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一种荧光定量PCR检测AAPB的方法

阅读：46发布：2023-03-14

专利汇可以提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法是根据AAPB的pufM基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQIDNO.2的核苷酸序列。本发明所提供的检测AAPB的方法与流式细胞仪检测方法相比，准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害，更加适合应用于湖泊、河流等颗粒性物质浓度高、颗粒粒径大的水体 AAPB的检测中。本发明方法定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。，下面是一种荧光定量PCR检测AAPB的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，根据AAPB的pufM 基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤：
S1、采集水体DNA样品：将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA；
S2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线：取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌pufM基因引物对，分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线：
将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
S4、样品检测：
取步骤S1中得到的水体样本DNA作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和pufM基因引物，进行实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增；其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA；将DNA样本的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM基因片段拷贝浓度。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：
将采集到的水体样品经过5 μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0.2 μm的微孔滤膜进行过滤；对0.2 μm微孔滤膜上的物质进行细菌的总DNA提取纯化，得到水体样品DNA。
4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，所述步骤S3中的总菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述荧光定量PCR检测的反应体系为：
20 μL SYBR-Green Master Mix，1 μL 纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μL，以去离子水补足至25 μL的终体积。
6.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其特征在于，步骤S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94℃ 10 s，54℃ 20 s 和72℃ 10 s。

说明书全文

一种荧光定量PCR检测AAPB的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR (聚合酶链式反应)检测AAPB的方法。

背景技术

[0002] 好氧不产氧光合细菌，Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB)是一类能利用光能进行光合作用的细菌。AAPB 有着独特的生理生态特征：(1)专性好氧；(2)营光合作用生长却不全依赖于光；(3)细菌叶绿素a (BChla)含量比厌氧光合细菌低很多，含有类胡萝卜素。

[0003] AAPB在水生态系统中有着特殊的意义，现有的文献表明：(1)AAPB分布广泛，在海洋、酸性矿山污水、热泉、江河和河口以及湖泊中都有发现；(2)在水生生态系统中占有较大比例，如在海洋中占总细菌的10%，(通过荧光显微镜发现在太平洋中占总原核细胞数的5%，在大西洋中则是2%-16%)，河口中占34%，在某些高山淡水湖泊中则超过50%，但是也有文献表明AAPB在15公里的近海的18个点位中一般只在1%左右，最多也不超过3%；(3) AAPB在海洋生态系统的碳循环中有重要作用。

[0004] 将Bchla (细菌叶绿素a)产生的光合能量转换为呼吸消耗所需的相应的碳量，-3 -1 -3 -1在陆架海和大洋分别为0.27 mgC m day 和0.11 mgC m day 相当于各自海区初级生产力的2.4%和5.4%。根据政府间气候委员会 (IPCC) 的模型，海洋吸收和释放二氧化碳的差值大约是2％，所以基于BChla的光能利用足以改变一个海区碳的“汇”“源”格局(Jiao et al., 2010 “Significant roles of bacteriochlorophylla supplemental to chlorophylla in the ocean” The ISME Journal, 4(4): 595-597)。现在世界各国极其关注全球碳排放。截止到2009年2月，一共有183个国家通过了《京都议定书》。因此研究AAPB对于我们理解全球碳排放、气候变化、温室效应等有重要现实意义。但是以上研究几乎都是针对海洋而针对湖泊，水库，河流的研究较少，对AAPB在淡水水生态系统中碳循环作用知之甚少。现有技术使用流式细胞仪检测AAPB，需要大型仪器流式细胞仪。流式细胞仪检测方法主要运用于海洋水体中，相对于海洋水体湖泊、河流等水体中颗粒性物质浓度更高，粒径更大对流式细胞仪有较大损耗；而且流式细胞仪价格昂贵一般科研机构不具备。
使用的试剂DAPI染料等是强烈致癌物质，对人体和环境都不友好，现有技术中缺乏一种快捷简便、安全的检测AAPB的方法。

[0005] 因此，AAPB检测方法还有待发展。

发明内容

[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，旨在解决现有的检测AAPB的技术操作困难并对环境不友好的问题。

[0007] 本发明的技术方案如下：一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，根据AAPB的pufM 基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测；其中，所述pufM引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。

[0008] 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述荧光定量PCR检测AAPB的方法具体包括以下步骤：S1、采集水体DNA样品：将采集到的水体样品经过过滤，得到水体中的细菌，并对细菌进行总DNA的提取纯化，得到水体样品DNA；
S2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线：取好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并稀释成多个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌pufM基因引物对，分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线：
将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并稀释成多个浓度梯度，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物分别以各个浓度的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值绘制荧光定量PCR标准曲线；
S4、样品检测：
取步骤S1中得到的水体样本DNA作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和pufM基因引物，进行实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增；其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA；将DNA样本的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM基因片段拷贝浓度。

[0009] 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述步骤S1具体为：将采集到的水体样品经过5 μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0.2 μm的微孔滤膜进行过滤；对0.2 μm微孔滤膜上的物质进行细菌的总DNA提取纯化，得到水体样品DNA。

[0010] 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，所述步骤S3中的总菌引物，其正向引物具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4的核苷酸序列。

[0011] 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，步骤S2中所述荧光定量PCR检测的反应体系为：20 μL SYBR-Green Master Mix，1 μL 纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μL，以去离子水补足至25 μL的终体积。

[0012] 所述的荧光定量PCR检测AAPB的方法，其中，步骤S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94℃ 10 s，54℃20 s 和72℃ 10 s。

[0013] 有益效果：本发明所提供的检测AAPB的方法与流式细胞仪检测方法相比，准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害，更加适合应用于湖泊、河流等颗粒性物质浓度高、颗粒粒径大的水体AAPB的检测中。本发明方法定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。附图说明

[0014] 图1为本发明实施例2中荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图。

[0015] 图2为本发明实施例2中荧光定量PCR熔链曲线图。

[0016] 图3为本发明实施例2中AAPB荧光定量PCR标准曲线。

[0017] 图4为本发明实施例3中总细菌荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

[0018] 本发明提供一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0019] 本发明提供的一种荧光定量PCR检测AAPB的方法，能快速准确地定量检测水体中AAPB，能用于对湖泊、水库、河流等淡水水体中AAPB的检测。本方法具有操作简单、对环境友好、检测结果准确等优点，采用本方法建立的标准曲线灵敏度高、重复性好，在AAPB的鉴定领域具有良好的应用前景。

[0020] 本发明所提供的荧光定量PCR检测AAPB的方法，是利用根据AAPB的pufM 基因片段设计出的引物，进行实时荧光定量PCR检测，其中所述引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，pufM forward (5'-TATAAYCCATTTCAYGC-3')；反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列，pufM reverse (5'-GCRAACCACCAAGCCCA-3')。

[0021] 本发明的方法主要步骤包括：采集和处理，过滤水体样品并提取DNA，应用SYBR Green I 嵌合荧光法针对pufM基因片段进行实时荧光定量PCR检测，应用计算机获取标准曲线，计算待测样品中pufM 基因片段拷贝数和AAPB的数量。

[0022] 本发明的方法具体包括以下具体步骤：S1、采集水体DNA样品：
将采集到的水体样品经过5 μm的微孔滤膜过滤，得到的滤液再用0.2 μm的微孔滤膜进行过滤；对0.2 μm微孔滤膜上的物质进行细菌总DNA的提取纯化，得到水体DNA样品。

[0023] S2、建立AAPB荧光定量PCR标准曲线：取已知的好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并按10倍稀释法稀释成
3 8
10 ～10 拷贝每微升的6个浓度梯度，每个稀释梯度重复3次，用好氧不产氧异养细菌pufM基因引物对，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。

[0024] S3、建立水体总细菌荧光定量PCR标准曲线：通过确定总细菌的16S rRNA gene的拷贝数，可确定水体总菌数。将大肠杆菌作为标
0 5
准菌株，提取DNA并按10倍稀释法稀释成10 ～10 拷贝每微升的6个浓度梯度，每个稀释梯度重复3次，按照步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，用总菌引物在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。所使用的总菌引物，正向引物具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列，(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')，反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4的核苷酸序列，(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。

[0025] S4、样品检测：取步骤S1中得到的DNA样本作为模板，按步骤S2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，分别用总菌引物和pufM基因引物，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增。其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用好氧不产氧光合细菌的DNA。反应结束后，将DNA样本的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到DNA样本中的pufM基因片段拷贝浓度，据此得到原水样中的pufM基因拷贝浓度，进而得到原水样中好氧不产氧光合细菌数量和占总细菌的比例。

[0026] 在本发明方法中，所述荧光定量PCR检测的反应体系可以为：20 μL SYBR-Green Master Mix，1 μL 纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μL，以去离子水补足至25 μL的终体积。

[0027] 所述实时荧光定量PCR的反应程序可为：50℃ 2 min，95℃ 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94℃ 10 s，54℃ 20 s 和
72℃ 10 s。PCR完成后，按0.1℃每秒的升温速率从72℃升至95℃进行溶解曲线的分析验证。

[0028] 本发明方法优点明显，与流式细胞仪检测方法相比准确度更高，容易操作，成本低廉，效率高而且更加安全，无毒无害。流式细胞仪检测方法主要运用于海洋水体中，相对于海洋水体湖泊、河流水体中颗粒性物质浓度更高，粒径更大对流式细胞仪有较大损耗；而且流式细胞仪价格昂贵一般科研机构不具备。采用本发明的方法对湖泊、河流等水体AAPB进行检测则不存在这些问题，定量检测重复性好，可以对样品进行高通量的检测且仅需2个小时左右就能完成。

[0029] 实施例1 样品的采集与预处理对TH湖主要入湖河流水体的水样进行AAPB的定量。采集水体样品TH1~9，将得到的水体样品分别经过5 μm的微孔滤膜过滤后再用0.2 μm的膜过滤滤液，压力小于100 mbar；
然后对0.2 μm滤膜上的物质进行总DNA的提取纯化，得到水体DNA样品TH1~9。

[0030] 实施例2 建立AAPB荧光定量PCR标准曲线取已知的好氧不产氧光合细菌作为标准菌株，提取其DNA并按10倍稀释法稀释成
3 8
10 ～10 拷贝每微升的6个浓度梯度，用好氧不产氧异养细菌pufM 基因引物对，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。本实施例中是采用SYBRGreen I 嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR。将上述各浓度梯度DNA作为模板，进行扩增反应每个浓度加入3个反应管同时进行。

[0031] 所述荧光定量PCR检测的反应体系为：20 μL SYBR-Green Master Mix，1 μL 纯化后的DNA样品，用于扩增的引物对，每条引物浓度10 pmol、添加量为0.4 μL，以去离子水补足至25 μL的终体积。

[0032] 所述引物对为：正向引物pufM forward (5'- TATAAYCCATTTCAYGC-3')；
反向引物pufM reverse (5'-GCRAACCACCAAGCCCA-3')。

[0033] 所述实时荧光定量PCR的反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 30 s，接着进行40个循环，每个循环包括94℃ 10 s，54℃ 20 s 和
72℃ 10 s。PCR完成后，按0.1℃每秒的升温速率从72℃升至95℃进行溶解曲线的分析验证。

[0034] 反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。

[0035] AAPB阳性克隆DNA中pufM 基因片段拷贝浓度(拷贝/μL)按照如下方法进行计算：23
DNA中的pufM拷贝浓度 (拷贝/mL)=[6.02×10 (拷贝/mol)]×[DNA浓度 (g/mL)]/[一个基因组的摩尔质量 (g/mol)]。以初始模板DNA 量的对数为横坐标，以PCR 反应过程中每个稀释样品的C(t) 值为纵坐标，分别绘制AAPB及总菌的标准曲线，如图3和图4所示。实施例中荧光信号的采集和相关数据处理都由实时荧光定量PCR仪所带的软件完成。
按0.1℃每秒的升温速率从72℃升至95℃进行溶解曲线的分析验证。

[0036] 图1荧光定量PCR敏感度检测的荧光信号图，说明经过40个循环待测样品PCR都进入平台期，循环数再增加不会对实验结果产生影响。图2荧光定量PCR熔链曲线图，熔链温度在86℃左右，熔链曲线的峰单一，说明PCR扩增反应过程中没有非目的片段扩增；扩增效率高、特异性好。3 为本实施例中AAPB荧光定量PCR标准曲线，y = -3.260×log(conc) + 8.041(注：conc表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。

[0037] 实施例3 建立总细菌荧光定量PCR标准曲线0 5
将大肠杆菌作为标准菌株，提取DNA并按10倍稀释法稀释成10 ～10 拷贝每微升的
6个浓度梯度，按照实施例2中的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。将上述各浓度梯度DNA作为模板，进行扩增反应每个浓度加入3个反应管同时进行。

[0038] 所使用的总菌引物：正向引物：(5'-CCTACGGGAGGCA GCAG-3')；
反向引物：(5'-ATTACCGCGGCTG CTGG-3')。

[0039] 反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈C(t)值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。图4为本实施例中总细菌荧光定量PCR标准曲线，y = -2.936×log(conc) + 8.601(注：conc表示反应体系中的标准质粒拷贝数)。

[0040] 实施例4 样品检测以实施例1提取的TH湖入湖河流的水样DNA样品TH1~9为模板，按实施例2的实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应体系和扩增条件与作标准曲线时一致，每个样品重复3次，同时做阳性对照 (以克隆的AAPB菌株DNA替代待测样品DNA)和阴性对照 (以去离子水代替待测样品DNA)。反应结束后根据样品的循环阈值C(t)值，用标准曲线方程计算出总菌及pufM基因片段的初始拷贝数，两者之比即为AAPB在样品中的丰度。

[0041] 所测水样中AAPB的丰度如下表所示：样品 16SrRNAgene拷贝数 pufM gene拷贝数比例%
TH1 1.16E＋06 5.01E＋04 4.31
TH2 2.50E＋06 4.73E＋04 1.89
TH3 1.13E＋07 2.05E＋05 1.81
TH4 1.31E＋08 9.27E＋05 0.71
TH5 3.64E＋06 2.66E＋05 7.31
TH6 1.21E＋05 1.05E＋04 8.68
TH7 2.21E＋07 2.08E＋05 0.94
TH8 1.38E＋07 7.12E＋05 5.16
TH9 3.65E＋06 5.44E＋04 1.49
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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