技术领域
[0001] 本
发明涉及一种高分子材料，尤其是涉及一种羧基化荧光编码微球及其合成方法。
背景技术
[0002] 液相芯片技术被喻为后基因组时代的芯片技术，又称流式微珠技术。20世纪90年代以来，这种综合了分子
生物学、免疫学、光学和化学等领域的新技术得到蓬勃发展，成为影响最深远的重大科技进展之一，也是FDA唯一批准的可应用于临床诊断的芯片技术。液相芯片技术的载体是表面功能化的荧光编码微球，表面功能化的荧光微球以其强大的固定生物大分子的能
力及稳定而高效的
发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有很高的研究应用价值。
[0003] 荧光微球是指粒径在纳米到微米范围内，负载有荧光物质，受外界
能量激发而发射荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型外形为球形。根据载体及荧光物质的不同，荧光微球可分为两类：一类是无机/有机荧光微球(一种是以无机材料为载体，荧光物质为有机化合物；另一种是有机高分子为载体，荧光物质为无机物)；另一类为有机/有机微球(微球载体是合成或天然的高分子材料，荧光物质是有机物)。其中有机/有机微球可以在其表面方便地修饰各种各样实际需要的功能团，可选择不同的共聚
单体和聚合工艺进行高分子微球设计，又因微球的
密度与
水相近而使得固定在微球表面的生物大分子可在均相中进行各类反应，因此有机/有机荧光微球一直是科研人员以及企业研究的热点。其中美国德克萨斯州，Austin的LuminexCorporation开发的100种荧光编码微球就是有机/有机荧光微球的一个典型例子。
[0004] 制备荧光微球的方法主要包括共价结合法和包埋
吸附法。共价结合法包括将荧光分子共价聚合在微球的内部以及将荧光分子共价结合于微球表面两种方式；前者是先将荧光分子和聚合反应的单体通过化学反应制得含有荧光团的聚合单体，然后通过聚合反应制备荧光微球。Rembaum等(美国
专利US 4326008)将丹磺酰氯与丙烯胺反应，生成含有荧光团的单体，再通过聚合反应制备出荧光微球。Peterson(美国专利US 4194877)通过丙烯酰胺将
荧光染料连接到聚合单体上后再通过乳液聚合制备出荧光微球。但这种方法往往需要荧光分子带有特殊的反应基团，对于没有相应反应基团的荧光分子就很难适用，而且由于荧光分子连接到单体上往往使聚合得到的微球均匀性下降，因此大大限制了微球的应用范围。共价结合法制备荧光微球的另一种方式是先通过聚合反应制备微球并在微球表面修饰相应的反应基团，然后通过化学反应将荧光分子共价连接到微球表面。Schwartz等(美国专利US 4609689)用1，3—丙二胺对表面含有环
氧基团的微球进行修饰，然后将异硫氰酸荧光素(FITC)通过
氨基共价连接到微球而制备荧光微球。Chandler等(美国专利US6268222)先将纳米聚苯乙烯颗粒溶胀吸附荧光物质，再通过化学反应将纳米颗粒共价连接微米级的聚苯乙烯微球表面，从而实现对微球进行编码。Cheung等(美国专利US 5194300)用荧光胺与表面含有
羧酸酯的微球反应制得荧光微球。这种制备荧光微球的方式同样需要荧光分子具有相应反应基团，而且由于荧光分子与微球表面官能团发生反应，因此大大降低微球表面官能团的数量而限制其在生物医学等领域的应用。
[0005] 包埋吸附的方式主要是在聚合反应中加入荧光分子，使得荧光分子随着单体的聚合反应而被包埋在微球的内部或表层或者先合成出
种子微球再用
溶剂溶胀的方法包埋荧光分子。在聚合反应之前将染料溶解到单体中通常会由于染料在聚合过程中的自由基链终止作用而造成转化率降低和形成多分散的微球(不同粒径的微球混合物)。为了减少荧光分子对微球粒径均一性的影响，很多包埋荧光分子的方法一般是在聚合反应的中后期再加入荧光物质或者采用溶剂溶胀的方法制备粒径比较均一的荧光微球。Haugland等(美国专利US 5723218)利用溶胀的方法将氟化
硼络合二吡咯甲川类化合物(BODIPY)包埋到微球里来制备荧光微球；Schwartz(美国专利US 5,073,498)中用溶胀的方法制出荧光微球。Zhang，Yu Zhong等也利用溶胀的方法制出具有环带的荧光微球；Fulwyler等(美国专利US4,717,655)则将两种染料配成五种不同比率的溶液，制出五种编码的荧光微球。Chandler等(美国专利US 65142 95，6528165，6649414)也是用溶剂对微球进行溶胀从而达到对微球进行
染色，最多可以做出64种荧光编码微球。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种简单易行的合成羧基化荧光编码微球的方法，合成的羧基化荧光编码微球粒径均一、大小可控、荧光性质稳定、荧光分散变异系数小，可应用于液相芯片分析。
[0007] 本发明所述的羧基化荧光编码微球是一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，其粒径均一，大小为1～10μm，通过控制反应条件使微球包埋不同种类和数量的荧光物质而实现荧光微球的编码。
[0008] 本发明所述的羧基化荧光编码微球的合成方法包括以下步骤：
[0009] 1)采用分散聚合法合成聚苯乙烯种子微球：将苯乙烯(St)和甲基
丙烯酸(MAA)溶于
乙醇，以聚乙烯基吡咯烷
酮(PVP)作为分散剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在氮气保护下反应，离心，洗涤后烘干，得聚苯乙烯种子微球；
[0010] 2)制备羧基化微球：将上述制得的聚苯乙烯种子微球分散到水溶液中，加入过
硫酸钾、烯酸和二乙烯基苯(DVB)，混匀后通N2，反应后洗涤，得羧基化微球；
[0011] 3)制备羧基化荧光编码微球：将步骤2)所得的羧基化微球分散于水中，加入有机荧光分子，避光反应，得羧基化荧光编码微球。
[0012] 在步骤1)中，按
质量百分比，甲基丙烯酸的用量最好为苯乙烯的0.5％～6.0％，聚乙烯基吡咯烷酮的用量最好为苯乙烯的2％～4％，偶氮二异丁腈的用量最好为苯乙烯的1％～2.5％；在氮气保护下反应的
温度最好为60～90℃，反应的时间最好为12～24h；所述洗涤可分别用水和乙醇各至少洗1次；所述聚乙烯基吡咯烷酮可选用PVP K-30、PVP
6
360、PVP 10 中的至少一种。所述的苯乙烯最好用按质量百分比计算浓度为10％的氢氧化钠溶液按等体积洗涤两次后用二次水洗涤3～4次，再用无水硫酸钠干燥保存，以除去苯乙烯单体中的阻聚剂；偶氮二异丁腈最好用乙醇重结晶。
[0013] 在步骤2)中，按质量百分比，聚苯乙烯种子微球为1％～5％，过
硫酸钾为0.1％～1％，烯酸为0.02％～1％，二乙烯基苯为0％～0.2％，余为水，通N2的时间最好为5～
30min，反应的温度最好为60～90℃，反应的时间最好为5～10h，所述洗涤可分别用水和乙醇洗至少1次；所述的烯酸可选自丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、十一烯酸、油酸等烯酸中的至少一种。
[0014] 在步骤3)中，按质量比，羧基化微球∶有机荧光分子为1∶(0.001～80)；所述的有机荧光分子可选自荧光素、罗丹明6G、罗丹明101、香豆素染料、氟硼类染料、方酸类染料、花菁类染料等疏水性荧光物质中的至少一种；所述的有机荧光分子可采用具有至少两种不同发射
波长的有机荧光分子。
[0015] 本发明制备的羧基化荧光编码微球，其粒径在1～10μm之间，通过对苯乙烯、甲基丙烯酸以及引发剂、搅拌速度的控制，可以制得大小均一、粒径不同的聚苯乙烯荧光微球。这种微球通过EDC、NHS等化学物质活化后可将生物分子固定在微球表面。在合适的激发光照射下，荧光微球能够发射荧光；通过控制加入荧光分子的种类和数量以及其他条件可制得具有不同发射波长和荧光强度的微球，并可在流式细胞仪的荧光通道中区分，从而实现荧光微球的编码。
附图说明
[0016] 图1为
实施例1中得到的粒径为5.7μm的聚苯乙烯种子微球颗粒表面形貌电镜扫描图(SEM)。
[0017] 图2为实施例1中得到的粒径为5.7μm的聚苯乙烯种子微球的流式前向光散色图(FCS)。在图2中，横坐标为前向散射光强度FCS～A(×1,000)，纵坐标为微球数量Count(个)；微球粒径d＝5.7μm，标准偏差CV＝3.1％。
[0018] 图3为实施例2中羧基化荧光微球的电镜图(SEM)。
[0019] 图4为实施例2中羧基化荧光微球对应的种子微球的电镜图(SEM)。
[0020] 图5为实施例2中得到的羧基化荧光微球的流式荧光分布图(FITC通道)。在图5中，横坐标为荧光相对强度FITC～A，纵坐标为荧光微球数量Count(个)；标准偏差CV＝
19.7％。
[0021] 图6为实施例2中得到的羧基化荧光微球的荧光共聚焦
显微镜扫描图。
[0022] 图7为实施例4中得到的羧基化荧光编码微球的流式分布图(PE通道)。在图7中，横坐标为荧光相对强度PE～A，纵坐标为荧光微球数量Count(个)。
[0023] 图8为实施例5中得到的羧基化荧光编码微球的流式分布图(PE通道)。在图8中，横坐标为荧光相对强度PE～A，纵坐标为荧光微球数量Count(个)。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的。
[0025] 实施例1：合成粒径均一的聚苯乙烯种子微球
[0026] 称取0.375g的PVP和0.25g的AIBN，将称好的PVP放入100mL的三颈瓶中，加入47.5mL的乙醇溶解，加上搅拌棒，固定，搅拌；将称好的AIBN加至一个三
角烧瓶中，加入15mL的St，以及0.21mL的MAA，振荡使其溶解，溶解后将溶液转移到筒形滴液漏斗中，然后滴加到三颈瓶中，安装上
温度计；通N210min，在70℃油浴下反应，搅拌速度250rpm，反应
24h后停止。冷却后，将产物转移到50mL的离心管在4000rpm离心5min，然后依次用乙醇和水各洗三遍。得到的微球在70℃
真空烘箱中干燥24h。得到的微球的粒径为5.7μm，其粒径的分散系数为3.1％，单分散性好。
[0027] 实施例2：制备羧基化荧光微球
[0028] 称取4.73μm聚苯乙烯种子微球1g，十二
烷基磺酸钠(SDS)25mg，过硫酸钾(K2S2O8)250mg，荧光素5mg，加至100mL三颈瓶中，加入40mL蒸馏水，超声5分钟至固体完全分散。另取一支15mL离心管，加入4mL甲醇，980μL十一烯酸，10μL二乙烯基苯，混匀，移取250μL溶液至三颈瓶中，通N2 5～20分钟。机械搅拌(250rpm)，置于70℃油浴中反应7.5h，停止取出。所得的微球在6000rpm下离心4分钟，用乙醇洗三遍，最后用去离子水再洗三遍，加入去离子水保存于4℃。得到的微球粒径与种子粒径相比基本没有变化，且均一性好、微球的荧光分布窄。
[0029] 实施例3：检测微球表面的羧基固定生物大分子的能力
[0030] 准确移取80μL的活化缓冲溶液(10mM
醋酸钠，pH5.0)至1.5mL的离心管中，加6
入5.0×10 微球。混匀后分别加入0.5mg和3.3mg新制的NHS和EDC溶液，混合物在室温下孵化20min，离心(10000rpm×1min)移去未反应的NHS和EDC。加入250μL活化缓冲溶液洗涤一次后离心得到微球；加入500μL活化缓冲溶液，混匀，加入30μg的戊肝
抗体(HbeAb)，混匀后在室温下置于水平摇床上反应3.5h；之后加入500μL洗涤缓冲溶液混匀，离心(10000rpm×1min)后移去上清液，最后加入500μL保存缓冲溶液保存。
[0031] 移取50μL浓度为10μg/mL的藻红蛋白标记的山羊抗小鼠抗体(PE～GAM)稀释4
液至每个1.5mL离心管，再分别移入偶联了HBeAb的微球2μL(2×10 个微球)在37℃孵育30分钟。加入500μL洗涤缓冲溶液混匀，离心(10000rpm/min)移去上清液，最后加入
500μLPBS，用Luminex200液相芯片仪检测偶联效率。结果表明制得的羧基化荧光微球表面羧基固定生物大分子的能力与美国Spherotech公司商品化的聚苯乙烯微球一致，加入荧光分子并不会影响微球固定生物大分子的能力。
[0032] 实施例4：控制荧光分子加入量制备羧基化荧光编码微球
[0033] 所用的种子微球的制备方法和实施例1相同，微球的粒径为4.92μm，所用的荧光物质为罗丹明6G。取三份种子微球，分别加入0mg、2mg、5mg的罗丹明6G，其他物质的加入量以及反应条件均与上述实施例2相同，制备出三种荧光微球。然后将三种荧光微球混合，到流式细胞仪上检测，用PE荧光通道作为检测通道。可以观察到三种荧光微球可以很好的区分开来，在PE通道的荧光强度分布直方图上出现三个峰
[0034] 实施例5：控制反应条件制备羧基化荧光编码微球
[0035] 所用的种子微球的制备方法和实施例1相同，微球的粒径为3.86μm。取四份种子微球(各1g)，分别加入罗丹明6G 4 mg，控制四份的温度和DVB的含量分别为65℃ 10 LDVB、70℃ 10 LDVB、75℃ 10 LDVB、70℃ 20 LDVB，其他物质的加入量以及反应条件与上述实施例2相同，制备出四种荧光微球。然后将四种荧光微球混合，到流式细胞仪上检测，用PE荧光通道作为检测通道。可以观察到四种荧光微球可以很好的区分开来，在PE通道的荧光强度分布直方图上出现四个峰。
