一种基因芯片及其应用
阅读：778发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种基因芯片及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 基因芯片 及其应用，本发明公开了在肝癌组织中特异性表达的小核糖核酸，本发明还公开了有关这些小核糖核酸的用途。所述的基因芯片是含有特异性地针对所述小核糖核酸的探针的芯片，所述基因芯片可用于制备 鉴别 肝癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的 试剂 或 试剂盒 ，用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒，以及辅助性诊断肝癌等。，下面是一种基因芯片及其应用专利的具体信息内容。
1.一种芯片，其特征在于，它含有特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序 列如SEQ ID NO：1-10所示。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，它还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：11-41所示的小核糖核酸的探针；优选地，它还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含：
一容器；
位于所述容器中的特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示；以及
说明书；
并且每种探针与可检测的标志物相连，不同探针上相连的可检测标志物也不同；优选 地，所述的标志物是荧光微球、吲哚菁染料。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有特异性地针对一种 或多种序列如SEQ ID NO：11-41所示的小核糖核酸的探针；优选地，所述试剂盒中还含 有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
5.一种用于检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有如权利要求1所述的芯片和说明 书。
6.一种如权利要求1所述芯片的用途，其特征在于，所述芯片用于制备鉴别肝癌组织、癌 旁组织、和/或正常组织的试剂盒。
7.一种小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸包括序列如SEQ ID NO：1-10所示的 寡核苷酸，其特征在于，用于制备(a)鉴别肝癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的试剂或试剂 盒；或(b)检测肝癌的试剂或试剂盒；优选地所述的试剂是特异性地针对小核糖核酸的探针。
8.一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括步 骤：
(i)将核酸样品与特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示；
(ii)根据样品与小核糖核酸的探针的杂交情况，获得所述小核糖核酸的表达谱；
优选地，所述的探针位于芯片上；更佳地，所述的核酸样品是抽提核酸。
9.一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)将待检体系和含有特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序列 如SEQ ID NO：1-10所示；
(ii)观察待检体系与所述探针的杂交情况，其中，如果所述待检体系可与探针杂交， 则表明该待检体系存在肝癌的可能性；
所述待检体系选择组织、细胞体系、或抽提的核酸。
10.一种筛选候选物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)将待筛选物质与实验组的肝癌细胞培养物接触，然后检测所述肝癌细胞中小核糖核 酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示，从而获得实验组肝癌细胞中 所述小核糖核苷酸的表达谱；
(b)将实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱与空白对照组表达谱及正常肝细 胞中所述小核糖核苷酸的表达谱进行比较，所述空白对照组表达谱是来自不加入待筛选物 质的肝癌细胞培养物；
其中，如果实验组表达谱与空白对照组表达谱的一致率＜70％，说明该待筛选物质是 与肝癌的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质，可以作为进一步筛选的基础；较佳地，一 致率＜50％，更佳地，一致率＜20％。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种含有特异性地针对小核糖核酸的探针 的基因芯片及其相关应用。
背景技术
肝癌是东南亚和南非的最常见肿瘤之一，其死亡率也非常高。人类疾病很多是 由于一些基因表达紊乱或失控所引起的。小核糖核酸(小RNA，microRNA，miRNA)是 一类长度约21-25nt的不编码蛋白质的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，通 过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶mRNA，是一 种起负调控作用的分子。目前研究显示许多miRNA参与了生物体发育、分化、生长、 免疫应答等生理过程，且其表达及功能失调可能导致肿瘤发生，白血病以及病毒感染 等多种病理现象。
尽管目前有报道显示miRNA可能在生物体发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作 用。本领域仍然迫切需要了解在肝癌中的miRNAs表达谱。
尽管目前有报道显示miRNA可能在生物体发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作 用。本领域仍然迫切需要了解在肝癌中的miRNAs表达谱。
发明内容
本发明旨在提供一种含有特异性地针对小核糖核酸的探针的芯片，所述小核糖 核酸是肝癌组织中所特有的。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括上述的芯片。
本发明的再一个目的是提供上述芯片的用途，所述用途是制备鉴别肝癌组织、 癌旁组织、和/或正常组织的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种小核糖核酸的用途。
本发明的第五个目的是提供一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方 法。
本发明的第六个目的是提供一种检测肝癌的方法。
本发明的第七个目的是提供一种筛选与肝癌的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在 物质的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种芯片，它含有特异性地针对小核糖核酸的探针， 所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示。
在另一优选例中，所述的芯片还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：11 -41所示的小核糖核酸的探针；更佳地，所述芯片还含有特异性地针对一种或多种序列 如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含：
一容器；
位于所述容器中的特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序列如 SEQ ID NO：1-10所示；以及
说明书；
并且每种探针与可检测的标志物相连，不同探针上相连的可检测标志物也不同； 优选地，所述的标志物是荧光微球、吲哚菁染料。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有阳性对照品，所述的阳性对照品是含 有特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所 示；每种探针与可检测的标志物相连，所述的标志物是CY3。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：11-41所示的小核糖核酸的探针；优选地，所述试剂盒中还含有特异性地针对 一种或多种序列如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，所述的试剂盒含有 如上述的芯片和说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种如上述的芯片的用途，所述芯片用于制备鉴别肝 癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的试剂盒。
在本发明的第五方面，提供了一种小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸包括 序列如SEQ ID NO：1-10所示的寡核苷酸，所述的小核糖核酸用于制备(a)鉴别肝癌组织、 癌旁组织、和/或正常组织的试剂或试剂盒；或(b)检测肝癌的试剂或试剂盒；优选地所述 的试剂是特异性地针对所述小核糖核酸的探针。
在本发明的第六方面，提供了一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方 法，所述方法包括步骤：
(i)将核酸样品与特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序 列如SEQ ID NO：1-10所示；和
(ii)根据样品与小核糖核酸的探针的杂交情况，获得所述小核糖核酸的表达谱。
优选地，所述的探针位于芯片上；更佳地，所述的核酸样品是抽提核酸。
在本发明的第七方面，提供了一种检测肝癌的方法，所述方法包括步骤：
(i)将待检体系和含有特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸 的序列如SEQ ID NO：1-10所示；
(ii)观察待检体系与所述探针的杂交情况，其中，如果所述待检体系可与探针 杂交，则表明该待检体系存在肝癌的可能性；
所述待检体系选择组织、细胞体系、或抽提的核酸。
在本发明的第八方面，提供了一种筛选候选物质的方法，所述方法包括步骤：
(a)将待筛选物质与实验组的肝癌细胞培养物接触，然后检测所述肝癌细胞中小 核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示，从而获得实验 组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱；
(b)将实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱与空白对照组表达谱及正 常肝细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱进行比较，所述空白对照组表达谱是来自不加 入待筛选物质的肝癌细胞培养物；
其中，如果实验组表达谱与空白对照组表达谱的一致率＜70％，说明该待筛选 物质是与肝癌的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质，可以作为进一步筛选的基础； 较佳地，一致率＜50％，更佳地，一致率＜20％。
据此，本发明提供了在肝癌中的miRNAs表达谱，并以此完成了上述发明。
附图说明
图1显示了在肝癌、癌旁和正常肝组织中差异表达的miRNA的表达谱。
图2显示了实时RT-PCR验证芯片的结果；其中
a1到a8分别是8个mi RNA的结果；X轴代表不同的样品，Y轴代表癌和癌旁相 对的表达水平，数据均以癌旁表达值为参照作了倍数转换；
b的X轴代表不同的mi RNAs的芯片和实时RT-PCR检测的结果，Y轴代表8个 miRNAs用芯片和实时RT-PCR检测所得表达值的癌/癌旁比值。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括上述的芯片。
本发明的再一个目的是提供上述芯片的用途，所述用途是制备鉴别肝癌组织、 癌旁组织、和/或正常组织的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种小核糖核酸的用途。
本发明的第五个目的是提供一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方 法。
本发明的第六个目的是提供一种检测肝癌的方法。
本发明的第七个目的是提供一种筛选与肝癌的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在 物质的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种芯片，它含有特异性地针对小核糖核酸的探针， 所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示。
在另一优选例中，所述的芯片还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：11 -41所示的小核糖核酸的探针；更佳地，所述芯片还含有特异性地针对一种或多种序列 如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含：
一容器；
位于所述容器中的特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序列如 SEQ ID NO：1-10所示；以及
说明书；
并且每种探针与可检测的标志物相连，不同探针上相连的可检测标志物也不同； 优选地，所述的标志物是荧光微球、吲哚菁染料。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有阳性对照品，所述的阳性对照品是含 有特异性地针对小核糖核酸的探针，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所 示；每种探针与可检测的标志物相连，所述的标志物是CY3。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有特异性地针对一种或多种序列如SEQ ID NO：11-41所示的小核糖核酸的探针；优选地，所述试剂盒中还含有特异性地针对 一种或多种序列如SEQ ID NO：42-84所示的小核糖核酸的探针。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，所述的试剂盒含有 如上述的芯片和说明书。
在本发明的第四方面，提供了一种如上述的芯片的用途，所述芯片用于制备鉴别肝 癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的试剂盒。
在本发明的第五方面，提供了一种小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸包括 序列如SEQ ID NO：1-10所示的寡核苷酸，所述的小核糖核酸用于制备(a)鉴别肝癌组织、 癌旁组织、和/或正常组织的试剂或试剂盒；或(b)检测肝癌的试剂或试剂盒；优选地所述 的试剂是特异性地针对所述小核糖核酸的探针。
在本发明的第六方面，提供了一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方 法，所述方法包括步骤：
(i)将核酸样品与特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序 列如SEQ ID NO：1-10所示；和
(ii)根据样品与小核糖核酸的探针的杂交情况，获得所述小核糖核酸的表达谱。
优选地，所述的探针位于芯片上；更佳地，所述的核酸样品是抽提核酸。
在本发明的第七方面，提供了一种检测肝癌的方法，所述方法包括步骤：
(i)将待检体系和含有特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸 的序列如SEQ ID NO：1-10所示；
(ii)观察待检体系与所述探针的杂交情况，其中，如果所述待检体系可与探针 杂交，则表明该待检体系存在肝癌的可能性；
所述待检体系选择组织、细胞体系、或抽提的核酸。
在本发明的第八方面，提供了一种筛选候选物质的方法，所述方法包括步骤：
(a)将待筛选物质与实验组的肝癌细胞培养物接触，然后检测所述肝癌细胞中小 核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO：1-10所示，从而获得实验 组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱；
(b)将实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱与空白对照组表达谱及正 常肝细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱进行比较，所述空白对照组表达谱是来自不加 入待筛选物质的肝癌细胞培养物；
其中，如果实验组表达谱与空白对照组表达谱的一致率＜70％，说明该待筛选 物质是与肝癌的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质，可以作为进一步筛选的基础； 较佳地，一致率＜50％，更佳地，一致率＜20％。
据此，本发明提供了在肝癌中的miRNAs表达谱，并以此完成了上述发明。
附图说明
图1显示了在肝癌、癌旁和正常肝组织中差异表达的miRNA的表达谱。
图2显示了实时RT-PCR验证芯片的结果；其中
a1到a8分别是8个mi RNA的结果；X轴代表不同的样品，Y轴代表癌和癌旁相 对的表达水平，数据均以癌旁表达值为参照作了倍数转换；
b的X轴代表不同的mi RNAs的芯片和实时RT-PCR检测的结果，Y轴代表8个 miRNAs用芯片和实时RT-PCR检测所得表达值的癌/癌旁比值。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现了一些miRNA，这些miRNA(如SEQ ID NO：1-10所示序列)在肝癌、癌旁和正常肝组织每两种组织间的表达都有显著差异：
具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-101)，
具有SEQ ID NO：2所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-148a)，
具有SEQ ID NO：3所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-181a)，
具有SEQ ID NO：4所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-214)，
具有SEQ ID NO：5所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-221)，
具有SEQ ID NO：6所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-222)，
具有SEQ ID NO：7所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-25)，
具有SEQ ID NO：8所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-29c)，
具有SEQ ID NO：9所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-34a)，和
具有SEQ ID NO：10所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-424)。
基于本发明的上述新发现，发明人完成了一系列的发明，例如但不限于：
1、获得一种基因芯片(微列阵芯片)，芯片上含有能特异性地同上述miRNA结 合的探针；
2、制备一种用于鉴别肝癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的试剂或试剂盒；
3、制备一种初步检测肝癌的试剂或试剂盒；
4、检测能同上述miRNA特异性结合的物质的方法；
5、用于进行肝癌的初步分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；
6、用于初步评估相关人群肝癌的患病风险，早期监测、早期预防；
7、用于初步评估相关人群的肝癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的 治疗方法。
本发明包括可用于检测miRNA的表达水平，进而鉴别肝癌组织、癌旁组织、和/ 或正常组织的的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性地针对miRNA的探针。优选的， 所述探针携带可检测信号。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上。
本发明还涉及定量和定性检测miRNA水平，从而判断肝癌的发生或发展的诊断 试验方法。这些试验是本领域所熟知的，例如包括(但不限于)：实时荧光定量PCR， 聚类分析，非参数Mann-Whitney检验，Spearman相关性分析等。
一种检测待测组织或样品中是否存在所述miRNA及其存在量的方法是利用实时 荧光定量PCR进行检测，它包括：制备各miRNA的特异性探针(所述探针优选携带可 检测信号)，制备各miRNA的特异性引物，进行PCR，然后通过检测PCR结束后的可 检测信号的强弱来判断所述miRNA的水平。作为本发明的优选方式，基于TaqMan荧 光技术，即以TaqMan荧光探针为基础进行检测。TaqMan荧光探针为一种寡核苷酸， 其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完 整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检 测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信 号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
所述的小核糖核酸特异性的引物和/或探针也包含在本发明内，用于检测样品中 是否存在所述小核糖核酸及其存在量，从而用于判断受试者是否患有肝癌或患病风 险。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上，用于分析组织或样品中 miRNA的差异表达分析和基因诊断。
本发明提供的芯片含有特异性地针对miRNA的探针，所述miRNA如SEQ ID NO：1- 10所示序列；较佳地，所述芯片还含有特异性地针对如SEQ ID NO：11-41所示序列的 miRNA的探针；更佳地，所述芯片还含有特异性地针对如SEQ ID NO：42-84所示序列的 miRNA的探针。
在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：将候选物 质与如SEQ ID NO：1-10所示序列的探针接触；观察候选物质与所述探针的杂交情 况，其中，若所述候选物质可与探针杂交，则表明该候选物质是治疗肝癌的潜在物质。
更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质与所述探针的杂交情况；所述对 照组是不添加所述候选物质的体系。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的 所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、首次揭示和证明了一类小核糖核酸与肝癌密切相关，找到了可作为肝癌临床 诊断的重要生物标志物，为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点；
2、首次揭示如SEQ ID NO：1-84所示序列的miRNA表达谱及其同肝癌的相关性， 为相关疾病的防治提供了有效途径；
3、本发明人分析了大量的肝癌患者中小核糖核酸的水平，并与正常人作了细致 的比较，因此结果准确可靠。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除 非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的 意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法 中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
验证实施例
材料与方法
病例组织：
78对癌和癌旁组织来自于原发性肝癌患者的手术切除标本，这些标本去自于浙 江大学第一附属医院病理科和启动肝癌研究所。10例正常肝来自意外死亡者。所取 得所有组织标本均通过上海市政府授权的世界卫生组织合作组织伦理委员会的同意。 手术切除标本均经过了病理学分析，病理分级依照Edmonson标准。临床资料包括： 年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、肝硬化状态、HBV和HCV感染情况， 这些资料都来自于患者的病例记录。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达 48小时。
MicroRNA芯片：
探针设计针对成熟miRNAs序列，miRNAs序列从sanger数据库下载 (http://microrna.sanger.ac.uk；miRBase Release 7.0，accessed June，2005).靶 序列包含人类miRNAs 435个，122个预测miRNAs序列和75个大鼠和小鼠的序列， 总计芯片上包括了509个靶向于成熟miRNAs探针。除此之外我们设计了8个已知的 RNA没有互补结合的寡核苷酸序列作为阴性对照。其它的靶miRNAs探针采用Ambion 公司的miRNA Probe Construction Kit(Ambion，Austin，TX USA)合成。
RNA抽提和样品准备：
富含miRNA的用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得，具体操作按照相应 说明书小RNA。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson’的方法(11)。简而言之， 4μg小RNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶-cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA) 及2单位2units T4RNA ligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时，对miRNA 进行标记。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。标记的RNA用0.3M醋酸钠 和2.5体积乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液 重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在 芯片和盖片之间均匀流动。将杂交室放在杂交仪BioMixerTM II上(CapitalBio Corp， Beijing，China)于42℃水浴杂交过夜，之后用洗液洗两遍。
实时RT-PCR验证芯片结果：
RNA样品用MicroRNA逆转录试剂盒合成单链cDNA(Applied Biosystems， Foster，USA)。我们用ABI公司合成的mi RNA和U43MGB探针检测PCR产物，以U43 作为内参进行相对定量分析。每个逆转录反应用1-10ng miRNA，靶基因和U43在同 一反应体系中进行逆转录。相对定量real-time PCR反应用ABI 7300系统进行反应 (Applied Biosystems，Foster，USA)。本研究运用looped-primer进行特异的逆转 录的反应确保检测的目的基因仅为成熟miRNAs。
芯片资料的统计分析：
芯片杂交的图像用LuxScanTM10K扫描仪扫描获得，并通过LuxScanTM软件定量。 数据的预处理包括：背景扣除，数据过滤和标化，表达水平的数值进行log转化。这 些处理都是用R软件包完成的。将信号杂交值在三分之一的样品高于100的microRNA 作后续的分析。用多项量表法(Multi-dimensional scaiing，MDS)来分析所有miRNAs 在所有标本的表达谱型。之后我们用四种方法(Student’s t检验，Wilcoxon检 验，eBayes检验和微阵列显著性分析(SAM))分析了癌与癌旁，癌与正常，癌旁与正 常的差异，在其中三种方法中差异均有统计学意义者定义为差异表达microRNAs.在 所有的分析中错误发现率设为小于0.01(FDR＜0.01)有统计学意义。
结果
不同miRNA表达谱型鉴别肝癌、癌旁及正常肝组织
我们用miRNAs寡核苷酸芯片(包含509个探针)分析78对肝癌和癌旁组织及 10例正常肝的miRNA的表达谱。发现84个miRNAs在肝癌、癌旁或者正常肝之间表 达有明显差异。其中有10个miRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织每两种组织之间表达 都有显著差异，详见表1。上述结果详见表1，图1。之后用支持向量机的留一交叉 验证法分析爱和癌旁差异的69个miRNAs的区分能力，89.70％的肝癌和癌旁可以被正 确区分。因此此谱型的可以作为诊断分子标记。
表184个miRNA在肝癌组织(HCC)、癌旁组织(N)和正常肝组织(NL)中的 差异表达(p＜0.05)
84个microRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织之间明显差异表达，图为84个 microRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织表达谱的非监督局类结果。
所述的84个microRNAs及其核苷酸序列如表2所示：
MiRNA ID SEQUENCE SEQ ID NO： hsa-miR-101 UACAGUACUGUGAUAACUGAAG SEQ ID NO：1 hsa-miR-148a UCAGUGCACUACAGAACUUUGU SEQ ID NO：2 hsa-miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU SEQ ID NO：3 hsa-miR-214 ACAGCAGGCACAGACAGGCAG SEQ ID NO：4 hsa-miR-221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC SEQ ID NO：5 hsa-miR-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC SEQ ID NO：6
hsa-miR-25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA SEQ ID NO：7 hsa-miR-29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGU SEQ ID NO：8 hsa-miR-34a UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU SEQ ID NO：9 hsa-miR-424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA SEQ ID NO：10 hsa-let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU SEQ ID NO：11 hsa-miR-106b UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU SEQ ID NO：12 hsa-miR-107 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA SEQ ID NO：13 hsa-miR-134 UGUGACUGGUUGACCAGAGGG SEQ ID NO：14 hsa-miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG SEQ ID NO：15 hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA SEQ ID NO：16 hsa-miR-185 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA SEQ ID NO：17 hsa-miR-188 CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGGU SEQ ID NO：18 hsa-miR-18a UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA SEQ ID NO：19 hsa-miR-191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCU SEQ ID NO：20 hsa-miR-202 AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA SEQ ID NO：21 hsa-miR-210 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA SEQ ID NO：22 hsa-miR-224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUA SEQ ID NO：23 hsa-miR-29a UAGCACCAUCUGAAAUCGGUU SEQ ID NO：24 hsa-miR-30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC SEQ ID NO：25 hsa-miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG SEQ ID NO：26 hsa-miR-331 GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA SEQ ID NO：27 hsa-miR-422a CUGGACUUAGGGUCAGAAGGCC SEQ ID NO：28 hsa-miR-422b CUGGACUUGGAGUCAGAAGGCC SEQ ID NO：29 hsa-miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU SEQ ID NO：30 hsa-miR-520b AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG SEQ ID NO：31 hsa-miR-520d AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUU SEQ ID NO：32 hsa-miR-520f AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU SEQ ID NO：33 hsa-miR-92 UAUUGCACUUGUCCCGGCCUG SEQ ID NO：34 hsa-miR-93 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG SEQ ID NO：35 hsa-miR-98 UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU SEQ ID NO：36 PREDICTED_MIR165 CAGCACCACUUGCAGGGGAGGG SEQ ID NO：37
PREDICTED_MIR166 UCGAAGCCUUGGGUGUGGGAGG SEQ ID NO：38 PREDICTED_MIR189 UGCUGGUGAGGGAGCCCUGCUG SEQ ID NO：39 hsa-miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG SEQ ID NO：40 hsa-miR-103 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA SEQ ID NO：41 hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU SEQ ID NO：42 hsa-miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG SEQ ID NO：43 hsa-miR-146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU SEQ ID NO：44 hsa-miR-150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG SEQ ID NO：45 hsa-miR-192 CUGACCUAUGAAUUGACAGCC SEQ ID NO：46 hsa-miR-19b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA SEQ ID NO：47 hsa-miR-200b UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA SEQ ID NO：48 hsa-miR-215 AUGACCUAUGAAUUGACAGAC SEQ ID NO：49 hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU SEQ ID NO：50 hsa-miR-29b UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU SEQ ID NO：51 hsa-miR-342 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC SEQ ID NO：52 PREDICTED_MIR191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCU SEQ ID NO：53 hsa-miR-106a AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGC SEQ ID NO：54 hsa-miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGU SEQ ID NO：55 hsa-miR-20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG SEQ ID NO：56 hsa-miR-20b CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG SEQ ID NO：57 hsa-miR-10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG SEQ ID NO：58 hsa-miR-122a UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU SEQ ID NO：59 hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA SEQ ID NO：60 hsa-miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG SEQ ID NO：61 hsa-miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU SEQ ID NO：62 hsa-miR-130b CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU SEQ ID NO：63 hsa-miR-154 UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG SEQ ID NO：64 hsa-miR-148b UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU SEQ ID NO：65 hsa-miR-194 UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA SEQ ID NO：66 hsa-miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC SEQ ID NO：67 hsa-miR-199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC SEQ ID NO：68
hsa-miR-199a* ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA SEQ ID NO：69 hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU SEQ ID NO：70 hsa-miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC SEQ ID NO：71 hsa-miR-296 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU SEQ ID NO：72 hsa-miR-30e-5p UGUAAACAUCCUUGACUGGA SEQ ID NO：73 hsa-miR-423 AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAG SEQ ID NO：74 hsa-miR-497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU SEQ ID NO：75 hsa-miR-516-3p UGCUUCCUUUCAGAGGGU SEQ ID NO：76 hsa-miR-523 AACGCGCUUCCCUAUAGAGGG SEQ ID NO：77 hsa-miR-99a AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG SEQ ID NO：78 hsa-miR-99b CACCCGUAGAACCGACCUUGCG SEQ ID NO：79 PREDICTED_MIR207 ACUUUGUGCUGGUGCCGGGGAA SEQ ID NO：80 PREDICTED_MIR240 UAUUGCCACAACUUUGGGGUGA SEQ ID NO：81 hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU SEQ ID NO：82 hsa-miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU SEQ ID NO：83 hsa-miR-24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG SEQ ID NO：84
用实时RT-PCR法验证芯片结果：
我们采用Real-time RT-PCR法验证芯片结果。本检测用ABI公司的miRNAs检 测试剂盒，其中包含miRNA特异性的逆转录引物和MGB探针，以确保检测到的目的产 物仅为成熟miRNAs，而不包含前体，检测的准确性很高，1个碱基的差异都可以区分。 我们挑选了8个癌和癌旁表达差异显著的miRNAs，每个miRNAs分析它们在5对组织 的表达情况。我们以U43为内参进行了相对定量分析，结果用配对t检验统计分析。 Real-time RT-PCR结果显示6个microRNAs在癌组织表达上调，2个表达下调，与芯 片结果完全相符，具体结果见图2。
结果表明，芯片检测方法准确性很好。
实施例2
肝癌易感性检测试剂盒
如实施例1所述，如序列SEQ ID NO：1-84所示的小核糖核酸与肝癌密切相关。 因此，可基于这个抽提病人的miRNA进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有miRNA芯片，芯片上固定有特异性地针对小核 糖核酸的探针，所述小核糖核酸分别如序列SEQ ID NO：1-84所示。
随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患肝癌的对象、已知患肝癌 的病人和经检测无肝癌的正常人。
获得测试组中待检测对象的肝组织，使用如实施例1的方法抽提RNA和制备检测 样品，并同肝癌检测试剂盒中的芯片杂交，获得表达谱。
检测结果：
对于表达谱同实施例1中的相近的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患 有肝癌。
检测结果表明，表达谱同实施例1中的相近程度越高(一致率≥90％)的检测对 象的肝癌易感性比例明显高于相近程度低(一致率＜70％)的人群。
因此，这表明通过本发明提供的芯片和试剂盒，可进行肝癌的辅助性检测。
实施例3
肝癌易感性辅助性检测
重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了70个人(检测前不知道是否有肝癌 症状)进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有miRNA芯片，芯片上固定有特异性地针对小核 糖核酸的探针，所述小核糖核酸分别如序列SEQ ID NO：1-84所示。
获得测试组中待检测对象的肝组织，使用如实施例1的方法抽提RNA和制备检测 样品，并同肝癌检测试剂盒中的芯片杂交，获得表达谱。
结果同样证实了，表达谱同实施例1中的相近程度越高(一致率≥90％)的检 测对象的肝癌易感性比例明显高于相近程度低(一致率＜70％)的人群。
实施例4
基于支持向量机和留一交叉验证法的预测
用实施例1所述的方法发现，在84个microRNAs中，有69个microRNAs在肝癌和癌 旁肝组织(HCC vs.N)中的表达水平差异显著，进而发明人构建支持向量机(SVM， support vector machine)预测模型，用留一交叉验证法(leave-one-out cross-val idation prediction models)根据69个差异表达microRNAs的表达谱预测 组织为肝癌或者癌旁肝组织的正确率。
结果显示89.70％的肝癌和癌旁肝组织可以被正确区分。在癌旁肝和正常组织间， 有27个microRNAs表达显著差异表达。用支持向量机和留一交叉法分析，结果显示 97.7％的癌旁肝和正常组织可以被正确区分。在肝癌和正常组织间有55个microRNAs 存在差异表达。用支持向量机和留一交叉验证模型，结果显示100％的肝癌和正常组织 可以被正确区分。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>一种基因芯片及其应用
<130>080198
<160>84
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
uacaguacug ugauaacuga ag 22
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210>3
<211>23
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
aacauucaac gcugucggug agu 23
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<211>21
<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
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acagcaggca cagacaggca g 21
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<211>23
<212>RNA
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agcuacauug ucugcugggu uuc 23
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<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
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<212>RNA
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<400>7
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cugugcgugu gacagcggcu ga 22
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<213>智人(Homo sapiens)
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cacccguaga accgaccuug cg 22
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<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
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acuuugugcu ggugccgggg aa 22
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<212>RNA
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uauugccaca acuuuggggu ga 22
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<212>RNA
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ugagguagua gauuguauag uu 22
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<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>83
uaaugccccu aaaaauccuu au 22
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<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>84
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-101)，
具有SEQ ID NO：2所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-148a)，
具有SEQ ID NO：3所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-181a)，
具有SEQ ID NO：4所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-214)，
具有SEQ ID NO：5所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-221)，
具有SEQ ID NO：6所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-222)，
具有SEQ ID NO：7所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-25)，
具有SEQ ID NO：8所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-29c)，
具有SEQ ID NO：9所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-34a)，和
具有SEQ ID NO：10所示核酸序列的小核糖核酸(has-miR-424)。
基于本发明的上述新发现，发明人完成了一系列的发明，例如但不限于：
1、获得一种基因芯片(微列阵芯片)，芯片上含有能特异性地同上述miRNA结 合的探针；
2、制备一种用于鉴别肝癌组织、癌旁组织、和/或正常组织的试剂或试剂盒；
3、制备一种初步检测肝癌的试剂或试剂盒；
4、检测能同上述miRNA特异性结合的物质的方法；
5、用于进行肝癌的初步分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；
6、用于初步评估相关人群肝癌的患病风险，早期监测、早期预防；
7、用于初步评估相关人群的肝癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的 治疗方法。
本发明包括可用于检测miRNA的表达水平，进而鉴别肝癌组织、癌旁组织、和/ 或正常组织的的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性地针对miRNA的探针。优选的， 所述探针携带可检测信号。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上。
本发明还涉及定量和定性检测miRNA水平，从而判断肝癌的发生或发展的诊断 试验方法。这些试验是本领域所熟知的，例如包括(但不限于)：实时荧光定量PCR， 聚类分析，非参数Mann-Whitney检验，Spearman相关性分析等。
一种检测待测组织或样品中是否存在所述miRNA及其存在量的方法是利用实时 荧光定量PCR进行检测，它包括：制备各miRNA的特异性探针(所述探针优选携带可 检测信号)，制备各miRNA的特异性引物，进行PCR，然后通过检测PCR结束后的可 检测信号的强弱来判断所述miRNA的水平。作为本发明的优选方式，基于TaqMan荧 光技术，即以TaqMan荧光探针为基础进行检测。TaqMan荧光探针为一种寡核苷酸， 其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完 整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检 测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信 号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
所述的小核糖核酸特异性的引物和/或探针也包含在本发明内，用于检测样品中 是否存在所述小核糖核酸及其存在量，从而用于判断受试者是否患有肝癌或患病风 险。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上，用于分析组织或样品中 miRNA的差异表达分析和基因诊断。
本发明提供的芯片含有特异性地针对miRNA的探针，所述miRNA如SEQ ID NO：1- 10所示序列；较佳地，所述芯片还含有特异性地针对如SEQ ID NO：11-41所示序列的 miRNA的探针；更佳地，所述芯片还含有特异性地针对如SEQ ID NO：42-84所示序列的 miRNA的探针。
在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括：将候选物 质与如SEQ ID NO：1-10所示序列的探针接触；观察候选物质与所述探针的杂交情 况，其中，若所述候选物质可与探针杂交，则表明该候选物质是治疗肝癌的潜在物质。
更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质与所述探针的杂交情况；所述对 照组是不添加所述候选物质的体系。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的 所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、首次揭示和证明了一类小核糖核酸与肝癌密切相关，找到了可作为肝癌临床 诊断的重要生物标志物，为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点；
2、首次揭示如SEQ ID NO：1-84所示序列的miRNA表达谱及其同肝癌的相关性， 为相关疾病的防治提供了有效途径；
3、本发明人分析了大量的肝癌患者中小核糖核酸的水平，并与正常人作了细致 的比较，因此结果准确可靠。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除 非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的 意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法 中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
验证实施例
材料与方法
病例组织：
78对癌和癌旁组织来自于原发性肝癌患者的手术切除标本，这些标本去自于浙 江大学第一附属医院病理科和启动肝癌研究所。10例正常肝来自意外死亡者。所取 得所有组织标本均通过上海市政府授权的世界卫生组织合作组织伦理委员会的同意。 手术切除标本均经过了病理学分析，病理分级依照Edmonson标准。临床资料包括： 年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、肝硬化状态、HBV和HCV感染情况， 这些资料都来自于患者的病例记录。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达 48小时。
MicroRNA芯片：
探针设计针对成熟miRNAs序列，miRNAs序列从sanger数据库下载 (http://microrna.sanger.ac.uk；miRBase Release 7.0，accessed June，2005).靶 序列包含人类miRNAs 435个，122个预测miRNAs序列和75个大鼠和小鼠的序列， 总计芯片上包括了509个靶向于成熟miRNAs探针。除此之外我们设计了8个已知的 RNA没有互补结合的寡核苷酸序列作为阴性对照。其它的靶miRNAs探针采用Ambion 公司的miRNA Probe Construction Kit(Ambion，Austin，TX USA)合成。
RNA抽提和样品准备：
富含miRNA的用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得，具体操作按照相应 说明书小RNA。样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson’的方法(11)。简而言之， 4μg小RNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶-cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA) 及2单位2units T4RNA ligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时，对miRNA 进行标记。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。标记的RNA用0.3M醋酸钠 和2.5体积乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液 重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在 芯片和盖片之间均匀流动。将杂交室放在杂交仪BioMixerTM II上(CapitalBio Corp， Beijing，China)于42℃水浴杂交过夜，之后用洗液洗两遍。
实时RT-PCR验证芯片结果：
RNA样品用MicroRNA逆转录试剂盒合成单链cDNA(Applied Biosystems， Foster，USA)。我们用ABI公司合成的mi RNA和U43MGB探针检测PCR产物，以U43 作为内参进行相对定量分析。每个逆转录反应用1-10ng miRNA，靶基因和U43在同 一反应体系中进行逆转录。相对定量real-time PCR反应用ABI 7300系统进行反应 (Applied Biosystems，Foster，USA)。本研究运用looped-primer进行特异的逆转 录的反应确保检测的目的基因仅为成熟miRNAs。
芯片资料的统计分析：
芯片杂交的图像用LuxScanTM10K扫描仪扫描获得，并通过LuxScanTM软件定量。 数据的预处理包括：背景扣除，数据过滤和标化，表达水平的数值进行log转化。这 些处理都是用R软件包完成的。将信号杂交值在三分之一的样品高于100的microRNA 作后续的分析。用多项量表法(Multi-dimensional scaiing，MDS)来分析所有miRNAs 在所有标本的表达谱型。之后我们用四种方法(Student’s t检验，Wilcoxon检 验，eBayes检验和微阵列显著性分析(SAM))分析了癌与癌旁，癌与正常，癌旁与正 常的差异，在其中三种方法中差异均有统计学意义者定义为差异表达microRNAs.在 所有的分析中错误发现率设为小于0.01(FDR＜0.01)有统计学意义。
结果
不同miRNA表达谱型鉴别肝癌、癌旁及正常肝组织
我们用miRNAs寡核苷酸芯片(包含509个探针)分析78对肝癌和癌旁组织及 10例正常肝的miRNA的表达谱。发现84个miRNAs在肝癌、癌旁或者正常肝之间表 达有明显差异。其中有10个miRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织每两种组织之间表达 都有显著差异，详见表1。上述结果详见表1，图1。之后用支持向量机的留一交叉 验证法分析爱和癌旁差异的69个miRNAs的区分能力，89.70％的肝癌和癌旁可以被正 确区分。因此此谱型的可以作为诊断分子标记。
表184个miRNA在肝癌组织(HCC)、癌旁组织(N)和正常肝组织(NL)中的 差异表达(p＜0.05)
84个microRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织之间明显差异表达，图为84个 microRNAs在肝癌、癌旁和正常肝组织表达谱的非监督局类结果。
所述的84个microRNAs及其核苷酸序列如表2所示：
MiRNA ID SEQUENCE SEQ ID NO： hsa-miR-101 UACAGUACUGUGAUAACUGAAG SEQ ID NO：1 hsa-miR-148a UCAGUGCACUACAGAACUUUGU SEQ ID NO：2 hsa-miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU SEQ ID NO：3 hsa-miR-214 ACAGCAGGCACAGACAGGCAG SEQ ID NO：4 hsa-miR-221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC SEQ ID NO：5 hsa-miR-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC SEQ ID NO：6
hsa-miR-25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA SEQ ID NO：7 hsa-miR-29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGU SEQ ID NO：8 hsa-miR-34a UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU SEQ ID NO：9 hsa-miR-424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA SEQ ID NO：10 hsa-let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU SEQ ID NO：11 hsa-miR-106b UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU SEQ ID NO：12 hsa-miR-107 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA SEQ ID NO：13 hsa-miR-134 UGUGACUGGUUGACCAGAGGG SEQ ID NO：14 hsa-miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG SEQ ID NO：15 hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA SEQ ID NO：16 hsa-miR-185 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA SEQ ID NO：17 hsa-miR-188 CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGGU SEQ ID NO：18 hsa-miR-18a UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA SEQ ID NO：19 hsa-miR-191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCU SEQ ID NO：20 hsa-miR-202 AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA SEQ ID NO：21 hsa-miR-210 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA SEQ ID NO：22 hsa-miR-224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUA SEQ ID NO：23 hsa-miR-29a UAGCACCAUCUGAAAUCGGUU SEQ ID NO：24 hsa-miR-30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC SEQ ID NO：25 hsa-miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG SEQ ID NO：26 hsa-miR-331 GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA SEQ ID NO：27 hsa-miR-422a CUGGACUUAGGGUCAGAAGGCC SEQ ID NO：28 hsa-miR-422b CUGGACUUGGAGUCAGAAGGCC SEQ ID NO：29 hsa-miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU SEQ ID NO：30 hsa-miR-520b AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG SEQ ID NO：31 hsa-miR-520d AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUU SEQ ID NO：32 hsa-miR-520f AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU SEQ ID NO：33 hsa-miR-92 UAUUGCACUUGUCCCGGCCUG SEQ ID NO：34 hsa-miR-93 AAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG SEQ ID NO：35 hsa-miR-98 UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU SEQ ID NO：36 PREDICTED_MIR165 CAGCACCACUUGCAGGGGAGGG SEQ ID NO：37
PREDICTED_MIR166 UCGAAGCCUUGGGUGUGGGAGG SEQ ID NO：38 PREDICTED_MIR189 UGCUGGUGAGGGAGCCCUGCUG SEQ ID NO：39 hsa-miR-100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG SEQ ID NO：40 hsa-miR-103 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA SEQ ID NO：41 hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU SEQ ID NO：42 hsa-miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG SEQ ID NO：43 hsa-miR-146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU SEQ ID NO：44 hsa-miR-150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG SEQ ID NO：45 hsa-miR-192 CUGACCUAUGAAUUGACAGCC SEQ ID NO：46 hsa-miR-19b UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA SEQ ID NO：47 hsa-miR-200b UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA SEQ ID NO：48 hsa-miR-215 AUGACCUAUGAAUUGACAGAC SEQ ID NO：49 hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGUU SEQ ID NO：50 hsa-miR-29b UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU SEQ ID NO：51 hsa-miR-342 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGUC SEQ ID NO：52 PREDICTED_MIR191 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCU SEQ ID NO：53 hsa-miR-106a AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGC SEQ ID NO：54 hsa-miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGU SEQ ID NO：55 hsa-miR-20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG SEQ ID NO：56 hsa-miR-20b CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG SEQ ID NO：57 hsa-miR-10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG SEQ ID NO：58 hsa-miR-122a UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU SEQ ID NO：59 hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA SEQ ID NO：60 hsa-miR-126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG SEQ ID NO：61 hsa-miR-130a CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU SEQ ID NO：62 hsa-miR-130b CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU SEQ ID NO：63 hsa-miR-154 UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG SEQ ID NO：64 hsa-miR-148b UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU SEQ ID NO：65 hsa-miR-194 UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA SEQ ID NO：66 hsa-miR-195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC SEQ ID NO：67 hsa-miR-199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC SEQ ID NO：68
hsa-miR-199a* ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA SEQ ID NO：69 hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU SEQ ID NO：70 hsa-miR-27b UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC SEQ ID NO：71 hsa-miR-296 AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU SEQ ID NO：72 hsa-miR-30e-5p UGUAAACAUCCUUGACUGGA SEQ ID NO：73 hsa-miR-423 AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAG SEQ ID NO：74 hsa-miR-497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU SEQ ID NO：75 hsa-miR-516-3p UGCUUCCUUUCAGAGGGU SEQ ID NO：76 hsa-miR-523 AACGCGCUUCCCUAUAGAGGG SEQ ID NO：77 hsa-miR-99a AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG SEQ ID NO：78 hsa-miR-99b CACCCGUAGAACCGACCUUGCG SEQ ID NO：79 PREDICTED_MIR207 ACUUUGUGCUGGUGCCGGGGAA SEQ ID NO：80 PREDICTED_MIR240 UAUUGCCACAACUUUGGGGUGA SEQ ID NO：81 hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU SEQ ID NO：82 hsa-miR-365 UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU SEQ ID NO：83 hsa-miR-24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG SEQ ID NO：84
用实时RT-PCR法验证芯片结果：
我们采用Real-time RT-PCR法验证芯片结果。本检测用ABI公司的miRNAs检 测试剂盒，其中包含miRNA特异性的逆转录引物和MGB探针，以确保检测到的目的产 物仅为成熟miRNAs，而不包含前体，检测的准确性很高，1个碱基的差异都可以区分。 我们挑选了8个癌和癌旁表达差异显著的miRNAs，每个miRNAs分析它们在5对组织 的表达情况。我们以U43为内参进行了相对定量分析，结果用配对t检验统计分析。 Real-time RT-PCR结果显示6个microRNAs在癌组织表达上调，2个表达下调，与芯 片结果完全相符，具体结果见图2。
结果表明，芯片检测方法准确性很好。
实施例2
肝癌易感性检测试剂盒
如实施例1所述，如序列SEQ ID NO：1-84所示的小核糖核酸与肝癌密切相关。 因此，可基于这个抽提病人的miRNA进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有miRNA芯片，芯片上固定有特异性地针对小核 糖核酸的探针，所述小核糖核酸分别如序列SEQ ID NO：1-84所示。
随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患肝癌的对象、已知患肝癌 的病人和经检测无肝癌的正常人。
获得测试组中待检测对象的肝组织，使用如实施例1的方法抽提RNA和制备检测 样品，并同肝癌检测试剂盒中的芯片杂交，获得表达谱。
检测结果：
对于表达谱同实施例1中的相近的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患 有肝癌。
检测结果表明，表达谱同实施例1中的相近程度越高(一致率≥90％)的检测对 象的肝癌易感性比例明显高于相近程度低(一致率＜70％)的人群。
因此，这表明通过本发明提供的芯片和试剂盒，可进行肝癌的辅助性检测。
实施例3
肝癌易感性辅助性检测
重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了70个人(检测前不知道是否有肝癌 症状)进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有miRNA芯片，芯片上固定有特异性地针对小核 糖核酸的探针，所述小核糖核酸分别如序列SEQ ID NO：1-84所示。
获得测试组中待检测对象的肝组织，使用如实施例1的方法抽提RNA和制备检测 样品，并同肝癌检测试剂盒中的芯片杂交，获得表达谱。
结果同样证实了，表达谱同实施例1中的相近程度越高(一致率≥90％)的检 测对象的肝癌易感性比例明显高于相近程度低(一致率＜70％)的人群。
实施例4
基于支持向量机和留一交叉验证法的预测
用实施例1所述的方法发现，在84个microRNAs中，有69个microRNAs在肝癌和癌 旁肝组织(HCC vs.N)中的表达水平差异显著，进而发明人构建支持向量机(SVM， support vector machine)预测模型，用留一交叉验证法(leave-one-out cross-val idation prediction models)根据69个差异表达microRNAs的表达谱预测 组织为肝癌或者癌旁肝组织的正确率。
结果显示89.70％的肝癌和癌旁肝组织可以被正确区分。在癌旁肝和正常组织间， 有27个microRNAs表达显著差异表达。用支持向量机和留一交叉法分析，结果显示 97.7％的癌旁肝和正常组织可以被正确区分。在肝癌和正常组织间有55个microRNAs 存在差异表达。用支持向量机和留一交叉验证模型，结果显示100％的肝癌和正常组织 可以被正确区分。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>一种基因芯片及其应用
<130>080198
<160>84
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<213>智人(Homo sapiens)
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uacaguacug ugauaacuga ag 22
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<213>智人(Homo sapiens)
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<213>智人(Homo sapiens)
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<212>RNA
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<212>RNA
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aaagugcuuc ucuuuggugg guu 23
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<212>RNA
<213>智人(Homo sapiens)
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<212>RNA
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<212>RNA
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cagcaccacu ugcaggggag gg 22
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ugcuggugag ggagcccugc ug 22
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ugagguagua gguugugugg uu 22
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<211>22
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