度的增加、和实验室费用的增加。因此,用于确定败血症存在的差的诊断程序,包括取样和试验,为保健系统带来严重的财政负担。怀疑具有败血症的患者的血液培养物的诊断缺陷的其他潜在后果包括广谱抗生素的使用和滥用、抗微生物抗性的发展和艰难梭菌(Clostridium difficile)感染、副反应和增加的治疗成本。
[0019] SIRS和败血症的替代诊断方法已被深入研究且大体上落入两类之一:病原体检测、或利用生物标志物确定宿主响应。有希望的快速且灵敏的病原体检测技术包括使用聚合酶链式反应(PCR),例如,Roche的 SeptiFast,尤其是当联合血液培养使用时(Bauer和Reinhart(2010)International Journal of Medical Microbiology 300:
411–413;Uwe Lodes等人(2012)Langenbeck's Archives of Surgery 397:447–455;和Pasqualini等人(2012)Journal of Clinical Microbiology 50:1285-1288)。利用这一技术时的当前困境是,如何在不存在血液培养结果或相关临床迹象时,最佳地解释早期阳性PCR结果。此类试验是复杂的并包括多个多重反应。进一步地,当使用灵敏的测定方法时,微生物的准确定量在确定病原体检测的适当性(relevance)方面是重要的。与基于PCR的病原体检测相关的另一个技术困难,特别是在外周血液样品中,是缺乏检测宿主核酸背景中的少量病原体核酸的能力。
[0020] 考虑到许可进入三级护理ICU设施的大多数(>80%)患者患具有不同病因的SIRS,包括大型手术后,患疑似感染或处于感染的高险的那些患者可以在早期被鉴定和分级和监测是有巨大临床重要性的,以开启基于证据的和目标导向医学治疗(Kumar,A.等人(2006)Critical Care Medicine 34,1589–1596)。这是至关重要的,因为用于有和没有感染的SIRS的急性管理方案非常不同。对经验性治疗的依赖是指,因为确切的感染部位还未被鉴定,一些患者可能正在接受过度的抗生素而其他患者正在接受免疫抑制性的治疗(例如皮质类固醇)。因此,对能够区分感染阴性SIRS(inSIRS)与感染阳性-SIRS(例如,败血症)、定量微生物DNA、区分原核生物与真核生物DNA并跨宽范围的潜在病原体区分革兰氏阳性与革兰氏阴性DNA,从而帮助临床医生制定适于此类患者的患者管理和治疗决策的试验存在持续的需求。
[0021] 还对超越革兰氏阳性和革兰氏阴性进一步分类细菌以辅助临床医生确定适合的疗程的快速测定和试验存在需求。传统方法通常要求培养所述细菌,取决于细菌的种,通常培养2至10天(例如生长缓慢的和需要复杂营养的生物体诸如分支杆菌可花费10天)。细菌特别是厌菌的这种培养,可以是劳动密集性的、繁重的并要求特殊的设备和试剂。培养后,实验室一般进行的第一程序是革兰氏染色和形态学评价,其结果被立即报告给临床医生。革兰氏染色允许将所培养的细菌(如果培养的话)分类为以下组:革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性球菌、厌氧菌、和念珠菌属(Candida spp.)。此类信息联合其他数据可能足以进行适当的抗生素选择。然后另外的试验可帮助确定抗生素敏感性和物种鉴定,尽管由于成本和物流,通常不进行这些试验。
[0022] 由于与菌血症相关的高死亡率、某些感染治疗不足的危险,或关于使用不适当的抗生素的顾虑,临床医生倾向于大量地安排血液培养并在获取血液培养物后很快将患者置于经验性抗生素。因此,疑似患有败血症的患者一般在获取血液培养物不久后且在接收任何培养或进一步的实验结果之前被置于经验性抗生素。使用的经验性抗生素的选择取决于诸如以下的因素:感染部位(例如呼吸系统、皮肤、泌尿系统、胃肠感染等)、感染是医院获得的或社区获得的、病原体的流行病学、医院微生物抗性模式、患者是否已用或正在用抗生素、患者过敏、和患者的共病和已知的抗生素毒性。对临床医生关于选择经验性抗生素的指导通常可由医院出版物、保健团体(HMO)、专家团体和科学文献获得(实例参见http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/antimicrobial-guidelines/;http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/;Huttner B,Jones M,Huttner A,Rubin M,Samore MH(2013)Antibiotic prescription practices for pneumonia,skin and soft tissue infections and urinary tract infections throughout the US Veterans Affairs system.J Antimicrob Chemother 68:2393–2399.doi:10.1093/jac/dkt171;Snydman DR(2012)Empiric antibiotic selection strategies for healthcare-associated 
pneumonia,intra-abdominal infections,and catheter-associated bacteremia.J 
Hosp Med 7Suppl 1:S2–S12.doi:10.1002/jhm.980;Maxwell DJ,Easton KL,Brien J-AE,Kaye KI(2005)Antibiotic guidelines in NSW hospitals.Aust Health Rev 29:416–
421.)。然而,由于微生物抗生素抗性的发展,微生物测试的目的和目标是提供关于适当使用窄谱抗生素的依据和指导并随后减少使用经验性广谱抗生素。因此,需要能及时提供关于窄谱抗生素的适当使用的指导,优选地不必培养生物体的试验。
[0023] 发明概述
[0024] 本发明是基于,确定了细菌和真菌的rRNA基因内的一种或更多种单核苷酸多态性是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真菌特有的,且在一些情形中是特定种或种的组特有的。基于这一确定性,本发明人已经开发了多种方法和试剂盒,其利用这些辨别性的SNP来鉴定样品中细菌和/或真菌的存在或不存在,将细菌与真菌区分开,将细菌分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的,将细菌分类为特定组的病原体的成员,鉴定细菌的种或鉴定细菌为数种可能的种之一,和/或鉴定真菌的种。在特定情形中,这些方法和试剂盒还帮助定量样品中的微生物。
[0025] 尽管本发明的一些方法和试剂盒可用于确定任何样品中细菌或真菌的存在,区分和/或鉴定细菌或真菌,但在一些实施方案中,本发明的方法和试剂盒对于确定生物样品诸如来自哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品中细菌或真菌的存在,区分和/或鉴定细菌或真菌是特别有用的。甚至更特别地,这些方法和试剂盒适合分析来自患SIRS的受试者的血液,以确定SIRS是否具有传染性来源,即,受试者是否患败血症,或SIRS是否是感染阴性的,或分析来自疑似患败血症的受试者的血液以确定该受试者是否的确患败血症。在受试者患有细菌或真菌感染导致的败血症的情形中,本发明的方法和试剂盒可用于确定细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性的;将细菌分类(classify)或分类(categorize)为例如需氧或厌氧的或主要抗生素治疗组的成员;鉴定细菌的种或鉴定细菌为数种可能的种之一;和/或鉴定受试者血液中存在的真菌的种。而且,还可确定感染的严重度,如通过血液中细菌或真菌的数量测量。因此,本发明的方法和试剂盒可用于指导临床医生是否使受试者住院,和需要何种疗程(如果存在的话)。本发明的方法和试剂盒还可用于指导临床医生应进行何种进一步的试验来确定抗生素抗性、微生物毒力和如有必要,明确细菌的种。由于本发明的方法可进行的速度,这些决定可由临床医生对首次被评价的受试者在数小时而不是数天内做出。因此,本发明的方法和试剂盒可减少现有技术的方法可能带来的不必要的住院、不必要的抗生素施用和/或无效或不适合的抗生素的施用,并帮助快速实施适合且有效的治疗方案
[0026] 在一个方面,本发明提供确定样品中细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置,其中:当在位置396存在C和在位置398存在T、A或C时确定细菌为革兰氏阴性细菌;而当在位置396存在A、T或G和在位置398存在C时确定细菌为革兰氏阳性细菌。
[0027] 在一些实施方案中,细菌选自不动杆菌属(Acinetobacter spp.);放线杆菌属(Actinobacillus spp.);杜拉放线菌属(Actinomadura spp.);放线菌属(Actinomyces spp.);游动放线菌属(Actinoplanes spp.);气单胞菌属(Aeromonas spp.);农杆菌属(Agrobacterium spp.);Alistipes spp.;Anaerococcus spp.;节杆菌属(Arthrobacter spp.);芽孢杆菌属(Bacillus spp.);布鲁氏菌属(Brucella spp.);Bulleidia spp.;伯克氏菌属(Burkholderia spp.);心杆菌属(Cardiobacterium spp.);柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.);梭菌属(Clostridium spp.);棒状杆菌属(Corynebacterium spp.);
嗜皮菌属(Dermatophilus spp.);Dorea spp.;爱德华菌属(Edwardsiella spp.);肠杆菌属(Enterobacter spp.);肠球菌属(Enterococcus spp.);丹毒丝菌属(Erysipelothrix spp.);埃希氏杆菌属(Escherichia spp.);真杆菌属(Eubacterium spp.);柔嫩梭菌属(Faecalibacterium spp.);产线菌属(Filifactor spp.);大芬戈尔德菌属(Finegoldia spp.);黄杆菌属(Flavobacterium spp.);Gallicola spp.;嗜血杆菌属(Haemophilus spp.);创伤球菌属(Helcococcus spp.);霍尔德曼氏菌属(Holdemania spp.);生丝微菌属(Hyphomicrobium spp.);克雷伯菌属(Klebsiella spp.);乳杆菌属(Lactobacillus spp.);军团菌属(Legionella spp.);李斯特菌属(Listeria spp.);甲基杆菌属
(Methylobacterium spp.);微球菌属(Micrococcus spp.);小单孢菌属(Micromonospora spp.);动弯杆菌属(Mobiluncus spp.);莫拉克斯氏菌属(Moraxella spp.);摩根氏菌属(Morganella spp.);分支杆菌属(Mycobacterium spp.);奈瑟氏菌属(Neisseria spp.);
诺卡氏菌属(Nocardia spp.);类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.);副拟杆菌属
(Parabacteroides spp.);巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.);Peptoniphilus spp.;消化链球菌属(Peptostreptococcus spp.);动性球菌属(Planococcus spp.);动性杆菌属(Planomicrobium spp.);邻单胞菌属(Plesiomonas spp.);卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp.);普雷沃氏菌属(Prevotella spp.);丙酸菌属(Propionibacterium spp.);变形杆菌属(Proteus spp.);Providentia spp.;假单胞菌属(Pseudomonas spp.);罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.);红球菌属(Rhodococcus spp.);罗斯氏菌属(Roseburia spp.);瘤胃球菌属(Ruminococcus spp.);沙门氏菌属(Salmonella spp.);Sedimentibacter spp.;沙雷氏菌属(Serratia spp.);志贺氏菌属(Shigella spp.);Solobacterium spp.;鞘醇单胞菌属(Sphingomonas spp.);Sporanaerobacter spp.;葡萄球菌属(Staphlococcus spp.);
寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.);链球菌属(Steptococcus spp.);链霉菌属
(Streptomyces spp.);天梭菌属(Tissierella spp.);弧菌属(Vibrio spp.);和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)。在其他实施方案中,细菌选自Bacterial ID No.1-1430。在特定实例中,细菌是哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌,诸如选自以下之中的一种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌
(Streptococcus mutans)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、远缘链球菌
(Streptococcus sobrinus)和口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌
(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、链球菌
(Streptococcus bovis)、血链球菌、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、变异链球菌和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌
(Klebsiella oxytoca)、绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产气肠杆菌
(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌
(Serratia marcescens)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、弗氏柠檬酸杆菌
(Citrobacter freundii)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、流感嗜血杆菌
(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)、颊普雷沃氏菌(Prevotella buccae)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)和产黑色普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)。
[0028] 本发明的另一方面涉及用于确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,其中当在位置396存在C时确定细菌为革兰氏阴性细菌;而当在位置396存在G时确定细菌为革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中,哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
[0029] 在另一方面,本发明提供用于确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态的方法,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、396、398和648的位置,其中当在位置396存在C;在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在T;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在G;
或在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在G时确定细菌为革兰氏阴性细菌;和当在位置396存在G;在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在C;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G和在位置286存在A;
在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A和在位置286存在A;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在A;或在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在T或A时,确定细菌为革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中,细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、同性恋螺杆菌
(Helicobacter cinaedi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流产嗜性衣原体
(Chlamydophila abortus)、非典型韦荣氏球菌(Veillonella atypica)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
[0030] 该方法还可包括鉴定细菌或鉴定细菌为一组细菌之一,其中:在位置396存在C指示,该细菌是选自产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌的革兰氏阴性细菌;在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在T指示,细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在G指示,细菌是革兰氏阴性细菌琼脂韦荣氏球菌;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在G指示,细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;在位置396存在G指示,细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革兰氏阳性细菌;在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在C指示,细菌是革兰氏阳性细菌粪肠球菌或屎肠球菌;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在T和在位置648存在T指示,细菌是革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G和在位置286存在A指示,细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A和在位置286存在A指示,细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在A指示,细菌是革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌溶血葡萄球菌。
[0031] 在一个方面,本发明提供用于分类样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌为七组哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌之一的方法,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,其中:当在位置396、398、399、400和
401分别存在A、C、G、C和C时,确定细菌为选自革兰氏阳性物种炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria 
monocytogenes)、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌(Eubacterium 
desmolans)、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和
Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌(Veillonella dispar)的第1组病原体;当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时,确定细菌为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、马红球菌(Rhodococcus equi)、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、解脲棒状杆菌(Corynebacterium urealyticum)、克氏动弯杆菌(Mobiluncus curtisii)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)和Actinomyces massiliensis,或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和肺炎嗜性衣原体(Chlamydophila pneumoniae)的第2组病原体;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时,确定细菌为选自革兰氏阴性需氧细菌之中的第3组病原体,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌(Actinobacillus hominis)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌
(Haemophilus parahaemolyticus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌
(Shigella dysenteriae)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)和Flavobacterium ceti;当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时,确定该细菌为选自革兰氏阴性需氧物种嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组病原体;当在位置396、
398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时,确定该细菌为第5组病原体,嗜麦芽寡养单胞菌;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时,确定该细菌为选自革兰氏阴性厌氧物种颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第66病原体;或当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时,确定该细菌为第7组病原体,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)。
[0032] 本发明还提供用于分类样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的方法,包括分析来自样品的核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置和对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置399、400和401或位置278、286和648的位置的单核苷酸多态性(SNP);其中如果位置396、398、399、400和401被评价,则细菌被分类为七组哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌之一;其中当在位置396、398、399、
400和401分别存在A、C、G、C和C时,确定该细菌为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌之中的第1组病原体;当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时,确定该细菌为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体之中的第2组病原体;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时,确定该细菌为选自革兰氏阴性需氧细菌之中的第3组病原体,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti;当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时,确定该细菌为选自革兰氏阴性需氧物种嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组病原体;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时,确定该细菌为第5组病原体嗜麦芽寡养单胞菌;当在位置396、398、
399、400和401分别存在C、A、G、T和A时,确定该细菌为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组病原体;或当在位置396、
398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时,确定该细菌为第7组病原体牙龈卟啉单胞菌;且[0033] 如果位置278、286、396、398和648被评价,则细菌被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性;其中当在位置396存在C;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;在位置
396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时,确定该细菌为革兰氏阴性细菌;而当在位置396存在G;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时,确定该细菌为革兰氏阳性细菌。
[0034] 在一些实施方案中,如果确定细菌为第1组细菌,本发明的方法还可包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、495、496、500和501的位置的SNP,其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、C和C时,确定该细菌为选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌或单核细胞增多性李斯特氏菌的1a组细菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、G和G时,确定该细菌为选自无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌和酿脓链球菌的1b组细菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、C、G、A、T和C时,确定该细菌为1c组细菌肠乳杆菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、C、G、A、T、C和A时,确定该细菌为选自幽门螺杆菌和大肠弯曲杆菌的1d组细菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、G、G、G、G、C和C时,确定该细菌为1e组细菌产气荚膜梭菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在A、A、T、C、G、A、C和C时,确定该细菌为选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和腐生葡萄球菌的1f组细菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、A、G、A、T、C和T时,确定该细菌为1g组细菌链状真杆菌;当在位置490、491、492、
493、495、496、500和501分别存在G、A、A、T、G、A、C和C时,确定该细菌为1h组细菌殊异韦荣氏球菌;当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在G、A、G、G、G、G、C和C时,确定该细菌为1i组细菌艰难梭菌;其中当在位置490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、C和C时,确定该细菌为1j组细菌红斑丹毒丝菌;当在位置490、491、492、493、
495、496、500和501分别存在T、A、C、C、G、A、G和G时,确定该细菌为选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌的1k组细菌;且当在位置
490、491、492、493、495、496、500和501分别存在T、G、T、G、G、G、C和C时,确定该细菌为1l组细菌,Peptostreptococcus stomatis。
[0035] 如果确定细菌为第2组细菌,本发明的方法还可包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、496、499和501的位置的SNP,其中当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在A、G、A、T、G、G和A时,确定该细菌为2a组细菌白喉棒状杆菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时,确定该细菌为选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌的2b组细菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、A、G、G、G和A时,确定该细菌为选自环圈链霉菌和索马里链霉菌的2c组细菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、C、C、T、A、A和C时,确定该细菌为2d组细菌问号钩端螺旋体;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、A、G、G、G和A时,确定该细菌为2e组细菌结核分枝杆菌;当在位置490、491、492、
493、496、499和501分别存在G、G、A、T、G、G和A时,确定该细菌为选自杰氏棒状杆菌和解脲棒状杆菌的2f组细菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、G、G、G、G和G时,确定细菌为2g组细菌克氏动弯杆菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、G、T、A、G、G和A时,确定该细菌为选自沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的2h组细菌;当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、A、G、G、G和A时,确定该细菌为选自星状诺卡氏菌和巴西诺卡氏菌的2i组细菌,且当在位置490、491、492、493、496、499和501分别存在G、T、T、G、G、G和A时,确定该细菌为2j组细菌Actinomyces massiliensis。
[0036] 在确定细菌为第3组细菌的情形中,所述方法还可包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和501的位置的SNP,其中当在位置490、491、496和501分别存在A、C、G和A时,确定该细菌为选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌的3a组细菌;当在位置490、491、496和501分别存在A、C、T和A时,确定该细菌为选自卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌的3b组细菌;当在位置490、491、496和501分别存在G、A、T和A时,确定该细菌为选自淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌的3c组细菌;当在位置490、491、496和501分别存在G、C、G和A时,确定该细菌为选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌的3d组细菌;当在位置490、491、496和501分别存在G、C、T和A时确定细菌为3e组细菌,鲍氏不动杆菌;当在位置490、491、496和501分别存在G、G、G和C时,确定该细菌为3f组细菌流产布鲁氏菌;且当在位置490、491、496和501分别存在T、A、T和A时,确定该细菌为3g组细菌Flavobacterium ceti。
[0037] 如果确定细菌为第4组细菌,所述方法还可包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491、496和499的位置的SNP,其中当在位置490、491、496和499分别存在A、C、G和C时,确定该细菌为4a组细菌嗜肺军团菌;当在位置490、491、496和499分别存在G、A、T和G时,确定该细菌为4b组细菌洋葱伯克氏菌;且当在位置490、491、496和
499分别存在G、C、G和G时,确定该细菌为4c组细菌Cardiobacterium valvarum。
[0038] 如果确定细菌为第6组细菌,所述方法还可包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置490、491和496的位置的SNP,其中当在位置490、491和496分别存在C、A和T时,确定细菌为6a组细菌颊普雷沃氏菌;当在位置490、491和496分别存在T、A和C时,确定该细菌为6b组细菌产黑色普雷沃氏菌;当在位置490、491和496分别存在T、A和T时,确定该细菌为6c组细菌脆弱拟杆菌;且当在位置490、491和496分别存在T、T和C时,确定该细菌为6b组细菌中间普雷沃氏菌。
[0039] 在一些实施方案中,本发明的方法还包括确定细菌是否对一种或更多种抗生素有抗性。
[0040] 在一个实施方案中,以上和此处描述的方法还包括分析样品以确定样品中真菌的存在或不存在,该进一步分析包括分析核酸在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、245、251或256的位置的5.8S rRNA基因内的单核苷酸多态性(SNP),该SNP指示样品中真菌的存在,其中SNP选自在位置142的C;在位置144的A;在位置146的A;
在位置147的A;在位置148的C;在位置154的T;在位置157的T;在位置164的C或G;在位置167的A;在位置185的G;在位置187的A;在位置188的A;在位置194的T;在位置197的G;在位置
213的A;在位置215的T;在位置216的T;在位置219的G;在位置223的A;在位置231的G或A;在位置232的T;在位置236的T;在位置245的C或A;在位置251的C;和在位置256的T。
[0041] 该方法还可包括分析样品以确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的存在和身份,该进一步分析包括分析核酸在5.8S rRNA基因内的至少四种SNP,其中:该至少四种SNP包括在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259的位置的至少两个的那些;哺乳动物(例如,人类)真菌病原体选自白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、荚膜组织胞浆菌(Ajellomyces capsulatus)、葡萄穗霉属(Stachybotrys sp.)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium 
apiospermum)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans);且病原体的存在和身份基于下表中列出的SNP的存在来确定:
[0042]
[0043] 在一些实施方案中,至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、165、196、202、223、224或259的位置。在其他实施方案中,至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置223的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、224或259的位置。
[0044] 在一些实施方案中,本发明的方法还包括确定样品中细菌的数量和/或真菌细胞的数量。在特定实例中,样品是来自展示全身炎症反应综合征(SIRS)或怀疑具有败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品,诸如血液样品。在本发明的方法的一些实施方案中,在分析之前从样品中提取核酸。在进一步的实施方案中,所述分析包括扩增核酸。在一些实例中,分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
[0045] 本发明的另一方面涉及确定样品中真菌的存在或不存在的方法,包括分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),该SNP指示样品中真菌的存在,其中SNP选自在位置142的C;在位置144的A;在位置146的A;在位置147的A;在位置148的C;在位置154的T;在位置157的T;在位置164的C或G;在位置167的A;在位置185的G;在位置187的A;在位置188的A;在位置194的T;在位置197的G;在位置213的A;在位置215的T;在位置216的T;在位置219的G;在位置223的A;在位置231的G或A;在位置232的T;在位置236的T;在位置
245的C或A;在位置251的C;和在位置256的T。在一些实施方案中,样品选自土壤、食物、水、表面擦拭物和来自受试者的生物样品。在特定实施方案中,生物样品选自血液、组织、痰、灌洗液、粪便、尿液和唾液。
[0046] 所述方法还可包括确定样品中真菌细胞的数量。在特定实例中,在分析之前从样品中提取核酸。在一些实施方案中,所述分析包括扩增核酸。在进一步的实施方案中,分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
[0047] 本发明还提供确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法,包括分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因内的至少4种SNP,其中:该至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259中的至少两个位置;哺乳动物(例如,人类)真菌病原体选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌;且病原体的身份基于下表中列出的SNP的存在来确定:
[0048]
[0049] 在特定实例中,至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、165、196、202、223、224或259的位置。在其他实例中,至少四种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置223的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、224或259的位置。
[0050] 本发明还提供确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法,包括分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因内的至少两种SNP,其中:所述至少两种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示,样品中的真菌病原体是念珠菌属的种。适当地,念珠菌属的种选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和光滑念珠菌。
[0051] 本发明还提供确定样品中存在或不存在念珠菌属的种的方法,包括分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因内的至少两种SNP,其中:所述至少两种SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示样品中存在念珠菌属的种,且其中在位置163不存在T和在位置164不存在C指示样品中不存在念珠菌属的种。适当地,念珠菌属的种选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和光滑念珠菌。
[0052] 在一些实施方案中,确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法还包括确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,其中:当在位置396存在C时确定细菌为革兰氏阴性细菌;而当在位置396存在G时确定细菌为革兰氏阳性细菌。在一些实例中,细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
[0053] 在进一步的实施方案中,确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的身份的方法还包括确定样品中哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的SNP,其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、396、398和648的位置,其中当:在位置396存在C;在位置396存在A,在位置398存在C且在位置278存在T;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G且在位置648存在G;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G且在位置648存在G时,确定该细菌为革兰氏阴性细菌;而当在位置396存在G;在位置396存在A,在位置398存在C且在位置278存在C;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G且在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A且在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G且在位置648存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G且在位置648存在T或A时,确定该细菌为革兰氏阳性细菌。在一些实例中,细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
[0054] 这些方法还可包括鉴定细菌或鉴定细菌为一组细菌之一,其中:在位置396的C指示,细菌是选自产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌琼脂韦荣氏球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;在位置396的G指示,细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌粪肠球菌或屎肠球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,细菌是革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌,溶血葡萄球菌。
[0055] 这些方法还可包括分类样品中的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌为七组哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌之一,包括分析来自样品的核酸在16S rRNA基因中的单核苷酸多态性(SNP),其中所述SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,如以上和本文描述的。此外,可按照以上和本文描述的进行将细菌进一步分组为组1a-l、2a-j、3a-g、4a-c和6a-d。
[0056] 在一些实例中,还确定样品中真菌细胞和/或细菌的数量。样品可以是例如,来自哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品,诸如例如血液、组织、痰、灌洗液、粪便、尿或唾液。在特定的实施方案中,生物样品是血液。在一些实施方案中,在分析之前从样品中提取核酸。在进一步的实施方案中,所述分析包括扩增核酸。在一些情形中,所述分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。
[0057] 本发明还提供诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中:16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,且其中当在位置396存在C时,诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症,且当在位置396存在G时,诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置167存在A;在位置
185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;在位置197存在G;在位置
213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置223存在A;在位置
231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时,诊断为真菌感染导致的败血症。在该方法的一些实施方案中,细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
[0058] 在另一方面,本发明提供诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中:16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、396、398和648的位置,且其中当:在位置396存在C;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时,诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症;而当在位置396存在G;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时,诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8srRNA基因的位置142、144、146、
147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、
245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置
167存在A;在位置185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;在位置
197存在G;在位置213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置
223存在A;在位置231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时,诊断为真菌感染导致的败血症。
[0059] 在一个实例中,细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
[0060] 在一些实施方案中,这些方法还包括当确定败血症由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌导致时,鉴定细菌或鉴定细菌为一组细菌之一,其中在位置396的C指示,细菌是选自产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌琼脂韦荣氏球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;在位置396的G指示,细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌粪肠球菌或屎肠球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,细菌是革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置286的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌溶血葡萄球菌。
[0061] 在另一方面,本发明提供诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中:16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置,且其中当在位置396存在C时,诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症,而当在位置396存在G时,诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259中的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
[0062]
[0063] 在一些实施方案中,细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。
[0064] 还提供了诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中:16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置278、286、396、398和648的位置,且其中当在位置396存在C;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在T;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在G;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在G时,诊断为革兰氏阴性细菌感染导致的败血症;而当在位置396存在G;在位置396存在A,在位置398存在C和在位置278存在C;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时,诊断为革兰氏阳性细菌感染导致的败血症;且5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259中的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
[0065]
[0066] 在特定实施方案中,细菌感染是被选自以下的细菌感染:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
[0067] 在某个实例中,所述方法还包括当确定败血症由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌导致时,鉴定细菌或鉴定细菌为一组细菌之一,其中:在位置396的C指示,细菌是选自产黑色普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、颊普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌和洋葱伯克氏菌的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的T指示,细菌是选自大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌和流产嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌琼脂韦荣氏球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的G指示,细菌是革兰氏阴性细菌非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌和龋齿韦荣氏球菌;在位置396的G指示,细菌是选自环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C和在位置278的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌粪肠球菌或屎肠球菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的T和在位置648的T指示,细菌是革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G和在位置
286的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌牛链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、酿脓链球菌、咽峡炎链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌和血链球菌;或在位置396的A、在位置398的C、在位置278的A和在位置286的A指示,细菌是选自金黄色葡萄球菌、远缘链球菌、星座链球菌和口腔链球菌的革兰氏阳性细菌;在位置396的A、在位置398的C、在位置
278的A、在位置286的G和在位置648的A指示,细菌是革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌或人葡萄球菌;且在位置396的A、在位置398的C、在位置278的G、在位置286的G和在位置648的T或A指示,细菌是革兰氏阳性细菌溶血葡萄球菌。
[0068] 本发明还提供诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,且其中当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时,诊断为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种,幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时,诊断为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时,诊断为选自革兰氏阴性需氧细菌的第3组细菌导致的败血症,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti;当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时,确定为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时,诊断为第5组细菌,嗜麦芽寡养单胞菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时,诊断为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和
401分别存在C、A、G、T和C时,诊断为第7组细菌牙龈卟啉单胞菌导致的败血症;且
[0069] 5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2中列出的5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、
231、232、236、245、251或256的位置,且当在位置142存在C;在位置144存在A;在位置146存在A;在位置147存在A;在位置148存在C;在位置154存在T;在位置157存在T;在位置164存在C或G;在位置167存在A;在位置185存在G;在位置187存在A;在位置188存在A;在位置194存在T;在位置197存在G;在位置213存在A;在位置215存在T;在位置216存在T;在位置219存在G;在位置223存在A;在位置231存在G或A;在位置232存在T;在位置236存在T;在位置245存在C或A;在位置251存在C;或在位置256存在T时,诊断为真菌感染导致的败血症。
[0070] 在另一方面,本发明提供诊断哺乳动物(例如,人类)受试者中的败血症的方法,包括分析来自受试者血液的核酸在16S rRNA基因中的SNP和5.8s rRNA基因中的SNP,其中SNP的存在指示败血症,其中16S rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置,且其中当在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C时,诊断为选自革兰氏阳性物种,炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或革兰氏阴性物种幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的第1组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C时,诊断为选自革兰氏阳性物种,白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis或革兰氏阴性物种,问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的第2组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C时,诊断为选自的革兰氏阴性需氧细菌的第3组细菌导致的败血症,所述革兰氏阴性需氧细菌选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti;当在位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C时,确定为选自革兰氏阴性需氧物种,嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的第4组细菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C时,诊断为第5组细菌嗜麦芽寡养单胞菌导致的败血症;当在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A时,诊断为选自革兰氏阴性厌氧物种,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌、中间普雷沃氏菌的第6组细菌导致的败血症;当在位置
396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C时,诊断为第7组细菌,牙龈卟啉单胞菌导致的败血症;且
[0071] 5.8s rRNA基因中的SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置254的位置;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、165、196、202、223、224或259中的任何两个位置,且其中基于下表中列出的SNP的存在诊断由选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的真菌感染导致的败血症:
[0072]
[0073]
[0074] 在本方法的一些实施方案中,如果确定败血症是由来自第1、2、3、4或6组的细菌导致的,则将细菌进一步分组为1a-l、2a-j、3a-g、4a-c和6a-d组可按照以上和本文描述的进行。
[0075] 在一些实施方案中,还确定了样品中细菌和/或真菌的数量。在一个实例中,在分析之前从样品中提取核酸。在另外的实例中,分析包括扩增核酸。在一个实施方案中,分析利用测序、5'核酸酶消化、分子信标、寡核苷酸连接、微阵列、或其任何组合进行。在进一步的实施方案中,诊断方法还包括向受试者施用治疗剂,诸如抗真菌剂或抗生素。
[0076] 附图简述
[0077] 图1显示对掺有革兰氏阴性、革兰氏阳性或真菌生物体的全血的定量RT-PCR测定(测定)的结果。
[0078] 表A
[0079] 序列简述
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088] 表B
[0089] 核苷酸符号
[0090]
[0091]
[0092] 发明详述
[0093] 1.定义
[0094] 除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料,但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的,下文定义了下列术语。
[0095] 如本文所用的,冠词“一(a)”和“一(an)”是指一个或多于一个(即,至少一个)该冠词的语法宾语。举例来讲,“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
[0096] “扩增产物”是指由核酸扩增技术生成的核酸产物。
[0097] 如本文所用的,术语“生物样品”指可从患者提取的未处理的、处理的、稀释的或浓缩的样品。适合地,生物样品选自患者身体的任何部分,包括但不限于毛发、皮肤、指甲、组织或体液诸如唾液和血液。
[0098] 整个说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为意指,包括所述的步骤或元素或步骤或元素的组,但不排除任何其它的步骤或元素或步骤或元素的组。
[0099] 如本文所用的,“对应的”核酸位置或核苷酸是指,在两个或更多个核酸分子的对齐的位点出现的位置或核苷酸。相关多核苷酸或变体多核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何方法比对。此类方法通常将匹配最大化,并包括诸如利用手动比对和通过利用许多可得的比对程序(例如,BLASTN)的方法以及本领域技术人员知晓的其他方法。通过比对多核苷酸的序列,本领域技术人员可利用相同的核苷酸作为指导鉴定对应的核苷酸或位置。例如,通过比对编码大肠杆菌16S rRNA(SEQ ID NO:1中列出)的基因与编码来自另一物种的16S rRNA的基因的序列,本领域技术人员可利用保守的核苷酸作为指导鉴定对应的位置和核苷酸。
[0100] “基因”是指占据基因组上特定基因座的遗传单位,并由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即,内含子、5’和3’非翻译序列)组成。
[0101] “同源性”是指相同或构成保守性取代的核酸或氨基酸的数目百分比。同源性可利用序列比较程序诸如GAP(Deveraux等人,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)确定,其被通过引用并入本文。以这种方式,与本文提及的序列具有相似或明显不同长度的序列可通过向比对中插入缺口来比较,此类缺口例如通过GAP使用的比较算法来确定。
[0102] “杂交”在本文中用于表示,互补性核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体。互补的碱基序列是因碱基配对规则而被关联的那些序列。在DNA中,A与T配对且C与G配对。在RNA中,U与A配对且C与G配对。就这一点而言,如本文所用的术语“匹配”和“错配”是指互补性核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交,例如如上所述的经典的A-T和G-C碱基对。错配是未有效杂交的核苷酸的其它组合。
[0103] “分离的”是指,实质上或基本上不含在其天然状态中通常伴随其的成分的材料。
[0104] 如本文所用的,术语“寡核苷酸”是指包括经由磷酸二酯键连接的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其相关的结构变体或合成类似物)的聚合物(或其相关的结构变体或合成类似物)。因此,虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中核苷酸残基和残基之间的键是天然存在的核苷酸聚合物,但是应该理解的是,该术语在其范围内还包括各种类似物,包括但不限于,肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核酸等等。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸的长度通常是相当短的,一般从约10至30个核苷酸残基,但该术语可以指任何长度的分子,尽管该术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
[0105] 术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用并是指人类或其他哺乳动物的患者和受试者,且包括期望使用本发明的方法检查或治疗的任何个体。然而应理解,“患者”不隐含着存在症状。落入本发明范围内的合适的哺乳动物包括但不限于,灵长类动物、家畜动物(例如,绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如,兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如,猫、狗)和捕获的野生动物(例如,狐、鹿、澳洲野狗)。
[0106] 如本文所用的,术语“多态性”是指给定区域的核苷酸或氨基酸序列与另一个体的同源区域中的核苷酸或氨基酸序列相比的差异,尤其是,给定区域的核苷酸或氨基酸序列在同一物种的个体之间不同的差异。多态性一般相对于参考序列来定义。多态性包括单核苷酸差异、多于一个核苷酸的序列的差异和单个或多个核苷酸插入、倒位和缺失;以及单氨基酸差异、多于一个氨基酸的序列的差异和单个或多个氨基酸插入、倒位和缺失。“多态性位点”是变异发生的位点。应理解,当核酸序列中存在多态性,且述及多态性位点处的一个或更多个特定碱基的存在时,本发明涵盖互补链上在该位点的一个或更多个互补碱基。
[0107] 如本文所用的,术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、rRNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指长度上多于30个核苷酸碱基的寡核苷酸。
[0108] “引物”是当与DNA的一条链配对时,能够在合适的聚合剂的存在下启动引物延伸产物的合成的寡核苷酸。引物优选是单链的以获得最大扩增效率,但也可以是双链的。引物必须足够长以在聚合剂的存在下启动延伸产物的合成。引物的长度取决于很多因素,包括应用、要采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如,取决于靶序列的复杂性,寡核苷酸引物通常包含15至35个或更多的核苷酸残基,但是其可包含更少的核苷酸残基。引物可以是大的多核苷酸,例如从约200个核苷酸残基至几千个碱基或更多。引物可被选择成与其被设计以杂交的模板上的序列“基本上互补”,并且用作合成起始的位点。“基本上互补”意指引物互补性足以与靶多核苷酸杂交。在一些实施方案中,引物不含有与其被设计以杂交的模板的错配,但这不是必须的。例如,非互补性核苷酸残基可以与引物的5’末端连接,而引物序列的其余部分与模板互补。或者,非互补性核苷酸残基或一段非互补性核苷酸残基可以散布于引物内,只要引物序列与其要杂交的模板序列具有足够的互补性并由此形成合成引物的延伸产物的模板。
[0109] “探针”是指与另一个分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指明,否则术语“探针”通常是指通过互补性碱基配对与通常称为“靶多核苷酸”的另一多核苷酸结合的多核苷酸探针。取决于杂交条件的严格度,探针可以与缺少与该探针的完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可被直接或间接标记。
[0110] 术语“败血症”在本文中按照其通常的临床医学含义使用,并包括例如,全身性和/或血液源感染,诸如细菌或真菌感染。
[0111] 术语“败血症-相关的细菌”是指已被鉴定为能够在受试者中导致败血症、或已在患败血症的受试者血液中被鉴定的细菌。因此,“哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌”是指已被鉴定为能够在哺乳动物(例如,人类)受试者中导致败血症、或已在患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者的血液中被鉴定的细菌。哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的实例包括,鲍氏不动杆菌、人放线杆菌、Actinomyces massiliensis、嗜水气单胞菌、炭疽芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、流产布鲁氏菌、洋葱伯克氏菌、大肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、Cardiobacterium valvarum、沙眼衣原体、流产嗜性衣原体、肺炎嗜性衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、白喉棒状杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、刚果嗜皮菌、迟缓爱德华菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、红斑丹毒丝菌、大肠杆菌、链状真杆菌、Flavobacterium ceti、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、肠乳杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特氏菌、藤黄微球菌、克氏动弯杆菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根菌、结核分枝杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、多杀巴斯德氏菌、Peptostreptococcus stomatis、牙龈卟啉单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、产碱普罗威登斯菌、铜绿假单胞菌、马红球菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、远缘链球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、非典型韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、殊异韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌。
[0112] 术语“败血症-相关的真菌”是指,已被鉴定为能够在受试者中导致败血症、或已在患败血症的受试者的血液中被鉴定的真菌(包括酵母)。因此,“哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的真菌”是指已被鉴定为能够在哺乳动物(例如,人类)受试者中导致败血症、或已在患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者的血液中被鉴定的真菌。哺乳动物(例如,人类)败血症相关的真菌的实例包括白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属的种、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属的种、烟曲霉和新型隐球菌。
[0113] 如本文所用的,“败血症”被定义为具有推定或确认的感染过程的SIRS。感染过程的确认可使用微生物培养或致病物质的分离来确定。从免疫度来说,败血症可被视为对微生物或全身感染的全身响应。
[0114] 如本文所用的,术语“序列同一性”是指在比较窗口中序列在一个核苷酸接着一个核苷酸的基础上或一个氨基酸接着一个氨基酸的基础上的相同程度。因此,“序列同一性百分比”通过以下来计算:在比较窗口比较两个最佳比对的序列,确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如,A、T、C、G、I)的位置的数目以生成配对位置的数目,将配对位置的数目除以比较窗口中总的位置数目(即窗口大小),并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
[0115] 如本文所用的,术语单核苷酸多态性(SNP)是指,当基因组序列中的单核苷酸(A、T、C或G)改变时(诸如经由取代、添加或缺失)发生的核苷酸序列变异。SNP可发生在基因组,诸如原核或真核微生物的基因组的编码(基因)和非编码区域中。
[0116] 如本文所用的“全身炎症反应综合征(SIRS)”是指,由非特异性创伤引起的具有下列可测量的临床特征中的两个或更多个的临床响应:体温高于38℃或低于36℃、心率高于90次每分钟、呼吸频率高于20次每分钟、白细胞计数(总的白细胞)高于12,000/mm3或低于
4,000/mm3或带状嗜中性白细胞的百分比高于10%。从免疫角度来说,其可被视为代表对创伤(例如,大型手术)或全身炎症的全身响应。因此,如本文所用的,“感染-阴性SIRS(inSIRS)”包括上文提到的临床响应但是不存在可鉴定的感染过程。
[0117] 如本文所用的,术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果在完全或部分地阻止感染、状况或其症状方面可以是预防性的和/或在部分或完全地治愈感染、状况和/或由所述感染或状况引起的不良作用方面可以是治疗性的。如本文所用的,“治疗”覆盖对哺乳动物(例如,人类)中感染或状况的任何治疗,并包括:(a)阻止感染或状况发生在可能易患所述感染或状况但还未被诊断患有所述感染或状况的受试者中;(b)抑制所述感染或状况,即,阻止其发展;和(c)减轻所述感染或状况,即,导致感染或状况的消退。
[0118] 2.本发明的多态性
[0119] 本发明部分地基于确定,细菌的16S rRNA基因内(且因此16S rRNA分子内)的SNP可用于将细菌分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性。SNP的特定组合可用于进一步分类细菌,特别是进一步分类或鉴定哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌病原体。本发明还部分地基于确定,真核生物的5.8S rRNA基因内(且因此5.8S rRNA分子内)的单SNP可用于区分真菌细胞(包括酵母细胞)与哺乳动物细胞。还已确定,真核生物的5.8S rRNA内的SNP的组合可用于区分和鉴定最常见的哺乳动物(例如,人类)真菌病原体。
[0120] 2.1利用16S rRNA中的SNP分类细菌
[0121] 本发明提供确定样品中细菌的革兰氏状态,即确定细菌为革兰氏阳性或革兰氏阴性的方法。如本文证明的,编码16S rRNA(且因此16S rRNA分子本身)的基因在对应于SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA基因的位置396和398的的核苷酸位置的多态性可用于确定绝大多数细菌的革兰氏状态,所述绝大多数细菌包括大多数哺乳动物(例如,人类)病原体(包括发现污染红血细胞和血小板制品的常见细菌、见于哺乳动物(例如,人类)粪便样品中的最常见的细菌和许多导致败血症的病原体)、最常见的土壤细菌和见于工作环境中的常见细菌。任何原核生物的16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中对应于SEQ ID NO:1的位置396和398的位置是可容易地通过与SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA基因比对而鉴定的。在一些实例中,对应于SEQ ID NO:1的核苷酸518-537且跨其全长为近7000个细菌的种共有的高度保守序列,可用于帮助比对。使用这两种SNP区分大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性原核生物的一般规则描述于表1中。
[0122] 表1.
[0123]革兰氏状态 SNP 396 SNP 398
阴性 C T/A/C
阳性 A/T/G C
[0124] 因此,本发明提供通过分析来自样品的核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置的SNP确定该样品中细菌的革兰氏状态的方法,其中在位置396的C和在位置398的T、A或C指示,样品中的细菌是革兰氏阴性细菌;而在位置396的A、T或G和在位置398的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌。利用在对应于SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA基因的396和398的位置的SNP可被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌包括,例如,不动杆菌属;放线杆菌属;马杜拉放线菌属;放线菌属;游动放线菌属;气单胞菌属;农杆菌属;Alistipes spp.;Anaerococcus spp.;节杆菌属;芽孢杆菌属;布鲁氏菌属;Bulleidia spp.;伯克氏菌属;心杆菌属;柠檬酸杆菌属;梭菌属;棒状杆菌属;嗜皮菌属;Dorea spp.;爱德华菌属;肠杆菌属;肠球菌属;丹毒丝菌属;埃希氏杆菌属;真杆菌属;柔嫩梭菌属(Faecalibacterium spp.);产线菌属;大芬戈尔德菌属(Finegoldia spp.);黄杆菌属;Gallicola spp.;嗜血杆菌属;创伤球菌属;霍尔德曼氏菌属(Holdemania spp.);生丝微菌属;克雷伯菌属;乳杆菌属;军团菌属;李斯特菌属;甲基杆菌属;微球菌属;小单孢菌属;动弯杆菌属;莫拉克斯氏菌属;摩根氏菌属;分支杆菌属;奈瑟氏菌属;诺卡氏菌属;类芽孢杆菌属;副拟杆菌属(Parabacteroides spp.);
巴斯德氏菌属;Peptoniphilus spp.;消化链球菌属;动性球菌属;动性杆菌属;邻单胞菌属;卟啉单胞菌属;普雷沃氏菌属;丙酸菌属;变形杆菌属;Providentia spp.;假单胞菌属;
罗尔斯通菌属;红球菌属;罗斯氏菌属(Roseburia spp.);瘤胃球菌属;沙门氏菌属;
Sedimentibacter spp.;沙雷氏菌属;志贺氏菌属;Solobacterium spp.;鞘氨醇单胞菌属;
Sporanaerobacter spp.;葡萄球菌属;寡养单胞菌属;链球菌属;链霉菌属;天梭菌属(Tissierella spp.);弧菌属;和耶尔森氏菌属。
[0125] 利用在位置396和398的位置的SNP可被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的病原体的特定实例包括但不限于表2中列出的那些。
[0126] 表2.
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167] 2.2利用16S rRNA中的SNP进一步分类导致哺乳动物(例如,人类)败血症的细菌[0168] 通常在哺乳动物(例如,人类)中导致败血症的细菌病原体包括革兰氏阳性细菌Actinomyces massiliensis、炭疽芽孢杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、白喉棒状杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、刚果嗜皮菌、粪肠球菌、屎肠球菌、红斑丹毒丝菌、链状真杆菌、肠乳杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、藤黄微球菌、克氏动弯杆菌、结核分枝杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、Peptostreptococcus stomatis、马红球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、血链球菌、远缘链球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、和革兰氏阴性细菌鲍氏不动杆菌、人放线杆菌、嗜水气单胞菌、脆弱拟杆菌、流产布鲁氏菌、洋葱伯克氏菌、大肠弯曲杆菌、Cardiobacterium valvarum、沙眼衣原体、肺炎嗜性衣原体、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、Flavobacterium ceti、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、卡他莫拉菌、摩氏摩根菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、多杀巴斯德氏菌、牙龈卟啉单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、产碱普罗威登斯菌、铜绿假单胞菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、殊异韦荣氏球菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌。通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401的位置的SNP,并应用表3中列出的规则,这些病原体可被分为七组。
[0169] 表3.
[0170]
[0171]
[0172] 因此,在位置396、398、399、400和401分别存在A、C、G、C和C指示,细菌为通常是革兰氏阳性细菌诸如炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌、肠乳杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链状真杆菌、艰难梭菌、红斑丹毒丝菌、牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌和Peptostreptococcus stomatis或选自幽门螺杆菌、大肠弯曲杆菌和殊异韦荣氏球菌的革兰氏阴性细菌的第1组病原体。
[0173] 在位置396、398、399、400和401分别存在G、C、G、C和C指示,细菌为选自诸如选自白喉棒状杆菌、刚果嗜皮菌、藤黄微球菌、马红球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌、结核分枝杆菌、杰氏棒状杆菌、解脲棒状杆菌、克氏动弯杆菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和Actinomyces massiliensis的革兰氏阳性细菌,或选自问号钩端螺旋体、沙眼衣原体和肺炎嗜性衣原体的革兰氏阴性细菌的第2组病原体。
[0174] 在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、G、C和C指示,细菌为是包括人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌、霍乱弧菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、鲍氏不动杆菌、流产布鲁氏菌和Flavobacterium ceti的需氧革兰氏阴性细菌的第3组病原体。
[0175] 位置396、398、399、400和401分别存在A、T、G、C和C指示,细菌为是包括嗜肺军团菌、洋葱伯克氏菌和Cardiobacterium valvarum的需氧革兰氏阴性细菌的第4组病原体。
[0176] 在位置396、398、399、400和401分别存在C、T、A、C和C指示,细菌为是需氧革兰氏阴性细菌诸如嗜麦芽寡养单胞菌的第5组病原体。
[0177] 在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和A指示,细菌为是厌氧革兰氏阴性细菌诸如,颊普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、脆弱拟杆菌或中间普雷沃氏菌的第6组病原体。
[0178] 在位置396、398、399、400和401分别存在C、A、G、T和C指示,细菌为是厌氧革兰氏阴性细菌诸如牙龈卟啉单胞菌的第7组病原体。
[0179] 通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、495、496、500和501的位置的SNP,并应用表4中列出的规则,被分类为第1组病原体可被进一步分为12个亚组,其中分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的A、A、C、C、G、A、C和A指示,细菌是革兰氏阳性细菌、需氧、且可能是万古霉素抗性的,并包括病原体炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的A、A、C、C、G、A、G和G指示,细菌是革兰氏阳性、需氧、β-溶血性链球菌的种,包括无乳链球菌、咽峡炎链球菌、星座链球菌、停乳链球菌、中间链球菌、酿脓链球菌;分别在位置490、491、492、493、495、
496、500和501的A、A、C、C、G、A、T、C指示,细菌是革兰氏阳性需氧菌,肠乳杆菌;分别在位置
490、491、492、493、495、496、500和501的A、A、C、G、A、T、C和A指示,细菌是革兰氏阴性螺旋需氧菌,幽门螺杆菌或大肠弯曲杆菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的A、A、G、G、G、G、C和C指示,细菌是革兰氏阳性、厌氧杆菌,产气荚膜梭菌;分别在位置490、491、
492、493、495、496、500和501的A、A、T、C、G、A、C和C指示,细菌是具有可能的苯唑西林抗性的革兰氏阳性葡萄球菌,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、A、A、G、A、T、C和T指示,细菌是革兰氏阳性厌氧杆菌,链状真杆菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和
501的G、A、A、T、G、A、C和C指示,细菌是革兰氏阴性厌氧球菌,殊异韦荣氏球菌;分别在位置
490、491、492、493、495、496、500和501的G、A、G、G、G、G、C和C指示,细菌是革兰氏阳性厌氧杆菌,艰难梭菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的T、A、C、C、G、A、C和C指示,细菌是革兰氏阳性杆菌,红斑丹毒丝菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的T、A、C、C、G、A、G和G指示,细菌是革兰氏阳性α-溶血性球菌,选自牛链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、肺炎链球菌、血链球菌、远缘链球菌;且分别在位置490、491、492、
493、495、496、500和501的T、G、T、G、G、G、C和C指示,细菌是革兰氏阳性、厌氧球菌,Peptostreptococcus stomatis。
[0180] 表4.
[0181]
[0182]
[0183] 通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置490、491、492、493、495、496、499和501的位置的SNP,并应用表5中列出的规则,被分类为第2组的病原体可被进一步分为9个亚组,其中分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的A、G、A、T、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性、耐酸杆菌,白喉棒状杆菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、C、A、G、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性球菌,选自刚果嗜皮菌、藤黄微球菌和马红球菌;分别在位置490、
491、492、493、495、496、500和501的G、C、A、G、G、G和G指示,细菌是革兰氏阳性、耐酸杆菌,环圈链霉菌或索马里链霉菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、C、C、T、A、A和C指示,细菌是革兰氏阴性螺旋细菌,问号钩端螺旋体;分别在位置490、491、492、493、
495、496、500和501的G、G、A、G、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性、耐酸杆菌,结核分枝杆菌;
分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、G、A、T、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性、耐酸杆菌,杰氏棒状杆菌或解脲棒状杆菌;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、G、G、G、G、G和G指示,细菌是革兰氏阳性、厌氧杆菌,克氏动弯杆菌;分别在位置
490、491、492、493、495、496、500和501的G、G、T、A、G、G和A指示,细菌是革兰氏阴性的并且是沙眼衣原体或肺炎嗜性衣原体;分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、T、A、G、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性杆菌、部分耐酸,并是需氧的星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌;且分别在位置490、491、492、493、495、496、500和501的G、T、T、G、G、G和A指示,细菌是革兰氏阳性杆菌、部分耐酸的,且是厌氧菌Actinomyces massiliensis。
[0184] 表5.
[0185]
[0186] 通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置490、491、496和501的位置的SNP,并应用表6中列出的规则,被分类为第3组的病原体可被进一步分为7个亚组,其中分别在位置490、491、496和501的A、C、G和A指示,细菌是革兰氏阴性球菌或球杆菌,选自人放线杆菌、迟缓爱德华菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、副溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、摩氏摩根菌、多杀巴斯德氏菌、产碱普罗威登斯菌和霍乱弧菌;分别在位置490、491、496和501的A、C、G和A指示,细菌是具有可能的超广谱β内酰胺酶抗性的革兰氏阴性细菌,包括卡他莫拉菌和铜绿假单胞菌;分别在位置490、491、496和501的G、A、T和A指示,细菌是革兰氏阴性双球菌,淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌;分别在位置490、491、496和501的G、C、G和A指示,细菌是具有可能的超广谱β内酰胺酶抗性的革兰氏阴性细菌,选自嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、痢疾志贺氏菌、索氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌;分别在位置490、491、496和501的G、C、T和A指示,细菌是具有可能的超广谱β内酰胺酶抗性的革兰氏阴性球菌,鲍氏不动杆菌;分别在位置490、491、496和501的G、G、G和C指示,细菌是流产布鲁氏菌;且分别在位置490、491、496和501的T、A、T和A指示,细菌是Flavobacterium ceti。
[0187] 表6.
[0188]
[0189] 通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置490、491、496和499的位置的SNP,并应用表7中列出的规则,被分类为第4组的病原体可被进一步分为3个亚组,其中分别在位置490、491、496和499的A、C、G和C指示,细菌是革兰氏阴性多形细菌,嗜肺军团菌;分别在位置490、491、496和499的G、A、T和G指示,细菌是兰氏阴性杆菌,洋葱伯克氏菌;且分别在位置490、491、496和499的G、C、G和G指示,细菌是革兰氏阴性杆菌,Cardiobacterium valvarum。
[0190] 表7.
[0191]组 状态 490 491 496 499
4a 革兰氏阴性、多形,嗜肺军团菌 A C G C
4b 革兰氏阴性、杆菌,洋葱伯克氏菌 G A T G
4c 革兰氏阴性、杆菌,Cardiobacterium valvarum G C G G
[0192] 第5组的病原体嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotropomonas maltophila),可被鉴定而不使用除表3中的SNP以外的额外SNP。
[0193] 通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置490、491和492的位置的SNP,并应用表8中列出的规则,被分类为第6组的病原体可被进一步分为4个亚组,其中分别在位置490、491和492的C、A和T指示,细菌是革兰氏阴性、厌氧、杆菌,颊普雷沃氏菌;分别在位置490、491和492的T、A和C指示,细菌是革兰氏阴性、厌氧、杆菌,产黑色普雷沃菌;分别在位置490、491和492的T、A和T指示,细菌是革兰氏阴性、厌氧、杆菌,脆弱拟杆菌;且分别在位置490、491和492的T、A和C指示,细菌是革兰氏阴性、厌氧、杆菌,中间普雷沃氏菌。
[0194] 表8.
[0195]组 状态 490 491 496
6a 革兰氏阴性、厌氧、杆菌颊普雷沃氏菌 C A T
6b 革兰氏阴性、厌氧、杆菌产黑色普雷沃氏菌 T A C
6c 革兰氏阴性、厌氧、杆菌脆弱拟杆菌 T A T
6d 革兰氏阴性、厌氧、杆菌中间普雷沃氏菌 T T C
[0196] 第7组的病原体牙龈卟啉单胞菌可被鉴定而不使用除表3的SNP以外的额外SNP。
[0197] 因此,利用本发明的方法可分析来自患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者或怀疑患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者,例如展示有SIRS的人类受试者的样品,诸如血液样品,以准确和快速地确定一种细菌是否可能是诱因(即,样品中是否存在该细菌),以及该细菌是否是革兰氏阳性或革兰氏阴性、抗酸或非抗酸、需氧或厌氧、和/或大的可能的抗生素抗性组的部分。利用表3-8中的信息,细菌物种的身份也可被缩小范围,或在一些情形中被确认。
[0198] 2.3利用16S rRNA中的1种或更多种SNP分类通常导致败血症的哺乳动物(例如,人类)病原体
[0199] 通常在哺乳动物(例如,人类)中导致败血症的细菌病原体包括革兰氏阳性细菌,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、绿色链霉菌组(咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌)、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌、和革兰氏阴性细菌大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌和产黑色普雷沃氏菌。通过分析核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中所列的16S rRNA基因的位置396和398的位置的SNP,并应用表1中列出的规则,这些病原体可被分为革兰氏阳性或革兰氏阴性,其中在位置396的C和在位置398的T、A或C指示,细菌是革兰氏阴性细菌;而在位置396的A、T或G和在位置398的C指示,细菌是革兰氏阳性细菌。
[0200] 事实上,这一亚组的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态可基于16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA基因的位置396的位置的仅单个SNP来确定。具体地,在对应于SEQ ID NO:1的位置396的位置的C指示,细菌是革兰氏阴性细菌,而A、T或G指示,细菌是革兰氏阳性细菌。因此,本发明提供通过分析来自样品的核酸在16S rRNA基因(或16S rRNA分子或其DNA拷贝)中在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396的位置的SNP来确定该样品中细菌的革兰氏状态的方法,其中在位置396的C指示,样品中的细菌是革兰氏阴性细菌;而在位置396的A、T或G指示,细菌是革兰氏阳性细菌。样品中的细菌可能是哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌,诸如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、绿色链霉菌组(咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌)、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌或产黑色普雷沃氏菌。因此,本发明提供检测来自患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者或怀疑患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者,例如展示有SIRS的哺乳动物(例如,人类)受试者的样品,诸如血液样品中的细菌的方法,且如果检测到所述细菌,则确定所述细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性的。
[0201] 可在哺乳动物(例如,人类)中导致败血症但不如以上所述的那些常见的其他细菌包括例如,革兰氏阴性细菌,肠道沙门氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣荣氏球菌和琼脂韦荣氏球菌;和革兰氏阳性细菌,环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。在这些之中,大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌和琼脂韦荣氏球菌不遵循以上所述的规则且因此不能仅利用在位置396的SNP或在位置396和398的SNP而被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性。为了准确地将也导致败血症的这些细菌病原体分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性,可使用在位置278、286和648(编号对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA)的另外3个SNP。因此,在位置
396、398、278、286和648的共5个SNP可用于确定哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的以下细菌病原体的革兰氏状态:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、绿色链霉菌组(咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌)、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌。
[0202] 利用以上定义的五个SNP对可导致哺乳动物(例如,人类)败血症的这些革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌分类的一般规则如下:
[0203] 如果位置396是C,则细菌是革兰氏阴性的且包括表9中的种;而如果位置396是A或G,则细菌是革兰氏阳性的且包括表10中的种。
[0204] 表9.
[0205]
[0206]
[0207] 表10.
[0208]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 结核分枝杆菌 G C G G A
阳性 索马里链霉菌 G C G G A
阳性 环圈链霉菌 G C G G T
[0209] 如果位置396、398和278是A、C和T(分别地),则细菌是革兰氏阴性的且包括表11中的种。
[0210] 如果位置396、398和278是A、C和C(分别地),则细菌是革兰氏阳性的且包括表12中的种。
[0211] 表11.
[0212]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 大肠弯曲杆菌 A C T T A
阴性 空肠弯曲杆菌 A C T T A
阴性 红嘴鸥弯曲杆菌 A C T T A
阴性 胎儿弯曲杆菌 A C T A A
阴性 同性恋螺杆菌 A C T G T
阴性 幽门螺杆菌 A C T G A
阴性 流产嗜性衣原体 A C T T T
[0213] 表12.
[0214]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 粪肠球菌 A C C A A
阳性 屎肠球菌 A C C A A
[0215] 如果位置396、398和278是A、C、G且位置286是A,则细菌是革兰氏阳性的且包括表13中的种。
[0216] 表13.
[0217]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 牛链球菌 A C G A A
阳性 无乳链球菌 A C G A G
阳性 停乳链球菌 A C G A G
阳性 酿脓链球菌 A C G A G
阳性 咽峡炎链球菌 A C G A T
阳性 中间链球菌 A C G A T
阳性 缓症链球菌 A C G A T
阳性 变异链球菌 A C G A T
阳性 肺炎链球菌 A C G A T
阳性 血链球菌 A C G A T
[0218] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、A,则细菌是革兰氏阳性的且包括表14中的种。
[0219] 表14.
[0220]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 金黄色葡萄球菌 A C A A A
阳性 远缘链球菌 A C A A A
阳性 星座链球菌 A C A A T
阳性 口腔链球菌 A C A A T
[0221] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、G且位置648是G,则细菌是革兰氏阴性且包括表15中的种。
[0222] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、G且位置648是A,则细菌是革兰氏阳性且包括表16中的种。
[0223] 表15.
[0224]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 琼脂韦荣氏球菌 A C A G G
[0225] 表16.
[0226]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 表皮葡萄球菌 A C A G A
阳性 人葡萄球菌 A C A G A
[0227] 如果位置396、398、278和286是A、C、G和G(分别地)且位置648是G,则细菌是革兰氏阴性的且包括表17中的种。
[0228] 如果位置396、398、278和286是A、C、G和G且位置648是A或T,则细菌是革兰氏阳性的且包括表18中的种。
[0229] 表17.
[0230]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 非典型韦荣氏球菌 A C G G G
阴性 小韦荣氏球菌 A C G G G
阴性 龋齿韦荣氏球菌 A C G G G
[0231] 表18.
[0232]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 溶血葡萄球菌 A C G G A
阳性 腐生葡萄球菌 A C G G A
阳性 产气荚膜梭菌 A C G G T
[0233] 因此,通过分析核酸在16S rRNA(或16S rRNA或其DNA拷贝)的位置396、398、378、386和648的SNP可确定大多数哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌的革兰氏状态,其中当在位置396存在C;或在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在T;在位置396存在A、在位置398存在C、在位置278存在A、在位置286存在G和在位置648存在G;或在位置
396存在A、在位置398存在C、在位置278存在G、在位置286存在G和在位置648存在G时,确定细菌病原体是革兰氏阴性细菌;且当在位置396存在G;或在位置396存在A、在位置398存在C和在位置278存在C;或在位置396存在A、在位置398存在C,在位置278存在G和在位置286存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A和在位置286存在A;或在位置
396存在A,在位置398存在C,在位置278存在A,在位置286存在G和在位置648存在A;或在位置396存在A,在位置398存在C,在位置278存在G,在位置286存在G和在位置648存在T或A时,确定细菌病原体是革兰氏阳性细菌。
[0234] 因此,利用本发明的方法可分析来自患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者或怀疑患败血症的哺乳动物(例如,人类)受试者,例如展示有SIRS的哺乳动物(例如,人类)受试者的样品,诸如血液样品,以准确和快速地确定一种细菌是否可能是诱因(即,样品中是否存在该细菌),以及该细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性。利用表9-18中的信息,细菌的种的身份还可被缩小范围,或在一些情形中被确认。
[0235] 2.4利用5.8S rRNA中的SNP区分真菌细胞与哺乳动物细胞或原核生物
[0236] 5.8S rRNA分子是真核生物特有的。如本文确定的,5.8S rRNA基因内的(以及因此5.8S rRNA分子内的)许多SNP是真菌真核生物(包括酵母),诸如哺乳动物(例如,人类)真菌病原体,白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌特有的,并因此可用于区分此类真菌细胞与哺乳动物细胞。由于5.8S rRNA分子在原核生物中不存在,相同的SNP可用于区分真菌细胞与原核生物诸如细菌。如此,这些SNP可用于确定样品中真菌细胞的存在。
[0237] 在对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、
245、251、256的任一位置的SNP可用于鉴定样品中真菌细胞诸如白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的存在,并将它们与与哺乳动物细胞区分。真菌和哺乳动物细胞的5.8S rRNA基因中这些位置的SNP显示在表19中。
[0238] 表19.
[0239]
[0240]
[0241] 因此,本发明提供通过分析来自样品的核酸在对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因的位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、245、251、256的任一位置的SNP而快速检测样品中真菌细胞的存在的方法,其中在位置142的C;在位置144的A;在位置146的A;在位置147的A;在位置148的C;在位置154的T;在位置157的T;在位置164的C或G;在位置167的A;在位置
185的G;在位置187的A;在位置188的A;在位置194的T;在位置197的G;在位置213的A;在位置215的T;在位置216的T;在位置219的G;在位置223的A;在位置231的G或A;在位置232的T;
在位置236的T;在位置245的C或A;在位置251的C;或在位置256的T指示真菌细胞的存在。与之相比,哺乳动物细胞的5.8S rRNA基因包含在位置142的T;在位置144的G;在位置146的G;
在位置147的G;在位置148的T;在位置154的A;在位置157的C;在位置164的T;在位置167的G;在位置185的T;在位置187的G;在位置188的C;在位置194的G;在位置197的T;在位置213的G;在位置215的C;在位置216的A;在位置219的T;在位置处223无;在位置231的C;在位置
232的A;在位置236的C;在位置245处无;在位置251的G;或在位置256的G。由这一方法鉴定的真菌细胞可包括,例如,白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌。
[0242] 2.5利用5.8S rRNA中的SNP鉴定哺乳动物(例如,人类)真菌病原体
[0243] 多种真菌物种是已知的哺乳动物(例如,人类)病原体。这些包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌。5.8S rRNA基因中4个SNP的组合(以及因此5.8S rRNA分子或其DNA拷贝中的4个SNP的组合)可用于准确鉴定和区分这些物种的每一种。
[0244] 可用于鉴定和区分这十一种哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的4个SNP的组合包括,在位置254;位置160或255之一;和位置163、164、165、196、202、223、224和259的任何2个的SNP,编号对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因。表20列出了对于每一种病原体在每个位置的SNP。因此,本发明提供通过分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因中的至少4个SNP而确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体身份的方法,其中所述SNP在位置254;位置160或255之一;和位置163、164、165、196、202、223、224和259的任何2个处。
[0245] 表20.
[0246]
[0247] 由于SNP 164和223还可用于区分真菌与哺乳动物细胞,利用在位置164或223的SNP的组合能够完全辨别哺乳动物背景中的11种病原体真菌物种。因此在一个实例中,本发明提供通过分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因中的至少4个SNP而确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体身份的方法,其中SNP包括在位置254;位置160或255之一;位置164和位置163、165、196、202、223、224和259之一的SNP。在另一个实例中,这些方法包括分析来自样品的核酸的至少4个SNP,其中这些SNP包括在位置254;位置160或255之一;位置223和位置163、164、165、196、202、224和259之一的SNP。利用此类方法,可准确鉴定样品,包括来自哺乳动物,包括人类受试者的生物样品中的病原性真菌物种。
[0248] 另外,SNP 163和164可区分念珠菌属的种与其他真菌病原体。因此在另一个实例中,本发明提供通过分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因中的至少两个SNP而确定样品中哺乳动物(例如,人类)真菌病原体身份的方法,其中:所述至少两个SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和位置对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示,样品中的真菌病原体是念珠菌属的种。在相关实例中,本发明还提供通过分析来自样品的核酸在5.8S rRNA基因中的至少两个SNP而确定样品中念珠菌属物种的存在或不存在的方法,其中:所述至少两个SNP在对应于SEQ ID NO:2的位置163的位置和位置对应于SEQ ID NO:2的位置164的位置,其中在位置163存在T和在位置164存在C指示样品中念珠菌属的种的存在,且其中在位置163不存在T和在位置164不存在C指示样品中不存在念珠菌属的种。在以上实例的具体实施方案中,念珠菌属的种选自白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌和光滑念珠菌。
[0249] 3.筛选特定多态性以根据本发明分类微生物
[0250] 本领域已知的检测一个或更多个SNP的任何方法可用在本文描述的方法中以分类和/或鉴定样品中的微生物。在特定实施方案中,这些方法还帮助定量样品中的微生物,即,确定或估计样品中细菌和/或真菌的数量。许多方法是本领域已知用于确定样品中在对应于单核苷酸多态性的特定位置的核苷酸存在。用于检测多态性的各种工具包括包括但不限于,DNA测序、扫描技术、基于杂交的技术、基于延伸的分析、基于掺入的技术、基于限制性内切酶的分析和基于连接的技术。
[0251] 根据本发明的方法可鉴定本文描述的在16S rRNA和/或5.8S rRNA基因内、在16S rRNA和/或5.8S rRNA分子内或在其DNA拷贝内和对于任一条链的多态性。在一些实例中,检测多态性的方法利用扩增的第一步骤,且扩增可来自16S rRNA和/或5.8S rRNA基因或来自16S rRNA和/或5.8S rRNA分子的DNA拷贝。
[0252] 核酸可来自受试者的生物样品或来自环境样品,所述环境样品诸如空气、土壤或水样品、滤出物、食物或工业制品、或来自表面,诸如来自医疗器械或工作场所的表面的擦拭物。受试者可以是人类受试者或非人类受试者,诸如哺乳动物受试者,诸如灵长类动物、家畜动物(例如,绵羊、牛、马、驴、猪、山羊)、实验室试验动物(例如,兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如,猫、狗)和捕获的野生动物(例如,狐、鹿、澳洲野狗)。来自受试者的生物样品可来自受试者身体的任何部分,包括但不限于体液诸如血液、唾液、或痰、或尿液、粪便、细胞、组织或活检组织。在其他实例中,核酸从培养的细胞获得。在特定实例中,被分析的核酸来自展示有SIRS的哺乳动物(例如,人类)受试者的生物样品。这样的受试者可能患败血症和/或可能被怀疑患败血症。
[0253] 按照本发明的方法被分析的核酸可当在样品内时被分析,或可先从样品中被提取,例如在分析之前从样品中被分离。用于从样品分类核酸的任何方法可用在本发明的方法中,且此类方法是本领域技术人员熟知的。所提取的核酸可包括DNA和/或RNA(包括mRNA或rRNA)。在一些实例中,进一步的逆转录步骤可在分析之前被包括在方法中。因此,将被分析的核酸可包括16S rRNA基因、16S rRNA、16S rRNA的DNA拷贝、5.8S rRNA基因、5.8S rRNA、5.8S rRNA的DNA拷贝、或其任何组合。所述核酸还可包含构成16S rRNA基因、16S rRNA、16S rRNA的DNA拷贝、5.8S rRNA基因、5.8S rRNA、或5.8S rRNA的DNA拷贝的部分,只要该部分包含待被分析SNP的核酸位置。
[0254] 在一些情形中,这些方法包括扩增核酸。在此类情形中,合适的核酸扩增技术是本领域普通技术人员熟知的,并包括例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,Inc.1994-1998)中描述的聚合酶链式反应(PCR)、例如美国专利号5 ,422,252中描述的链置换扩增(SDA );例如Liu等人 ,( 1996 ,J.Am.Chem.Soc.118.1587-1594和国际申请WO 92/01813)和Lizardi等人,(International Application WO 97/19193)中描述的滚环扩增(RCR);例如Sooknanan等人,(1994,
Biotechniques 17:1077-1080)中描述的基于核酸序列的扩增(NASBA);连接酶链式反应(LCR);简单序列重复分析(SSR);分支DNA扩增测定(b-DNA);转录扩增和自维持序列复制;
和例如Tyagi等人,(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.BRIC 935395-5400)中描述的Q-β复制酶扩增。
[0255] 此类方法可利用一种或更多种寡核苷酸探针或引物,包括例如选择性杂交于靶多核苷酸的扩增引物对,所述靶多核苷酸包含一个或更多个SNP。在实践本发明的方法中有用的寡核苷酸探针可包括,例如,与靶多核苷酸的包括SNP位置的部分互补并跨越其的寡核苷酸,其中在多态性位点的特定核苷酸(即,SNP)的存在通过存在或不存在探针的选择性杂交来检测。此类方法还可包括将靶多核苷酸和杂交的寡核苷酸与内切酶接触,并根据在多态性位点核苷酸的出现是否与探针的对应核苷酸互补来检测探针的裂解产物的存在或不存在。
[0256] 引物可利用任何方便的合成方法制造。此类方法的实例可见于“Protocols for Oligonucleotides and Analogues;Synthesis and Properties”,Methods in Molecular Biology Series;第20卷;Sudhir Agrawal编辑,Humana ISBN:0-89603-247-7;1993。引物还可被标记以帮助检测。
[0257] 对检测SNP有用的任何方法可用在本发明中,且许多不同的方法是本领域已知用于SNP基因分型的(综述参见 A.C.(2001)Nat.Rev.Genet.2,930–942(2001);Kwok,P.Y.(2001)Ann Rev Genomics Hum Genet 2,235–258;Kim S,Misra A.(2007)Ann Rev Biomed Eng.9:289-320)。此类方法可由连续使用三个步骤组成,包括“反应”(例如杂交、连接、延伸和裂解)、随后“分离”(例如固相微量滴定板、微粒或阵列、凝胶电泳、溶液相均质化或半均质化(solution-phase homogenous or semi-homogenous))、随后“检测”(例如间接比色、质谱、荧光、荧光共振能量转移、荧光偏振和化学发光)。不存在针对所有应用的一种理想SNP基因分型方法,且鉴于各种参数例如样品尺寸和待分析的SNP的数量来确定最适当的方法已在本领域技术人员的能力范围内。
[0258] 特别适宜于临床使用且依赖于询问少数目的SNP的示例技术快速、灵敏(通过扩增样品中的核酸)、一步骤、实时测量输出、能够被多重化和自动化、相对廉价、且准确,包括但不限于, 测定(5’核酸酶测定,Applied Biosystems)、分子信标探针诸如(Invitrogen)或 探针(Sigma Aldrich)和模板定向的染料掺入
(Template Directed Dye Incorporation)(TDI,Perkin Elmer)。例如,
(Applied Biosystems)利用与等位基因特异性探针杂交、溶液相均质化、和荧光共振能量转移的组合。 测定依赖于正向引物和反向引物和Taq DNA聚合酶以扩增核酸、联
合Taq DNA聚合酶的5’-核酸酶活性以降解被设计为跨SNP位点结合的标记的探针。反应、分离和检测都可同时进行且随着反应进行实时读取结果。尽管此类方法不适宜同时分析大量的SNP,但是其尤其适合以合理的成本快速、灵敏且准确地询问少量SNP。
[0259] 尽管一些方法可能比其他方法的更适合,但是本领域已知的检测一个或更多个SNP的任何方法可用在本文所述的分类和/或鉴定样品中的微生物的方法中。此类方法的非限制性实例描述于下文。
[0260] 3.1核酸测序技术
[0261] 在一些实施方案中,多态性通过核酸测序技术鉴定。具体地,跨越SNP位点的扩增产物可利用传统测序方法学测序(例如,“双脱氧法介导的链终止方法”,还称为“Sanger方法”(Sanger,F.,等人,(1975)J.Molecular,Biol.94:441;Prober等人,1987,Science,238:336-340)和“化学降解法”,还称为“Maxam-Gilbert法”(Maxam,A.M.,等人,(1977)
Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74:560),这二份参考文献通过引用并入本文以确定在SNP位点的核苷酸存在。
[0262] Boyce-Jacino等人,美国专利号6,294,336提供了通过利用选择性结合某个位点处的多核苷酸靶的引物来确定核酸分子(DNA或RNA)序列的固相测序方法,其中SNP是选择性结合靶的最3'的核苷酸。还可采用其他测序技术诸如变性高压液相色谱法或质谱法。
[0263] 在其他示例性实例中,测序方法包括称为PyrosequencingTM的技术。该方法基于焦磷酸在DNA的聚合期间脱氧核苷酸被并入的任何时候的生成。焦磷酸的生成与荧光素酶催化的反应偶合,使得如果特定脱氧核苷酸被并入,则发射出光,生成定量性和辨别性的热解图。样品加工包括用生物素化的引物的PCR扩增,分离链霉亲和素包被的珠(或其他固相)上的生物素化的单链扩增子和测序引物的退火。然后通过PyrosequenceTM分析样品,其加入指示反应(indicator reaction)所需的许多酶和底物,包括硫酸化酶和荧光素酶、以及用于降解未被并入的核苷酸的pyrase。然后通过添加四种脱氧核苷酸来询问样品。光发射可由电荷耦合器照相机(CCD)检测并与所并入的核苷酸的数目成比例。结果由模式识别装置自动分配。
[0264] 可选地,本发明的方法可利用“微测序”方法鉴定核酸序列中多态性位点处核苷酸的存在。微测序方法确定“预先确定的”位点处的仅单个核苷酸的身份。此类方法在确定靶多核苷酸中多态性的存在和身份方面特别有用。此类微测序方法、以及用于确定在多态性位点处核苷酸的存在的其他方法在通过引用并入本文的Boyce-Jacino等人的美国专利号6294336中被讨论。
[0265] 微测序方法包括Goelet,P.等人WO 92/15712中公开的Genetic Bit AnalysisTM方法。用于测定DNA中多态性位点的另外的引物-导引的、核苷酸并入程序也已被描述(Komher,J.S.等人,(1989)Nucl.Acids.Res.17:7779-7784;Sokolov,B.P.,(1990)
Nucl.Acids Res.18:3671;Syvanen,A.C,等人,(1990)Genomics,8:684-692;Kuppuswamy,M.N.等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1143-1147;Prezant,T.R.等人,
(1992)Hum.Mutat.1:159-164;Ugozzoli,L.等人,1992,GATA,9:107-112;Nyren,P.等人,(1993)Anal.Biochem.208:171-175;和Wallace,WO89/10414)。这些方法与Genetic Bit AnalysisTM的不同之处在于,这些方法依赖于并入标记的脱氧核苷酸以区分多态性位点处的多个碱基。以这样的方式,由于信号与并入的脱氧核苷酸的数目成比例,在相同核苷酸的运行中出现的多态性可产生与运行的长度成比例的信号(Syvanen,A.C.,等人,(1993)
Amer.J.Hum.Genet.52:46-59)。
[0266] 另外的微测序方法已由Mundy,C.R.(美国专利号4,656,127)和Cohen,D.等人(法国专利2,650,840;PCT公布号WO91/02087)提供,其涉及基于溶液的用于确定多态性位点的核苷酸的身份的方法。如同在美国专利号4,656,127的Mundy方法中一样,采用与3'紧邻多态性位点的等位基因序列互补的引物。
[0267] 在其他示例性实例中,例如,Macevicz(美国专利号5,002,867)描述了经由与寡核苷酸探针的多种混合物杂交确定核酸序列的方法。根据此类方法,通过允许靶与在一个位置具有不变核苷酸而在其他位置具有变体核苷酸的多个探针组顺序地杂交来确定靶多核苷酸的序列。Macevicz方法通过以下确定靶的核苷酸序列:将靶与一组探针杂交,然后确定位点的数目(即,“匹配”的数目),该组的至少一个成员能够与靶杂交。重复这一程序,直到一组探针中的每个成员已被测试。
[0268] 可选地,带有荧光偏振检测(FP-TDI)测定的模板介导的染料-终止物掺入测定(Chen等人,1999)是一种形式的引物延伸测定,也称为微型测序或单碱基延伸测定
(Syvanen,1994)。该引物延伸测定能够检测SNP。DNA测序方案确定3'紧邻SNP特异性测序引物的那个碱基的性质,所述SNP特异性测序引物紧邻多态性位点的上游退火到靶DNA。在DNA聚合酶和适当的双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)存在下,引物受靶DNA序列命令在多态性位点特异性地延伸一个碱基。通过确定并入了哪个ddNTP,可推断靶DNA中存在的等位基因。
[0269] 3.2基于多态性杂交的技术
[0270] 用于检测核苷酸序列中多态性的杂交技术可包括,但不限于 测定(Applied Biosystems)、斑点印迹、反向斑点印迹、多重等位基因特异性诊断测定(MASDA)、动态等位基因特异性杂交(DASH)Jobs等人,(Genome Res(2003)13:916-924)、分子信标和DNA印迹法。
[0271] 用于鉴定核苷酸序列中的SNP的 测定(还称为5'核酸酶测定或5'消化测定)基于置换并裂解与靶DNA杂交的寡核苷酸探针的Taq聚合酶的核酸酶活性,生成荧光信号。要求对特定SNP特异性的 探针,每个探针具有附加于5'末端的荧光染料
附加于3'末端的猝灭剂。当探针完整时,猝灭剂通过荧光共振能量转移(FRET)与荧光团相互作用,猝灭其荧光。在PCR退火步骤期间, 探针与靶DNA杂交。在延伸步骤中,荧
光染料被Taq聚合酶的核酸酶活性裂解,导致报告染料荧光的增加。错配探针被置换而不被片段化。样品的基因型通过测量两种不同染料的信号强度来确定。
[0272] 另一种有用的SNP鉴定方法包括DASH(动态等位基因特异性杂交),其包括随着反应温度稳定升高,动态追踪与靶(PCR产物)杂交的探针(寡核苷酸)以鉴定多态性(Prince,J.A等人,(2001)Genome Res,11(1):152-162)。
[0273] 在一些实施方案中,多重等位基因特异性诊断测定(MASDA)可用于分析大数目的样品(>500)。MASDA利用寡核苷酸杂交来询问DNA序列。多重DNA样品被固定在固体支持物上并与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针的集进行单杂交。与给定样品中存在的特定多态性互补的任何探针被靶DNA有效地从池中亲和性纯化。由结合的ASO的化学或酶测序生成的序列特异性条带模式(指纹)容易地鉴定这些特定突变。
[0274] 存在许多替代的基于杂交的技术,包括,尤其是,分子信标和 探针(Tyagi,S和Kramer,F.R.,(1996)Nat.Biotechnol,14:303-308;Thelwell等人,(2000)
Nucleic Acid Res.28(19):3752-3761)。分子信标包括在其5'和3'末端具有荧光报告物和猝灭染料的寡核苷酸。寡核苷酸的中间部分跨靶序列杂交,但5'和3'侧翼区域彼此互补。未与其靶序列杂交时,5'和3'侧翼区域杂交形成茎环结构,且由于报告物和猝灭染料接近而几乎不存在荧光。然而,与其靶序列杂交后,染料被分离且存在荧光的大量增加。与完全互补杂合体相比,错配的探针-靶杂合体在明显更低的温度下分离。存在“信标”方法的许多变化形式。 探针是类似的但并入PCR引物序列作为探针的一部分。还已开发更新的
“双链体”形式。
[0275] 在一些实施方案中,鉴定SNP的另外方法包括SNP-ITTM方法(Orchid BioSciences,Inc.,Princeton,N.J.)。通常,SNP-ITTM是3-步骤引物延伸反应。在第一步骤中,靶多核苷酸通过与捕获引物杂交而被从样品中分离,这提供第一水平的特异性。在第二步骤中,捕获引物从终点的核苷酸三磷酸在靶SNP位点延伸,这提供第二水平的特异性。在第三步骤中,被延伸的核苷酸三磷酸可利用多种已知形式检测,包括:直接荧光、间接荧光、间接比色测定、质谱、荧光偏振等等。反应可利用SNPstream.TM仪器(Orchid BioSciences,Inc.,Princeton,N.J.)在自动格式中的384孔格式中处理。
[0276] 在这些实施方案中,扩增产物可通过使用或不使用放射性探针的DNA印迹分析检测。例如,在一个这样的方法中,扩增包含非常低水平的多态性位点的核酸序列的小DNA样品,和经由DNA印迹技术分析或类似地利用斑点杂交分析。高水平的扩增信号使非放射性探针或标记的使用容易。可选地,用于检测扩增产物的探针可直接或间接被可检测地标记,例如标记放射同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。
[0277] 杂交条件诸如盐浓度和温度可为待筛选的核苷酸序列调整。DNA印迹和杂交方案描述于Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience),第2.9.1-2.9.10页。可标记探针与随机寡聚物和DNA聚合酶的Klenow片段的杂交。非常高特异性活性的探针可利用市售试剂盒诸如Ready-To-Go DNA Labeling Beads (Pharmacia Biotech)按照制造商的方案获得。具有高重复序列含量的探针的可能性竞争以及杂交严格度和冲洗将单独确定所使用的每个探针。可选地,候选序列的片段可通过PCR生成,特异性可利用啮齿动物-人类体细胞杂合板(hybrid panel)并亚克隆片段来验证。这需要测序的和用作探针的大量制备工作。一旦给定基因片段已被鉴定,小探针制备物可通过纯化PCR产物的凝胶或柱来实现。
[0278] 可用在斑点印迹、反向斑点印迹、多重和MASDA形式中的适合的材料是本领域已知的并且包括但不限于,尼龙和硝酸纤维素膜。
[0279] 3.3多态性扫描技术
[0280] 本发明设想的用于检测核苷酸序列中的多态性的扫描技术可包括但不限于,化学错配裂解法(CMC)(Saleeba,J.A等人,(1992)Huma.Mutat,1:63-69)、错配修复酶裂解发(MREC)(Lu,A.L和Hsu,I.C.,(1992)Genomics,14(2):249-255)、化学裂解技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)Wartell等人,(1990)Nucl.Acids Res.18:2699-2705和Sheffield等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236);温度梯度凝胶电泳(TGGE)(Salimullah,等人,(2005)Cellular and Mol.Biol.Letts,10:237-245)、恒定变性凝胶电泳(CDGE)、单链构象多态性(SSCP)分析(Kumar,D等人,(2006)Genet.Mol.Biol,29(2):287-289)、异源双链体分析(HA)(Nagamine,C.M等人,(1989)Am.J.Hum.Genet,45:337-339)、微卫星标志物分析和单链多态性测定(SSPA)。
[0281] 在一些实施方案中,本发明的SNP通过CMC检测,其中放射性标记的DNA野生型序列(探针)与包含推定改变的扩增序列杂交以形成异源双链体。化学修饰、随后是哌啶裂解用于去除异源双链体中的错配泡。变性的异源双链体的凝胶电泳和放射自显影允许可视化裂解产物。四氧化锇用于修饰错配的胸苷且羟胺用于修饰错配的胞嘧啶。另外,标记探针DNA的反义链允许检测腺苷和苷错配。错配的化学裂解可用于检测长DNA片段中几乎100%的突变。而且,此方法提供测试片段内的突变的准确表征和确切位置。最近,该方法已被修改以使CMC更适合通过利用荧光引物而自动化,也能够多重化并从而减少操作的数量。可选地,经由PCR并入的荧光标记的dUTP允许靶和探针DNA链二者的内部标记并因而允许标记每个可能的杂合体,使突变检测的机会加倍并几乎保证100%检测。
[0282] 在其他实施方案中,错配修复酶裂解(MREC)测定用于鉴定本发明的SNP。MREC依赖于对包含错配的DNA特异的缺口酶系统。通过变性和允许再次退火扩增产物,通过PCR扩增感兴趣的序列且可能在PCR结束时生成同源双链体和异源双链体物质。这些杂合体用错配修复酶处理,然后通过变性凝胶电泳分析。MREC测定利用三种错配修复酶。MutY核酸内切酶从错配物中去除腺嘌呤并用于检测A/T和C/G颠换和G/C和T/A转换。哺乳动物胸腺嘌呤糖基化酶从T/G、T/C和T/T错配物中去除胸腺嘌呤并用于检测G/C和A/T转换以及A/T和G/C和T/A和A/T颠换。来自人类或小牛胸腺的所有类型的核酸内切酶或拓朴异构酶I可识别所有八种错配和可用于扫描任何核苷酸取代。MREC可使用可被并入到两条DNA链中的特定标记,从而允许鉴定给定位点中四种可能的核苷酸取代。
[0283] 在一些实施方案中,如美国专利号5,217,863(R.G.H.Cotton)中描述的化学裂解分析用于鉴定核苷酸序列中的SNP。类似异源双链体分析,化学裂解检测错配的等位基因序列彼此杂交时导致的不同特性。不将这一差异检测为凝胶上改变的迁移率,使用例如羟胺或四氧化锇、随后是哌啶以杂合体对化学裂解的改变的易感性检测这一差异。
[0284] 在本发明设想的裂解方法中,RNA酶A依赖于异源双链体错配分析的原理。在RNA酶A裂解方法中,通过PCR扩增获得的放射性标记的核糖探针和DNA之间的RNA-DNA异源双链体,通过利用RNA酶A在RNA:DNA杂合体中的错配点裂解单链RNA的能力,被RNA酶A酶促裂解。在这之后是是电泳和放射自显影。突变的存在和位置通过给定大小的裂解产物指示
(Meyers,R.M等人,(1985)Science,230:1242-1246和Gibbs,R.A和Caskey,T,1987,
Science,236:303-305)。
[0285] 通过酶裂解或化学裂解,DNA探针还可用于检测错配。参见例如,Cotton,等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397;Shenk等人,(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:989;和Novack等人,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:586。
[0286] 在一些实施方案中,采用 测定(Third WaveTM Technology)扫描本发明的16S rRNA和/或5.8S rRNA基因中的多态性。例如, 测定基于Flap内切核酸酶对
当两个重叠的寡核苷酸与靶DNA完全杂交时形成的三维结构的识别和裂解的特异性
(Lyamichev,V等人,(1999)Nat Biotechnol,17:292-296)。
[0287] 可选地,变性梯度凝胶电泳(DGGE)是分离和鉴定序列变体的有用技术。DGGE通常在恒定浓度的聚丙烯酰胺凝胶中进行,所述凝胶块在量线性增加的变性剂(通常是甲酰胺和尿素,阴极阳极)存在下成型。DGGE的变化形式采用沿着迁移路径的温度梯度并称为TGGE。通过DGGE或TGGE的分离是基于该事实:凝胶中部分解链的DNA分子的电泳迁移率与未解链的分子相比大大降低。
[0288] 在一些实施方案中,恒定变性凝胶电泳(CDGE)用于检测核苷酸序列中的SNP,如在Smith-Sorenson等人,(1993)Human Mutation 2:274-285(还参见,Anderson&Borreson,(1995)Diagnostic Molecular Pathology 4:203-211)中详细描述的。给定的DNA双链体在具有恒定变性剂的凝胶中以预先确定的、特征性的方式解链。突变改变这一运动。异常迁移的片段被分离并测序以确定具体的突变。
[0289] 在其他实施方案中,单链构象多态性(SSCP)分析提供检测本发明的SNP的方法。SSCP是基于分离的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率变化的方法。电泳迁移率取决于分子的尺寸和形状二者,且单链DNA分子回折到其自身并生成二级结构,所述二级结构以序列依赖性的方式由分子内相互作用决定。单核苷酸取代可改变单链的二级结构并因此改变电泳迁移率,导致放射自显影上的条带移动。给定的核苷酸变异改变单链构象的能力基于适当的理论模型是不可预测的,且二级结构的环或长的稳定恶茎中出现的碱基变化可能无法通过SSCP检测。标准SSCP在检测150-200bp的片段中的序列变化方面达到最大可靠性。已经开发了更高级的方案,允许以等于基于放射性的SSCP分析的灵敏度的灵敏度检测突变。这些方法在PCR中使用荧光-标记的引物并用基于荧光的自动化测序机器分析产物。多色荧光SSCP还允许在每个泳道中包括内部标准,内部标准可用于相对于彼此比较来自每个泳道的数据。增加检测率的其他变化形式包括基于双脱氧测序法的双脱氧指纹(ddF)和限制性内切核酸酶指纹(REF)。
[0290] ddF法是SSCP和Sanger双脱氧测序的组合,其包括对一个双脱氧核苷酸的Sanger测序反应的非变性凝胶电泳。以这种方式,可筛选例如250-bp的片段以鉴定SNP。REF是对SSCP的更复杂的修改,允许筛选大于1kb的片段。对于REF,用PCR扩增靶序列,用五到六种不同的限制性内切核酸酶独立消化,并在非变性凝胶上通过SSCP分析。在使用六种限制性酶的情形中,序列变化将存在于六种不同的限制性片段中,从而生成12种不同的单链区段。这些片段中任何一个的迁移率改变足以明确本发明的SNP的存在。获得的限制性模式使得能够定位所检查的区域中的改变。
[0291] 在一些实施方案中,异源双链体分析(HA)检测PCR产物或核苷酸序列中的单碱基取代。HA可快速进行而无需无放射性同位素或专门设备。HA方法通过加热和复性PCR产物利用了在一个或更多个位置具有不同核苷酸的序列之间的异源双链体的形成。由于错配的碱基周围的更开放的双链构造,异源双链体比其相应的同源双链体迁移得慢,然后被检测为具有减少的迁移率的条带。HA法检测特定单碱基取代的能力不能仅由知晓错配的碱基来预测,因为相邻的核苷酸对错配的区域的构造具有显著的影响,且基于长度的分离将明显地错过核苷酸取代。所使用的温度、凝胶交联和丙烯酰胺以及甘油和蔗糖的优化增强对突变的样品的分辨。HA法可快速进行并筛选大量样品在被测序的基因中的已知突变和多态性,而无需放射性同位素或专门设备。当HA与SSCP组合使用时,可容易地检测DNA片段中所有改变的多达100%。
[0292] 在一些实施方案中,识别核苷酸错配的蛋白的使用,诸如大肠杆菌mutS蛋白可用于检测本发明的16S rRNA或5.8S rRNA中的多态性(Modrich,(1991)Ann.Rev.Genet.25:229-253)。在mutS测定中,蛋白仅结合包含两个序列序列之间的异源双链体中的核苷酸错配的序列。
[0293] 在进一步的实施方案中,多态性检测可利用微卫星标志物分析进行。利用本领域已知的标准DNA分离方法,可采用具有例如约10厘摩(cM)的平均基因组间隔的微卫星标志物。
[0294] 以上描述的SSPA分析和紧密相关的异源双链体分析方法可用于筛选单碱基多态性(Orita,M.等人,(1989)Proc Natl Acad Sci USA,86:2766)。
[0295] 3.4用于多态性分析的核苷酸阵列和基因芯片
[0296] 本发明还涵盖通过使用寡核苷酸的阵列鉴定SNP的方法,其中阵列上的离散位置与一种或更多种包含本发明的SNP的并包括多态性位置侧翼的序列的序列互补,所述序列例如至少12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约20nt、或至少约25nt或更长的寡核苷酸。该阵列可包括一系列寡核苷酸,其每一个可与不同多态性特异性杂交。对于阵列的实例,参见Hacia等人(1996,Nat.Genet.14:441-447)和De Risi等人,(1996,Nat.Genet.14:457-460)。
[0297] 核苷酸阵列可视需要包括本发明的全部多态性或亚组。一种或更多种多态性形式可在阵列中存在。阵列上的寡核苷酸序列的长度一般是至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约20nt、或至少约25nt,或更多诸如100至200nt的长度。对于阵列的实例,参见Ramsay(1998,Nature Biotech.16:40-44);Hacia等人,(1996,Nature Genetics 14:441-
447);Lockhart等人,(1996,Nature Biotechnol.14:1675-1680);和De Risi等人,(1996,Nature Genetics 14:457-460)。
[0298] 许多方法可用于创建生物样品的微-阵列,诸如将在DNA杂交测定中使用的DNA样品的阵列。此类阵列的实例在PCT申请号WO95/35505(1995)、美国专利申请号5,445,934,(1995)和Drmanac等人,(1993,Science 260:1649-1652)中被详细讨论。Yershov等人,(1996,Genetics 93:4913-4918)描述了一种替代性的寡核苷酸阵列的构建。寡核苷酸阵列的构建和使用由同上的Ramsay(1998)综述。
[0299] 利用高密度寡核苷酸阵列鉴定核苷酸序列中的多态性的方法是本领域已知的。例如,Milosavljevic等人,(1996,Genomics 37:77-86)描述了通过与短寡聚物杂交识别DNA序列。还参见,Drmanac等人,(1998,Nature Biotech.16:54-58);和Drmanac和Drmanac,1999,Methods Enzymol.303:165-178)。Ginot,(1997,Human Mutation 10:1-10)提出了使用阵列鉴定未知突变。
[0300] 已知突变的检测被描述与Hacia等人(1996,Nat.Genet.14:441-447;Cronin等人,(1996)Human Mut.7:244-255及其他文献中。遗传作图(genetic mapping)中阵列的使用讨论于Chee等人,(1996,Science 274:610-613);Sapolsky和Lishutz,(1996,Genomics 33:445-456);和Shoemaker等人,(1996,Nat.Genet.14:450-456),利用平行的条形码测序进行酵母缺失突变体的定量表型分析。
[0301] 通过互补DNA微阵列定量监测基因表达模式描述于Schena等人,(1995,Science 270:467;DeRisi等人,1997,Science 270:680-686),在基因组规模上探索基因表达。
Wodicka等人,(1997,Nat.Biotech.15:1-15)在酿酒酵母(S.cerevisiae)中进行基因组广泛表达监测。
[0302] 寡核苷酸的高密度微阵列是本领域已知的并是市售可得的。阵列上寡核苷酸的序列将对应于已知靶序列。阵列上存在的寡核苷酸的长度是决定杂交对错配的存在将会如何灵敏的重要因素。通常寡核苷酸会是至少约12nt的长度,更通常至少约15nt的长度,优选地至少约20nt的长度且更优选地至少约25nt的长度,且不会长于比约35nt的长度,通常不多于约30nt的长度。
[0303] 利用光介导的合成技术产生大的寡核苷酸阵列的方法描述在美国专利号5,134,854(Pirrung等人)和美国专利号5,445,934(Fodor等人)中。利用计算机控制的系统,单体的异质阵列,经由在许多反应位点处的同时偶联,被转化为聚合物的异质阵列。可选地,微阵列通过预先合成的寡核苷酸在固体基质上的沉积生成,例如如在国际公布WO 95/35505中描述的。
[0304] 微阵列可被扫描以检测标记的基因组样品的杂交。用于检测装置上荧光标记的靶的方法和装置是本领域已知的。一般地,此类检测装置包括显微镜和用于将光导向基质的光源光子计数器检测来自基质的荧光,而x-y位移平台改变基质的位置。可用在主题方法中的共聚焦检测装置描述在美国专利号5,631,734中。扫描激光显微镜描述于Shalon等人(1996,Genome Res.6:639)。利用适当的激发线对使用的每个荧光团进行扫描。从扫描生成的数字图像随后被合并用于随后的分析。对于任何特定阵列元素,将来自一个核酸样品的荧光信号的比例与来自其他核酸样品的荧光信号相比较并确定相对信号强度。
[0305] 分析通过荧光检测收集的数据的方法是本领域已知的。数据分析包括以下步骤:将来自收集的数据的荧光强度确定为基质位置的函数,去除异常值,即偏离预先确定的统计分布的数据,并从剩余的数据计算靶的相对结合亲和性。所得的数据可展示为图像,每个区域中的强度根据靶与探针之间的结合亲和性变化。
[0306] 经由微芯片技术的核酸分析也可适用于本发明。在此技术中,数千不同的寡核苷酸探针可施加于芯片上的阵列。待分析的核酸被荧光标记并与芯片上的探针杂交。利用这些核酸微芯片研究核酸-蛋白相互作用也是可能的。利用这一技术,人们可确定突变的存在,测序被分析的核酸,或测量感兴趣的基因的表达水平。该方法是同时平行处理许多,甚至数千探针的一种方法并可惊人地增加分析速度。
[0307] mRNA转录的改变可通过本领域普通技术人员已知的任何技术检测。这些包括RNA印迹分析、PCR扩增和RNA酶保护。减少的mRNA转录指示序列的改变。
[0308] 阵列/芯片技术已成功地应用于许多情形中。例如,已对BRCA 1基因、酿酒酵母突变体菌株和HIV-1病毒的蛋白酶基因进行突变的筛选(Hacia等人,1996;Shoemaker等人,1996;Kozal等人,1996)。用于检测SNP的各种形式的芯片可基于定制产生。
[0309] 可用于检测SNP的基于阵列的镶嵌(tiling)策略描述在EP 785280中。简要地,一般地对于大量特定多态性,阵列可能是“镶嵌”的。“镶嵌”是指合成特定的一组寡核苷酸探针,该组由与感兴趣的靶序列互补的序列以及该序列的预先选择的变化形式(例如,一个或更多个给定位置被基础组的单体,即核苷酸的一个或更多个成员取代)组成,。镶嵌策略进一步描述在PCT申请号WO 95/11995中。在一些实施方案中,阵列对于大量特定SNP是镶嵌的。尤其是,阵列被镶嵌以包括大量检测块,每个检测块对一个特定SNP或一组SNP是特异性的。例如,检测块可被镶嵌以包括跨越包括特定SNP的序列区段的大量探针。为了确保探针与每个等位基因互补,在SNP位置不同的探针被成对地合成。除了在SNP位置不同的探针以外,单取代的探针通常也被镶嵌在检测块内。此类方法可简便地应用于本文公开的SNP信息。
[0310] 这些单取代的探针在从多态性的任一方向上的碱基和多达某一数目的碱基被其余的核苷酸(选自A、T、G、C和U)取代。通常,镶嵌的检测块中的探针将包括到达SNP的序列位置且包括离SNP 5个碱基的那些的序列位置的取代。单取代的探针为镶嵌的阵列提供内部对照,以区分实际杂交与人为的交叉杂交。完成与靶序列杂交并洗涤阵列后,扫描阵列以确定阵列上与靶序列杂交的位置。然后分析来自扫描的阵列的杂交数据以鉴定哪个等位基因或哪些等位基因的SNP存在于样品中。杂交和扫描可如PCT申请号WO 92/10092和WO 95/11995以及美国专利号5,424,186中描述的进行。
[0311] 因此,在一些实施方案中,芯片可包括长度约15个核苷酸的片段的核酸序列和与其互补的序列、或其片段的阵列,所述片段包含至少约8个连续的核苷酸,优选地10、15、20个,更优选地25、30、40、47或50个连续的核苷酸并包含多态性碱基。在一些实施方案中,多态性碱基在离多核苷酸的中心5、4、3、2或1个核苷酸内,更优选地在多核苷酸的中心。在其他实施方案中,芯片可包括包含任何数目的本发明的多核苷酸的阵列。
[0312] 寡核苷酸可利用化学偶联程序和喷墨施加设备合成在基质表面上,如PCT申请WO95/251116(Baldeschwieler等人)中描述的。在另一方面,利用真空系统、热、UV、机械或化学胶合程序,类似于斑点(或狭缝)印迹的“网格化”阵列可用于将cDNA片段或寡核苷酸布置和连接至基质表面。阵列,诸如以上描述的那些,可手动产生或通过利用可得的装置(狭缝印迹或斑点印迹设备)、材料(任何合适的固体支持物)、和机器(包括自动仪器)产生,并可包含8、24、96、384、1536、6144或更多个寡核苷酸、或使其适宜于市售可得的仪器的高效使用的任何其他数目。
[0313] 利用此类阵列,本发明提供鉴定样品中本发明的SNP的方法。此类方法包括孵育试验样品与包含对应于本发明的至少一个SNP位置的一个或更多个寡核苷酸探针的阵列,和测定来自试验样品的核酸与一种或更多种寡核苷酸探针的结合。此类测定将通常包括包含对应于许多SNP位置和/或那些SNP位置的等位基因变体的寡核苷酸探针的阵列,所述SNP中的至少一个是本发明的SNP。
[0314] 用于孵育核酸分子与试验样品的条件各异。培养条件取决于测定中采用的形式、采用的检测方法和测定中使用的核酸分子的类型和性质。本领域技术人员将认识到,任一种一般可得的杂交、扩增或阵列测定形式可被容易地调整以采用本文公开的新颖SNP。此类测定的实例可见于Chard,T,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1986);
Bullock,G.R.等人,Techniques in Immunocytochemistry,Academic Press,Orlando,
Fla.Vol.1(I 982),Vol.2(1983),Vol.3(1985);Tijssen,P.,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular 
Biology,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1985)。
[0315] 多成分集成系统也可用于分析SNP。此类系统将诸如PCR和毛细管电泳反应的方法微型化并区室化在单个功能装置中。此类技术的一个实例公开于美国专利号5,589,136,其描述了PCR扩增和毛细管电泳在芯片中的集成。
[0316] 集成系统可主要地设想于使用流体系统时。这些系统包括设计在微芯片中包括的玻璃、硅、石英或塑料晶片的微通道的模式。样品的移动受跨微芯片的不同区域施加的电、电渗或流体静力控制以创建无移动部分的功能性微观。改变电压控制微机械通道之间的交叉处的液体流,并改变液体流速以便跨微芯片的不同片区泵送。
[0317] 为了对SNP基因型分型,微流体系统可整合例如核酸扩增、微小测序引物延伸(mini-sequencing primer extension)、毛细管电泳和诸如激光引起的荧光检测的检测方法。
[0318] 在第一步骤中,DNA样品被优选地通过PCR扩增。然后,利用ddNTP(对每种ddNTP的特定荧光)和刚好杂交在靶向的多态性碱基的上游的适当的寡核苷酸微小测序引物对扩增产物进行自动的微型测序反应。完成在3'末端的延伸后,通过毛细管电泳分离引物与未被并入的荧光ddNTP。毛细管电泳中使用的分离介质可以是例如,聚丙烯酰胺、聚乙二醇或葡聚糖。单核苷酸引物延伸产物中并入的ddNTP通过激光引起的荧光检测鉴定。这种微芯片可用于平行处理至少96至384个样品或更多样品。
[0319] 3.5用于检测多态性的基于延伸的技术
[0320] 用于检测核苷酸序列中的多态性的基于延伸的技术可包括但不限于如在欧洲专利申请公布号0332435和Newton等人,(1989,Nucl.Acids Res.17:2503-2516)中公开的等位基因特异性扩增,还称为扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system)(ARMS),和如Gibbs等人,(1989,Nucleic Acids Research,17:2347)设想的多态性克隆(COPS)。
[0321] 基于延伸的技术ARMS利用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)PCR引物基因分型。在这一方法中,用于PCR的两个寡核苷酸引物之一被设计为结合多态性位点,最通常地引物的3'端靶向该位点。在小心控制的条件(退火温度、镁浓度等)下,扩增仅在如果在PCR引物3'端的核苷酸与多态性位点处的碱基互补时发生,错配的扩增“阻滞”。
[0322] ARMS方法的一种变化形式,称为诱变分离的PCR(MS-PCR),包括不同长度的两种ARMS引物,各自对某位点处的不同多态性特异。这一方法产生针对不同多态性的不同长度的PCR产物。
[0323] 3.6用于检测多态性的基于连接的测定
[0324] SNP检测的另一种典型方法包括寡核苷酸连接测定。许多方法利用DNA连接酶,一种可连接与DNA模板杂交的两个相邻寡核苷酸的酶。该方法的特异性来自对杂交的寡核苷酸与DNA模板在连接位点处完全匹配的要求。在寡核苷酸连接测定(OLA)或连接酶链式反应(LCR)测定中,突变位点周围的序列先被扩增,且一条链用作三个连接探针的模板,这三个连接探针中的两个是等位基因特异性寡核苷酸(ASO)且第三个是通用探针。许多方法可用于检测连接的产物。例如,两个ASO可用荧光或半抗原标记差异性地标记且连接的产物分别通过荧光或比色酶联免疫吸附测定检测。对于基于电泳的系统,使用迁移率改变标签(mobility modifier tag)或探针长度的变化联合荧光检测使得能够对单个试管中的数个单核苷酸取代进行多重基因分型。当在阵列上使用时,ASO可点布在芯片上特定位置或地址。然后可加入PCR扩增的DNA并可测量与阵列上特定地址的标记的寡核苷酸的连接。
[0325] 3.7生成信号的多态性检测测定
[0326] 在一些实施方案中,荧光共振能量转移(FRET)被设想为鉴定16S rRNA或5.8S rRNA基因中多态性的方法。FRET由于电子激发态的两种染料分子之间的相互作用而发生。
激发从一种(供体)染料分子传递到另一种(受体)染料分子,而不发射光子。这是距离依赖性的,即供体和受体染料必须紧密接近。杂交探针系统由以荧光染料标记的两种寡核苷酸组成。杂交探针对被设计为与靶DNA上的相邻区域杂交。每种探针用不同的标志物染料标记。两种染料的相互作用可能仅发生在二者结合其靶时。供体探针在3'端被荧光团标记而受体探针在5'端被荧光团标记。在PCR期间,这两种不同寡核苷酸与靶DNA的相邻区域杂交,使得与寡核苷酸偶联的荧光团在杂合体结构中是紧密接近的。供体荧光团(F1)被外部光源激发,然后将其部分激发能量传递至相邻的受体荧光团(F2)。被激发的受体荧光团(F2)发射在不同波长的光,然后其可被检测和测量分子接近性。
[0327] 在其他实施方案中,MagSNiPer方法基于单碱基延伸、磁性分离和化学发光的,提供了用于鉴定核苷酸序列中的SNP的另一种方法。单碱基核苷酸延伸反应以生物素化的引物进行,所述生物素化的引物的3'末端与带有标签标记的ddNTP的SNP位点邻近。然后引物被带有链霉亲和素的磁性包被的珠捕获,而未被并入的标记的ddNTP通过磁性分离除去。将磁珠与偶联有碱性磷酸酶的抗标签抗体孵育。通过磁性分离除去多余偶联物后,SNP分型通过测量化学发光进行。标记的ddNTP的并入通过碱性磷酸酶引起的化学发光监测。
[0328] 在一些实施方案中,荧光偏振提供用于鉴定核苷酸序列中多态性的方法。例如,在等位基因特异性染料-标记的双脱氧核苷三磷酸和市售可得的修饰的Taq DNA聚合酶存在下,将扩增的包含多态性的DNA与寡核苷酸引物(被设计为与DNA模板邻近多态性位点杂交)孵育。引物被对模板上存在的等位基因特异的染料-终止剂延伸,将荧光团的分子量增加大约10倍。在反应结束时,反应混合物中的两种染料-终止剂的荧光偏振被直接分析而无需分离或纯化。这一同质DNA诊断方法显示为是高度灵敏和特异性的,且适合对大量样品的自动基因分型。
[0329] 在其他实施方案中,表面增强的拉曼散射可用作检测和鉴定双链DNA片段中单碱基差异的方法。Chumanov,G.“Surface Enhanced Raman Scattering(SERS)for Discovering and Scoring Single Based Differences in DNA”Proc.Volume SPIE,3608(1999)。SERS还已被用于单分子检测。Kneipp,K,(1997,Physical Review Letters,78(9):
1667-1670)。SERS导致来自已被附加到纳米尺寸的金属结构的分子的拉曼信号强烈增加。
[0330] 例证性实例包括Xiao和Kwok(2003,Genome Research,13(5):932-939)讨论的基于引物延伸测定的基因分型方法,荧光猝灭作为检测。模板引导的染料-终止剂并入与荧光猝灭检测(FQ-TDI)测定是基于观察到,荧光染料R110-和R6G-标记的无环终止剂的强度在它们被并入DNA寡核苷酸引物后立即普遍猝灭。通过实时比较两种等位基因染料的荧光猝灭速率,可测量DNA样品中SNP的频率。在基因分型和在等位基因频率估计中,动态FQ-TDI测定是高度准确和可重现的。
[0331] 4.引物、探针、试剂盒和加工系统
[0332] 本发明提供可在本文描述确定在16S rRNA和/或5.8S rRNA基因的一个或更多个位置的SNP从而分类和/或鉴定样品中的微生物的方法中使用的探针和引物。在一些情形中,在本发明的方法中使用引物和探针帮助定量微生物。
[0333] 本发明的引物和探针与包含一个或更多个SNP位置的16S rRNA或5.8S rRNA基因(或16S rRNA或5.8S rRNA分子或其DNA拷贝)的至少一部分杂交。例如,引物可与一个或更多个SNP侧翼的序列杂交,且探针可与包括一个或更多个SNP的序列杂交。基于16S rRNA和5.8S rRNA基因的已知序列设计在本发明的方法中使用的合适引物和探针完全在本领域技术人员能力范围内。
[0334] 可用于本发明的方法中的引物和探针的非限制性实例包括实施例6中描述的那些,其中分析了哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA中对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、278、286和/或648的位置的SNP。例如,为了检测在位置
396和398的SNP,示例性探针序列包括针对革兰氏阳性细菌的GCAACGCCGCGT(SEQ ID NO:4)和GCGACGCCGCGT(SEQ ID NO:5)、和针对革兰氏阴性细菌的GCCAAGTAGCGT(SEQ ID NO:6)和GCCATGCCGCGT(SEQ ID NO:7),针对革兰氏阳性和阴性细菌二者的示例性正向引物包括ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT(SEQ ID NO:8);且示例性反向引物包括针对革兰氏阴性细菌的GCCAGCAGCYGCGGTAATACG(SEQ ID NO:9)和针对革兰氏阳性细菌的GCCAGCAGCCGCGGTAATACG(SEQ ID NO:10)。为了检测在位置278和286的SNP,示例性探针序列包括针对革兰氏阴性细菌的GCGATGATCAGTAG(SEQ ID NO:11)、GCTATGACGCTTAA(SEQ ID NO:12)、GCTTTGACGCATAA(SEQ ID NO:13)、GCTATGACGGGTAT(SEQ ID NO:14)、GCAATGATCAGTAG(SEQ ID:15)及
GTTTTGACGTCTAG(SEQ ID:16),和针对革兰氏阳性细菌的GCAACGATGCATAG(SEQ ID NO:17)、GCAACGATGCGTAG(SEQ ID NO:18)及GCCACGATACATAG(SEQ ID NO:19);示例性正向引物序列包括:针对革兰氏阴性细菌的TGWAGGAGGGGATTGCGTC(SEQ ID NO:20)、
TGTAGGATGAGACTATATW(SEQ ID NO:21)及TAARRGATCAGCCTATGTC(SEQ ID NO:22)和针对革兰氏阳性细菌的TGATGGATGGACCCGCGGT(SEQ ID NO:24);且示例性反向引物序列包括针对革兰氏阴性细菌的ATGAACGGCCACATTGG(SEQ ID NO:25)、ATGATCAGTCACACTGG(SEQ ID NO:
26)及GTGAWCGGACACACTGG(SEQ ID NO:27)和针对革兰氏阳性细菌的
GTGATCGGCCACACTGGRACT(SEQ ID NO:28)。为了检测在位置648的SNP,示例性探针包括针对革兰氏阴性细菌的CTGCTGATCTAGAG(SEQ ID NO:29)和针对革兰氏阳性细菌的
CTGGAAAACTTGAG(SEQ ID NO:30)和CTGGGAGACTTGAG(SEQ ID NO:31);示例性正向引物序列包括针对革兰氏阴性细菌的TAACCCCGTGAKGGGATGGA(SEQ ID NO:32)和针对革兰氏阳性细菌的CAACCGKGGAGGGTCATTGGA(SEQ ID NO:33);且示例性反向引物序列包括针对革兰氏阴性细菌的TCGGAGAGGAAAGTGGAATTCC(SEQ ID NO:34)和针对革兰氏阳性细菌的
CARRAGRGGARAGTGGAATTCC(SEQ ID NO:35)。区分革兰氏阴性细菌的引物和探针的另外的非限制性实例包括表21中的那些,而用于区分革兰氏阳性细菌的引物和探针的另外的非限制性实例包括表22中的那些。此类引物和探针特别适合诸如 测定的测定。
[0335] 表21.
[0336]
[0337]
[0338]
[0339] 表22.
[0340]
[0341]
[0342] 可用于本发明的方法的引物和探针的非限制性实例包括实施例6中描述和表23中列出的那些,其中分析了哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396、398、399、400和401和位置490、491、492、493、495、496、500和501的位置的SNP。
[0343] 表23.
[0344]
[0345]
[0346]
[0347]
[0348] 用于本发明的方法的引物和探针的非限制性实例包括表24中列出的那些,其中分析了真菌的5.8S rRNA中的SNP。
[0349] 表24.
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354] 检测根据本发明的16S rRNA和/或5.8S rRNA基因中的一个或更多个SNP所需的所有必要材料和试剂可一起组装在试剂盒中。试剂盒可还任选地包括用于检测标记的适当试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲液等等。例如,用于鉴定多态性的基于核酸的检测试剂盒可包括以下一种或更多种:(i)来自革兰氏阳性、革兰氏阴性、真菌和/或哺乳动物细胞的核酸(其可用作阳性对照);和(ii)与16S rRNA或5.8S rRNA基因的包含待分析的SNP位置的至少一部分特异性杂交的引物和/或探针,以及任选地在被怀疑的SNP位点处或其周围的一种或更多种其他AS标志物。还可包含适合扩增核酸的酶,包括各种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTMDNA连接酶等,取决于所采用的核酸扩增技术)、脱氧核苷酸和缓冲液,以提供扩增必需的反应混合物。此类试剂盒一般还将以合适的方式包括,对于每种单独的试剂和酶以及对于每种引物或探针的不同容器。试剂盒还可以以下为特征:用于进行本文描述的测定之一的各种装置和试剂;和/或对于使用试剂盒以鉴定如本文定义的SNP的存在的印刷的说明书。
[0355] 在一些实施方案中,本文一般描述的方法至少部分地通过诸如合适地编程的计算机系统的处理系统进行。可使用独立的计算机,微处理器执行允许进行上述方法的应用软件。可选地,方法可至少部分地通过作为分布式架构的一部分运行的一种或更多种处理系统进行。例如,处理系统可用于通过检测探针与核酸分子的杂交,检测SNP在一个位置的存在。处理系统还可用于基于一个或更多个SNP的检测确定细菌的革兰氏状态、身份或分组、或真菌的身份或分组。在一些实例中,由使用者输入到处理系统的命令帮助处理系统进行这些测定。
[0356] 在一个实例中,处理系统包括经总线(bus)互相连接的至少一个微处理器、存储器、输入/输出装置,诸如键盘和/或显示器、和外部接口。外部接口可用于将处理系统连接于外围装置,诸如通信网络、数据库或存储设备。微处理器可执行以应用软件的形式存储于存储器中的指令以允许进行SNP检测和/或微生物鉴定或分类过程,以及以进行任何其他所需的过程,诸如与计算机系统的通信。应用软件可包括一种或更多种软件模块,并可在适合的执行环境诸如操作系统环境等中执行。
[0357] 5.本发明的方法的应用
[0358] 本发明的方法用于分类和/或鉴定样品诸如来自受试者的样品或环境样品诸如土壤或水样品或取自设备或仪器(例如医学或手术仪器)表面或工作表面的样品中的微生物。然后该分类或鉴定可用于确定治疗的过程以去除、根除或减少微生物的数量。可组合任意两种或更多种本发明的方法。例如,利用本发明的方法可分析来自样品的核酸的16SrRNA基因中SNP的存在和5.8S rRNA中SNP的存在。这可被进行以确定样品中是否存在革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和/或真菌。在一些情形中,真菌的身份还可如本文教导的确定。细菌可被进一步分组或细菌的身份还可被确定或缩小到几种可能性之一。例如,如从以上公开内容将明显的,可被评价对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置396和398的位置处的SNP与在对应于SEQ ID NO:1中列出的16S rRNA基因的位置399、400和401或对应于
278、286和648的位置处的SNP组合,从而分类或甚至鉴定样品中的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌。例如,如果评价位置396、398、399、400和401处的SNP,样品中的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌可被分类为如上描述的7组病原体之一。然后可评价另外的SNP以进一步分类或甚至鉴定哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌。如果评价位置
278、286、396、398和648处的SNP,则哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌可被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性,且还可进一步被鉴定或鉴定为如上描述的一组物种中的一种。
在一些情形中,样品中细菌或真菌的数量被确定或估计。
[0359] 具有感染或怀疑的感染(例如,具有SIRS的受试者)的受试者通常出现在诊所、急诊室、普通病房和加护病房中的临床医生面前。此类患者通常具有体温异常、升高的心率和呼吸速率和异常白细胞计数的未诊断的临床迹象。临床医生必须确定患者是否有感染、感染的严重程度、是否准许患者入院(如果已经不在医院)、感染的来源、是否使用抗生素、以及如果使用,抗生素的类型、途径和剂量。患者中感染的存在最通常通过从患者获取样品并在培养肉汤中培养生物体评价。在生物体已生长后,可对其革兰氏染色、鉴定和确定其抗生素抗性。然而,在许多被感染的患者(>50%)中,培养生物体是不可能的。在没有鉴定到生物体的情况下,临床医生必须依赖于临床判断和使用广谱且通常是组合的抗生素。滥用广谱抗生素、而不了解病原体生物体的身份或敏感性,导致抗生素抗性的发展、抗生素的过度使用和患者中可能的毒性副作用。另外,败血症患者中抗生素的不当使用导致较高的死亡率和更长的住院时间(Garnacho-Montero,J.等人(2008)Journal of Antimicrobial Chemotherapy 61,436–441)。血液培养虽是灵敏的方法(1-100cfu/mL),但仅在获取的血液样品包含活生物体时灵敏,而在败血症中情况不总是这样(Coburn B,Morris AM,
Tomlinson G,Detsky AS(2012)Does this adult patient with suspected bacteremia require blood cultures?JAMA 308:502–511.doi:10.1001/jama.2012.8262.)。
[0360] 因此,本发明的方法尤其有用于帮助临床医生确定受试者,诸如展示有SIRS的受试者是否具有感染(例如败血症),且如果是,基于导致感染的微生物的分类确定适当的疗程。如在实施例6中证实的,在本发明的示例性方法中,检测的限值比培养微生物灵敏10-100倍。而且,本发明的方法帮助在从受试者(例如在怀疑败血症时)获取全血液样品的三小时内区分革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体和真菌。本发明的方法还可以时间有效的方式进行,使得临床医生可在在数小时而不是数天内得到结果。此类特性允许临床医生灵敏地检测和定量微生物的存在并作出关于使用对细菌的革兰氏状态特异的抗生素,或对细菌进一步分组或鉴定、或对真菌特异性的抗真菌剂的知情决策。这些改进可导致不必要入院的患者的数量的减少、微生物的灵敏检测、根据负荷(和其他因素)评价的感染的严重度、减少的广谱抗生素的使用、患者减少的使用广谱抗生素的时间、减少的来自抗生素的毒性、减少的抗生素抗性的发展。表25和26展示了,临床医生基于利用现有技术的方法和本发明的方法(在表中称为“SNP测定”)对微生物感染的检测和区分而可获得的用于进行决策的时间线的实例。
[0361] 表25.
[0362]
[0363] 表26.
[0364]
[0365]
[0366] 因此,本发明还延及受试者中败血症的诊断和阳性诊断后对败血症的管理。本文描述的分析5.8S rRNA中一个或更多个SNP和/或16S rRNA中一个或更多个SNP的方法可用于确定受试者在其血液中是否具有真菌和/或细菌感染并进一步将细菌分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性,和/或鉴定血液中细菌和/或真菌的分组或种。还可确定细菌和/或真菌负荷(即,细菌或真菌的数量)。
[0367] 在受试者展示SIRS且败血症的诊断不能利用本文提供的方法进行,即,无法利用本文提供的方法在样品中鉴定细菌或真菌细胞的情形中,则inSIRS的诊断可通过排除来进行。在一些情形中,可进行另外的试验以证实诊断。因此,本发明还延及受试者中inSIRS的诊断和诊断后对inSIRS的管理。
[0368] 5.1另外的测定和试验
[0369] 在一些情形中,本发明的方法与用于鉴定或分类微生物或表征微生物的其他方法组合进行。例如,细菌的抗生素敏感性或毒力因子的存在可在利用本发明的方法确定其分组或身份后评价。
[0370] 抗生素敏感性测定可利用培养方法或分子方法进行,且此类方法是本领域技术人员公知的。要求细菌的初步培养的各种市售系统是可得的,包括Biomerieux的 此类系统允许确定各种各样的抗生素的最低抑制浓度。
[0371] 分子试验也已被开发以鉴定抗生素抗性基因的存在(参见例如Huletsky,A.等人(2004)Journal of Clinical Microbiology 42,1875–1884;Watterson等人(1998)Journal of Clinical Microbiology 36,1969-1973)。ORSA的分子测试可利用被设计为检测mecR1(或mecA或蛋白PBP2a)的存在的PCR测定实现。各种方法包括Fang&Hedin(2006)Journal of Clinical Microbiology 44,675;Huletsky,A.等人(2004)Journal of 
Clinical Microbiology 42,1875–1884;和美国专利发布8,362,228中描述的那些。VRE的分子测试可利用被设计为检测VanA和/或VanB的存在的PCR测定实现。具体试验包括
Cantarelli等人.(2011)Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 44,
631–632;Fang等人(2012)Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31,261–265;和美国专利公布号20050058985A1中描述的那些。QREC(氟喹诺抗性)的分子测试可利用被设计为检测gyrA和parC中的突变的PCR测定实现。各种方法包括Jurado等人(2008)
J.Vet .Diagn .Invest.20 ,342–345;Karczmarczyk等人(2011 )
Appl.Environ.Microbiol.77,7113–7120;美国专利公布号20100136523A1;和国际专利公布号WO 2000024932中描述的那些。ESBL(头孢他啶抗性)的分子测试可利用被设计为检测bla(SHV)和突变的PCR测定进行(参见例如,Alfaresi等人(2010)Indian J Med Microbiol 
28,332;Randegger等人(2001)Antimicrob.Agents Chemother.45,1730–1736;和美国专利公布号20130065790A1。
[0372] 许多抗生素抗性基因和机制是本领域公知的(参见例如,Liu B,Pop M.ARDB-Antibiotic Resistance Genes Database.Nucleic Acids Res.2009Jan;37(Database issue):D443-7;http://ardb.cbcb.umd.edu/)。表27中详细描述了一些更常见的抗生素抗性机制。
[0373] 表27.
[0374]
[0375]
[0376] 每种关键、已知的抗性细菌属中抗性的主要机制列在表28中,主要机制被加以下划线。
[0377] 表28.
[0378]
[0379]
[0380]
[0381]
[0382]
[0383] 微生物毒力基因和机制也是公知的,并存在已知病原体的毒力机制和因子的在线数据库,例如病原体细菌的毒力因子(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和LLNL毒力数据库(http://mvirdb.llnl.gov/)。因此,已经利用本文描述的方法鉴定成因病原体后,本领域技术人员可容易地设计和/或进行针对毒力因子遗传决定子的特异性检测测定。用于检测葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、大肠杆菌和克雷伯菌属(Klebsiella spp.)中各种毒力因子的示例性测定包括美国专利公布号US2008012473和US20060194206;国际专利公布号WO2003052143;EP专利公布号2231851;
Pichon,B.等人(2012)J.Antimicrob.Chemother.67,2338–2341;Lenz等人(2010)Food Microbiol 27,317–326(2010);Margot等人(2013)J Food Prot 76,871–873;和Huang等人(2012)BMC Microbiol.12,148中描述的那些。一些关键哺乳动物(例如,人类)病原体的重要毒力因子的非限制性实例列在表29中。
[0384] 表29.
[0385]
[0386]
[0387]
[0388] 5.2管理和疗法
[0389] 基于本发明的方法的结果,当需要时,受试者可被适当地管理和施用疗法。例如,inSIRS的管理可包括,例如,施用治疗剂诸如血管活性化合物、类固醇和抗肿瘤坏死因子剂。此外,可使用例如Cohen和Glauser(1991,Lancet 338:736-739)中描述的旨在修复和保护器官功能的缓解性疗法,诸如静脉输液和输氧(intravenous fluids and oxygen)和紧密的血糖控制。
[0390] 若败血症被诊断和进行微生物的进一步分类、分组或鉴定,执业医生则可确定适当的方案以管理感染。这可包括施用一种或更多种治疗剂诸如抗生素、抗真菌剂或内毒素的抗体。对于败血症的适当疗法是本领域技术人员公知的并综述于例如,Healy(2002,Ann.Pharmacother.36(4):648-54)和Brindley(2005,CJEM.7(4):227)和Jenkins(2006,J Hosp Med.1(5):285-295)。
[0391] 通常,治疗剂将连同药学上可接受的载体在药物(或兽医,如果受试者是非人类受试者的话)组合物中施用并以实现其预期目的的有效量施用。施用于受试者的活性化合物的剂量应足以在受试者中实现随着时间的有益响应,诸如败血症或inSIRS的症状的减少或缓解,和/或减少或消除血液中的微生物。将施用的药学活性化合物的量可依赖于待治疗的受试者,包括其年龄、性别、体重和大体健康状况。在这方面,施用的活性化合物的准确量将取决于执业医生的判断。在确定治疗或预防败血症或inSIRS中将施用的活性化合物的有效量时,执业医生可评价败血症病例中感染的严重度,和与败血症或inSIRS相关的任何症状的严重度,所述症状包括炎症、血压异常、心跳过速、呼吸急促、发热、发冷、呕吐、腹泻、皮疹、头痛、意识模糊(confusion)、肌肉疼痛、痉挛。在任何情况中,本领域技术人员可容易地确定治疗剂的适合剂量和适合的治疗方案,而无需过度实验。
[0392] 治疗剂可与辅助(缓解性)疗法一同施用以增加对主要器官的氧气供应,增加向主要器官的血流和/或减少炎症反应。此类辅助疗法的例证性实例包括非类固醇抗炎药物(NSAID)、静脉注射生理盐水(intravenous saline)和氧气。
[0393] 为了本发明可被容易地被理解和付诸实践,现在通过以下非限制性实例描述特定的优选实施方案。实施例
[0394] 实施例1
[0395] 鉴定区分革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物的16S rRNA SNP
[0396] 编码16S rRNA分子的代表性基因从GenBank下载并利用CLUSTALW比对以确定保守序列区域。去除如通过CLUSTALW比对确定的可变序列,利用CLUSTALW再次比对序列并检查任何另外的可变区域。这一过程重复若干次。随后,生成编码16S rRNA的所有基因的最终保守mega-比对结果,其由大约702碱基对的保守序列区域组成。编码来自大肠杆菌的示例性16S rRNA的基因(Genbank登录号NR_074891)在SEQ ID NO:1中列出,且702个碱基对的保守区域延伸自SEQ ID NO:1的核苷酸254-955。
[0397] 分析比对的序列并确定,两个SNP足以区分大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。所鉴定的两个SNP位于SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA的位置396和398,并称为SNP 396和SNP 398。利用这两个SNP区分大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性原核生物的一般规则描绘在表30中。
[0398] 表30.
[0399]革兰氏状态 SNP 396 SNP 398
阴性 C T/A/C
阳性 A/T/G C
[0400] 实施例2
[0401] 利用SNP 396和SNP 398,计算机模拟革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物的区分[0402] 计算机模拟分析用于评价哪些原核生物可以仅利用SNP 396和398,在其革兰氏状态基础上被分类。十二(12)个碱基对探针(GC(A/C/G/T)A(A/C/G/T)G(CC/TA)GCGT;SEQ ID NO:2)被用于BLAST搜索中以鉴定跨越位置396和398(编号对应于SEQ ID NO:1中列出的大肠杆菌16S rRNA)的原核生物16S rRNA的区域,并分析结果以确定哪些物种可基于这些SNP被正确地分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性。
[0403] 表31表列出仅基于SNP位置396和398被分型为革兰氏阴性或革兰氏阳性的最常见的哺乳动物病原体。大多数病原体可基于这两个SNP被分型为革兰氏阴性或革兰氏阳性,除了在SNP位点396和398分别具有A和C或G和C的一些革兰氏阴性细菌,诸如螺杆菌属、韦荣氏球菌属、一些拟杆菌属、弯曲杆菌属、嗜性衣原体属(Chlamydiophila spp)。
[0404] 表31.
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409] 表32显示如Janssen等人(Appl.Environ.Microbiol.(2006)72,1719–1728)中鉴定的最常见的土壤细菌在位置396和398的SNP。
[0410] 表32.
[0411]
[0412] 表33显示如在Hewitt等人(PLoS ONE(2012)7,e37849)中鉴定的见于工作环境中的一些革兰氏阳性和革兰氏阴性原核生物在位置396和398的SNP。
[0413] 表33.
[0414]
[0415]
[0416] 表34显示如在Brecher等人(2005)Clinical Microbiology Reviews 18,195–204中鉴定的发现污染红血细胞和血小板制品的常见细菌在位置396和398的SNP。
[0417] 表34.
[0418]
[0419] 表35显示如在Son等人J Korean Med Sci(2010)25,992(2010);和SeeGene网址(www.seegene.com)以及Septifast网址(www.roche.com)中鉴定的见于人类血流感染(败血症)的常见细菌在位置396和398的SNP。
[0420] 表35.
[0421]
[0422]
[0423] 表36显示如在Claesson等人(Nucl Acids Res(2010)38(22),e200)中利用下一代测序技术时鉴定的见于人类粪便样品中的最常见的细菌在位置396和398的SNP。
[0424] 表36.
[0425]
[0426]
[0427] 因此,位置396和398处的SNP能够区分大量革兰氏阳性与革兰氏阴性原核生物,包括最常见于土壤、办公室环境中、作为血液产品污染物、哺乳动物(例如,人类)粪便材料中的细菌生物体、大多数哺乳动物(例如,人类)细菌病原体和哺乳动物(例如,人类)败血症中常见的大多数病原体。
[0428] 实施例3
[0429] 计算机模拟利用SNP对革兰氏阴性和革兰氏阳性败血症-相关的细菌的区分
[0430] 如在实施例2(表31)中所示的,存在利用位置396和398处的SNP不能确定哺乳动物(例如,人类)病原体的革兰氏状态的若干情形。这些病原体包括以下革兰氏阴性的属:螺杆菌属、韦荣氏球菌属、一些拟杆菌属、弯曲杆菌属和嗜性衣原体属。尽管最常见的哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌(例如,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、绿色链霉菌组(咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌)、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌或产黑色普雷沃氏菌)可利用位置396和398处的SNP被分类为革兰氏阴性或革兰氏阳性,但是可在哺乳动物(例如,人类)中导致败血症的其他细菌,诸如大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌和琼脂韦荣氏球菌,利用位置396和398处的SNP不能被分类。
[0431] 进行序列分析以确定哪些SNP可在其革兰氏状态基础上对常见和较不常见哺乳动物(例如,人类)败血症-相关的细菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌、绿色链霉菌组(咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球菌、缓症链球菌、变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌)、肺炎链球菌、无乳链球菌、牛链球菌、血链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、脆弱拟杆菌、洋葱伯克氏菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、颊普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌、产黑色普雷沃氏菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、大肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、同性恋螺杆菌、幽门螺杆菌、流产嗜性衣原体、非典型韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、龋齿韦荣氏球菌、琼脂韦荣氏球菌、环圈链霉菌、索马里链霉菌和结核分枝杆菌)分类。发现,在位置278、286和648(编号对应于SEQ ID NO:1中列出的16SrRNA)处的另外三个SNP可用于分类33种哺乳动物(例如,人类)败血症病原体。因此,在位置396、398、278、286和648的共5个SNP可用于确定这些哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的革兰氏状态。
[0432] 利用这五个SNP区分导致哺乳动物(例如,人类)败血症的33种革兰氏阳性和革兰氏阴性原核生物的一般规则如下:
[0433] 如果位置396是C则细菌是革兰氏阴性的且包括表37中的种;而如果位置396是A或G则细菌是革兰氏阳性的且包括表38中的种。
[0434] 表37.
[0435]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 产黑色普雷沃氏菌 C A A G T
阴性 中间普雷沃氏菌 C A T G G
阴性 颊普雷沃氏菌 C A T G T
阴性 脆弱拟杆菌 C A T A A
阴性 弗氏柠檬酸杆菌 C T G C A
阴性 产气肠杆菌 C T G C A
阴性 产酸克雷伯菌 C T G C A
阴性 粘质沙雷氏菌 C T G C A
阴性 摩氏摩根菌 C T G C C
阴性 嗜麦芽寡养单胞菌 C T G G C
阴性 鲍氏不动杆菌 C T G G G
阴性 阴沟肠杆菌 C T G C A
阴性 肺炎克雷伯菌 C T G C A
阴性 肠道沙门氏菌 C T G C A
阴性 大肠杆菌 C T G C A
阴性 奇异变形杆菌 C T G C T
阴性 脑膜炎奈瑟氏菌 C T G G T
阴性 铜绿假单胞菌 C T G G T
阴性 流感嗜血杆菌 C T T C T
阴性 洋葱伯克氏菌 C T G G A
[0436] 表38.
[0437]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 结核分枝杆菌 G C G G A
阳性 索马里链霉菌 G C G G A
阳性 环圈链霉菌 G C G G T
[0438] 如果位置396、398和278(分别地)是A、C和T则细菌是革兰氏阴性的且包括表39中的种;而如果位置396、398和278(分别地)是A、C和C则细菌是革兰氏阳性的且包括表40中的种。
[0439] 表39.
[0440]
[0441]
[0442] 表40.
[0443]革兰氏 物种 396 398 278 286 648
阳性 粪肠球菌 A C C A A
阳性 屎肠球菌 A C C A A
[0444] 如果位置396、398和278是A、C、G且位置286是A则细菌是革兰氏阳性的且包括表41中的种。
[0445] 表41.
[0446]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 牛链球菌 A C G A A
阳性 无乳链球菌 A C G A G
阳性 停乳链球菌 A C G A G
阳性 酿脓链球菌 A C G A G
阳性 咽峡炎链球菌 A C G A T
阳性 中间链球菌 A C G A T
阳性 缓症链球菌 A C G A T
阳性 变异链球菌 A C G A T
阳性 肺炎链球菌 A C G A T
阳性 血链球菌 A C G A T
[0447] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、A则细菌是革兰氏阳性的且包括表42中的种。
[0448] 表42.
[0449]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 金黄色葡萄球菌 A C A A A
阳性 远缘链球菌 A C A A A
阳性 星座链球菌 A C A A T
阳性 口腔链球菌 A C A A T
[0450] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、G且位置648是G则细菌是革兰氏阴性的且包括表43中的种。
[0451] 如果位置396、398、278、286是A、C、A、G且位置648是A则细菌是革兰氏阳性的且包括表44中的种。
[0452] 表43.
[0453]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 琼脂韦荣氏球菌 A C A G G
[0454] 表44.
[0455]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 表皮葡萄球菌 A C A G A
阳性 人葡萄球菌 A C A G A
[0456] 如果位置396、398、278和286是A、C、G和G(分别地)且位置648是G则细菌是革兰氏阴性的且包括表45中的种。
[0457] 如果位置396、398、278和286是A、C、G和G且位置648是A或T则细菌是革兰氏阳性的且包括表46中的种。
[0458] 表45.
[0459]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阴性 非典型韦荣氏球菌 A C G G G
阴性 小韦荣氏球菌 A C G G G
阴性 龋齿韦荣氏球菌 A C G G G
[0460] 表46.
[0461]革兰氏 种 396 398 278 286 648
阳性 溶血葡萄球菌 A C G G A
阳性 腐生葡萄球菌 A C G G A
阳性 产气荚膜梭菌 A C G G T
[0462] 实施例4
[0463] 区分真菌真核生物与原核生物和其他真核生物的5.8S rRNA SNP的鉴定和定位
[0464] 为了鉴定可区分真菌(包括酵母)真核生物与其他真核生物还有原核生物的5.8S rRNA中的SNP,来自白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌的代表性5.8S rRNA序列从GenBank下载并利用CLUSTALW比对以确定保守序列区域。去除通过CLUSTALW比对确定的可变序列,并利用CLUSTALW再次比对序列并检查任何另外的可变区域。这一过程重复若干次。生成真菌和四种哺乳动物5.8S rRNA的最终保守mega-比对结果,其由大约126碱基对的保守序列组成。该126-碱基对的序列对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因的核苷酸134-259和SEQ ID NO:3中列出的人类5.8S rRNA基因的核苷酸1-222。不同真菌、酵母和哺乳动物的种跨这一区域具有略微不同的长度和碱基对组成。
[0465] 通过分析这些序列,确定了在位置142、144、146、147、148、154、157、164、167、185、187、188、194、197、213、215、216、219、223、231、232、236、245、251、256(编号对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA)的任一个位置处的SNP将区分常见真菌和酵母人类病原体的核酸与哺乳动物宿主的核酸。利用5.8S rRNA中的这些SNP区分真菌与哺乳动物的一般规则描绘在表47中。
[0466] 表47.
[0467]SNP位置 真菌 哺乳动物
142 C T
144 A G
146 A G
147 A G
148 C T
154 T A
157 T C
164 C/G T
167 A G
185 G T
187 A G
188 A C
194 T G
197 G T
213 A G
215 T C
216 T A
219 G T
223 A 不存在
231 A/G C
232 T A
236 T C
245 A/C 不存在
251 C G
256 T G
[0468] 实施例5
[0469] 哺乳动物(例如,人类)真菌病原体的区分
[0470] 七种真菌物种,白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属(Fusarium sp.)、烟曲霉和新型隐球菌是已知的哺乳动物(例如,人类)病原体。这些病原体的5.8S rRNA序列从GenBank下载且利用CLUSTALW比对以上实施例4中描述的~126bp保守区域。
[0471] 进行序列分析以确定,最少4个SNP可用于区分这些病原体并鉴定它们。这些SNP包括在以下位置的那些:对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因的位置254;对应于SEQ ID NO:2的位置160或255的位置之一;和对应于SEQ ID NO:2的位置163、164、
165、196、202、223、224或259中的两个位置。
[0472] 因此,4个SNP的各种组合将区分这七种哺乳动物(例如,人类)真菌病原体,其中4个SNP包括在位置254;位置160或255之一;和位置163、164、165、196、202、223、224、259的任何两个的SNP。表48列出了对于每种病原体在每个位置的SNP。由于SNP 164和223还可用于区分酵母/真菌与哺乳动物,利用164或223的组合能够完全区分哺乳动物背景中的这七种病原体真菌物种。
[0473] 表48.
[0474]
[0475] 实施例6
[0476] 常见于哺乳动物(例如,人类)败血症中的革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物以及真菌真核生物的区分和定量
[0477] 进行测定以区分和定量常见于哺乳动物(例如,人类)败血症中的革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物以及真菌真核生物。
[0478] A.用于检测16S rRNA SNP并定量细菌的引物、探针和标准
[0479] Primer Express 2.0(Applied Biosystems)软件用于设计 MGB探针和引物以确定在原核生物的16S rRNA的位置396、398、278、286和648的SNP。设计针对这些SNP的总共8对正向和反向引物以及16个探针。以下引物和探针的组合可用于在其革兰氏状态的基础上对实施例3中描述的哺乳动物(例如,人类)败血症病原体分类。
[0480] 检测在哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA的位置396和398的SNP的引物和探针:
[0481] 探针序列:针对革兰氏阳性细菌的GCAACGCCGCGT(SEQ ID NO:4)和GCGACGCCGCGT(SEQ ID NO:5);和针对革兰氏阴性细菌的GCCAAGTAGCGT(SEQ ID NO:6)和GCCATGCCGCGT(SEQ ID NO:7)。
[0482] 正向引物序列:ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT(SEQ ID NO:8)用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。反向引物序列:GCCAGCAGCYGCGGTAATACG(SEQ ID NO:9)用于革兰氏阴性和GCCAGCAGCCGCGGTAATACG(SEQ ID NO:10)用于革兰氏阳性细菌。
[0483] 检测在哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA位置278和286的SNP的引物和探针:
[0484] 探针序列:针对革兰氏阴性细菌的GCGATGATCAGTAG(SEQ ID NO:11)、GCTATGACGCTTAA(SEQ ID NO:12)、GCTTTGACGCATAA(SEQ ID NO:13)、GCTATGACGGGTAT(SEQ ID NO:14)、GCAATGATCAGTAG(SEQ ID:15)和GTTTTGACGTCTAG(SEQ ID:16);和针对革兰氏阳性细菌的GCAACGATGCATAG(SEQ ID NO:17)、GCAACGATGCGTAG(SEQ ID NO:18)和
GCCACGATACATAG(SEQ ID NO:19)。
[0485] 正向引物序列:针对革兰氏阴性细菌的TGWAGGAGGGGATTGCGTC(SEQ ID NO:20)、TGTAGGATGAGACTATATW(SEQ ID NO:21)和TAARRGATCAGCCTATGTC(SEQ ID NO:22);和针对革兰氏阳性细菌的TTATAGATGGATCCGCGCY(SEQ ID NO:23)和TGATGGATGGACCCGCGGT(SEQ ID NO:24)。
[0486] 反向引物序列:针对革兰氏阴性的ATGAACGGCCACATTGG(SEQ ID NO:25)、ATGATCAGTCACACTGG(SEQ ID NO:26)和GTGAWCGGACACACTGG(SEQ ID NO:27)用于革兰氏阴性;和针对革兰氏阳性的GTGATCGGCCACACTGGRACT(SEQ ID NO:28)。
[0487] 检测在哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA的位置648的SNP的引物和探针:
[0488] 探针序列:针对革兰氏阴性的CTGCTGATCTAGAG(SEQ ID NO:29);和针对革兰氏阳性的CTGGAAAACTTGAG(SEQ ID NO:30)和CTGGGAGACTTGAG(SEQ ID NO:31)。
[0489] 正向引物序列:针对革兰氏阴性的TAACCCCGTGAKGGGATGGA(SEQ ID NO:32);和针对革兰氏阳性的CAACCGKGGAGGGTCATTGGA(SEQ ID NO:33)。
[0490] 反向引物序列:针对革兰氏阴性的TCGGAGAGGAAAGTGGAATTCC(SEQ ID NO:34)用于革兰氏阴性;和针对革兰氏阳性的CARRAGRGGARAGTGGAATTCC(SEQ ID NO:35)。
[0491] 引物和探针按照Applied Biosystems(Life Technologies,USA)的Custom 基因表达测定合成(Primers and probes were synthesized as Custom
gene expression assays by Applied Biosystems(Life Technologies,
USA))。所有革兰氏阴性探针标记以VICTM荧光标记且所有革兰氏阳性探针标记以FAMTM荧光标记,从而使得能够在一个单反应中区分革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌物种。
[0492] 对于定量实时PCR,准备每个革兰氏阳性和革兰氏阴性探针和引物组的反应。为了生成对于每个大的细菌组的标准曲线,准备表49中列出的ATCC对照。
[0493] 表49.
[0494]
[0495]
[0496] 每个标准一式两份地准备,且典型的PCR运行格式如下准备:试管1-16:396398GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,带有1:10连续稀释的金黄色葡萄球菌ATCC25923DNA。这生成标准曲线。试管17-32:396398GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,带有连续稀释的掺入细菌DNA的血液。试管33-48:396398GRPOS2、278286GRPOS2和
648GRPOS2预混液,带有1:10连续稀释的金黄色葡萄球菌ATCC25923DNA。这生成标准曲线。
试管49-64:396398GRPOS2、278286GRPOS2和648GRPOS2预混液,带有连续稀释的掺入细菌DNA的血液。试管65-66:396938GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,无模板对照。试管67-68:396398GRPOS2、278286GRPOS2和648GRPOS2预混液,无模板对照。所有革兰氏阳性和革兰氏阴性探针遵循这一实验方案。
[0497] PCR反应(一式两份)如下准备:1μL 20x TaqMan Gene Expression Assay;10μL 2x TaqMan Gene Expression预混液;4μL DNA模板(1-100ng);5μL无DNA酶和RNA酶的水。将PCR反应转移到Rotor-Gene Q实时PCR仪器(Qiagen,Australia)且PCR在以下条件下进行:
50℃2min;95℃10min;然后95℃15sec和60℃1min的45个循环。
[0498] Rotor-Gene Q v.2.1.0.9软件用于对每个连续稀释的以下对照生成标准曲线。革兰氏阳性对照:金黄色葡萄球菌ATCC25923;革兰氏阴性对照:大肠杆菌ATCC25922。
[0499] B.用于检测5.8S rRNA SNP的引物和探针
[0500] 念珠菌属和曲霉属的种的5.8S rDNA序列从GenBank下载并如上所述地比对。Primer Express 2.0(Applied Biosystems)用于设计对利用在位置164和165处的SNP鉴定酵母和真菌物种特异的 MGB探针和引物。
[0501] MGB FAM探针序列是CTCTTGGTTCCGGCATCGA(SEQ ID NO:36)且MGB VIC探针序列是CTCTTGGTTCTCGCATCGA(SEQ ID NO:37),正向引物序列是
TATGCAGTCTGAGTTGATTATCGTAATC(SEQ ID NO:38)和CAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTT(SEQ ID NO:39);且反向引物序列是GCATTTCGCTGCGTTCTTC(SEQ ID NO:40)。引物和探针按照Applied Biosystems(Life Technologies,USA)的Custom 基因表达测定合成。
[0502] 实施例7
[0503] 利用SNP对常见哺乳动物(例如,人类)病原体细菌分类和定量
[0504] 将常见哺乳动物(例如,人类)病原体分类为宽的组并定量允许进行下游决定,诸如抗生素选择、富集培养基选择、进行何种抗生素抗性试验、和进行何种微生物毒力试验,所述分类和定量可通过以下实现:首先从生物样品提取DNA和进行多重RT-PCR反应以扩增覆盖细菌16S rRNA的位置396、398、399、400和401的181个碱基对的区域,利用探针以把细菌分类为如上描述的第1-7组中之一。如果检测到细菌DNA,可进行第二反应以进一步将细菌分类成亚组,从而提供关于细菌的身份和/或特征的另外的信息,其可被临床医生使用以确定适当的疗程。确定细菌的确切身份和/或抗生素抗性和/或毒力的另外的研究可利用本领域描述的标准和公知的分子技术进行。
[0505] 在第一步骤中,利用本领域已知的任何方法从生物样品中提取任何细菌DNA,所述方法包括但不限于使用来自Biomerieux(NucleSENS )和Becton Dickinson(BD )的自动化的系统。用于从全血浓缩和提取细菌DNA的专门的试剂盒/系统也是
可得的,包括 (Biocartis)和 (MolZym)。然后利用扩增细菌16S rDNA
的相同181碱基对区域的下列两对正向和反向引物进行多重RT-PCR反应(反应1):具有序列ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT(SEQ ID NO:8)的正向引物和具有序列GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC(SEQ ID NO:278)的反向引物,其从大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌扩增对应于SEQ ID NO:2的16S rRNA的核苷酸338至536的区域;和具有序列ACTCCTACGGGAGGCTGCAGT(SEQ ID NO:279)的正向引物和具有序列GTATTACCGCGGCAGCTGGCAC(SEQ ID NO:280)的反向引物,其从衣原体属和嗜性衣原体属扩增相同区域。反应1还包括七种12个碱基对的探针,每种探针具有不同染料,覆盖位置396、398、399、400和401。探针如下,以5’至3’方向,SNP加下划线:
[0506] 探针1=AGCAACGCCGCGT(SEQ ID NO:281)
[0507] 探针2=AGCGACGCCGCGT(SEQ ID NO:282)
[0508] 探针3=AGCCATGCCGCGT(SEQ ID NO:283)
[0509] 探针4=AGCAATGCCGCGT(SEQ ID NO:284)
[0510] 探针5=AGCCATACCGCGT(SEQ ID NO:285)
[0511] 探针6=AGCCAAGTAGCGT(SEQ ID NO:286)
[0512] 探针7=AGCCAAGTCGCGT(SEQ ID NO:287)
[0513] 如果细菌DNA在样品中以足够的浓度存在,这些引物将从Genbank数据库中存在的超过7000个细菌的种,包括衣原体属的种扩增核酸。七种探针宽泛地将细菌分类为七个组:第1组主要包含革兰氏阳性生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中超过1800个细菌的种的存在;第2组主要包含革兰氏阳性生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中超过2200个细菌的种的存在;第3组包含革兰氏阴性生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中超过2300个细菌的种的存在;第4组包含革兰氏阴性生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中超过800个细菌的种的存在;第5组包含革兰氏阴性生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中的46个种(主要是寡养单胞菌(Stenotrophmonas spp));第6组包含革兰氏阴性厌氧生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中的82个种(主要是拟杆菌属和普雷沃氏菌属);第7组包含革兰氏阴性厌氧生物体,且所述12个碱基对的探针与正向和反向引物的组合将鉴定该组中的33个种(主要是卟啉单胞菌属)。
[0514] 如果反应1产生阳性结果,则进行第二步骤,所述第二步骤包括1:100稀释反应1的产物并将其加入多重反应2,多重反应2包含与反应1相同的正向和反向引物和表7中对每组哺乳动物(例如,人类)病原体列出的探针。例如,如果反应1对第1组细菌是阳性的,则1:100稀释反应产物并加入到包含SEQ ID NO:8和278中列出的正向和反向引物对和革兰氏阳性探针1a(SEQ ID NO:288)、1b(SEQ ID NO:289)、1c(SEQ ID NO:290)、1d(SEQ ID NO:291)、1e(SEQ ID NO:292)、1f(SEQ ID NO:293)、1g(SEQ ID NO:294)、1h(SEQ ID NO:295)、1i(SEQ ID NO:296)、1j(SEQ ID NO:297)、1k(SEQ ID NO:298)、1l(SEQ ID NO:299)的反应中。由于多重化和可用染料的数量的限制,每个反应可限于适当数量的探针。例如,可进行两个反应,一个反应包含探针1a-1g,而另一个反应包含探针1h-1l。对于任何探针的阳性结果指示样品中细菌的分组和可能的身份。例如,如果阳性结果是利用探针1a获得的,则样品中存在的细菌是具有可能的万古霉素抗性的革兰氏阳性细菌,选自炭疽芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌。表50列出了利用以上方法在样品中可用于分类细菌的探针和利用每种探针鉴定的被鉴定的细菌的分组和特征。
[0515] 表50.
[0516]
[0517]
[0518]
[0519]
[0520]
[0521] Gm+ve=革兰氏阳性
[0522] Gm–ve=革兰氏阴性
[0523] VRE=万古霉素抗性的肠球菌
[0524] ORSA=苯唑西林-抗性的金黄色葡萄球菌。
[0525] ESBL=超广谱β-内酰胺酶
[0526] 可进行第三步骤,包括特异性测试细菌的种和/或抗生素抗性和/或毒力,这可利用如本领域中描述的标准分子技术实现。
[0527] 一旦知晓了步骤1和2(以及步骤3,如果进行了)的结果,则可如上所述地利用已知量的适当的细菌物种对照DNA和生成标准曲线进行细菌定量。
[0528] 因此,三或四步骤的系列反应可将细菌分类为多个组,确定细菌的种,确定抗生素抗性,确定细菌毒力并定量原始样品中细菌DNA的量,而不必先培养或富集生物体。此类过程可花费比目前在培养物肉汤中培养生物体的时间少的时间实现。
[0529] 实施例8
[0530] 见于免疫受损的肺炎和囊性纤维化患者的气道和呼吸流体中的革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物以及真菌真核生物的区分和定量
[0531] 进行区分和定量通常见于免疫受损的患伴有败血症并发症的肺炎和囊性纤维化的人类患者的气道和呼吸流体的革兰氏阴性和革兰氏阳性原核生物和真菌真核生物的测定。从来自免疫受损的患者的BAL流体分离的常见微生物包括:葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、金黄色葡萄球菌、不动杆菌属、二氧化噬纤维菌属(Capnocytophaga)、肠杆菌科(Enterobacteriacea)、嗜血杆菌属、军团菌属、假单胞菌属、分支杆菌属、念珠菌属和曲霉属(参见Hohenadel IA,等人,(2001)Role of bronchoalveolar lavage in immunocompromised patients with pneumonia treated with a broad spectrum 
antibiotic and antifungal regimen.Thorax 56:115–120第118页的表2)。通常见于具有急性支气管炎、社区获得性肺炎和医院获得性肺炎的患者的下呼吸道的示例微生物包括:
博德特氏菌属(Bordetella)、链球菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、克雷伯菌属、肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、莫拉氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、念珠菌属和曲霉属(Carroll KC(2002)Laboratory Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections:Controversy and Conundrums.Journal of Clinical Microbiology 40:3115–3120)。通常见于囊性纤维化患者的气道中的示例微生物包括:嗜血杆菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属、寡养单胞菌属、克雷伯菌属、念珠菌属和曲霉属(Harrison F(2007)Microbial ecology of the cystic fibrosis lung.Microbiology(Reading,Engl)153:917–923)。
[0532] A.用于检测16S rRNA SNP并定量细菌的引物、探针和标准
[0533] Primer Express 2.0(Applied Biosystems)软件用于设计 MGB探针和引物以确定在原核生物的位置396和398处的SNP。设计对于这些SNP的总共1对正向和反向引物以及3种探针。以下引物和探针的组合可用于分类最常见的人类呼吸道细菌病原体。
[0534] 检测在哺乳动物(例如,人类)败血症病原体的16S rRNA的位置396和398处的SNP的引物和探针:
[0535] 探针序列:针对革兰氏阳性细菌的GCAACGCCGCGT(SEQ ID NO:4)和GCGACGCCGCGT(SEQ ID NO:5);和针对革兰氏阴性细菌的GCCATGCCGCGT(SEQ ID NO:7)。
[0536] 正向引物序列:ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT(SEQ ID NO:8)用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。反向引物序列:GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC(SEQ ID NO:278)用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。
[0537] 引物和探针按照Applied Biosystems(Life Technologies,USA)的Custom基因表达测定合成。所有革兰氏阴性探针标记以VICTM荧光标记且所有革兰氏阳
性探针标记以FAMTM荧光标记,从而使得能够在一个单反应中区分革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的种。
[0538] 对于定量性实时PCR,准备每个革兰氏阳性和革兰氏阴性探针和引物组的反应。为了生成对于每个大的细菌组标准曲线,准备表51中列出的ATCC对照。
[0539] 表51.
[0540]PCR预混液 使用的ATCC对照菌株
396398GRPOS1 金黄色葡萄球菌ATCC25923
396398GRPOS2 金黄色葡萄球菌ATCC25923
396398GRNEG1 大肠杆菌ATCC25922
396398GRNEG2 大肠杆菌ATCC25922
278286GRNEG 大肠杆菌ATCC25922
278286GRPOS1 金黄色葡萄球菌ATCC25923
278286GRPOS2 表皮葡萄球菌ATCC35983
648GRNEG 非典型韦荣氏球菌ATCC12641
648GRPOS1 金黄色葡萄球菌ATCC25923
648GRPOS2 粪肠球菌ATCC29212
[0541] 每个标准一式两份地准备,且典型的PCR运行格式如下准备:试管1-16:396398GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,带有1:10连续稀释的金黄色葡萄球菌ATCC25923DNA。这生成标准曲线。试管17-32:396398GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,带有连续稀释的掺入细菌DNA的血液。试管33-48:396398GRPOS2、278286GRPOS2和
648GRPOS2预混液,带有1:10连续稀释的金黄色葡萄球菌ATCC25923DNA。这生成标准曲线。
试管49-64:396398GRPOS2、278286GRPOS2和648GRPOS2预混液,带有连续稀释的掺入细菌DNA的血液。试管65-66:396938GRPOS1、278286GRPOS1和648GRPOS1预混液,无模板对照。试管67-68:396398GRPOS2、278286GRPOS2和648GRPOS2预混液,无模板对照。所有革兰氏阳性和革兰氏阴性探针遵循这一实验方案。
[0542] PCR反应(一式两份)如下准备:1μL 20x TaqMan Gene Expression Assay;10μL 2x TaqMan Gene Expression预混液;4μL DNA模板(1-100ng);5μL无DNA酶和RNA酶的水。将PCR反应转移到Rotor-Gene Q实时PCR仪器(Qiagen,Australia)且PCR在以下条件进行:50℃2min;95℃10min;然后95℃15sec和60℃1min的45个循环。
[0543] Rotor-Gene Q v.2.1.0.9软件用于对每个连续稀释的以下对照生成标准曲线。革兰氏阳性对照:金黄色葡萄球菌ATCC25923;革兰氏阴性对照:大肠杆菌ATCC25922。
[0544] B.用于检测5.8S rRNA SNP的引物和探针
[0545] 念珠菌属和曲霉属的种的5.8S rDNA序列从GenBank下载并如上所述地比对。Primer Express 2.0(Applied Biosystems)用于设计对利用在位置163和164处的SNP鉴定酵母和真菌物种特异的 MGB探针和引物。
[0546] MGB FAM探针序列是TTCCGGCATCGA(SEQ ID NO:324)且 MGB VIC探针序列是TTCTCGCATCGA(SEQ ID NO:325),正向引物序列是
CAAAACTTTCAACAACGGATCTC(SEQ ID NO:326)和TAAAACTTTCAACAACGGATCTC(SEQ ID NO:
327);且反向引物序列是GACGCTCGGACAGGCATG(SEQ ID NO:328)和GACGCTCAAACAGGCATG(SEQ ID NO:329)。引物和探针按照Applied Biosystems(Life Technologies,USA)的
Custom 基因表达测定合成。
[0547] 表52.
[0548] 来自免疫受损的患者的BAL的常见细菌的种
[0549]
[0550]
[0551] 表53.
[0552] 来自免疫受损的患者的BAL的常见真菌/酵母的种
[0553]
[0554] 表54.
[0555] 从具有急性支气管炎、社区获得性肺炎和医院获得性肺炎的患者的下呼吸道分离的常见微生物物种。
[0556]
[0557]
[0558] 表55.
[0559] 从具有急性支气管炎、社区获得性肺炎和医院获得性肺炎的患者的下呼吸道分离的常见真菌/酵母物种。
[0560]
[0561] 表56.
[0562] 见于具有囊性纤维化的患者的气道中的常见微生物。
[0563]
[0564]
[0565] 表57.
[0566] 见于具有囊性纤维化的患者的气道中的常见真菌/酵母物种。
[0567]
[0568] 实施例9
[0569] 在哺乳动物背景中区分哺乳动物(例如,人类)念珠菌属真菌病原体与其他真菌病原体
[0570] 十一种真菌物种,白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、荚膜组织胞浆菌、葡萄穗霉属、尖端赛多孢子菌、镰孢菌属、烟曲霉和新型隐球菌是已知的哺乳动物(例如,人类)病原体。这些病原体的5.8S rRNA序列从GenBank下载并利用CLUSTALW比对如以上实施例4中描述的~126bp保守区域。
[0571] 进行序列分析以确定,最少2个SNP能够用于区分常见念珠菌属病原体与哺乳动物基因组背景中的其他真菌病原体。对于确定适当的治疗方案和确定预后,这种区分在临床上是重要的。此类试验可对任何临床样品使用,但其对于分别用于败血症和肺炎诊断的血液和支气管肺泡灌洗样品特别合适的。这两个SNP包括对应于SEQ ID NO:2中列出的白色念珠菌5.8S rRNA基因的163、164的位置处的SNP。
[0572] 表58列出了每种病原体和对于许多哺乳动物在每个位置的SNP。由于SNP 163和164也可用于区分酵母/真菌与哺乳动物,这两个SNP的组合能够完全区分念珠菌属的病原体的种与哺乳动物背景中的其他病原体真菌物种。
[0573] 引物和探针是以上实施例8中描述的那些。
[0574] 表58.
[0575]
[0576] 实施例10
[0577] 基于微生物病原体的宽泛分类的抗生素选择
[0578] 利用本文详述的发明和所得的对微生物病原体的宽泛分类,可做出关于经验性和靶向的抗生素疗法的适当选择的更知情的决定,经验和靶向的抗生素疗法如以下表59和60所提供的(示例性地)。使用更为针对成因病原体的抗生素导致降低的成本(窄谱抗生素比广谱抗生素便宜得多)、更好的患者结果、更低的发展不利副作用(包括艰难梭菌感染)的可能性和更低的发展抗生素抗性的可能性。
[0579] 表59.
[0580] 基于革兰氏和组的确定的对于导致常见败血症的生物体的经验抗生素的示例选择
[0581]
[0582]
[0583] 表60.
[0584] 基于革兰氏和组的确定的对于能够被分组的生物体窄谱抗生素的示例选择
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589] *仅为示例–通常抗生素选择取决于其他因素诸如感染的来源(例如呼吸道vs皮肤vs腹部vs尿路)、医院抗菌谱(hospital antibiogram)、患者的共存病症(co-morbiditie)和过敏症。
[0590] 本文提及的每一个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用全文并入本文。
[0591] 本文对任何参考文献的提及不应解释为承认此类参考文献可用作本申请的“现有技术”。
[0592] 遍及本说明书,目的是描述本发明的优选实施方案而不限制本发明于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此本领域技术人员将领会,鉴于本公开内容,在示例的特定实施方案中可进行各种修改和改变而不偏离本发明的范围。所有这样的修改和变化意图被包括在所附的权利要求书的范围内。
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