拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
阅读：654发布：2023-02-24
专利汇可以提供拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及拮抗性TNFR2多肽，如 抗体 及其 抗原 结合 片段 ；以及这些多肽用于抑制调控性T细胞(T-reg)的增殖和/或扩增T效应细胞群体或功能的用途。例如，本发明的抗体包括拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段，并且可用于遏制T-reg介导的 肿瘤 反应性 T淋巴细胞的失活，以及 治疗 多种癌症和感染性 疾病 。，下面是拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体专利的具体信息内容。
1.一种能够特异性地结合人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含互补决定区-重链3(CDR-H3)，所述CDR-H3具有以下氨基酸序列：
(a)JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(b)AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；或
(c)ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
4
每个Z独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中在所述CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合包含LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)或VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的氨基酸序列的肽。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中在所述CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)或氨基酸161-169(CKPCAPGTF)内的表位。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。
5.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4YZ3Z5TDZ5X；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
3 3
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ或YTZ；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
其中每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的氨基酸；以及
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
8.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
9.如权利要求6-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
11.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
12.如权利要求9-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
13.如权利要求9-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
14.如权利要求9-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
15.如权利要求9-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
16.如权利要求9-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含与所述CDR-L2的N-末端结合的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
17.如权利要求9-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含与所述CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
18.如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不包含以下区(CDR)中的一个或多个：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)；
(f)CDR-L1，所述CDR-L1包含氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:29)；
(g)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:30)；以及
(h)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列QHSRELPRT(SEQ ID NO:31)。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含非天然恒定区。
20.如权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述非天然恒定区是人恒定区。
21.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段缺乏Fc结构域的全部或一部分，缺乏天然Fc结构域的全部或一部分，或者完全缺乏Fc结构域。
22.如权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于约100nM的KD特异性地结合至包含SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一者的氨基酸序列的肽，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)中的一个或多个的肽，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
24.如权利要求1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TNFR2信号传导。
25.如权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达。
26.如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制NFκB活化。
27.如权利要求1-26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制T-reg细胞的增殖。
28.如权利要求1-27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制表达TNFR2的癌细胞的增殖。
29.如权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞选自由以下组成的组：T细胞淋巴瘤细胞，如霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞；卵巢癌细胞；结肠癌细胞；多发性骨髓瘤细胞；以及肾细胞癌细胞。
30.如权利要求1-29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制骨髓源性抑制细胞的增殖。
31.如权利要求1-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不需要TNFα来减少或抑制T-reg细胞的增殖。
32.如权利要求1-31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段促进T效应细胞的增殖。
33.一种鉴别TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)使抗体或其片段的异质混合物暴露于肽，所述肽具有ID NO:285或286的氨基酸序列，或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；以及
(b)保留特异性地结合所述肽的抗体或其片段并除去不特异性地结合所述肽的抗体或其片段，从而产生包含至少一种所述TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的富集的抗体混合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述方法包括确定所述富集的抗体混合物中的所述抗体或其抗原结合片段中的一种或多种的氨基酸序列。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述肽结合至表面。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在噬菌体、细菌细胞或酵母细胞的表面上表达。
37.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段被表达为与核糖体非共价结合或与mRNA或cDNA共价结合的一条或多条多肽链。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述肽与可检测标记缀合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述可检测标记选自由荧光分子、表位标签和放射性标记组成的组。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述荧光分子选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗丹明和花菁。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述表位标签选自由以下组成的组：麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚-组氨酸标签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素和链霉亲和素。
42.如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)顺序地重复一次或多次。
43.一种产生TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：用肽免疫非人哺乳动物，所述肽包含SEQ ID NO:285或286的序列，或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；以及收集包含所述TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的血清。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述非人哺乳动物选自由以下组成的组：兔、小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、马和绵羊。
45.一种抗体或其抗原结合片段，其通过如权利要求33-44中任一项所述的方法产生。
46.如权利要求1-32和45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。
47.如权利要求46所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是F(ab’)2分子。
48.如权利要求1-32、45和46中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有选自由以下组成的组的同种型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。
49.如权利要求1-32和45-48中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与治疗剂缀合。
50.如权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
51.一种能够特异性地结合人TNFR2的单链多肽，其中所述单链多肽包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H3包含以下氨基酸序列：
(a)JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
(b)AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；或
(c)ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
52.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述CDR-H1和CDR-H2来自能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸70-180内的表位的抗TNFR2抗体。
53.如权利要求52所述的单链多肽，其中所述CDR-H1和CDR-H2来自能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)内的表位的抗TNFR2抗体。
54.如权利要求52所述的单链多肽，其中所述CDR-H1和CDR-H2来自能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸137-144(CAPLRKCR)内的表位的抗TNFR2抗体。
55.如权利要求52所述的单链多肽，其中所述CDR-H1和CDR-H2来自能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸161-169(CKPCAPGTF)内的表位的抗TNFR2抗体。
56.如权利要求52所述的单链多肽，其中所述CDR-H1和CDR-H2来自能够特异性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸80-86(DSTYTQL)、91-98(PECLSCGS)和116-123(RICTCRPG)内的表位的抗TNFR2抗体。
57.如权利要求51-56中任一项所述的单链多肽，其中在所述CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合包含LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)或VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的氨基酸序列的肽。
58.如权利要求51-57中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。
59.如权利要求51-57中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
60.如权利要求51-59中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列：
(a)GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；
(b)Z4YZ3Z5TDZ5X；或
(c)GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
4
每个Z独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸；并且
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
61.如权利要求60所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)。
62.如权利要求61所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
63.如权利要求61所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
64.如权利要求51-63中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-H2具有氨基酸序列：
(a)(J)5GSJ；
(b)VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；或
(c)VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
65.如权利要求64所述的单链多肽，其中所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)。
66.如权利要求51-65中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T。
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
67.如权利要求51-65中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
其中每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
3
每个Z独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的氨基酸；以及
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
68.如权利要求51-65中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
69.如权利要求66-68中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
70.如权利要求66-68中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
71.如权利要求66-70中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
72.如权利要求66-70中任一项所述的单链多肽，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
73.如权利要求66-72中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽包含含与所述CDR-L2的N-末端结合的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
74.如权利要求66-72中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽包含含与所述CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
75.如权利要求51-74中任一项所述的单链多肽，其中所述单链多肽不包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；以及
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)；
(f)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:29)；
(g)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:30)；以及
(h)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QHSRELPRT(SEQ ID NO:31)。
76.一种构建体，其包含第一多肽结构域和第二多肽结构域，其中所述第一多肽结构域和所述第二多肽结构域各自独立地包含如权利要求51-75中任一项所述的单链多肽。
77.如权利要求76所述的构建体，其中所述第一多肽结构域和所述第二多肽结构域通过共价接头结合。
78.如权利要求77所述的构建体，其中所述共价接头包含酰胺键。
79.如权利要求77所述的构建体，其中所述共价接头包含二硫键。
80.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
81.一种多核苷酸，其编码如权利要求51-75中任一项所述的单链多肽。
82.一种多核苷酸，其编码如权利要求76-79中任一项所述的构建体。
83.一种载体，其包含如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸。
84.如权利要求83所述的载体，其中所述载体是表达载体。
85.如权利要求84所述的载体，其中所述表达载体是真核表达载体。
86.如权利要求83所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
87.如权利要求86所述的载体，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒(Ad)、逆转录病毒、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒。
88.如权利要求87所述的载体，其中所述腺病毒是血清型5、26、35或48腺病毒。
89.如权利要求87所述的载体，其中所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒或慢病毒。
90.如权利要求87所述的载体，其中所述牛痘病毒是修饰的牛痘安卡拉(MVA)。
91.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求83-90中任一项所述的载体。
92.如权利要求91所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
93.如权利要求91所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
94.如权利要求93所述的宿主细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
95.如权利要求94所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
96.一种药物组合物，其包含如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述的单链多肽或如权利要求76-79中任一项所述的构建体和药学上可接受的载体或赋形剂。
97.如权利要求96所述的药物组合物，其中所述组合物还包含额外治疗剂。
98.如权利要求97所述的药物组合物，其中所述额外治疗剂是免疫治疗剂。
99.如权利要求98所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂、抗TWEAKR剂、塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他和/或加巴喷丁。
100.一种产生如权利要求1-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及从宿主细胞培养基中回收所述抗体或其抗原结合片段。
101.一种产生如权利要求51-75中任一项所述的单链多肽的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达编码所述单链多肽的多核苷酸，以及从宿主细胞培养基中回收所述单链多肽。
102.一种产生如权利要求76-79中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括：在宿主细胞中表达编码所述构建体的多核苷酸，以及从宿主细胞培养基中回收所述构建体。
103.一种抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响应的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
104.一种治疗人的细胞增殖病症的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌。
106.如权利要求104所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
107.一种治疗人的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1-32和
45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的一种或多种因子引起：病毒、细菌、真菌或寄生虫。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的病毒引起：丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒、赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒和基孔肯雅病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型。
110.如权利要求108所述的方法，其中所述感染性疾病由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属以及葡萄球菌属。
111.如权利要求108所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的真菌引起：曲霉属、假丝酵母属、马拉色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属以及犁头霉属。
112.如权利要求108所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的寄生虫引起：溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫以及火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。
113.一种用于抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响应的组合物，所述组合物包含如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
114.一种用于治疗人的细胞增殖病症的组合物，所述组合物包含如权利要求1-32和
45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
115.如权利要求114所述的组合物，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌。
116.如权利要求114所述的组合物，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
117.一种用于治疗人的感染性疾病的组合物，所述组合物包含如权利要求1-32和45-
50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞或如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
118.如权利要求117所述的组合物，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的一种或多种因子引起：病毒、细菌、真菌或寄生虫。
119.如权利要求118所述的组合物，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的病毒引起：丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒和基孔肯雅病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型。
120.如权利要求118所述的组合物，其中所述感染性疾病由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属以及葡萄球菌属。
121.如权利要求118所述的组合物，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的真菌引起：曲霉属、假丝酵母属、马拉色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属以及犁头霉属。
122.如权利要求118所述的组合物，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的寄生虫引起：溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫以及火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。
123.一种试剂盒，其包括选自由以下组成的组的剂：如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求51-75中任一项所述单链多肽、如权利要求76-
79中任一项所述的构建体、如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸、如权利要求83-90中任一项所述的载体、如权利要求91和93-95中任一项所述的宿主细胞以及如权利要求96-
99中任一项所述的药物组合物。
124.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求1-32和45-50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
125.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求51-75中任一项所述的单链多肽。
126.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求76-79中任一项所述的构建体。
127.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求80-82中任一项所述的多核苷酸。
128.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求83-90中任一项所述的载体。
129.如权利要求128所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于将所述载体转染到宿主细胞中的说明书。
130.如权利要求129所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于在所述宿主细胞中表达所述抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体的说明书。
131.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求91-95中任一项所述的宿主细胞。
132.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括如权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
133.如权利要求123所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括可用于在所述宿主细胞中表达所述抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体的试剂。
134.如权利要求123所述的试剂盒，其还包括用于将所述剂施用至人患者的说明书。
135.如权利要求123所述的试剂盒，其还包括用于制备或使用所述剂的说明书。
136.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。
137.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
138.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
139.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4YZ3Z5TDZ5X；
4 3
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYZZT(SEQ ID NO:264)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
其中每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的氨基酸；以及
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
140.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
141.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
142.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
143.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
144.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
145.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
146.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
147.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
148.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含与所述CDR-L2的N-末端结合的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
149.如权利要求141所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含与所述CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
150.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不包含以下区(CDR)中的一个或多个：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)；
(f)CDR-L1，所述CDR-L1包含氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:29)；
(g)CDR-L2，所述CDR-L2包含氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:30)；以及
(h)CDR-L3，所述CDR-L3包含氨基酸序列QHSRELPRT(SEQ ID NO:31)。
151.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含非天然恒定区。
152.如权利要求151所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述非天然恒定区是人恒定区。
153.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段缺乏Fc结构域的全部或一部分，缺乏天然Fc结构域的全部或一部分，或者完全缺乏Fc结构域。
154.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以小于约100nM的KD特异性地结合至包含SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一者的氨基酸序列的肽，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
155.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)中的一个或多个的肽，并且不结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
156.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TNFR2信号传导。
157.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达。
158.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制NFκB活化。
159.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制T-reg细胞的增殖。
160.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制表达TNFR2的癌细胞的增殖。
161.如权利要求160所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述癌细胞是选自由以下组成的组：\T细胞淋巴瘤细胞，如霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞；卵巢癌细胞；结肠癌细胞；多发性骨髓瘤细胞；以及肾细胞癌细胞。
162.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够减少或抑制骨髓源性抑制细胞的增殖。
163.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不需要TNFα来减少或抑制T-reg细胞的增殖。
164.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够直接扩增T效应细胞。
165.如权利要求51-56中任一项所述的单链多肽，其中在所述CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合包含LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)或VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的氨基酸序列的肽。
166.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。
167.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
168.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列：
(a)GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；
(b)Z4YZ3Z5TDZ5X；或
(c)GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸；并且
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
169.如权利要求168所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)。
170.如权利要求169所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。
171.如权利要求169所述的单链多肽，其中所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
172.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述CDR-H2具有氨基酸序列：
(a)(J)5GSJ；
(b)VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；或
(c)VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
173.如权利要求172所述的单链多肽，其中所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)。
174.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T。
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
175.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
5
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ(SEQ ID NO:268)；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
其中每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；
2
每个Z独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；
每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；
每个Z5独立地是包含疏水性侧链的氨基酸；以及
每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
176.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述单链多肽还包含以下CDR中的一个或多个或全部：
(a)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
(b)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
(c)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
177.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。
178.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
179.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。
180.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
181.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述单链多肽包含含与所述CDR-L2的N-末端结合的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。
182.如权利要求174所述的单链多肽，其中所述单链多肽包含含与所述CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
183.如权利要求51所述的单链多肽，其中所述单链多肽不包含以下CDR中的一个或多个：
(a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
(b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；以及
(c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
(d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；
(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)；
(f)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:29)；
(g)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:30)；以及
(h)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QHSRELPRT(SEQ ID NO:31)。
184.一种抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响应的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
185.一种治疗人的细胞增殖病症的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌。
187.如权利要求185所述的方法，其中所述细胞增殖病症是选自由以下组成的组的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
188.一种治疗人的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述人施用如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的一种或多种因子引起：病毒、细菌、真菌或寄生虫。
190.如权利要求189所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的病毒引起：丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒和基孔肯雅病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)以及人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型。
191.如权利要求189所述的方法，其中所述感染性疾病由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属以及葡萄球菌属。
192.如权利要求189所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的真菌引起：曲霉属、假丝酵母属、马拉色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属以及犁头霉属。
193.如权利要求189所述的方法，其中所述感染性疾病由选自由以下组成的组的寄生虫引起：溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫以及火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和细粒棘球绦虫。
拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体
发明领域
[0001] 本发明涉及能够拮抗肿瘤坏死因子受体2的多肽，如抗体及其抗原结合片段。本发明的多肽可用于调节调控性T细胞的活性，以及上调T效应细胞的活性并直接调节表面致癌
基因，如用于治疗细胞增殖病症和感染性疾病的免疫疗法领域中。
基因，如用于治疗细胞增殖病症和感染性疾病的免疫疗法领域中。
[0002] 发明背景
[0003] 使用天然存在的和遗传工程化的T淋巴细胞是用于改善各种人类病理的突出范式。例如，虽然用于治疗癌症的传统治疗平台包括手术切除肿瘤块、放射疗法和施用化学治
疗剂(Shewach,Chem.Rev.,109:2859-2861,2009)，但是过去十年见证了过继性免疫疗法应
用于癌症治疗方案中的再现。随着嵌合抗原受体(CAR-T)疗法的出现，已经出现了向患者输
注自体和同种异体肿瘤反应性T细胞的新方法(June,J.Clin.Invest.,117:1466-1476,
2007)。CAR-T疗法利用适应性免疫响应的资源以促进癌细胞细胞毒性并根除肿瘤物质。过
继性免疫疗法中的常见基序是使用T细胞，所述T细胞表现出在展示不同肿瘤抗原的细胞中
选择性地加强细胞毒性的能力。这种技术的实例包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(Dudley等
人,J.Immunother.,26:332-342,2003)，以及已经遗传重新工程化以便表现出与肿瘤特异
性抗原的反应性的自体或同种异体T细胞(Yee等人,PNAS.,99:16168-16173,2002)。
疗剂(Shewach,Chem.Rev.,109:2859-2861,2009)，但是过去十年见证了过继性免疫疗法应
用于癌症治疗方案中的再现。随着嵌合抗原受体(CAR-T)疗法的出现，已经出现了向患者输
注自体和同种异体肿瘤反应性T细胞的新方法(June,J.Clin.Invest.,117:1466-1476,
2007)。CAR-T疗法利用适应性免疫响应的资源以促进癌细胞细胞毒性并根除肿瘤物质。过
继性免疫疗法中的常见基序是使用T细胞，所述T细胞表现出在展示不同肿瘤抗原的细胞中
选择性地加强细胞毒性的能力。这种技术的实例包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(Dudley等
人,J.Immunother.,26:332-342,2003)，以及已经遗传重新工程化以便表现出与肿瘤特异
性抗原的反应性的自体或同种异体T细胞(Yee等人,PNAS.,99:16168-16173,2002)。
[0004] 尽管基于T淋巴细胞的癌症免疫疗法具有前景，但这种治疗平台的开发一直受免疫系统遏制自身细胞上固定的免疫攻击的自然倾向阻碍。与所有有核人细胞一样，癌细胞
表达I类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，所述蛋白将这些细胞与外来细胞区分开来。为
了防止细胞自相残杀，已经进化出调控性T细胞(T-reg细胞)，所述调控T细胞遏制表现出针
对“自身”MHC抗原的反应性的T细胞的活性。T-reg细胞代表异质类T细胞，所述T细胞可基于
其独特的表面蛋白呈递来区分。最容易理解的T-reg细胞群体包括CD4+、CD25+、FoxP3+T-
reg细胞和CD17+ T-reg细胞。这些细胞介导自身反应性T细胞的遏制的确切机制是正在进
行的研究的主题，但是已经显示某些类别的T-reg细胞抑制靶T细胞中诱导增殖的细胞因子
IL-2的产生，并且可另外地凭借CD25(IL-2受体的亚结构域)对IL-2的亲和力螯合来自自身
反应细胞的IL-2(Josefowicz等人,Ann.Rev.Immun.,30:531-564,2012)。
表达I类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白，所述蛋白将这些细胞与外来细胞区分开来。为
了防止细胞自相残杀，已经进化出调控性T细胞(T-reg细胞)，所述调控T细胞遏制表现出针
对“自身”MHC抗原的反应性的T细胞的活性。T-reg细胞代表异质类T细胞，所述T细胞可基于
其独特的表面蛋白呈递来区分。最容易理解的T-reg细胞群体包括CD4+、CD25+、FoxP3+T-
reg细胞和CD17+ T-reg细胞。这些细胞介导自身反应性T细胞的遏制的确切机制是正在进
行的研究的主题，但是已经显示某些类别的T-reg细胞抑制靶T细胞中诱导增殖的细胞因子
IL-2的产生，并且可另外地凭借CD25(IL-2受体的亚结构域)对IL-2的亲和力螯合来自自身
反应细胞的IL-2(Josefowicz等人,Ann.Rev.Immun.,30:531-564,2012)。
[0005] 虽然T-reg细胞在维持外周耐受中起重要作用，但构成这些细胞调节自身反应性T细胞活性的能力的基础的相同生物化学特征也用于通过遏制肿瘤反应性T淋巴细胞的活性
来破坏过继性免疫疗法和天然免疫响应。T-reg细胞活性的化学调节剂的开发已经成为许
多药理学研究的主题，因为获得能够抑制T-reg介导的T细胞遏制的剂可极大地提高过继性
癌症免疫疗法的范围和功效，以及提高免疫系统根除引起感染性疾病的病原生物体的能
力。
来破坏过继性免疫疗法和天然免疫响应。T-reg细胞活性的化学调节剂的开发已经成为许
多药理学研究的主题，因为获得能够抑制T-reg介导的T细胞遏制的剂可极大地提高过继性
癌症免疫疗法的范围和功效，以及提高免疫系统根除引起感染性疾病的病原生物体的能
力。
[0006] 已经在T-reg细胞表面上鉴定了肿瘤坏死因子受体(TNFR)亚型1和2作为决定细胞命运的信号转导分子。例如，TNFR1的活化加强了半胱天冬酶信号传导级联并终止于T-reg
细胞凋亡，而TNFR2的活化通过有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径诱导信号
传导，其协调通过TRAF2/3信号传导和NFκB介导的促进逃避细胞凋亡和细胞增殖的基因的
转录。由于其在指导细胞存活和生长中的作用，TNFR2代表了用于防止肿瘤反应性T淋巴细
胞的免疫检测的有吸引力的靶标。因此，目前需要用于靶向细胞增殖病症(如癌症)和多种
感染性疾病的治疗中的能够阻止T-reg细胞存活和增殖的疗法。
细胞凋亡，而TNFR2的活化通过有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径诱导信号
传导，其协调通过TRAF2/3信号传导和NFκB介导的促进逃避细胞凋亡和细胞增殖的基因的
转录。由于其在指导细胞存活和生长中的作用，TNFR2代表了用于防止肿瘤反应性T淋巴细
胞的免疫检测的有吸引力的靶标。因此，目前需要用于靶向细胞增殖病症(如癌症)和多种
感染性疾病的治疗中的能够阻止T-reg细胞存活和增殖的疗法。
发明内容
[0007] 本发明提供了拮抗性肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)多肽，如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段。本发明的拮抗性TNFR2多肽特异性地结合人TNFR2内含有KCRPG序列(SEQ ID
NO:19)的一个或多个残基的表位或非人灵长类动物(例如，野牛或牛，如本文所描述)的
TNFR2中的等效表位，并且不会特异性地结合人TNFR2内的KCSPG基序(SEQ ID NO:12)的残
基或非人灵长类动物的TNFR2中的等效表位。本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可用于治疗多种病理，包括癌症和感染性疾病。
NO:19)的一个或多个残基的表位或非人灵长类动物(例如，野牛或牛，如本文所描述)的
TNFR2中的等效表位，并且不会特异性地结合人TNFR2内的KCSPG基序(SEQ ID NO:12)的残
基或非人灵长类动物的TNFR2中的等效表位。本文所述的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可用于治疗多种病理，包括癌症和感染性疾病。
[0008] 本发明的拮抗性TNFR2多肽如此描述，因为它们表现出抑制T-reg细胞的增殖和/或促进T-reg细胞的死亡的能力。本发明的拮抗性TNFR2多肽可抑制表达TNFR2和致癌基因
的癌细胞的增殖和/或促进所述癌细胞的死亡。本发明的拮抗性TNFR2多肽可允许T效应细
胞(如细胞毒性CD8+ T细胞)的相互扩增。例如，这可能由于T-reg细胞增殖和活性的减弱而
发生。本发明的拮抗性TNFR2多肽可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。因此，本发
明的TNFR2多肽作为拮抗剂的名称是指它们减弱表达T-reg和TNFR2的癌细胞的增殖和活性
的能力，并且为清楚起见不表示T效应细胞响应的拮抗作用。
的癌细胞的增殖和/或促进所述癌细胞的死亡。本发明的拮抗性TNFR2多肽可允许T效应细
胞(如细胞毒性CD8+ T细胞)的相互扩增。例如，这可能由于T-reg细胞增殖和活性的减弱而
发生。本发明的拮抗性TNFR2多肽可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。因此，本发
明的TNFR2多肽作为拮抗剂的名称是指它们减弱表达T-reg和TNFR2的癌细胞的增殖和活性
的能力，并且为清楚起见不表示T效应细胞响应的拮抗作用。
[0009] 本文公开了能够特异性地结合人TNFR2的多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片段，所述多肽含有互补决定区-重链1(CDR-H1)和源自TNFR2抗体的CDR-H2以及具有氨基酸
序列JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5、JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2、JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:
278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或
AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)的CDR-H3，其中
序列JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5、JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2、JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:
278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或
AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)的CDR-H3，其中
[0010] 每个J独立地是天然存在的氨基酸；
[0011] 每个Z1独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
[0012] 每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；
[0013] 每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；
[0014] 每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
[0015] 每个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸以及酪氨酸。如本文在多肽式的上下文
中所使用的，下标符号中的数字字符表示所述式中存在的在前的氨基酸的量，并且上标符
号中的数字字符表示所述式中存在的前述氨基酸的类型。
中所使用的，下标符号中的数字字符表示所述式中存在的在前的氨基酸的量，并且上标符
号中的数字字符表示所述式中存在的前述氨基酸的类型。
[0016] 在第一方面，本发明的特征是一种能够特异性地结合人肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)的多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片段，其中所述单链多肽、抗体或其抗原结
合片段含有CDR-H3，所述CDR-H3具有以下氨基酸序列：
合片段含有CDR-H3，所述CDR-H3具有以下氨基酸序列：
[0017] (a)JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)；
[0018] (b)AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)；或
[0019] (c)ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)，或者相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
[0020] 其中每个J独立地是天然存在的氨基酸；
[0021] 每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
[0022] 每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；
[0023] 每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；
[0024] 每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且
[0025] 每个Z5独立地是包含疏水性侧链的天然存在的氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸以及酪氨酸。
[0026] 在一些实施方案中，在以上CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合包含LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)或VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的氨基酸
序列的肽。在一些实施方案中，在以上CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异
性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)或氨基酸161-169(CKPCAPGTF)内的表
位。
序列的肽。在一些实施方案中，在以上CDR-H3存在下，所述抗体或其抗原结合片段能够特异
性地结合SEQ ID NO:7的氨基酸142-149(KCRPGFGV)或氨基酸161-169(CKPCAPGTF)内的表
位。
[0027] 在一些实施方案中，所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。在一些实施方案中，所述CDR-H3具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
[0028] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段含有以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
[0029] (a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GJTF(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；
[0030] (b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；
[0031] (c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Y；
[0032] (d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；以及
[0033] (e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T。
[0034] 其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
[0035] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段含有以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
[0036] (a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4YZ3Z5TDZ5X；
[0037] (b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；
[0038] (c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；
[0039] (d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；以及
[0040] (e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；
[0041] 其中每个Z1独立地是包含在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；
[0042] 每个Z2独立地是包含在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
[0043] 每个Z3独立地是包含在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；
[0044] 每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；
[0045] 每个Z5独立地是包含疏水性侧链的氨基酸；以及
[0046] 每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
[0047] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段含有以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
[0048] (a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
[0049] (b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
[0050] (c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；
[0051] (d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及(e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的
氨基酸序列；
氨基酸序列；
[0052] 其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
[0053] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段含有以下区(CDR)中的一个或多个或全部：
[0054] (a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX(SEQ ID NO:257)；
[0055] (b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)；
[0056] (c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)；
[0057] (d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS或YTS；以及
[0058] (e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)。
[0059] 其中每个X独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
[0060] 在一些实施方案中，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)。在一些实施方案中，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)。
[0061] 在一些实施方案中，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS。在一些实施方案中，所述CDR-L2具有氨基酸序列YTS。
[0062] 在一些实施方案中，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)。在一些实施方案中，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
[0063] 在一些实施方案中，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)，并且所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)。
[0064] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段含有含与CDR-L2的N-末端结合的氨基酸序列LLIR(SEQ ID NO:262)的框架区。在一些实施方案中，所述单链多
肽、抗体或其抗原结合片段含有含与CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
肽、抗体或其抗原结合片段含有含与CDR-L2的C-末端结合的氨基酸序列TLE的框架区。
[0065] 在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或抗原结合片段不包含以下CDR中的一个或多个：
[0066] (a)CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GFTFSSY(SEQ ID NO:23)；
[0067] (b)CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列SSGGSY(SEQ ID NO:24)；以及
[0068] (c)CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列SASSSVYYMY(SEQ ID NO:26)；
[0069] (d)CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:27)；
[0070] (e)CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列QQRRNYPYT(SEQ ID NO:28)；
[0071] (f)CDR-L1，所述CDR-L1含有氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:29)；
[0072] (g)CDR-L2，所述CDR-L2含有氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:30)；以及
[0073] (h)CDR-L3，所述CDR-L3含有氨基酸序列QHSRELPRT(SEQ ID NO:31)。
[0074] 在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段含有非天然恒定区(如人恒定区)，缺乏Fc结构域的全部或一部分，缺乏天然Fc结构域的全部或一部分，或者完全缺乏Fc
结构域。
结构域。
[0075] 在另一方面，本发明提供含有第一多肽结构域和第二多肽结构域的构建体，所述结构域各自含有本发明的单链多肽。所述第一多肽结构域和第二多肽结构域可以是相同
的。在一些实施方案中，所述第一多肽结构域和第二多肽结构域可以是不同的。所述第一多
肽结构域和第二多肽结构域可通过接头结合，所述接头如含有酰胺键或二硫桥键的接头。
所述构建体可缺乏鼠类Fc结构域。
的。在一些实施方案中，所述第一多肽结构域和第二多肽结构域可以是不同的。所述第一多
肽结构域和第二多肽结构域可通过接头结合，所述接头如含有酰胺键或二硫桥键的接头。
所述构建体可缺乏鼠类Fc结构域。
[0076] 本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可以小于约100nM的KD特异性地结合至含有SEQ ID NO:11、19、20和34-117中任一者的氨基酸序列的肽，并且不结合
含有SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。类似地，本发明的多肽(如单链多肽、抗体或
其抗原结合片段)可特异性地结合含有SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)中的一个或
多个的肽，并且不结合含有SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
含有SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。类似地，本发明的多肽(如单链多肽、抗体或
其抗原结合片段)可特异性地结合含有SEQ ID NO:7的氨基酸142-146(KCRPG)中的一个或
多个的肽，并且不结合含有SEQ ID NO:7的氨基酸56-60(KCSPG)的肽。
[0077] 本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可抑制TNFR2信号传导。在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段降低或抑制选自由CHUK、NFKBIE、
NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达。
在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段抑制NFκB活化。例如，本发明的
拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段可使CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、
TRAF3、relB或cIAP2/BIRC3中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)相对于从
未用本发明的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段处理的样品中分离的这些分
子中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)降低或抑制例如1％、2％、3％、4％、
5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。可用于测定表达水平和磷酸化状态的示
例性测定是本领域中已知的，并且包括用于测定蛋白质含量的蛋白质印迹测定和用于测定
mRNA含量的定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验。在优选的实施方案中，抗TNFR2多肽
(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)是显性TNFR2拮抗剂并且因此即使在TNFR2激动
剂(如TNFα)或生长促进剂(如IL-2)存在下也能够抑制TNFR2活化。
NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达。
在一些实施方案中，所述单链多肽、抗体或其抗原结合片段抑制NFκB活化。例如，本发明的
拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段可使CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、
TRAF3、relB或cIAP2/BIRC3中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)相对于从
未用本发明的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段处理的样品中分离的这些分
子中的一种或多种的表达或翻译后修饰(例如，磷酸化)降低或抑制例如1％、2％、3％、4％、
5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。可用于测定表达水平和磷酸化状态的示
例性测定是本领域中已知的，并且包括用于测定蛋白质含量的蛋白质印迹测定和用于测定
mRNA含量的定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)实验。在优选的实施方案中，抗TNFR2多肽
(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)是显性TNFR2拮抗剂并且因此即使在TNFR2激动
剂(如TNFα)或生长促进剂(如IL-2)存在下也能够抑制TNFR2活化。
[0078] 拮抗性TNFR2多肽(例如，本发明的单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体)可表现出以下性质中的一种或多种或全部：
[0079] a.例如通过结合T-reg细胞表面上的TNFR2并使所述TNFR2失活来遏制T-reg细胞增殖；
[0080] b.例如通过结合MDSC表面上的TNFR2并使所述TNFR2失活来遏制MDSC增殖；
[0081] c.促进T效应细胞(如CD8+ T细胞)的扩增；和/或
[0082] d.遏制表达TNFR2的癌细胞，如T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏淋巴瘤细胞和皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞
的增殖。
的增殖。
[0083] 例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可减少患者(如人患者)体内或样品(例如，从患者分离的样品，所述患者如正在经历如本文所述的癌
症或感染性疾病的治疗的人患者，相对于未用所述拮抗剂治疗的患者或样品)内的T-reg或
癌细胞的总量。
症或感染性疾病的治疗的人患者，相对于未用所述拮抗剂治疗的患者或样品)内的T-reg或
癌细胞的总量。
[0084] 在一些实施方案中，所述拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)降低例如T-reg细胞或癌细胞(如T细胞淋巴瘤(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴
瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)表达TNFR2和/或这
些细胞分泌可溶性TNFR2。
瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)表达TNFR2和/或这
些细胞分泌可溶性TNFR2。
[0085] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可抑制患者(例如，人患者)体内或样品(例如，从正在经历如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的
人患者中分离的样品)中的T-reg细胞的增殖或减少所述T-reg细胞的总量。
人患者中分离的样品)中的T-reg细胞的增殖或减少所述T-reg细胞的总量。
[0086] 本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可能能够减少或抑制T-reg细胞和/或表达TNFR2的癌细胞的增殖。例如，所述癌细胞可选自由以下组成的组T细胞
淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏和皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多
发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞。结合癌细胞上的TNFR2可抑制或减少癌细胞的增殖或可
促进癌细胞的凋亡。
淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏和皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多
发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞。结合癌细胞上的TNFR2可抑制或减少癌细胞的增殖或可
促进癌细胞的凋亡。
[0087] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可结合骨髓源性抑制细胞(MDSC；例如，表达选自由以下组成的组的蛋白质和小分子的全部或子集的细
胞：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB
(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB
(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/
2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3
(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1))表面上的TNFR2。特
别地，MDSC不表达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。结合MDSC上的
TNFR2可抑制或减少MDSC的增殖或可促进MDSC的凋亡。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以
及其抗原结合片段)不需要TNFα来减少或抑制T-reg细胞、癌细胞(例如，表达TNFR2的癌细
胞)和/或MDSC的增殖。
胞：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB
(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB
(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/
2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3
(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1))表面上的TNFR2。特
别地，MDSC不表达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。结合MDSC上的
TNFR2可抑制或减少MDSC的增殖或可促进MDSC的凋亡。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以
及其抗原结合片段)不需要TNFα来减少或抑制T-reg细胞、癌细胞(例如，表达TNFR2的癌细
胞)和/或MDSC的增殖。
[0088] 在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。在
一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不含癌细
胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的
微环境中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。
一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不含癌细
胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的
微环境中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。
[0089] 例如，在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)减少或抑制T-reg细胞的增殖，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症
的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。例如，本发明的多肽(如
单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可表现出用于抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的
IC50比所述多肽用于抑制不含癌细胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2
倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、
10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制T-reg细胞的增殖，其效
力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、
结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的
部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的
部位)中更大。
的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。例如，本发明的多肽(如
单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可表现出用于抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的
IC50比所述多肽用于抑制不含癌细胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2
倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、
10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制T-reg细胞的增殖，其效
力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、
结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的
部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的
部位)中更大。
[0090] 在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力减少或抑制MDSC的增殖。在一些实
施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不含癌细胞的部
位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境
中以更大的效力减少或抑制MDSC的增殖。
施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不含癌细胞的部
位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境
中以更大的效力减少或抑制MDSC的增殖。
[0091] 例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可结合肿瘤的微环境内存在的MDSC表面上的TNFR2，并且可抑制或减少所述MDSC的增殖或者可
促进MDSC的细胞凋亡，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者
中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)更大。例如，本发明的多肽(如单链多肽、
抗体以及其抗原结合片段)可表现出用于抑制肿瘤微环境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽
用于抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、
1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、
30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多
肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效
力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、
结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的
部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的
部位)中更大。
促进MDSC的细胞凋亡，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者
中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)更大。例如，本发明的多肽(如单链多肽、
抗体以及其抗原结合片段)可表现出用于抑制肿瘤微环境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽
用于抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、
1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、
30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多
肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效
力在含有T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、
结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的
部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的
部位)中更大。
[0092] 在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T
细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不
含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在
肿瘤的微环境中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。
细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相对于不
含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在
肿瘤的微环境中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。
[0093] 例如，在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在肿瘤微环境中比在不含癌细胞的部
位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。例如，本
发明的多肽可具有的用于扩增癌症患者中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增未患癌
症的受试者中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、
1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在含有T细胞淋巴瘤
细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨
髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症
中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。在一些
实施方案中，所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)与存在于一种或多种癌细胞(如霍
奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细
胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)上的抗原特异性地反应。
位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。例如，本
发明的多肽可具有的用于扩增癌症患者中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增未患癌
症的受试者中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、
1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞，其效力在含有T细胞淋巴瘤
细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨
髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症
中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。在一些
实施方案中，所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)与存在于一种或多种癌细胞(如霍
奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细
胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)上的抗原特异性地反应。
[0094] 在另一方面，本发明的特征是一种通过以下方式鉴别TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的方法：
[0095] (a)使抗体或其片段的异质混合物暴露于肽，所述肽具有ID NO:285或286的氨基酸序列，或相对于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；以及
[0096] (b)保留特异性地结合所述肽的抗体或其片段并除去不特异性地结合所述肽的抗体或其片段，从而产生含有至少一种所述TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的富集的抗
体混合物。在一些实施方案中，所述方法包括确定所述富集的抗体混合物中的抗体或其抗
原结合片段中的一种或多种的氨基酸序列。
体混合物。在一些实施方案中，所述方法包括确定所述富集的抗体混合物中的抗体或其抗
原结合片段中的一种或多种的氨基酸序列。
[0097] 在一些实施方案中，所述肽结合至表面。所述抗体或其抗原结合片段可在病毒颗粒或细胞的表面(如噬菌体、细菌细胞或酵母细胞的表面)上表达。所述抗体或其抗原结合
片段可表达为与核糖体非共价结合或与mRNA或cDNA共价结合的一条或多条多肽链。在一些
实施方案中，所述肽与可检测标记，如选自由以下组成的组的可检测标记缀合：荧光分子
(例如，绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋
白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗
丹明和花菁)、表位标签(例如，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚-组氨酸标签、
FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素和链霉亲和素)和放射性标记。在一
些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)顺序地重复一次或多次。
片段可表达为与核糖体非共价结合或与mRNA或cDNA共价结合的一条或多条多肽链。在一些
实施方案中，所述肽与可检测标记，如选自由以下组成的组的可检测标记缀合：荧光分子
(例如，绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋
白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗
丹明和花菁)、表位标签(例如，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚-组氨酸标签、
FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素和链霉亲和素)和放射性标记。在一
些实施方案中，所述方法的步骤(a)和(b)顺序地重复一次或多次。
[0098] 在另一方面，本发明的特征是一种通过以下方式产生TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段的方法：用肽免疫非人哺乳动物，所述肽含有SEQ ID NO:285或286的序列，或相对
于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；以及收集含有所述TNFR2拮抗剂抗体
或其抗原结合片段的血清。非人哺乳动物可选自由以下组成的组：兔、小鼠、大鼠、山羊、豚
鼠、仓鼠、马和绵羊。
于所述序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；以及收集含有所述TNFR2拮抗剂抗体
或其抗原结合片段的血清。非人哺乳动物可选自由以下组成的组：兔、小鼠、大鼠、山羊、豚
鼠、仓鼠、马和绵羊。
[0099] 在另一方面，本发明的特征是一种通过以上实施方案中的任一个的方法产生的抗体或其抗原结合片段。
[0100] 本发明的抗体或其抗原结合片段可以是全长抗体或抗体片段，如单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗
体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、
双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单
链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片
段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段含
有例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫桥键或通过接头(如本文所述的接头)彼此共价
结合的两个或更多个CDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有选自由IgG、
IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型。所述抗体或其抗原结合片段可例如缀合至治疗剂，
如本文所述的细胞毒性剂。
体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、
双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单
链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片
段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段含
有例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫桥键或通过接头(如本文所述的接头)彼此共价
结合的两个或更多个CDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有选自由IgG、
IgA、IgM、IgD和IgE组成的组的同种型。所述抗体或其抗原结合片段可例如缀合至治疗剂，
如本文所述的细胞毒性剂。
[0101] 本发明的特征是一种编码本发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及一种含有这种多核苷酸的载体。所述载体可以是表达载体，如真核表达载
体，或病毒载体，如腺病毒(Ad，如血清型5、26、35或48腺病毒)、逆转录病毒(如γ-逆转录病
毒或慢病毒)、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒(如修饰的牛痘安
卡拉(MVA))。本发明的特征还是宿主细胞，如含有本发明地载体的原核细胞和真核细胞(例
如，哺乳动物细胞)。
体，或病毒载体，如腺病毒(Ad，如血清型5、26、35或48腺病毒)、逆转录病毒(如γ-逆转录病
毒或慢病毒)、痘病毒、腺相关病毒、杆状病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒(如修饰的牛痘安
卡拉(MVA))。本发明的特征还是宿主细胞，如含有本发明地载体的原核细胞和真核细胞(例
如，哺乳动物细胞)。
[0102] 在另一方面，本发明的特征是一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞(例如，TNFR2拮抗剂抗
体或其抗原结合片段)和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物可含有例如另外
的治疗剂，如免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗
PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB
剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂或抗TWEAKR剂。例如，所述免疫治疗剂
可以是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其
抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL
交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片
段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原
结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗
体或其抗原结合片段或抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段。所述免疫治疗剂可能能够特异性
地结合Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)的表1中描述的一种或多
种免疫靶标，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。例如，所述免疫治疗剂可以
是特异性地结合以下中的一种或多种的剂，如抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、
LIGHT、BTLA、LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF或神经纤毛蛋白。特别地，所述药物组合物含有TNFR2拮抗剂抗体
或其抗原结合片段和抗PD-1或抗PDL1抗体。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是塔革雷
汀(Targretin)、干扰素-α、氯倍他索(clobestasol)、Peg干扰素(例如， )、泼
尼松、罗米地辛(Romidepsin)、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、
加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小
分子疗法如伏立诺他。
体或其抗原结合片段)和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物可含有例如另外
的治疗剂，如免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗
PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB
剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂或抗TWEAKR剂。例如，所述免疫治疗剂
可以是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其
抗原结合片段、抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、TNF-α交联抗体或其抗原结合片段、TRAIL
交联抗体或其抗原结合片段、抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗CD30抗体或其抗原结合片
段、抗CD40抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原
结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR1抗体或其抗原结合片段、抗TRAILR2抗
体或其抗原结合片段或抗TWEAKR抗体或其抗原结合片段。所述免疫治疗剂可能能够特异性
地结合Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)的表1中描述的一种或多
种免疫靶标，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。例如，所述免疫治疗剂可以
是特异性地结合以下中的一种或多种的剂，如抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、
LIGHT、BTLA、LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF或神经纤毛蛋白。特别地，所述药物组合物含有TNFR2拮抗剂抗体
或其抗原结合片段和抗PD-1或抗PDL1抗体。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是塔革雷
汀(Targretin)、干扰素-α、氯倍他索(clobestasol)、Peg干扰素(例如， )、泼
尼松、罗米地辛(Romidepsin)、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、
加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小
分子疗法如伏立诺他。
[0103] 在一些实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂，如本文所描述的化学治疗剂。本发明的抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细胞(例如，TNFR2
拮抗剂抗体或其抗原结合片段)可例如通过将所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建
体、多核苷酸、载体或宿主细胞与化学治疗剂掺混而被配制用于与化学治疗剂共同施用。在
一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细
胞被配制用于与化学治疗剂分开施用。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域
中已知的键形成技术使所述化学治疗剂与所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、
多核苷酸、载体或宿主细胞直接缀合。
拮抗剂抗体或其抗原结合片段)可例如通过将所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建
体、多核苷酸、载体或宿主细胞与化学治疗剂掺混而被配制用于与化学治疗剂共同施用。在
一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、多核苷酸、载体或宿主细
胞被配制用于与化学治疗剂分开施用。在一些实施方案中，例如使用本文所述的或本领域
中已知的键形成技术使所述化学治疗剂与所述抗体或其抗原结合片段、单链多肽、构建体、
多核苷酸、载体或宿主细胞直接缀合。
[0104] 本发明的特征还是一种通过以下方式产生本发明的多肽(例如，单链多肽、构建体、抗体或抗原结合片段)的方法：在宿主细胞中表达编码所述单链多肽、构建体、抗体或其
抗原结合片段的多核苷酸以及从宿主细胞培养基回收所述单链多肽、抗体或其抗原结合片
段。
抗原结合片段的多核苷酸以及从宿主细胞培养基回收所述单链多肽、抗体或其抗原结合片
段。
[0105] 本发明另外地特征是一种通过以下方式抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响应的方法以及一种通过以下方式治疗人的细胞增殖病症的方法：向需要治疗的人施用本发明
的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物(例
如，含有TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段和任选的免疫治疗剂如抗PD-1或抗PDL1抗体
的药物组合物)。另外地，本发明的特征是一种用于抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响
应以及用于治疗人的细胞增殖病症的组合物，所述组合物含有本发明的单链多肽、构建体、
抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。
的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物(例
如，含有TNFR2拮抗剂抗体或其抗原结合片段和任选的免疫治疗剂如抗PD-1或抗PDL1抗体
的药物组合物)。另外地，本发明的特征是一种用于抑制人中由调控性T细胞介导的免疫响
应以及用于治疗人的细胞增殖病症的组合物，所述组合物含有本发明的单链多肽、构建体、
抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。
[0106] 在一些实施方案中，所述细胞增殖病症可以是癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌
(laryngeal cancer)、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸
癌或喉癌(throatcancer)。在特定情况下，所述细胞增殖病症可以是选自由以下组成的组
的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病
(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门
癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉
瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿
瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢
性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道
癌、成感觉神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织
细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经
胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍
奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏
肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克
尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓
瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金
淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、
胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、
嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌
肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征(sézary syndrome)、小肠癌、软组
织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子
宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
(laryngeal cancer)、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸
癌或喉癌(throatcancer)。在特定情况下，所述细胞增殖病症可以是选自由以下组成的组
的癌症：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病
(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门
癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉
瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿
瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢
性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道
癌、成感觉神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织
细胞瘤、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经
胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍
奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏
肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克
尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓
瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金
淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、
胰腺神经内分泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、
嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌
肉瘤、唾液腺癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征(sézary syndrome)、小肠癌、软组
织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子
宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
[0107] 本发明的特征还是通过向患者(例如，哺乳动物患者，如人患者)施用本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段)、多核苷酸、载体或宿主
细胞来治疗T细胞淋巴瘤(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌、结肠癌、
多发性骨髓瘤或肾细胞癌的方法。例如，本发明提供了一种通过向患者(例如，哺乳动物患
者，如人患者)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段来治疗卵巢癌的方法。本
发明另外地特征是一种用于治疗患者(例如，人患者)的霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴
瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或肾细胞癌的组合物，所述组合物含有本
发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。
细胞来治疗T细胞淋巴瘤(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌、结肠癌、
多发性骨髓瘤或肾细胞癌的方法。例如，本发明提供了一种通过向患者(例如，哺乳动物患
者，如人患者)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段来治疗卵巢癌的方法。本
发明另外地特征是一种用于治疗患者(例如，人患者)的霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴
瘤、T细胞淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或肾细胞癌的组合物，所述组合物含有本
发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。
[0108] 本发明的特征还是一种通过向需要治疗的人施用本发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞来治疗患者(例如，人患者)的感染性疾病
的方法，以及一种用于治疗患者(例如，人患者)的感染性疾病的组合物，所述组合物含有本
发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。在一些实施
方案中，所述感染性疾病由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起。例如，可根据本发明的方法治疗
的病毒感染包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病
毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病
毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病
毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、
圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、
伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐
病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔
斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚
帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡
尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠
病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴
拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、
马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯
病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、
道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-
刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎
病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病
毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔肯雅病毒、天花病毒、
猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒
(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸
综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病
毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例
如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、
SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型
以及传染性海绵状脑病如慢性耗竭疾病。
的方法，以及一种用于治疗患者(例如，人患者)的感染性疾病的组合物，所述组合物含有本
发明的单链多肽、构建体、抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞。在一些实施
方案中，所述感染性疾病由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起。例如，可根据本发明的方法治疗
的病毒感染包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒、凯丹姆病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病
毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病
毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒、根岸病毒、米班病毒、索马里兹礁病毒、秋列尼病毒、阿罗阿病
毒、登革病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、
圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、
伊利乌斯病毒、以色列火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐
病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔
斯布朗病毒、黄热病毒、恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊病毒、胡蒂亚
帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达卡
尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、塔马纳蝙蝠
病毒、细胞融合因子病毒、伊皮病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴
拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、
马邱波病毒、奥利华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯
病毒、太米阿米病毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒、卢约病毒、汉坦病毒、辛诺柏病毒、
道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-
刚果出血热(CCHF)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、东方马脑炎
病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病
毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔肯雅病毒、天花病毒、
猴痘病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、人疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒
(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、流感病毒、严重急性呼吸
综合征(SARS)病毒、狂犬病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病
毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例
如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒、柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、腺相关病毒、星状病毒、JC病毒、BK病毒、
SV40病毒、诺沃克病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型
以及传染性海绵状脑病如慢性耗竭疾病。
[0109] 在一些实施方案中，可根据本发明的方法治疗的细菌感染包括由属于选自由以下组成的组的属的细菌引起的细菌感染：沙门氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒
状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属(例如，大肠杆菌，
如O157:H7)、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、
沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏
菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属和葡萄球
菌属。此外，可根据本发明的方法治疗的寄生虫感染包括由以下引起的寄生虫感染：溶组织
内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利
什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、
卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包
括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那
龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸
虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫或细粒棘球绦虫。
状杆菌属、诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属(例如，大肠杆菌，
如O157:H7)、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、
沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴斯德氏
菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌属、弧菌属、弯曲杆菌属和葡萄球
菌属。此外，可根据本发明的方法治疗的寄生虫感染包括由以下引起的寄生虫感染：溶组织
内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥虫、克氏锥虫、墨西哥利
什曼原虫、巴西利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、
卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包
括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那
龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸
虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫或细粒棘球绦虫。
[0110] 本发明的特征还是试剂盒，如含有本发明的单链多肽、构建体、抗体或抗原结合片段(例如，拮抗剂TNFR2抗体)、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞的试
剂盒。在一些情况下，本发明的试剂盒可含有用于将本发明的载体转染到本发明的宿主细
胞中的说明书。任选地，试剂盒可含有用于在本发明的宿主细胞中表达本发明的单链多肽、
抗体或抗原结合片段的说明书(和任选地，可用于在本发明的宿主细胞中表达本发明的单
链多肽、抗体或抗原结合片段的试剂)。本发明的试剂盒还可含有用于将本发明的单链多
肽、构建体、抗体或抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞
施用于人患者的说明书。任选地，试剂盒可含有用于制备或使用本发明的抗体或抗原结合
片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞的说明书。
剂盒。在一些情况下，本发明的试剂盒可含有用于将本发明的载体转染到本发明的宿主细
胞中的说明书。任选地，试剂盒可含有用于在本发明的宿主细胞中表达本发明的单链多肽、
抗体或抗原结合片段的说明书(和任选地，可用于在本发明的宿主细胞中表达本发明的单
链多肽、抗体或抗原结合片段的试剂)。本发明的试剂盒还可含有用于将本发明的单链多
肽、构建体、抗体或抗原结合片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞
施用于人患者的说明书。任选地，试剂盒可含有用于制备或使用本发明的抗体或抗原结合
片段、本发明的多核苷酸、本发明的载体或本发明的宿主细胞的说明书。
[0111] 定义
[0112] 如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述值的不超过10％的值。例如，术语“约5nM”指示4.5nM至5.5nM的范围。
[0113] 如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指特异性地结合至特定抗原或与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程化和以其他方式修饰形式的抗
体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异缀合物抗体(例如，双-、三-和四-特异性抗体、
双抗体、三抗体和四抗体)以及抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG
和scFv片段。此外，除非另外说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)是指包括完整分子以及能
够特异性地结合至靶蛋白的抗体片段(例如像，Fab和F(ab')2片段)两者。Fab和F(ab')2片段
缺乏完整抗体的Fc片段，从动物的循环中更快地清除，并且可具有比完整抗体更少的非特
异性组织结合(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；以引用的方式并入本文)。
体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异缀合物抗体(例如，双-、三-和四-特异性抗体、
双抗体、三抗体和四抗体)以及抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG
和scFv片段。此外，除非另外说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)是指包括完整分子以及能
够特异性地结合至靶蛋白的抗体片段(例如像，Fab和F(ab')2片段)两者。Fab和F(ab')2片段
缺乏完整抗体的Fc片段，从动物的循环中更快地清除，并且可具有比完整抗体更少的非特
异性组织结合(参见Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316,1983；以引用的方式并入本文)。
[0114] 如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体的保留特异性地结合至靶抗原的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是
Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL
和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区处通过二硫桥连接的两
个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结
构域组成的Fv片段；(v)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-
546,1989)，其由VH结构域组成；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区
(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成接头连接。此
外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用重组方法通过接头连
接，所述接头使它们能够制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链
Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988和Huston等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。可使用本领域技术人员已知的常规技术
来获得这些抗体片段，并且可以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合片
段可通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解或者在一些实施方案中通过本
领域中已知的化学肽合成程序而产生。
Fab、F(ab’)2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL
和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区处通过二硫桥连接的两
个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结
构域组成的Fv片段；(v)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-
546,1989)，其由VH结构域组成；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区
(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成接头连接。此
外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用重组方法通过接头连
接，所述接头使它们能够制成其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链
Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988和Huston等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。可使用本领域技术人员已知的常规技术
来获得这些抗体片段，并且可以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合片
段可通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解或者在一些实施方案中通过本
领域中已知的化学肽合成程序而产生。
[0115] 如本文所用，术语“抗肿瘤坏死因子受体2抗体”、“TNFR2抗体”、“抗TNFR2抗体部分”和/或“抗TNFR2抗体片段”等包括能够特异性地结合至TNFR2的任何含蛋白质或肽的分
子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，如但不限于重链或轻链的至少一个互补
决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何
部分。例如，免疫球蛋白分子的两个或更多个部分可例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键、二
硫桥键或通过接头(如本文描述或本领域中已知的接头)彼此共价结合。TNFR2抗体还包括
抗体样蛋白支架，如第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，其含有在结构以及对抗体CDR的溶
10
剂可及性方面相似的BC、DE和FG结构环。Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的可变区的
三级结构，并且本领域技术人员可通过用来自TNFR2单克隆抗体的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3
区的残基替代10Fn3的BC、DE和FG环的残基来将例如TNFR2单克隆抗体的CDR移植到纤连蛋白
支架上。
子，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，如但不限于重链或轻链的至少一个互补
决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何
部分。例如，免疫球蛋白分子的两个或更多个部分可例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键、二
硫桥键或通过接头(如本文描述或本领域中已知的接头)彼此共价结合。TNFR2抗体还包括
抗体样蛋白支架，如第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)，其含有在结构以及对抗体CDR的溶
10
剂可及性方面相似的BC、DE和FG结构环。Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的可变区的
三级结构，并且本领域技术人员可通过用来自TNFR2单克隆抗体的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3
区的残基替代10Fn3的BC、DE和FG环的残基来将例如TNFR2单克隆抗体的CDR移植到纤连蛋白
支架上。
[0116] 如本文所用，术语“拮抗剂TNFR2抗体”和“拮抗性TNFR2抗体”是指能够抑制或降低TNFR2的活化和/或减弱由TNFR2介导的一种或多种信号转导途径的TNFR2抗体。例如，拮抗
性TNFR2抗体可抑制或减少调控性T细胞的生长和增殖。拮抗性TNFR2抗体可通过阻断TNFR2
结合TNFα来抑制或降低TNFR2活化。以这种方式，拮抗性TNFR2抗体可阻断TNFR2的三聚化，
否则所述TNFR2的三聚化将通过与TNFα相互作用诱导、从而导致TNFR2活性的遏制。
性TNFR2抗体可抑制或减少调控性T细胞的生长和增殖。拮抗性TNFR2抗体可通过阻断TNFR2
结合TNFα来抑制或降低TNFR2活化。以这种方式，拮抗性TNFR2抗体可阻断TNFR2的三聚化，
否则所述TNFR2的三聚化将通过与TNFα相互作用诱导、从而导致TNFR2活性的遏制。
[0117] 如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，通常是人或人源化抗体。在本发明中，结合特异性中的一种可针对TNFR2，并且
另一种可针对任何其他抗原，例如，针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、
病毒源性蛋白、病毒编码包膜蛋白、细菌源性蛋白或细菌表面蛋白等。
另一种可针对任何其他抗原，例如，针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、
病毒源性蛋白、病毒编码包膜蛋白、细菌源性蛋白或细菌表面蛋白等。
[0118] 如本文所用，短语“化学治疗剂”是指在治疗癌症(如本文所述的癌症)中具有治疗有用性的任何化学试剂。化学治疗剂涵盖化学剂和生物剂两者。这些剂可起到抑制细胞活
性的作用，癌细胞依赖于细胞活性以继续存活。化学治疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗
代谢物、激素、激素类似物和抗肿瘤药物。适合与本文所述的组合物和方法结合使用的示例
性化学治疗剂包括但不限于Slapak和Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter
86in Harrison's Principles ofInternal medicine,第14版；Perry等人,
Chemotherapeutic,Chapter 17in Abeloff,Clinical Oncology第2版,2000；Baltzer L.
和Berkery R.(编):Oncology Pocket Guide to Chemotherapeutic,第2版St.Luois,
mosby-Year Book,1995；Fischer D.S.,Knobf M.F.,Durivage H.J.(编):The Cancer
Chemotherapeutic Handbook,第4版St.Luois,Mosby-Year Handbook中列出的那些，其各
自的公开内容均以引用的方式并入本文，因为它们属于化学治疗剂。
性的作用，癌细胞依赖于细胞活性以继续存活。化学治疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗
代谢物、激素、激素类似物和抗肿瘤药物。适合与本文所述的组合物和方法结合使用的示例
性化学治疗剂包括但不限于Slapak和Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter
86in Harrison's Principles ofInternal medicine,第14版；Perry等人,
Chemotherapeutic,Chapter 17in Abeloff,Clinical Oncology第2版,2000；Baltzer L.
和Berkery R.(编):Oncology Pocket Guide to Chemotherapeutic,第2版St.Luois,
mosby-Year Book,1995；Fischer D.S.,Knobf M.F.,Durivage H.J.(编):The Cancer
Chemotherapeutic Handbook,第4版St.Luois,Mosby-Year Handbook中列出的那些，其各
自的公开内容均以引用的方式并入本文，因为它们属于化学治疗剂。
[0119] 如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有源自一种来源生物(如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变结构域序列(例如，CDR序列)和源自不同生物体(例如，人、另一种灵长类动
物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等)的免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知
的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人,1986,BioTechniques
4:214-221；Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；
4,816,567；和4,816,397；其以引用的并入本文。
物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等)的免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域中已知
的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人,1986,BioTechniques
4:214-221；Gillies等人,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；
4,816,567；和4,816,397；其以引用的并入本文。
[0120] 如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在轻链和重链可变结构域中发现的高变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。如本领域所理解的，描绘抗体的
高变区的氨基酸位置可根据上下文和本领域中已知的各种定义而变化。可变结构域内的一
些位置可被视为杂合高变位置，因为这些位置可被认为是在一组标准下的高变区内，同时
被认为是在不同组标准下的高变区之外。这些位置中的一个或多个也可在扩增的高变区中
找到。本发明包括在这些杂合高变位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域
各自包含通过三个CDR连接的四个框架区，所述框架区主要采用β-折叠构型，所述CDR形成
连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR
区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他抗体
链的CDR一起有助于抗体的靶结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins
of Immunological Interest(National Institute ofHealth,Bethesda,Md.1987；其以引
用的并入本文)。如本文所用，除非另有说明，否则根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基
编号系统进行免疫球蛋白氨基酸残基的编号。
高变区的氨基酸位置可根据上下文和本领域中已知的各种定义而变化。可变结构域内的一
些位置可被视为杂合高变位置，因为这些位置可被认为是在一组标准下的高变区内，同时
被认为是在不同组标准下的高变区之外。这些位置中的一个或多个也可在扩增的高变区中
找到。本发明包括在这些杂合高变位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域
各自包含通过三个CDR连接的四个框架区，所述框架区主要采用β-折叠构型，所述CDR形成
连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的CDR通过FR
区按顺序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他抗体
链的CDR一起有助于抗体的靶结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins
of Immunological Interest(National Institute ofHealth,Bethesda,Md.1987；其以引
用的并入本文)。如本文所用，除非另有说明，否则根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基
编号系统进行免疫球蛋白氨基酸残基的编号。
[0121] 如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代表现出类似物理化学性质(如极性、静电荷和空间体积)的一个或多个不同的氨
基酸。对于以下表1中的20种天然存在的氨基酸中的每一种，总结了这些性质。
基酸。对于以下表1中的20种天然存在的氨基酸中的每一种，总结了这些性质。
[0122] 表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学性质
[0123]
[0124] 从此表可以看出，保守氨基酸家族包括例如(i)G、A、V、L、I、P和M；(ii)D和E；(iii)C、S和T；(iv)H；K和R；(v)N和Q；以及(vi)F、Y；并且W.A保守突变或取代因此是一种氨基酸取
代相同氨基酸家族的成员的突变或取代(例如，Ser取代Thr或Lys取代Arg)。
代相同氨基酸家族的成员的突变或取代(例如，Ser取代Thr或Lys取代Arg)。
[0125] 如本文所用，术语“缀合物”是指通过一个分子的反应性官能团与另一个分子的适当反应性官能团的化学键合形成的化合物。
[0126] 如本文在TNFR2拮抗剂的背景下所用，术语“构建体”是指含有与第二多肽结构域结合的第一多肽结构域的融合蛋白。多肽结构域可各自独立地为拮抗性TNFR2单链多肽，例
如，如本文所述。第一多肽结构域可例如通过接头如肽接头或二硫桥等与第二多肽结构域
共价结合。可用于连接拮抗性TNFR2构建体的多肽结构域的示例性接头包括但不限于在
Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582(2012)中描述的那些，其公开内容以引用的
方式整体并入本文。
如，如本文所述。第一多肽结构域可例如通过接头如肽接头或二硫桥等与第二多肽结构域
共价结合。可用于连接拮抗性TNFR2构建体的多肽结构域的示例性接头包括但不限于在
Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582(2012)中描述的那些，其公开内容以引用的
方式整体并入本文。
[0127] 如本文所用，术语“衍生化抗体”是指通过化学反应进行修饰以便裂解残基的抗体或添加对分离的抗体不是天然的化学部分。衍生化抗体可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇
化、磷酸化、酰胺化、通过添加已知的化学保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配
体或其他蛋白质的键联来获得。可通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，所述技术
包括但不限于使用已建立的程序的特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成
等。另外，衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸，例如使用琥珀抑制技术(参见例如，美国
专利号6,964,859；以引用的方式并入本文)。
化、磷酸化、酰胺化、通过添加已知的化学保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配
体或其他蛋白质的键联来获得。可通过已知技术进行多种化学修饰中的任一种，所述技术
包括但不限于使用已建立的程序的特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成
等。另外，衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸，例如使用琥珀抑制技术(参见例如，美国
专利号6,964,859；以引用的方式并入本文)。
[0128] 如本文所用，术语“双抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过太短的接头(例如，由五个氨基酸组成的接头)连接的VH和VL结构域以允许同一肽链
上的VH和VL结构域的分子内缔合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构
域配对，以便形成同二聚体结构。因此，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，所述
肽链各自含有通过极短的接头(例如，由1-2个氨基酸组成的接头)连接的一个VH结构域和
一个VL结构域以允许同一肽链内的VH和VL结构域的分子内缔合。为了折叠成它们的天然结
构，以这种方式配置的肽通常是三聚化以便将相邻肽链的VH和VL结构域定位成在空间上彼
此接近以允许适当的折叠(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,
1993；以引用的方式并入本文)。
上的VH和VL结构域的分子内缔合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构
域配对，以便形成同二聚体结构。因此，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，所述
肽链各自含有通过极短的接头(例如，由1-2个氨基酸组成的接头)连接的一个VH结构域和
一个VL结构域以允许同一肽链内的VH和VL结构域的分子内缔合。为了折叠成它们的天然结
构，以这种方式配置的肽通常是三聚化以便将相邻肽链的VH和VL结构域定位成在空间上彼
此接近以允许适当的折叠(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,
1993；以引用的方式并入本文)。
[0129] 如本文所用，TNFR2的“显性拮抗剂”是即使在TNFR2激动剂如TNFα或IL-2存在下也能够抑制TNFR2活化的拮抗剂(例如，拮抗性多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)。例
如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα)或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激动剂
(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加小于200％(例如，小于
200％、100％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少)，则TNFR2拮抗剂是显性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细
胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在
常规基因表达测定中监测选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及
cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达降低)来评估TNFR2活化的抑制。本文描述
了可用于监测TNFR2活化的细胞增殖测定和基因表达测定(例如分别在实施例9和12中)。
如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα)或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激动剂
(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加小于200％(例如，小于
200％、100％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少)，则TNFR2拮抗剂是显性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细
胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在
常规基因表达测定中监测选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及
cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达降低)来评估TNFR2活化的抑制。本文描述
了可用于监测TNFR2活化的细胞增殖测定和基因表达测定(例如分别在实施例9和12中)。
[0130] 如本文所用，“双重可变结构域免疫球蛋白”(“DVD-Ig”)是指通过接头组合两种单克隆抗体的靶结合可变结构域以产生四价双重靶向单一剂的抗体。(Gu等人,
Meth.Enzymol.,502:25-41,2012；以引用的方式并入本文)。用于本发明的DVD的轻链的合
适接头包括Gu等人的第30页上表2.1中鉴定的那些：短K链接头ADAAP(SEQ ID NO:118)(鼠
类)和TVAAP(SEQ ID NO:119)(人)；长κ链接头ADAAPTVSIFP(SEQ ID NO:120)(鼠类)和
TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:121)(人)；短λ链接头QPKAAP(SEQ ID NO:122)(人)；长λ链接头
QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:123)(人)；GS-短接头GGSGG(SEQ ID NO:124)，GS-培养基接头
GGSGGGGSG(SEQ ID NO:125)和GS-长接头GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:126)(所有GS接头都
是鼠类和人)。用于DVD的重链的合适接头包括在Gu&Ghayur,2012,Methods in Enzymology
502:25-41的第30页上的表2.1中鉴定的那些，所述文献以引用的方式并入本文：短接头
AKTTAP(SEQ ID NO:127)(鼠类)和ASTKGP(SEQ ID NO:128)(人)；长接头AKTTAPSVYPLAP
(SEQ ID NO:129)(鼠类)和ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:130)(人)；GS-短接头GGGGSG(SEQ
ID NO:131)，GS-培养基接头GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:132)和GS-长接头GGGGSGGGGSGGGG
(SEQ ID NO:133)(所有GS接头都是鼠类和人)。
Meth.Enzymol.,502:25-41,2012；以引用的方式并入本文)。用于本发明的DVD的轻链的合
适接头包括Gu等人的第30页上表2.1中鉴定的那些：短K链接头ADAAP(SEQ ID NO:118)(鼠
类)和TVAAP(SEQ ID NO:119)(人)；长κ链接头ADAAPTVSIFP(SEQ ID NO:120)(鼠类)和
TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:121)(人)；短λ链接头QPKAAP(SEQ ID NO:122)(人)；长λ链接头
QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:123)(人)；GS-短接头GGSGG(SEQ ID NO:124)，GS-培养基接头
GGSGGGGSG(SEQ ID NO:125)和GS-长接头GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:126)(所有GS接头都
是鼠类和人)。用于DVD的重链的合适接头包括在Gu&Ghayur,2012,Methods in Enzymology
502:25-41的第30页上的表2.1中鉴定的那些，所述文献以引用的方式并入本文：短接头
AKTTAP(SEQ ID NO:127)(鼠类)和ASTKGP(SEQ ID NO:128)(人)；长接头AKTTAPSVYPLAP
(SEQ ID NO:129)(鼠类)和ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:130)(人)；GS-短接头GGGGSG(SEQ
ID NO:131)，GS-培养基接头GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:132)和GS-长接头GGGGSGGGGSGGGG
(SEQ ID NO:133)(所有GS接头都是鼠类和人)。
[0131] 如本文所用，术语“内源性”描述天然存在于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。
[0132] 如本文所用，术语“外源性”描述不天然存在于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。外
源性物质包括从外部来源提供给生物体或从其提取的培养物质的那些。
源性物质包括从外部来源提供给生物体或从其提取的培养物质的那些。
[0133] 如本文所用，术语“框架区”或“FW区”包括与CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可存在于例如人抗体、啮齿动物来源的抗体(例如鼠类抗体)、人源化抗体、灵长类化抗体、嵌合
抗体、抗体片段(例如Fab片段)、单链抗体片段(例如，scFv片段)、抗体结构域和双特异性抗
体等。
抗体、抗体片段(例如Fab片段)、单链抗体片段(例如，scFv片段)、抗体结构域和双特异性抗
体等。
[0134] 如本文所用，术语“融合蛋白”是指通过共价键与另一分子连接的蛋白质。融合蛋白可通过例如一种蛋白质的N-末端与另一种蛋白质的C-末端之间的形成酰胺键的反应来
化学合成。或者，可通过例如从载体或细胞的基因组表达编码融合蛋白的多核苷酸来在细
胞(例如，真核细胞或原核细胞)中重组表达含有与另一种蛋白质共价结合的一种蛋白质的
融合蛋白。融合蛋白可含有与接头共价结合的一种蛋白质，所述接头进而与另一分子共价
结合。可用于形成融合蛋白的接头的实例包括含肽的接头，如含有天然存在的或非天然存
在的氨基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不
存在于天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。接头可使用本领域
中熟知的各种策略来制备，并且取决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件
下的水解、在碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解
(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012)。
化学合成。或者，可通过例如从载体或细胞的基因组表达编码融合蛋白的多核苷酸来在细
胞(例如，真核细胞或原核细胞)中重组表达含有与另一种蛋白质共价结合的一种蛋白质的
融合蛋白。融合蛋白可含有与接头共价结合的一种蛋白质，所述接头进而与另一分子共价
结合。可用于形成融合蛋白的接头的实例包括含肽的接头，如含有天然存在的或非天然存
在的氨基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不
存在于天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。接头可使用本领域
中熟知的各种策略来制备，并且取决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件
下的水解、在碱性条件下的水解、氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解
(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582,2012)。
[0135] 如本文所用，术语“异种特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人或人源化抗体。传统上，异种特异性抗体的重组产生是基于两个免疫
球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein等人,Nature 305:
537,1983)。类似的程序公开于例如WO 93/08829；美国专利号6,210,668；6,193,967；6,
132,992；6,106,833；6,060,285；6,037,453；6,010,902；5,989,530；5,959,084；5,959,
083；5,932,448；5,833,985；5,821,333；5,807,706；5,643,759；5,601,819；5,582,996；5,
496,549；4,676,980；WO 91/00360；WO 92/00373；EP 03089；Traunecker等人,EMBO J.10:
3655(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology 121:210(1986)中；其以引用的方式并
入本文。异种特异性抗体可包含在多特异性抗体中强制正确链结合的Fc突变，如Klein等
人,mAbs 4(6):653-663,2012所描述；其以引用的方式并入本文。
球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein等人,Nature 305:
537,1983)。类似的程序公开于例如WO 93/08829；美国专利号6,210,668；6,193,967；6,
132,992；6,106,833；6,060,285；6,037,453；6,010,902；5,989,530；5,959,084；5,959,
083；5,932,448；5,833,985；5,821,333；5,807,706；5,643,759；5,601,819；5,582,996；5,
496,549；4,676,980；WO 91/00360；WO 92/00373；EP 03089；Traunecker等人,EMBO J.10:
3655(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology 121:210(1986)中；其以引用的方式并
入本文。异种特异性抗体可包含在多特异性抗体中强制正确链结合的Fc突变，如Klein等
人,mAbs 4(6):653-663,2012所描述；其以引用的方式并入本文。
[0136] 如本文所用，术语“人抗体”是指其中蛋白质的基本上每个部分(例如，CDR、框架、CL、CH结构域(例如，CH1、CH2、CH3)、铰链、(VL，VH))在人中是基本上非免疫原性、只有微小序列变化或变异的抗体。人抗体可在人细胞中(例如，通过重组表达)产生或者由能够表达功
能重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此
外，当人抗体是单链抗体时，它可包括不存于天然人抗体中的接头肽。例如，Fv可包含接头
肽，如2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基，所述接头肽连接重链的可变区和轻链的可变区。
此类接头肽被认为具有人源。人抗体可通过本领域已知的多种方法来制备，所述方法包括
使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和
4,716,111；以及PCT公布WO 1998/46645；WO 1998/50433；WO 1998/24893；WO 1998/16654；
WO 1996/34096；WO 1996/33735；和WO 1991/10741；其以引用的方式并入本文。人抗体还可
使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。
参见例如，PCT公布WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,
413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,
793；5,916,771；以及5,939,598；其以引用的方式并入本文。
能重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此
外，当人抗体是单链抗体时，它可包括不存于天然人抗体中的接头肽。例如，Fv可包含接头
肽，如2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基，所述接头肽连接重链的可变区和轻链的可变区。
此类接头肽被认为具有人源。人抗体可通过本领域已知的多种方法来制备，所述方法包括
使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和
4,716,111；以及PCT公布WO 1998/46645；WO 1998/50433；WO 1998/24893；WO 1998/16654；
WO 1996/34096；WO 1996/33735；和WO 1991/10741；其以引用的方式并入本文。人抗体还可
使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。
参见例如，PCT公布WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,
413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,
793；5,916,771；以及5,939,598；其以引用的方式并入本文。
[0137] 如本文所用，术语“人源化”抗体是指非人(例如，鼠类)抗体的形式，所述形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他靶结合亚结
构域)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且
通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的
那些。全部或基本全部的FR区也可以是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免
疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人
源化的方法是本领域中已知的。参见例如，Riechmann等人,Nature 332:323-7,1988；Queen
等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；以及6,180,370；
EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；以及EP519596；其以引
用的方式并入本文。
构域)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，所述人源化抗体将包含至少一个且
通常两个可变结构域的基本全部，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的
那些。全部或基本全部的FR区也可以是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免
疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人
源化的方法是本领域中已知的。参见例如，Riechmann等人,Nature 332:323-7,1988；Queen
等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；以及6,180,370；
EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；以及EP519596；其以引
用的方式并入本文。
[0138] 如本文所用，术语“疏水性侧链”是指由于例如侧链内存在的化学部分的空间或电子性质而在水中表现出低溶解度的氨基酸侧链。含有疏水性侧链的氨基酸的实例包括含有
不饱和脂族烃的那些，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；以及含有
在生理pH下静电中性的芳环系统的氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
不饱和脂族烃的那些，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；以及含有
在生理pH下静电中性的芳环系统的氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0139] 如本文所用，术语“免疫治疗剂”是指如本文所述的化合物，如抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体，所述化合物特异性地结合免疫检查点受体或配体并且对受体或配
体发挥拮抗性作用，从而减少或抑制受体或配体的信号转导，所述受体或配体的信号转导
否则会导致免疫响应的下调。免疫治疗剂包括化合物，如抗体、抗原结合片段、单链多肽和
的构建体，所述化合物能够特异性地结合在造血细胞如淋巴细胞(例如T细胞)表面上表达
的受体，并且遏制由受体或配体诱导的信号传导，所述信号传导否则将导致针对内源性
(“自身”)抗原(如肿瘤相关抗原)的耐受性。免疫治疗剂可使由受体或配体诱导的信号传导
相对于在所述免疫治疗剂不存在下表现出的由所述受体或配体诱导的信号传导降低例如
1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.9％或100％。可用于测量受体或配体信号传导的程度的示例性测定包
括例如，用于测量与特定信号转导途径相关的蛋白质表达改变的酶联免疫吸附测定
(ELISA)技术，以及基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，如可用于确定与特定信号转导途径
相关的基因表达的变化的定量PCR、逆转录PCR和实时PCR实验等。可用于确定剂是否是“免
疫治疗剂”的示例性方法包括Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)中
描述的测定，其公开内容以引用的方式整体并入本文。免疫治疗剂的实例包括例如，特异性
地结合以下中的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、LIGHT、BTLA、
LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF和神经纤毛蛋白。免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、
Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、
抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面
癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
体发挥拮抗性作用，从而减少或抑制受体或配体的信号转导，所述受体或配体的信号转导
否则会导致免疫响应的下调。免疫治疗剂包括化合物，如抗体、抗原结合片段、单链多肽和
的构建体，所述化合物能够特异性地结合在造血细胞如淋巴细胞(例如T细胞)表面上表达
的受体，并且遏制由受体或配体诱导的信号传导，所述信号传导否则将导致针对内源性
(“自身”)抗原(如肿瘤相关抗原)的耐受性。免疫治疗剂可使由受体或配体诱导的信号传导
相对于在所述免疫治疗剂不存在下表现出的由所述受体或配体诱导的信号传导降低例如
1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％、99.9％或100％。可用于测量受体或配体信号传导的程度的示例性测定包
括例如，用于测量与特定信号转导途径相关的蛋白质表达改变的酶联免疫吸附测定
(ELISA)技术，以及基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，如可用于确定与特定信号转导途径
相关的基因表达的变化的定量PCR、逆转录PCR和实时PCR实验等。可用于确定剂是否是“免
疫治疗剂”的示例性方法包括Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-584(2015)中
描述的测定，其公开内容以引用的方式整体并入本文。免疫治疗剂的实例包括例如，特异性
地结合以下中的一种或多种的抗体或其抗原结合片段：OX40L、TL1A、CD40L、LIGHT、BTLA、
LAG3、TIM3、Singlecs、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、BTNL2、CD48、KIR、LIR、LIR抗体、ILT、NKG2D、NKG2A、MICA、MICB、CD244、CSF1R、IDO、TGFβ、CD39、CD73、CXCR4、CXCL12、SIRPA、CD47、VEGF和神经纤毛蛋白。免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、
Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、
抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面
癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
[0140] 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指产生所述抗体的方法。
[0141] 如本文所用，术语“多特异性抗体”是指对多于一种靶抗原表现出亲和力的抗体。多特异性抗体可具有与完整免疫球蛋白分子相似的结构，并且包括Fc区，例如IgGFc区。此
类结构可包括但不限于IgG-Fv、IgG-(scFv)2、DVD-Ig、(scFv)2-(scFv)2-Fc和(scFv)2-Fc-
(scFv)2。在IgG-(scFv)2的情况下，scFv可连接至重链或轻链的N-末端或C-末端。包含Fc区
并且抗TNFR2抗体或其抗原结合片段可掺入其中的示例性多特异性分子已由Kontermann,
2012,mAbs 4(2):182-197；Yazaki等人,2013,Protein Engineering,Design&Selection
26(3):187-193和Grote等人,2012,在Proetzel&Ebersbach(eds.),Antibody Methods and
Protocols,Methods in MolecularBiology第901卷,第16章:247-263中进行了综述；其以
引用的方式并入本文。在一些实施方案中，基于IgG或DVD或scFv的片段，抗体片段可以是无
Fc区的多特异性分子的组分。缺乏Fc区并且抗体或抗体片段可掺入其中的示例性多特异性
分子包括scFv二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)和四聚体(四抗体)，Fab二聚体(通过粘附
多肽或蛋白质结构域缀合)和Fab三聚体(化学缀合的)由Hudson和Souriau,2003,Nature
Medicine 9:129-134描述；所述文献以引用的方式并入本文。
类结构可包括但不限于IgG-Fv、IgG-(scFv)2、DVD-Ig、(scFv)2-(scFv)2-Fc和(scFv)2-Fc-
(scFv)2。在IgG-(scFv)2的情况下，scFv可连接至重链或轻链的N-末端或C-末端。包含Fc区
并且抗TNFR2抗体或其抗原结合片段可掺入其中的示例性多特异性分子已由Kontermann,
2012,mAbs 4(2):182-197；Yazaki等人,2013,Protein Engineering,Design&Selection
26(3):187-193和Grote等人,2012,在Proetzel&Ebersbach(eds.),Antibody Methods and
Protocols,Methods in MolecularBiology第901卷,第16章:247-263中进行了综述；其以
引用的方式并入本文。在一些实施方案中，基于IgG或DVD或scFv的片段，抗体片段可以是无
Fc区的多特异性分子的组分。缺乏Fc区并且抗体或抗体片段可掺入其中的示例性多特异性
分子包括scFv二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)和四聚体(四抗体)，Fab二聚体(通过粘附
多肽或蛋白质结构域缀合)和Fab三聚体(化学缀合的)由Hudson和Souriau,2003,Nature
Medicine 9:129-134描述；所述文献以引用的方式并入本文。
[0142] 如本文所用，术语“骨髓源性抑制细胞”或“MDSC”是指免疫系统的调节多种效应细胞和抗原呈递细胞的活性的细胞，如T细胞、NK细胞、树突细胞和巨噬细胞等。骨髓源性抑制
细胞通过它们的基因表达谱区分，并且表达选自由以下组成的组的蛋白质和小分子的全部
或子集：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、Fcγ
RIIB(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB
(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/
2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3
(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1))。特别地，MDSC不表
达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40
(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。
细胞通过它们的基因表达谱区分，并且表达选自由以下组成的组的蛋白质和小分子的全部
或子集：B7-1(CD80)、B7-H1(PD-L1)、CCR2、CD1d、CD1d1、CD2、CD31(PECAM-1)、CD43、CD44、补体组分C5a R1、F4/80(EMR1)、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRIIA(CD32a)、Fcγ
RIIB(CD32b)、FcγRIIB/C(CD32b/c)、FcγRIIC(CD32c)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB
(CD16b)、半乳糖凝集素-3、GP130、Gr-1(Ly-6G)、ICAM-1(CD54)、IL-1RI、IL-4Rα、IL-6Rα、整联蛋白α4(CD49d)、整联蛋白αL(CD11a)、整联蛋白αM(CD11b)、M-CSFR、MGL1(CD301a)、MGL1/
2(CD301a/b)、MGL2(CD301b)、一氧化氮、PSGL-1(CD162)、L-选择蛋白(CD62L)、siglec-3
(CD33)、转铁蛋白受体(TfR)、VEGFR1(Flt-1)以及VEGFR2(KDR或Flk-1))。特别地，MDSC不表
达选自由B7-2(CD86)、B7-H4、CD11c、CD14、CD21、CD23(FcεRII)、CD34、CD35、CD40
(TNFRSF5)、CD117(c-kit)、HLA-DR以及Sca-1(Ly6)组成的组的蛋白质。
[0143] 如本文所用，术语“中性TNFR2多肽”和“表型-中性TNFR2多肽”是指结合TNFR2并且不发挥对TNFR2活化的拮抗或激动作用的多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)。例如，如果
TNFR2多肽结合TNFR2并且既不加强也不遏制TNFR2活化，例如，如通过测量表达TNFR2的细
胞(例如，T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC)和/或通过测量一种或多种NFκB靶基因(如
CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和/或cIAP2/BIRC3)的表达，则所述多肽
是中性TNFR2多肽。用于测量细胞增殖和基因表达的示例性测定分别描述于例如实施例9和
12中。
TNFR2多肽结合TNFR2并且既不加强也不遏制TNFR2活化，例如，如通过测量表达TNFR2的细
胞(例如，T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC)和/或通过测量一种或多种NFκB靶基因(如
CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB和/或cIAP2/BIRC3)的表达，则所述多肽
是中性TNFR2多肽。用于测量细胞增殖和基因表达的示例性测定分别描述于例如实施例9和
12中。
[0144] 如本文所用，术语“非天然恒定区”是指抗体恒定区，源自不同于抗体可变区的来源或者是具有不同于天然抗体恒定区序列的氨基酸序列的人源合成多肽的抗体恒定区。例
如，含有非天然恒定区的抗体可具有源自非人来源(例如，小鼠、大鼠或兔)的可变区和源自
人来源的恒定区(例如，人抗体恒定区)，或者源自另一种灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、
猫、狗、豚鼠、牛科动物的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等的恒定区。
如，含有非天然恒定区的抗体可具有源自非人来源(例如，小鼠、大鼠或兔)的可变区和源自
人来源的恒定区(例如，人抗体恒定区)，或者源自另一种灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、
猫、狗、豚鼠、牛科动物的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马或野牛等的恒定区。
[0145] 如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”是指在比对序列并且(必要时)引入空位以获得最大序列同一性百分比(例如，为了进行最佳比对，可将空位引入候选序列和参考
序列中的一个或两个，并且为了比较目的，可忽略非同源序列)之后，候选序列中与参考序
列的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。用于确定序列同一性百分
比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的
计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量
比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，出于
比较与候选序列进行比对的参考序列可显示，候选序列在候选序列的全长或在候选序列的
连续氨基酸(或核酸)残基的选定部分上表现出50％至100％的序列同一性。出于比较目的
而比对的候选序列的长度可以是例如，参考序列的长度的至少30％(例如，30％、40、50％、
60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置由与参考序列中的相应位置相同的
氨基酸残基占据时，则在所述位置处的分子是相同的。
序列中的一个或两个，并且为了比较目的，可忽略非同源序列)之后，候选序列中与参考序
列的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。用于确定序列同一性百分
比的目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的
计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量
比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，出于
比较与候选序列进行比对的参考序列可显示，候选序列在候选序列的全长或在候选序列的
连续氨基酸(或核酸)残基的选定部分上表现出50％至100％的序列同一性。出于比较目的
而比对的候选序列的长度可以是例如，参考序列的长度的至少30％(例如，30％、40、50％、
60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置由与参考序列中的相应位置相同的
氨基酸残基占据时，则在所述位置处的分子是相同的。
[0146] 如本文所用，术语“灵长类化抗体”是指包含来自灵长类动物来源的抗体的框架区和来自非灵长类动物来源的抗体的其他区(如CDR和/或恒定区)的抗体。用于产生灵长类化
抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,
780；所述专利以引用的方式并入本文。例如，本发明的灵长类化抗体或其抗原结合片段可
通过将非灵长类动物抗体或其抗原结合片段的CDR插入含有灵长类动物的一个或多个框架
区的抗体或其抗原结合片段中来产生。
抗体的方法是本领域中已知的。参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,
780；所述专利以引用的方式并入本文。例如，本发明的灵长类化抗体或其抗原结合片段可
通过将非灵长类动物抗体或其抗原结合片段的CDR插入含有灵长类动物的一个或多个框架
区的抗体或其抗原结合片段中来产生。
[0147] 如本文所用，在多核苷酸片段的背景下术语“可操作地连接”意图指将两个多核苷酸片段连接以使得由所述两个多核苷酸片段编码的氨基酸序列保持在框内。
[0148] 如本文所用，术语“药物代谢动力学概况”是指在将药物施用至患者后药物随时间推移的吸收、分布、代谢和清除。
[0149] 如本文所用，TNFR2的“隐性拮抗剂”是在诸如TNFα或IL-2的TNFR2激动剂存在下将TNFR2活化抑制至相对于如在诸如TNFα或IL-2的TNFR2激动剂不存在下测量的相同拮抗剂
的抑制程度显著更低程度的拮抗剂(例如，拮抗性多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片
段)。例如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα)或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激
动剂(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加例如10倍、20倍、30
倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍，则TNFR2拮抗剂是隐性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖
的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在常规基因表达测定中监测选自由
CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多
种基因的表达降低)来评估TNFR2活化的抑制。本文描述了可用于监测TNFR2活化的细胞增
殖测定和基因表达测定(例如分别在实施例9和12中)。
的抑制程度显著更低程度的拮抗剂(例如，拮抗性多肽，如单链多肽、抗体或其抗原结合片
段)。例如，如果在TNFR2激动剂(例如，TNFα)或IL-2存在下拮抗剂的IC50相对于如在TNFR2激
动剂(如TNFα或IL-2)不存在下在相同测定中测量的拮抗剂的IC50增加例如10倍、20倍、30
倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍，则TNFR2拮抗剂是隐性拮抗剂。可例如通过测量TNFR2+细胞(如T-reg细胞，表达TNFR2的癌细胞，或骨髓源性抑制细胞)的增殖
的抑制以及通过测量NFκB信号传导的抑制(例如，通过在常规基因表达测定中监测选自由
CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、TRAF2、TRAF3、relB以及cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多
种基因的表达降低)来评估TNFR2活化的抑制。本文描述了可用于监测TNFR2活化的细胞增
殖测定和基因表达测定(例如分别在实施例9和12中)。
[0150] 如本文所用，术语“调控序列”包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel,Gene
Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,
1990)中；所述文献以引用的方式并入本文。
Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,CA,
1990)中；所述文献以引用的方式并入本文。
[0151] 如本文所用，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接以形成一条链。scFv片段含有单条多肽链，所述多肽链包含通过接头隔开的
抗体轻链(VL)的可变区(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链(VH)的可变区(例
如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的接头可以是由蛋白原氨基酸
组成的肽接头。可使用替代接头以便增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨
基酸的接头)，以便增强scFv片段的溶解度(例如，亲水性接头如含有重复甘氨酸和丝氨酸
残基的含聚乙二醇的接头或多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内
或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或者以减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖
基化位点接头)。scFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,892,019；Flo等
人，(Gene 77:51,1989)；Bird等人，(Science 242:423,1988)；Pantoliano等人，
(Biochemistry 30:10117,1991)；Milenic等人，(Cancer Research 51:6363,1991)；以及
Takkinen等人，(Protein Engineering 4:837,1991)中。scFv分子的VL和VH结构域可源自
一种或多种抗体分子。本领域普通技术人员还将理解，可修饰本发明的scFv分子的可变区，
以使得它们的氨基酸序列与它们所源自的抗体分子不同。例如，在一个实施方案中，可(例
如，在CDR和/或框架残基中)进行导致氨基酸残基的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取
代。或者或另外，使用本领域公认的技术对CDR氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。scFv
片段描述于例如WO 2011/084714中；其以引用的方式并入本文。
抗体轻链(VL)的可变区(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链(VH)的可变区(例
如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的接头可以是由蛋白原氨基酸
组成的肽接头。可使用替代接头以便增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨
基酸的接头)，以便增强scFv片段的溶解度(例如，亲水性接头如含有重复甘氨酸和丝氨酸
残基的含聚乙二醇的接头或多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内
或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或者以减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖
基化位点接头)。scFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,892,019；Flo等
人，(Gene 77:51,1989)；Bird等人，(Science 242:423,1988)；Pantoliano等人，
(Biochemistry 30:10117,1991)；Milenic等人，(Cancer Research 51:6363,1991)；以及
Takkinen等人，(Protein Engineering 4:837,1991)中。scFv分子的VL和VH结构域可源自
一种或多种抗体分子。本领域普通技术人员还将理解，可修饰本发明的scFv分子的可变区，
以使得它们的氨基酸序列与它们所源自的抗体分子不同。例如，在一个实施方案中，可(例
如，在CDR和/或框架残基中)进行导致氨基酸残基的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取
代。或者或另外，使用本领域公认的技术对CDR氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。scFv
片段描述于例如WO 2011/084714中；其以引用的方式并入本文。
[0152] 如本文所用，短语“特异性地结合”是指以特殊性决定蛋白质和其他生物分子的异源群体中抗原的存在的结合反应，所述蛋白质和其他生物分子例如通过抗体或其抗原结合
片段识别。特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD结合至抗原。
例如，特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以达100nM(例如，1pM与100nM之间)
的KD结合至抗原。未表现出与特定抗原或其表位的特异性结合的抗体或其抗原结合片段将
对所述特定抗原或其表位表现出大于100nM(例如，大于500nm、1μM、100μM、500μM或1mM)的
KD。可使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。
例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。
关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见Harlow和Lane,
Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)以及
Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,
NewYork(1999)。
片段识别。特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以小于100nM的KD结合至抗原。
例如，特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将以达100nM(例如，1pM与100nM之间)
的KD结合至抗原。未表现出与特定抗原或其表位的特异性结合的抗体或其抗原结合片段将
对所述特定抗原或其表位表现出大于100nM(例如，大于500nm、1μM、100μM、500μM或1mM)的
KD。可使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。
例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。
关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见Harlow和Lane,
Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)以及
Harlow和Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,
NewYork(1999)。
[0153] 如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指接受针对如本文所述的特定疾病或病状(如癌症或感染性疾病)的治疗的生物体。受试者和患者的实例包括接受针对疾病或病状
(例如，诸如癌症或感染性疾病的细胞增殖病症)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、
山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马和野牛等。
(例如，诸如癌症或感染性疾病的细胞增殖病症)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、
山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科的成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、奶牛、绵羊、马和野牛等。
[0154] 如本文所用，术语“转染”是指通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一种，例如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
[0155] 如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或病症，如细胞增殖病症(如癌症或感染性疾病)的进展的治疗性
治疗。有益或所需的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即
未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解还是全部
缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的那些包括已患有病状或病症的那些以
及易于患上病状或病症的那些或有待预防病状或病症的那些。
治疗。有益或所需的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度减轻、疾病状态稳定化(即
未恶化)、疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解还是全部
缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的那些包括已患有病状或病症的那些以
及易于患上病状或病症的那些或有待预防病状或病症的那些。
[0156] 如本文所用，术语“肿瘤微环境”是指形成肿瘤的癌细胞以及肿瘤内或肿瘤边界或围绕癌细胞的非癌细胞、分子和/或血管的群体。
[0157] 如本文所用，术语“肿瘤坏死因子受体超家族”、“TNFR超家族”或“TNFRS”是指特征在于常见富含半胱氨酸的结构域(CRD)的具有羧基末端细胞内结构域和氨基末端细胞外结
构域的一组I型跨膜蛋白。TNFR超家族包括由于与TNF超家族中的一种或多种配体结合而介
导细胞信号传导的受体。TNFR超家族可分成两个亚组：含有细胞内死亡结构域的受体和缺
乏这种结构域的那些受体。死亡结构域是80个氨基酸的基序，所述基序在受体活化后传播
细胞凋亡信号转导级联。含有细胞内死亡结构域的示例性TNFR超家族成员包括TNFR1，而
TNFR2表示不含这种结构域的TNFR超家族蛋白。TNFR超家族的成员包括TNFR1、TNFR2、RANK、
CD30、CD40、淋巴毒素β受体(LT-βR)、OX40、Fas受体、诱饵受体3(DCR3)、CD27、4-1BB、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱饵受体1(DCR1)、诱饵受体2(DCR2)、骨保护素、TWEAK受体、
TACI、BAFF受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导
的TNFR-相关的TROY、死亡受体6(DR6)、死亡受体3(DR3)和外异蛋白A2受体。
构域的一组I型跨膜蛋白。TNFR超家族包括由于与TNF超家族中的一种或多种配体结合而介
导细胞信号传导的受体。TNFR超家族可分成两个亚组：含有细胞内死亡结构域的受体和缺
乏这种结构域的那些受体。死亡结构域是80个氨基酸的基序，所述基序在受体活化后传播
细胞凋亡信号转导级联。含有细胞内死亡结构域的示例性TNFR超家族成员包括TNFR1，而
TNFR2表示不含这种结构域的TNFR超家族蛋白。TNFR超家族的成员包括TNFR1、TNFR2、RANK、
CD30、CD40、淋巴毒素β受体(LT-βR)、OX40、Fas受体、诱饵受体3(DCR3)、CD27、4-1BB、死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱饵受体1(DCR1)、诱饵受体2(DCR2)、骨保护素、TWEAK受体、
TACI、BAFF受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、B细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导
的TNFR-相关的TROY、死亡受体6(DR6)、死亡受体3(DR3)和外异蛋白A2受体。
[0158] 如本文所用，术语“可变区CDR”包括如使用基于序列或结构的方法鉴定的CDR或互补决定区中的氨基酸。如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽两者
的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等人,
J.Biol.Chem.252:6609-6616,1977和Kabat,等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；
Chothia等人,(J.Mol.Biol.196:901-917,1987)以及MacCallum等人,(J.Mol.Biol.262:
732-745,1996)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施方案
中，术语“CDR”是由Kabat基于序列比较定义的CDR。
的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等人,
J.Biol.Chem.252:6609-6616,1977和Kabat,等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；
Chothia等人,(J.Mol.Biol.196:901-917,1987)以及MacCallum等人,(J.Mol.Biol.262:
732-745,1996)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施方案
中，术语“CDR”是由Kabat基于序列比较定义的CDR。
[0159] 如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体，如质粒、RNA载体、病毒或其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷
酸递送到原核或真核细胞中。此类表达载体的实例公开于例如WO 1994/11026中；其以引用
的方式并入本文。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将
这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外序列元件。可用于表达本发明的
抗体和抗体片段的某些载体包括含有调控序列的质粒，如指导基因转录的启动子和增强子
区。用于表达抗体和抗体片段的其他有用载体含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列增强
这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括
例如5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达
载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可含有编码用于选择含有这种载体的
细胞的标记的多核苷酸。合适的标记的实例包括编码对抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡
那霉素或诺尔丝菌素)的抗性的基因。
酸递送到原核或真核细胞中。此类表达载体的实例公开于例如WO 1994/11026中；其以引用
的方式并入本文。本发明的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将
这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外序列元件。可用于表达本发明的
抗体和抗体片段的某些载体包括含有调控序列的质粒，如指导基因转录的启动子和增强子
区。用于表达抗体和抗体片段的其他有用载体含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列增强
这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括
例如5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达
载体上携带的基因的有效转录。本发明的表达载体还可含有编码用于选择含有这种载体的
细胞的标记的多核苷酸。合适的标记的实例包括编码对抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡
那霉素或诺尔丝菌素)的抗性的基因。
[0160] 如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。提及“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。抗体
(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定靶标的结合
特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶标特异性的其他抗体样分子两者。天然抗体和免
疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同
的重(H)链组成。天然抗体的每条重链在氨基末端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结
构域。天然抗体的每条轻链在氨基末端(VL)具有可变结构域，并且在羧基末端具有恒定结
构域。
附图说明
(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定靶标的结合
特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶标特异性的其他抗体样分子两者。天然抗体和免
疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同
的重(H)链组成。天然抗体的每条重链在氨基末端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结
构域。天然抗体的每条轻链在氨基末端(VL)具有可变结构域，并且在羧基末端具有恒定结
构域。
附图说明
[0161] 图1A和1B示出拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1的重链和轻链的DNA和氨基酸序列。图1A示出编码TNFRAB1的重链(顶部)的DNA序列和所述重链的氨基酸序列(底部)。三个互补决定
区(CDR)的氨基酸序列以粗体显示。图1B示出编码TNFRAB1的轻链(顶部)的DNA序列和所述
轻链的氨基酸序列(底部)。三个CDR的氨基酸序列以粗体显示。
区(CDR)的氨基酸序列以粗体显示。图1B示出编码TNFRAB1的轻链(顶部)的DNA序列和所述
轻链的氨基酸序列(底部)。三个CDR的氨基酸序列以粗体显示。
[0162] 图2A和2B示出人TNFR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。值得注意的是，人TNFR2在本文编号，以位置1的N-末端甲硫氨酸开始并且以位置461的C-末端丝氨酸结束(SEQ ID NO:
7)。对TNFR2内的氨基酸位置的所有提及都是在图2A和2B中所示的TNFR2编号方案的背景下
进行的。(图2A)阴影残基KCRPGFGV(SEQ ID NO:20)定义由拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1特异性
结合的表位。值得注意的是，TNFRAB1选择性地结合此区域内的残基而不结合加下划线残基
KCSPG(SEQ ID NO:12)的能力促进TNFR2信号传导的拮抗作用。本发明的抗体对加下划线残
基区域内或附近的残基的亲和力较差(或缺乏)与这些抗体的拮抗活性一致，因为与含有加
下划线残基的表位的结合一直与TNFR2抗体中的抑制活性的衰减相关。TNFRAB1另外结合包
含阴影残基CKPCAPGTF(SEQ ID NO:21)的表位。尽管这些残基在具有KCRPG基序的一级序列
中不是连续的，但它们可能在TNFR2的三维三级结构中在空间上接近，并且可适当地定位以
与本发明的拮抗性TNFR2抗体相互作用(参见图4)。(图2B)阴影残基CAPLRKRCR(SEQ ID NO:
11)定义由拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2特异性结合的表位。TNFRAB2可另外结合包含残基
DSTYTQL(SEQ ID NO:8)、PECLSCGS(SEQ ID NO:9)和RICTCRPG(SEQ ID NO:10)的一个或多
个区域，所述区域可以是不连续表位的一部分。尽管这些残基在一级序列中不是连续的，但
它们可能在TNFR2的三维三级结构中在空间上接近，并且可适当地定位以与本发明的拮抗
性TNFR2抗体相互作用。
7)。对TNFR2内的氨基酸位置的所有提及都是在图2A和2B中所示的TNFR2编号方案的背景下
进行的。(图2A)阴影残基KCRPGFGV(SEQ ID NO:20)定义由拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1特异性
结合的表位。值得注意的是，TNFRAB1选择性地结合此区域内的残基而不结合加下划线残基
KCSPG(SEQ ID NO:12)的能力促进TNFR2信号传导的拮抗作用。本发明的抗体对加下划线残
基区域内或附近的残基的亲和力较差(或缺乏)与这些抗体的拮抗活性一致，因为与含有加
下划线残基的表位的结合一直与TNFR2抗体中的抑制活性的衰减相关。TNFRAB1另外结合包
含阴影残基CKPCAPGTF(SEQ ID NO:21)的表位。尽管这些残基在具有KCRPG基序的一级序列
中不是连续的，但它们可能在TNFR2的三维三级结构中在空间上接近，并且可适当地定位以
与本发明的拮抗性TNFR2抗体相互作用(参见图4)。(图2B)阴影残基CAPLRKRCR(SEQ ID NO:
11)定义由拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2特异性结合的表位。TNFRAB2可另外结合包含残基
DSTYTQL(SEQ ID NO:8)、PECLSCGS(SEQ ID NO:9)和RICTCRPG(SEQ ID NO:10)的一个或多
个区域，所述区域可以是不连续表位的一部分。尽管这些残基在一级序列中不是连续的，但
它们可能在TNFR2的三维三级结构中在空间上接近，并且可适当地定位以与本发明的拮抗
性TNFR2抗体相互作用。
[0163] 图3A和3B是示出从酶联免疫吸附测定(ELISA)实验获得的原始数据的表，进行所述实验以确定TNFRAB1和TNFRAB2对TFNR2内的各种连续和不连续表位的亲和力(参见实施
例1)。原始发光值在所述表的第四列(右侧)中示出。所示的肽序列代表含有TNFR2内与
TNFRAB1(图3A)或TNFRAB2(图3B)相互作用的构象表位的一部分的肽序列。具有单位数代码
“2”的氨基酸残基表示在肽合成期间在硫醇位置用乙酰胺基甲基(ACM)部分化学保护的半
胱氨酸残基。这些残基不与含溴甲基的亲电试剂反应，并且因此在肽合成的环化和双环化
阶段期间不交联。所述表中的第三列表示肽支架的一般结构。“CYS.S”表示27个残基的肽，
其中所述肽的位置1-11和17-27表示源自TNFR2的含有半胱氨酸残基的11个残基的肽，所述
半胱氨酸残基基于可用于UniProt条目P20333的信息在天然蛋白质中形成二硫桥。将序列
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly掺入此组肽的位置12-16。将不形成二硫桥的天然Cys残基用乙酰胺
基甲基(ACM)保护基保护，并且用单位数代码“2”表示。
例1)。原始发光值在所述表的第四列(右侧)中示出。所示的肽序列代表含有TNFR2内与
TNFRAB1(图3A)或TNFRAB2(图3B)相互作用的构象表位的一部分的肽序列。具有单位数代码
“2”的氨基酸残基表示在肽合成期间在硫醇位置用乙酰胺基甲基(ACM)部分化学保护的半
胱氨酸残基。这些残基不与含溴甲基的亲电试剂反应，并且因此在肽合成的环化和双环化
阶段期间不交联。所述表中的第三列表示肽支架的一般结构。“CYS.S”表示27个残基的肽，
其中所述肽的位置1-11和17-27表示源自TNFR2的含有半胱氨酸残基的11个残基的肽，所述
半胱氨酸残基基于可用于UniProt条目P20333的信息在天然蛋白质中形成二硫桥。将序列
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly掺入此组肽的位置12-16。将不形成二硫桥的天然Cys残基用乙酰胺
基甲基(ACM)保护基保护，并且用单位数代码“2”表示。
[0164] 图4是说明TNFR2内的可与拮抗剂TNFR2抗体(如TNFRAB1和TNFRAB2)相互作用的构象表位以及不与拮抗剂TNFR2抗体相互作用的残基的示意图。KCSPG基序在图的左上角的扩
展中示出；KCRPG基序在图右侧的扩展中示出。蛋白质的外表面表示TNFR2的范德瓦耳斯表
面。图4是从TNFR2的X射线晶体结构分离的TNFR2单体的呈现(PDB ID：3ALQ,Mukai,等人,
Sci.Signal.,3:ra83,2010)。
展中示出；KCRPG基序在图右侧的扩展中示出。蛋白质的外表面表示TNFR2的范德瓦耳斯表
面。图4是从TNFR2的X射线晶体结构分离的TNFR2单体的呈现(PDB ID：3ALQ,Mukai,等人,
Sci.Signal.,3:ra83,2010)。
[0165] 图5是示出TNFRAB1在体外遏制培养的T-reg细胞的生长的图。值表示相对于未处理的对照细胞在使T-reg细胞暴露于特定条件后保留在培养物中的存活T-reg细胞的分数。
最左侧上示出的条形图表示用200U/ml的IL-2(对照)、TNFα(20ng/ml)、TNFR2激动剂(2.5μ
g/ml)、拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1(2.5μg/ml)或拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2(2.5μg/ml)处理
的T-reg细胞。左边第二个示出的条形图展示在用TNFRAB1处理细胞后T-reg存活力的剂量
依赖性变化。右边第二个示出的条形图显示TNFRAB1抑制TNFα的生长促进活性的能力。用恒
定浓度的TNFα(20ng/ml)和不同浓度的TNFRAB1(0.0008至25μg/ml)处理T-reg细胞。
TNFRAB1能够以浓度依赖性方式遏制TNFα诱导的增殖，从而表明TNFRAB1拮抗TNFR2。最右侧
上示出的条形图展示TNFα对T-reg细胞的生长的影响。相对于未处理的细胞，用20ng/ml
TNFα孵育T-reg细胞导致大约130％的增殖。
最左侧上示出的条形图表示用200U/ml的IL-2(对照)、TNFα(20ng/ml)、TNFR2激动剂(2.5μ
g/ml)、拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1(2.5μg/ml)或拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2(2.5μg/ml)处理
的T-reg细胞。左边第二个示出的条形图展示在用TNFRAB1处理细胞后T-reg存活力的剂量
依赖性变化。右边第二个示出的条形图显示TNFRAB1抑制TNFα的生长促进活性的能力。用恒
定浓度的TNFα(20ng/ml)和不同浓度的TNFRAB1(0.0008至25μg/ml)处理T-reg细胞。
TNFRAB1能够以浓度依赖性方式遏制TNFα诱导的增殖，从而表明TNFRAB1拮抗TNFR2。最右侧
上示出的条形图展示TNFα对T-reg细胞的生长的影响。相对于未处理的细胞，用20ng/ml
TNFα孵育T-reg细胞导致大约130％的增殖。
[0166] 图6A是示出TNFα以剂量依赖性方式诱导T-reg细胞增殖的能力的图。
[0167] 图6B是示出IL-2以剂量依赖性方式诱导T-reg细胞增殖的能力的图。用TNFα和IL-2(200U/ml)孵育新鲜分离的人CD4+细胞达48小时以剂量依赖性方式诱导T-reg细胞扩增，
并且IL-2的存在对于促进T-reg扩增是重要的。
并且IL-2的存在对于促进T-reg扩增是重要的。
[0168] 图6C是示出TNFα和显性拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2对T-reg细胞增殖的影响的图。x轴上的值表示相对于用IL-2处理的样品，T-reg细胞的数量的变化百分比。
[0169] 图6D和6E是示出为了确定TNFRAB2对T-reg细胞增殖的影响而进行的重复实验的结果的图。
[0170] 图6F和6G是示出为了确定TNFRAB1对T-reg细胞增殖的影响而进行的重复实验的结果的图。
[0171] 图7A是示出TNFα对CD4+ T-reg细胞的增殖的影响的图。x轴上的值表示相对于用IL-2处理，用TNFα处理后T-reg细胞的数量的变化百分比。
[0172] 图7B是示出在存在和不存在TNFα的情况下TNFRAB1主要抑制T-reg细胞增殖的能力的图。
[0173] 图7C是示出在存在和不存在TNFα的情况下TNFRAB2抑制T-reg细胞增殖的能力的图。
[0174] 图7D和7E是示出在存在和不存在TNFα的情况下TNFR2显性拮抗剂对T-reg细胞增殖的影响的图。
[0175] 图8A是示出TNFRAB1和TNFRAB2通常抑制T-reg细胞增殖的能力的图。
[0176] 图8B是示出相对于通过用IL-2处理诱导的作用，TNFRAB1和TNFRAB2对T-reg细胞增殖的影响的图。
[0177] 图8C是示出TNFRAB1和TNFRAB2对总T-reg数量的影响的图。
[0178] 图8D是示出相对于通过用IL-2处理诱导的作用，TNFRAB1和TNFRAB2对总T-reg数量的影响的图。
[0179] 图8E是展示TNFRAB1和TNFRAB2对以高亲和力状态表达CD25(CD25高)并且以低亲和力状态表达CD45RA(CD45RA低)的活化的T-reg细胞(aT-reg细胞)的影响的图。
[0180] 图8F是示出TNFRAB1和TNFRAB2对表达CD45RO高和CD25高的T-reg细胞群体的影响的图。
[0181] 图8G是示出TNFRAB2对表达CD25高的CD4+ T细胞的影响的图。
[0182] 图8H是示出TNFRAB2对表达CD25高的T-reg细胞的影响的图。这些数据表明，虽然在用TNFRAB1或TNFRAB2处理后活化的(aT-reg)细胞和静息(rT-reg)细胞两者的增殖受到抑
制，但拮抗性TNFR2抗体优先抑制aT-reg细胞的增殖。
制，但拮抗性TNFR2抗体优先抑制aT-reg细胞的增殖。
[0183] 图9A是一系列2维流式细胞术图，其展示指导T-reg细胞的生长的剂(例如，TNFα、IL-2和TNFR2激动剂)以及TNFR2拮抗剂TNFRAB2对各种表型的T-reg细胞的增殖的影响。用
TNFR2拮抗剂抗体处理优先抑制表达CD25高的T-reg细胞的增殖。示出与单独IL-2(200U/
ml)、与TNFα(20ng/ml)或与TNFR2拮抗剂抗体(12.5μg/ml)一起孵育达48小时后表达TNFR2
的CD4+、CD25高+细胞的比例。
TNFR2拮抗剂抗体处理优先抑制表达CD25高的T-reg细胞的增殖。示出与单独IL-2(200U/
ml)、与TNFα(20ng/ml)或与TNFR2拮抗剂抗体(12.5μg/ml)一起孵育达48小时后表达TNFR2
的CD4+、CD25高+细胞的比例。
[0184] 图9B是示出TNFRAB1对TNFR2的分泌的影响的图，以pg/ml为单位示出。
[0185] 图9C是一系列1维流式细胞术图，其示出通过羧基荧光素(CFSE)标记测量的TNFRAB2对CD8+ T细胞计数的影响。
[0186] 图10A是示出全长TNFRAB1(IgG)以及TNFRAB1的F(ab’)2片段抑制T-reg细胞的增殖的能力的图。
[0187] 图10B是示出全长TNFRAB2(IgG)以及TNFRAB2的F(ab’)2片段抑制T-reg细胞的增殖的能力的图。这些数据表明，这些拮抗性TNFR2抗体的Fab区与TNFR2的特异性结合可能负
责调节T-reg细胞生长，而不是这些抗体的Fc区的非特异性结合。IL-2(200U/ml)加上
TNFRAB1或TNFRAB2的完整抗体或F(ab’)2片段与新鲜分离的CD4+细胞一起孵育达48小时在
存在或不存在TNFα(20ng/ml)的情况下产生T-reg细胞的类似的剂量依赖性抑制。
责调节T-reg细胞生长，而不是这些抗体的Fc区的非特异性结合。IL-2(200U/ml)加上
TNFRAB1或TNFRAB2的完整抗体或F(ab’)2片段与新鲜分离的CD4+细胞一起孵育达48小时在
存在或不存在TNFα(20ng/ml)的情况下产生T-reg细胞的类似的剂量依赖性抑制。
[0188] 图10C是示出剂量-响应测定的结果的图，其中在抗IgG抗体存在下用TNFRAB1处理T-reg细胞。
[0189] 图10D是示出剂量-响应测定的结果的图，其中在抗IgG抗体存在下用TNFRAB2处理T-reg细胞。由TNFR2拮抗剂抗体诱导的T-reg细胞生长的剂量依赖性抑制不受抗IgG分子的
存在影响，从而表明由TNFRAB1或TNFRAB2介导的非特异性交联不负责这些抗体对T-reg细
胞增殖的抑制作用。交联抗体(2.5μg/ml)与TNFR2拮抗剂抗体(0.02–25μg/ml)的共孵育不
影响抗体以剂量依赖性方式抑制T-reg增殖的能力。数据作为单一代表性实施例呈现。
存在影响，从而表明由TNFRAB1或TNFRAB2介导的非特异性交联不负责这些抗体对T-reg细
胞增殖的抑制作用。交联抗体(2.5μg/ml)与TNFR2拮抗剂抗体(0.02–25μg/ml)的共孵育不
影响抗体以剂量依赖性方式抑制T-reg增殖的能力。数据作为单一代表性实施例呈现。
[0190] 图11A是聚丙烯酰胺凝胶的图像，其示出在TNFRAB1表达后进行的SDS-PAGE分析的结果。
[0191] 图11B是聚丙烯酰胺凝胶的图像，其示出在TNFRAB2表达后进行的SDS-PAGE分析的结果。示出了还原的和未还原的TNFR2拮抗剂抗体(2.5μg)的分析。
[0192] 图11C是聚丙烯酰胺凝胶的图像，其示出在TNFRAB1的F(ab’)2片段表达后进行的SDS-PAGE分析的结果。
[0193] 图11D是聚丙烯酰胺凝胶的图像，其示出在TNFRAB2的F(ab’)2片段表达后进行的SDS-PAGE分析的结果。示出了在F(ab')2片段制备物中在消化之前和之后的TNFR2拮抗剂抗
体的分析。
体的分析。
[0194] 图12A是示出TNFR2拮抗剂抗体对TNFα和淋巴毒素的表达的影响的图。
[0195] 图12B是示出TNFR2拮抗剂抗体对FoxP3和CD25的表达的影响的图。
[0196] 图12C是示出TNFR2拮抗剂抗体对以下促进NFκB活化的基因的表达的影响的图：保守的螺旋-环-螺旋遍存激酶(CHUK)、B细胞抑制剂中的κ轻链多肽基因增强子的核因子ε
(NFKBIE)、B细胞抑制剂中的κ轻多肽基因增强子地核因子α(NFKBIA)、有丝分裂原活化蛋白
激酶11(MAP3K11)、TNFα受体相关因子2(TRAF2)、TNFα受体相关因子3(TRAF3)、转录因子
relB以及含有3蛋白质的杆状病毒IAP重复序列(cIAP2/BIRC3)。实时PCR分析用于检测在与
IL-2(50U/ml)与TNFα(20ng/ml)或TNFR2拮抗剂(2.5μg/ml)的组合一起孵育3小时后后从新
鲜CD4+细胞分离的RNA。
(NFKBIE)、B细胞抑制剂中的κ轻多肽基因增强子地核因子α(NFKBIA)、有丝分裂原活化蛋白
激酶11(MAP3K11)、TNFα受体相关因子2(TRAF2)、TNFα受体相关因子3(TRAF3)、转录因子
relB以及含有3蛋白质的杆状病毒IAP重复序列(cIAP2/BIRC3)。实时PCR分析用于检测在与
IL-2(50U/ml)与TNFα(20ng/ml)或TNFR2拮抗剂(2.5μg/ml)的组合一起孵育3小时后后从新
鲜CD4+细胞分离的RNA。
[0197] 图12D是示出如使用基于细胞的ELISA测定测量的TNFRAB1遏制NFκB活化的能力的图。
[0198] 图12E是示出如使用基于细胞的ELISA测定测量的TNFRAB2遏制NFκB活化的能力的图。磷酸化的RelA/NFκB p65用作NFκB活性的标志物。用拮抗性TNFR2抗体处理T-reg细胞导
致相对于用TNFα处理减弱的NFκB活化。使用基于细胞的ELISA，在新鲜CD4+细胞与IL-2
(200U/ml)和各种浓度的TNFα(0.2–20ng/ml)或TNFR2拮抗剂抗体(0.02–25μg/ml)一起孵育
10分钟后测量磷酸化RelA/NFκB p65。RelA/NFκB p65的磷酸化由TNFα诱导并且以剂量依赖
性方式受TNFR2拮抗剂mAb抑制。
致相对于用TNFα处理减弱的NFκB活化。使用基于细胞的ELISA，在新鲜CD4+细胞与IL-2
(200U/ml)和各种浓度的TNFα(0.2–20ng/ml)或TNFR2拮抗剂抗体(0.02–25μg/ml)一起孵育
10分钟后测量磷酸化RelA/NFκB p65。RelA/NFκB p65的磷酸化由TNFα诱导并且以剂量依赖
性方式受TNFR2拮抗剂mAb抑制。
[0199] 图13A是示出TNFRAB1和TNFRAB2与TNFR2的结合的动力学和热力学参数的表。缔合-1 -1 -1
速率常数以M s 的单位示出，解离速率常数以s 的单位示出，并且平衡常数以M的单位示
出。
速率常数以M s 的单位示出，解离速率常数以s 的单位示出，并且平衡常数以M的单位示
出。
[0200] 图13B是示出TNFRAB1和TNFRAB2对人TNFR2内的各种线性肽序列的亲和力的表。相对亲和力被表示为一系列“+”符号，以使得此符号的较高量表示升高的亲和力值。来自
ELISA结合实验的原始数据在“阅读”列中提供。
ELISA结合实验的原始数据在“阅读”列中提供。
[0201] 图13C是示出TNFα对TNFRAB1和TNFRAB2对人TNFR2内的各种线性肽序列的亲和力的影响的表。相对亲和力被表示为一系列“+”符号，以使得此符号的较高量表示升高的亲和
力值。来自ELISA结合实验的原始数据在“阅读”列中提供。
力值。来自ELISA结合实验的原始数据在“阅读”列中提供。
[0202] 图14A和14B是示出为了确定温和地抑制TNFR2活性的隐性-TNFR2拮抗剂抗体(隐性拮抗剂TNFR2抗体A)对T-reg细胞增殖的影响而进行的重复实验的结果的图。
[0203] 图14C和14D是示出为了确定温和地抑制TNFR2活性的第二隐性-TNFR2拮抗剂(隐性拮抗剂TNFR2抗体B)对T-reg细胞增殖的影响而进行的重复实验的结果的图。这些隐性拮
抗剂抗体是针对TNFR2的外部区域而产生，以便防止导致NFκB活化的TNFR2三聚化。
抗剂抗体是针对TNFR2的外部区域而产生，以便防止导致NFκB活化的TNFR2三聚化。
[0204] 图15A是示出人TNFR2的反平行二聚体和平行二聚体的三维结构的结构模型。
[0205] 图15B是示出TNFα-TNFR2复合物的三维结构的结构模型。阴影残基表示人TNFR2内由TNFRAB1结合的氨基酸。蛋白质在范德瓦尔斯表面以下以带状形式描绘。本文所述的数据
清楚地表明，对于完整抗体或其F(ab’)2片段结合至呈反平行构象的TNFR2，TNFR2受体将在
指定氨基酸基序处结合所述抗体或其片段。平行二聚体的结合位点彼此太靠近并且因此将
阻止抗体结合。此外，三聚体TNFα-TNFR2复合物掩蔽由拮抗性TNFR2抗体结合的表位，因为
这些残基位于三聚体结构的内部。
清楚地表明，对于完整抗体或其F(ab’)2片段结合至呈反平行构象的TNFR2，TNFR2受体将在
指定氨基酸基序处结合所述抗体或其片段。平行二聚体的结合位点彼此太靠近并且因此将
阻止抗体结合。此外，三聚体TNFα-TNFR2复合物掩蔽由拮抗性TNFR2抗体结合的表位，因为
这些残基位于三聚体结构的内部。
[0206] 图15C是示出TNFR2作为含有三聚体TNF的三聚体的已知和公开的三聚体结构模型的图像。在此结构中还示出阴影残基，所述阴影残基表示人TNFR2内由隐性拮抗剂TNFR2抗
体A和B结合的氨基酸。
体A和B结合的氨基酸。
[0207] 图16A是示出TNFRAB1对从呈现卵巢癌的患者分离的T-reg细胞(灰色阴影)和从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞(黑色阴影)的增殖的影响的图。
[0208] 图16B是示出TNFRAB2对从呈现卵巢癌的患者分离的T-reg细胞(灰色阴影)和从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞(黑色阴影)的增殖的影响的图。
[0209] 图17A是示出TNFRAB1对从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图。
[0210] 图17B是示出TNFRAB2对从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图。
[0211] 图17C是示出TNFRAB1对从呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图。
[0212] 图17D是示出TNFRAB2对从呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图。
[0213] 图17E是示出TNFRAB1对从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图(相对于图17A的重复数据集)。
[0214] 图17F是示出TNFRAB2对从未呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图(相对于图17B的重复数据集)。
[0215] 图17G是示出TNFRAB1对从呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图(相对于图17C的重复数据集)。
[0216] 图17H是示出TNFRAB2对从呈现卵巢癌的受试者分离的T-reg细胞增殖的影响的图(相对于图17D的重复数据集)。
[0217] 图18A是示出从用于确定十二种鼠类抗体的TNFR2结合亲和力的基于ELISA的结合测定获得的荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第12列中，并且从
所述板的A行至F行连续稀释。
所述板的A行至F行连续稀释。
[0218] 图18B是示出从用于确定十二种鼠类抗体对在N-末端具有与牛血清白蛋白(BSA)结合的氨基酸序列LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)的靶肽1的亲和力的基于ELISA的结合测
定获得的荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第12列中，并且从所
述板的A行至F行连续稀释。
定获得的荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第12列中，并且从所
述板的A行至F行连续稀释。
[0219] 图18C是示出从用于确定十二种鼠类抗体对在C-末端具有与BSA结合的氨基酸序列VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的靶肽2的结合亲和力的基于ELISA的结合测定获得的
荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第12列中，并且从所述板的A
行至F行连续稀释。
荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第12列中，并且从所述板的A
行至F行连续稀释。
[0220] 图19是示出从用于确定十二种鼠类抗体对不相关的TNFR2表位的结合亲和力的基于ELISA的结合测定获得的荧光值的表。将十二种抗体排列在96孔微量滴定板的第1列至第
12列中，并且从所述板的A行至F行连续稀释。
12列中，并且从所述板的A行至F行连续稀释。
[0221] 图20是示出从用于确定靶肽1(LRKCRPGFGVA，SEQ ID NO:285)和靶肽2(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID NO:286)的BSA缀合物对TNFR2A3的亲和力的基于ELISA的结合测
定获得的荧光值的表。
定获得的荧光值的表。
[0222] 图21A是示出在与IL-2、TNFα、TNFR2激动剂和不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2一起孵育后培养的T-reg细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为
单位。
单位。
[0223] 图21B是示出在与IL-2、TNFα、TNFR2激动剂和不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后培养的T-reg细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为
单位。
单位。
[0224] 图21C是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2一起孵育后培养的T效应细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
[0225] 图21D是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，培养的OVCAR3细胞(一种表达TNFR2的卵巢癌细胞系)群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以
μg/ml为单位。
μg/ml为单位。
[0226] 图22A是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，从患有卵巢癌的患者或未患癌症的人受试者分离的样品中T-reg细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所
示的数值以μg/ml为单位。
示的数值以μg/ml为单位。
[0227] 图22B是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，从患有卵巢癌的患者或未患癌症的人受试者分离的样品中T效应细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所
示的数值以μg/ml为单位。
示的数值以μg/ml为单位。
[0228] 图23A是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，从患有皮肤T细胞淋巴瘤并且正用免疫治疗剂治疗的患者或未患癌症的人受试者分离的样品中T效应细
胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
[0229] 图23B是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，从患有皮肤T细胞淋巴瘤并且正用免疫治疗剂治疗的患者或未患癌症的人受试者分离的样品中T-reg细
胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
[0230] 图23C是示出在与不同浓度的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1一起孵育后，从患有皮肤T细胞淋巴瘤并且正用免疫治疗剂治疗的患者或未患癌症的人受试者分离的样品中TNFR2+
CD26-细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
CD26-细胞群体的变化百分比的图。沿X轴所示的数值以μg/ml为单位。
具体实施方式
[0231] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体和抗原结合片段)通过结合此受体(例如，在T-reg细胞、表达TNFR2的癌细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)的外表面上)来抑制
表达TNFR2的细胞上的TNFR2的活化并且因此阻止蛋白质募集其同源配体TNFα。TNFα通过使
TNFR2蛋白的三聚体成核来加强TNFR2信号传导。正是这种三聚化事件使个体TNFR2蛋白紧
密接近并且通过MAPK/NFκB/TRAF2/3途径引发信号传导，其最终导致细胞生长并逃避细胞
凋亡。TNFR2抗体可通过结合受体并阻止TNFα触发这种结构变化来拮抗这种相互作用。例
如，可能发生这种情况的一种机制是通过形成反平行TNFR2二聚体，所述二聚体是受体的无
活性结构形式。
表达TNFR2的细胞上的TNFR2的活化并且因此阻止蛋白质募集其同源配体TNFα。TNFα通过使
TNFR2蛋白的三聚体成核来加强TNFR2信号传导。正是这种三聚化事件使个体TNFR2蛋白紧
密接近并且通过MAPK/NFκB/TRAF2/3途径引发信号传导，其最终导致细胞生长并逃避细胞
凋亡。TNFR2抗体可通过结合受体并阻止TNFα触发这种结构变化来拮抗这种相互作用。例
如，可能发生这种情况的一种机制是通过形成反平行TNFR2二聚体，所述二聚体是受体的无
活性结构形式。
[0232] 本发明部分基于TNFR2内促进受体拮抗作用的表位的发现，以及以下发现：拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段的结合特异性主要由所述抗体或其片段的CDR-H3序列决定。
已经发现TNFR2内不同残基的结合促进受体拮抗作用，如TNFR2内含有KCRPG基序(SEQ ID
NO:19)的残基，以及下游氨基酸(例如，LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)和VVCKPCAPGTFSN
(SEQ ID NO:286)表位)。另外，已经发现用拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3替代中性抗TNFR2抗
体(即，在功能上既不具有拮抗性也不具有激动性的抗体)的CDR-H3序列可使所述表型-中
性抗体转化为拮抗性TNFR2抗体，如显性拮抗性TNFR2抗体。总之，这些发现使得能够产生
TNFR2结合多肽(例如，含有任选地与一个或多个另外的CDR结合的CDR-H3区的单链多肽，抗
体及其抗原结合片段)，如结合TNFR2并遏制受体活化的显性拮抗剂多肽。
已经发现TNFR2内不同残基的结合促进受体拮抗作用，如TNFR2内含有KCRPG基序(SEQ ID
NO:19)的残基，以及下游氨基酸(例如，LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)和VVCKPCAPGTFSN
(SEQ ID NO:286)表位)。另外，已经发现用拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3替代中性抗TNFR2抗
体(即，在功能上既不具有拮抗性也不具有激动性的抗体)的CDR-H3序列可使所述表型-中
性抗体转化为拮抗性TNFR2抗体，如显性拮抗性TNFR2抗体。总之，这些发现使得能够产生
TNFR2结合多肽(例如，含有任选地与一个或多个另外的CDR结合的CDR-H3区的单链多肽，抗
体及其抗原结合片段)，如结合TNFR2并遏制受体活化的显性拮抗剂多肽。
[0233] 拮抗性TNFR2多肽(例如，本文描述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体)可表现出以下性质中的一种或多种或全部：
[0234] a例如通过结合T-reg细胞表面上的TNFR2并使所述TNFR2失活来遏制T-reg细胞增殖；
[0235] b.例如通过结合MDSC表面上的TNFR2并使所述TNFR2失活来遏制MDSC增殖；
[0236] c.促进T效应细胞(如CD8+ T细胞)的扩增；和/或
[0237] d.遏制表达TNFR2的癌细胞，如T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和肾细胞癌细胞的增殖。
[0238] 在一些实施方案中，拮抗性TNFR2多肽(例如，本文描述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体)与在不含癌细胞的部位中相比，以更大的效力在肿瘤的微环境中发挥
上述特征中的一种或多种或全部。例如，拮抗性TNFR2多肽(例如，本文描述的单链多肽、抗
体、其抗原结合片段和构建体)可相对于未患癌症的受试者(如哺乳动物受试者，例如人)，
优先地在患有癌症的患者(如哺乳动物患者，例如人)中发挥性质(a)、(b)和(c)中的一种或
多种或全部。
上述特征中的一种或多种或全部。例如，拮抗性TNFR2多肽(例如，本文描述的单链多肽、抗
体、其抗原结合片段和构建体)可相对于未患癌症的受试者(如哺乳动物受试者，例如人)，
优先地在患有癌症的患者(如哺乳动物患者，例如人)中发挥性质(a)、(b)和(c)中的一种或
多种或全部。
[0239] 以下部分提供了拮抗性TNFR2多肽(如本发明的单链多肽、抗体、其抗原结合片段和构建体)的示例性特征的描述，以及它们在治疗方法中的用途。
[0240] 拮抗性TNFR2多肽
[0241] 对TNFR2/MAPK/TRAF2/3信号转导级联的影响
[0242] 本发明的抗TFNR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)能够与TNFR2相互作用并抑制其活性。因此，本发明的抗TNFR2多肽可选择性地拮抗TNFα-TNFR2相互作用而
不是促进TNFR2信号传导。这对于治疗性应用(如癌症免疫疗法)尤其重要，因为在与TNFα缔
合后的TNFR2活化导致MAPK和TRAF2/3信号级联的传播和NFκB介导的参与T-reg细胞生长和
逃避细胞凋亡的基因的转录活化(Faustman,等人,Nat.Rev.Drug Disc.,9:482-493,
2010)。本发明的TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可以高亲和力结合
TNFR2，并且可使受体与TNFα在空间上隔离，而不是允许TNFα结合至TNFR2引发TNFR2信号传
导，例如，通过结合呈反平行二聚体构象的TNFR2，其中TNFα结合位点在空间上是不可接近
的。这进而阻止TNFα使TNFR2的活化三聚体成核，所述成核触发TNFR2信号转导。因此，本发
明的抗体可用于遏制T-reg细胞的生长和增殖，从而允许例如可发动针对例如癌细胞或外
来病原体的免疫响应的T效应细胞的增殖。因此，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可施用于哺
乳动物受试者，如患有细胞增殖病症或感染性疾病的人患者，以便增强患者的免疫响应(例
如，针对癌细胞或病原生物体的免疫响应)的有效性。
不是促进TNFR2信号传导。这对于治疗性应用(如癌症免疫疗法)尤其重要，因为在与TNFα缔
合后的TNFR2活化导致MAPK和TRAF2/3信号级联的传播和NFκB介导的参与T-reg细胞生长和
逃避细胞凋亡的基因的转录活化(Faustman,等人,Nat.Rev.Drug Disc.,9:482-493,
2010)。本发明的TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可以高亲和力结合
TNFR2，并且可使受体与TNFα在空间上隔离，而不是允许TNFα结合至TNFR2引发TNFR2信号传
导，例如，通过结合呈反平行二聚体构象的TNFR2，其中TNFα结合位点在空间上是不可接近
的。这进而阻止TNFα使TNFR2的活化三聚体成核，所述成核触发TNFR2信号转导。因此，本发
明的抗体可用于遏制T-reg细胞的生长和增殖，从而允许例如可发动针对例如癌细胞或外
来病原体的免疫响应的T效应细胞的增殖。因此，本文所述的拮抗性TNFR2多肽可施用于哺
乳动物受试者，如患有细胞增殖病症或感染性疾病的人患者，以便增强患者的免疫响应(例
如，针对癌细胞或病原生物体的免疫响应)的有效性。
[0243] 对T-reg细胞增殖的影响
[0244] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可用于减弱T-reg细胞的活性(例如，增殖)，所述T-reg细胞通常伴随T细胞介导的针对自身细胞的细胞毒
性，如T淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击。拮抗性TNFR2抗体可施用于哺乳动物受试者，如人(例
如，通过本文所述的各种施用途径中的任一种)，以便延长适应性免疫响应(如针对癌细胞
或病原生物体的响应)的持续时间。以这种方式，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、
抗体或其抗原结合片段)可与现有技术协同增强用于癌症和感染性疾病的基于T淋巴细胞
的治疗。例如，可施用本发明的TNFR2拮抗剂以遏制T-reg细胞活性，由此增强肿瘤反应性T
细胞的细胞毒性作用。TNFR2拮抗剂还可与现有策略协同促进肿瘤反应性T细胞存活(如淋
巴细胞耗竭和生长因子疗法)，并且进而延长体内抗肿瘤反应性的持续时间。
性，如T淋巴细胞对肿瘤细胞的攻击。拮抗性TNFR2抗体可施用于哺乳动物受试者，如人(例
如，通过本文所述的各种施用途径中的任一种)，以便延长适应性免疫响应(如针对癌细胞
或病原生物体的响应)的持续时间。以这种方式，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、
抗体或其抗原结合片段)可与现有技术协同增强用于癌症和感染性疾病的基于T淋巴细胞
的治疗。例如，可施用本发明的TNFR2拮抗剂以遏制T-reg细胞活性，由此增强肿瘤反应性T
细胞的细胞毒性作用。TNFR2拮抗剂还可与现有策略协同促进肿瘤反应性T细胞存活(如淋
巴细胞耗竭和生长因子疗法)，并且进而延长体内抗肿瘤反应性的持续时间。
[0245] 拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)也可用于治疗哺乳动物受试者(例如人)中的多种传染性疾病，因为抑制T-reg增殖促进能够发动对病原生物体的
攻击的CD8+ T-淋巴细胞的活性。另外，本发明的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段可用
于治疗人或农业农场动物(例如，牛科哺乳动物、猪、奶牛、马、绵羊、山羊、猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠或其他非人哺乳动物)的各种感染性疾病，如结核分枝杆菌。
攻击的CD8+ T-淋巴细胞的活性。另外，本发明的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段可用
于治疗人或农业农场动物(例如，牛科哺乳动物、猪、奶牛、马、绵羊、山羊、猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠或其他非人哺乳动物)的各种感染性疾病，如结核分枝杆菌。
[0246] 对TNFR2+癌细胞的直接作用
[0247] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可结合癌细胞(如TNFR2+肿瘤细胞)表面上的TNFR2并使其失活。例如，本文所述的拮抗性TNFR2抗体及其
抗原结合片段可结合T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞等表面上的TNFR2。本发明的拮
抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段直接结合癌细胞上的TNFR2的能力提供了另一种途径，这
些分子可通过所述途径减弱癌细胞存活和增殖。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段(如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的抗体或其抗原结合片段)可
直接结合癌细胞(例如，皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或多发性骨髓瘤细
胞，如卵巢癌细胞)表面上的TNFR2以便遏制所述细胞增殖和/或促进细胞的细胞凋亡的能
力。
抗原结合片段可结合T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞等表面上的TNFR2。本发明的拮
抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段直接结合癌细胞上的TNFR2的能力提供了另一种途径，这
些分子可通过所述途径减弱癌细胞存活和增殖。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段(如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的抗体或其抗原结合片段)可
直接结合癌细胞(例如，皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或多发性骨髓瘤细
胞，如卵巢癌细胞)表面上的TNFR2以便遏制所述细胞增殖和/或促进细胞的细胞凋亡的能
力。
[0248] TNFR2拮抗剂多肽不依赖于额外的TNFR2结合剂获得活性
[0249] 值得注意的是，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)能够结合TNFR2并遏制TNFR2介导的信号传导而不需要内源性TNFR2结合剂，如TNFα。本发明
的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)不需要TNFα来减弱T-reg和/或
癌细胞增殖。不受机制的限制，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可表现出这种
性质，因为这些抗体或其抗原结合片段能够结合TNFR2并稳定这种受体的反平行二聚体构
象。这种结构构型不能加强NFκB信号传导。通过将TNFR2维持在无活性结构状态，本发明的
拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可阻止TNFR2激动剂恢复细胞生长。
的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)不需要TNFα来减弱T-reg和/或
癌细胞增殖。不受机制的限制，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可表现出这种
性质，因为这些抗体或其抗原结合片段能够结合TNFR2并稳定这种受体的反平行二聚体构
象。这种结构构型不能加强NFκB信号传导。通过将TNFR2维持在无活性结构状态，本发明的
拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可阻止TNFR2激动剂恢复细胞生长。
[0250] 例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可结合TNFR2+细胞，如T-reg细胞、癌细胞或骨髓源性抑制细胞(MDSC)表面上的TNFR2，并且在存在
或不存在TNFα的情况下抑制此类细胞的增殖。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多
肽、抗体及其抗原结合片段)可使此类细胞的增殖相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的
此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种细胞增殖测定中表现
出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα
不存在下在相同细胞增殖测定中所述拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结
合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、
6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。可用于测量TNFR2抗体的拮抗作用的细胞死亡测定的实
例在本文中，例如在下文的实施例9中进行了描述。类似地，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如
单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可使如通过测量选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、
TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达评估的TNFR2信号传
导相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种基因表达测定中表现出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值
(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα不存在下在相同基因表达测定中所述拮抗性
TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、
35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。可用于测量TNFR2抗体的拮抗作用的基因表达测定的实例在本文中，例如在下文的实施例12中进行了
描述。
或不存在TNFα的情况下抑制此类细胞的增殖。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多
肽、抗体及其抗原结合片段)可使此类细胞的增殖相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的
此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种细胞增殖测定中表现
出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα
不存在下在相同细胞增殖测定中所述拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结
合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、
6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。可用于测量TNFR2抗体的拮抗作用的细胞死亡测定的实
例在本文中，例如在下文的实施例9中进行了描述。类似地，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如
单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可使如通过测量选自由CHUK、NFKBIE、NFKBIA、MAP3K11、
TRAF2、TRAF3、relB和cIAP2/BIRC3组成的组的一种或多种基因的表达评估的TNFR2信号传
导相对于未用所述TNFR2拮抗剂多肽处理的此类细胞抑制例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可在这种基因表达测定中表现出在TNFα的存在或不存在下基本不变的IC50值
(例如，在TNFα存在下的IC50值相对于在TNFα不存在下在相同基因表达测定中所述拮抗性
TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的IC50值变化小于50％、45％、40％、
35％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％)。可用于测量TNFR2抗体的拮抗作用的基因表达测定的实例在本文中，例如在下文的实施例12中进行了
描述。
[0251] 直接杀死T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和MDSC
[0252] 本文公开的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)不仅能够减少T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC增殖，而且能够诱导样品内(例如，患者如人类患者
体内)的T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC的死亡。本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段可能能够使用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品(如从正经历针对
如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、癌细胞(如
皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌细胞或多发性骨髓瘤细胞)和/
或MDSC的总数量相对于未用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品减少例如1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
体内)的T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC的死亡。本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段可能能够使用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品(如从正经历针对
如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、癌细胞(如
皮肤T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌细胞或多发性骨髓瘤细胞)和/
或MDSC的总数量相对于未用拮抗剂TNFR2抗体或其抗原结合片段处理的样品减少例如1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
[0253] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)减弱T-reg、MDSC和/或癌细胞生长的能力可能部分由于这些抗体或抗原结合片段减少样品(例如，从正
经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的可溶性TNFR2
的数量的能力。在这种有益活性不存在的情况下，可溶性TNFR2可由例如T-reg细胞分泌，并
且否则可能通过结合并隔离细胞外环境中的此类拮抗剂来干扰TNFR2拮抗剂定位至T-reg
细胞、TNFR2+癌细胞或MDSC表面处的TNFR2的能力。通过减少TNFR2分泌，本发明的拮抗性
TNFR2抗体或其抗原结合片段可使T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC对治疗性分子，如拮
抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段和/或本文所述或本领域中已知的可与本发明的组合物
和方法结合使用的额外抗癌剂越来越敏感。
经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的可溶性TNFR2
的数量的能力。在这种有益活性不存在的情况下，可溶性TNFR2可由例如T-reg细胞分泌，并
且否则可能通过结合并隔离细胞外环境中的此类拮抗剂来干扰TNFR2拮抗剂定位至T-reg
细胞、TNFR2+癌细胞或MDSC表面处的TNFR2的能力。通过减少TNFR2分泌，本发明的拮抗性
TNFR2抗体或其抗原结合片段可使T-reg细胞、TNFR2+癌细胞和/或MDSC对治疗性分子，如拮
抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段和/或本文所述或本领域中已知的可与本发明的组合物
和方法结合使用的额外抗癌剂越来越敏感。
[0254] 活性(CD25高和CD45RA低)T-reg细胞的选择性调节
[0255] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可能能够抑制样品(例如，从正经历针对如本文所述的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中
的T-reg细胞的增殖或减少所述T-reg细胞的总数量，并且可在活跃分裂状态下选择性地作
高
用于T-reg细胞。本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可选择性地靶向表达CD25
和CD45RA低的活性T-reg细胞，例如超过表达CD25中和CD45RA高的静息T-reg细胞。例如，本发
明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可能能够使表达CD25高和CD45RA低的T-reg细胞的
增殖相对于不表达CD25高和CD45RA低蛋白的T-reg细胞(如表达CD25中和CD45RA高蛋白的T-reg
细胞)减少例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
的T-reg细胞的增殖或减少所述T-reg细胞的总数量，并且可在活跃分裂状态下选择性地作
高
用于T-reg细胞。本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可选择性地靶向表达CD25
和CD45RA低的活性T-reg细胞，例如超过表达CD25中和CD45RA高的静息T-reg细胞。例如，本发
明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可能能够使表达CD25高和CD45RA低的T-reg细胞的
增殖相对于不表达CD25高和CD45RA低蛋白的T-reg细胞(如表达CD25中和CD45RA高蛋白的T-reg
细胞)减少例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
[0256] 肿瘤微环境中的T-reg细胞、MDSC和T效应细胞的调节
[0257] 本文所述的拮抗剂TNFR2多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。本文
所述的拮抗剂TNFR2多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于不含癌细胞的
部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环
境中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来
确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可表现出用
于减少或抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细
胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7
倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、
40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的
细胞死亡测定的实例在本文中，例如在下文的实施例9中进行了描述。本文所述的多肽(如
单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制T-reg细胞的增殖，其效力在含有T细胞
淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多
发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前
述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
所述的拮抗剂TNFR2多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于不含癌细胞的
部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环
境中以更大的效力减少或抑制T-reg细胞的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来
确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可表现出用
于减少或抑制肿瘤微环境中T-reg细胞的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细
胞的部位中T-reg细胞的增殖的IC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7
倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、
40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的
细胞死亡测定的实例在本文中，例如在下文的实施例9中进行了描述。本文所述的多肽(如
单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可减少或抑制T-reg细胞的增殖，其效力在含有T细胞
淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多
发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前
述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
[0258] 另外或可替代地，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力减少或抑制MDSC的增殖。本文所
述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于不含癌细胞的部位(如患有癌
症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效
力减少或抑制MDSC的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来确定这种作用。例如，本
文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可具有的用于减少或抑制肿瘤微环
境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50
小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,
000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的细胞死亡测定的实例在本文中，例如
在下文的实施例9中进行了描述。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)
可减少或抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效力在含有霍奇金氏淋巴瘤细
胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓
瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中
的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于不含癌细胞的部位(如患有癌
症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)在肿瘤的微环境中以更大的效
力减少或抑制MDSC的增殖。可使用例如本文所述的细胞死亡测定来确定这种作用。例如，本
文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可具有的用于减少或抑制肿瘤微环
境中MDSC的增殖的IC50比所述多肽用于减少或抑制不含癌细胞的部位中MDSC的增殖的IC50
小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,
000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽的拮抗作用的细胞死亡测定的实例在本文中，例如
在下文的实施例9中进行了描述。本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)
可减少或抑制MDSC的增殖或者可促进MDSC的细胞凋亡，其效力在含有霍奇金氏淋巴瘤细
胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓
瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此类癌细胞的部位(如患有前述癌症中
的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部位)中更大。
[0259] 另外地或可替代地，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可相对于未患癌症的受试者在患有癌症的患者中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞
毒性T细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相
对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部
位)在肿瘤的微环境中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。可使用例如本
文所述的细胞增殖测定来确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可具有的用于扩增肿瘤微环境中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增不
含癌细胞的部位中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7
倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、
40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽对T效应细胞
的作用的细胞增殖测定的实例在本文中，例如在下文的实施例18中进行了描述。本文所述
的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T
细胞，其效力在含有\T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此
类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的
受试者中的部位)中更大。所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)可例如与存在于一种
或多种癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)上的抗原特异性地反应。
毒性T细胞。在一些实施方案中，本发明的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)相
对于不含癌细胞的部位(如患有癌症的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的受试者中的部
位)在肿瘤的微环境中以更大的效力扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T细胞。可使用例如本
文所述的细胞增殖测定来确定这种作用。例如，本文所述的多肽(如单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)可具有的用于扩增肿瘤微环境中的T效应细胞的EC50比所述多肽用于扩增不
含癌细胞的部位中的T效应细胞的EC50小例如1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7
倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、
40倍、45倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更多。可用于测量抗TNFR2多肽对T效应细胞
的作用的细胞增殖测定的实例在本文中，例如在下文的实施例18中进行了描述。本文所述
的多肽(如单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可直接扩增T效应细胞，如CD8+细胞毒性T
细胞，其效力在含有\T细胞淋巴瘤细胞(例如，霍奇金氏或皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞的肿瘤的微环境中比在不含此
类癌细胞的部位(如患有前述癌症中的一种或多种的患者中远离肿瘤的部位或未患癌症的
受试者中的部位)中更大。所述T效应细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)可例如与存在于一种
或多种癌细胞(如霍奇金氏淋巴瘤细胞、皮肤非霍奇金氏淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、卵
巢癌细胞、结肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或肾细胞癌细胞)上的抗原特异性地反应。
[0260] 全长TNFR2拮抗剂抗体的抗原结合片段的活性
[0261] 本发明的拮抗性TNFR2抗体可抑制例如T-reg、癌细胞和/或MDSC生长或者促进T效应细胞生长，其效力与此类抗体的抗原结合片段所表现出的效力相似。例如，除去本发明的
拮抗性TNFR2抗体的Fc区可能不会改变所述分子减弱样品(例如，从正经历针对如本文所述
的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的增
殖或减少所述T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的总数量的能力。本发明的拮抗性TNFR2抗体以
及其抗原结合片段可通过不同于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的途径起作用，在抗体依赖性
细胞毒性途径中需要Fc区来募集效应蛋白以诱导细胞死亡。另外，拮抗性TNFR2抗体或其抗
原结合片段在交联剂存在下可能不易丧失抑制能力。因此，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其
抗原结合片段可在多种同种型(如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)中或者以多种形式表现出治疗
活性，所述形式如单链多肽(例如，一个或多个CDR例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫
桥彼此共价结合的单链多肽)、单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片
段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗
原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其
抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗
体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。
拮抗性TNFR2抗体的Fc区可能不会改变所述分子减弱样品(例如，从正经历针对如本文所述
的癌症或感染性疾病的治疗的人患者分离的样品)中的T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的增
殖或减少所述T-reg细胞、MDSC和/或癌细胞的总数量的能力。本发明的拮抗性TNFR2抗体以
及其抗原结合片段可通过不同于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的途径起作用，在抗体依赖性
细胞毒性途径中需要Fc区来募集效应蛋白以诱导细胞死亡。另外，拮抗性TNFR2抗体或其抗
原结合片段在交联剂存在下可能不易丧失抑制能力。因此，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其
抗原结合片段可在多种同种型(如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)中或者以多种形式表现出治疗
活性，所述形式如单链多肽(例如，一个或多个CDR例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或二硫
桥彼此共价结合的单链多肽)、单克隆抗体或其抗原结合片段、多克隆抗体或其抗原结合片
段、人源化抗体或其抗原结合片段、灵长类化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗
原结合片段、多特异性抗体或其抗原结合片段、双重可变免疫球蛋白结构域、单价抗体或其
抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗
体、抗体样蛋白支架、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子以及串联scFv(taFv)。
[0262] 拮抗性TNFR2多肽的特异性结合性质
[0263] 本发明的多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)与人TNFR2的特异性结合可通过多种已建立的方法中的任一种来确定。亲和力可通过各种测量来定量地表示，包括实现体外
TNFα-TNFR2相互作用的半数最大抑制所需的抗体的浓度(IC50)和抗体-TNFR2复合物解离的
平衡常数(KD)。描述TNFR2与本发明抗体的相互作用的平衡常数KD是TNFR2-抗体复合物解离
反应成彼此不相互作用的溶剂分离的TNFR2和抗体分子的化学平衡常数。
TNFα-TNFR2相互作用的半数最大抑制所需的抗体的浓度(IC50)和抗体-TNFR2复合物解离的
平衡常数(KD)。描述TNFR2与本发明抗体的相互作用的平衡常数KD是TNFR2-抗体复合物解离
反应成彼此不相互作用的溶剂分离的TNFR2和抗体分子的化学平衡常数。
[0264] 本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)包括以小于100nM(例如，95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、
20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM)的KD值特异性地结合至TNFR2的那些。在一些实
施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)是以小于1nM(例如，(例
如，990pM、980pM、970pM、960pM、950pM、940pM、930pM、920pM、910pM、900pM、890pM、880pM、
870pM、860pM、850pM、840pM、830pM、820pM、810pM、800pM、790pM、780pM、770pM、760pM、
750pM、740pM、730pM、720pM、710pM、700pM、690pM、680pM、670pM、660pM、650pM、640pM、
630pM、620pM、610pM、600pM、590pM、580pM、570pM、560pM、550pM、540pM、530pM、520pM、
510pM、500pM、490pM、480pM、470pM、460pM、450pM、440pM、430pM、420pM、410pM、400pM、
390pM、380pM、370pM、360pM、350pM、340pM、330pM、320pM、310pM、300pM、290pM、280pM、
270pM、260pM、250pM、240pM、230pM、220pM、210pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、
150pM、140pM、130pM、120pM、110pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、
10pM、5pM或1pM)的KD值特异性结合至TNFR2的那些。
20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM)的KD值特异性地结合至TNFR2的那些。在一些实
施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)是以小于1nM(例如，(例
如，990pM、980pM、970pM、960pM、950pM、940pM、930pM、920pM、910pM、900pM、890pM、880pM、
870pM、860pM、850pM、840pM、830pM、820pM、810pM、800pM、790pM、780pM、770pM、760pM、
750pM、740pM、730pM、720pM、710pM、700pM、690pM、680pM、670pM、660pM、650pM、640pM、
630pM、620pM、610pM、600pM、590pM、580pM、570pM、560pM、550pM、540pM、530pM、520pM、
510pM、500pM、490pM、480pM、470pM、460pM、450pM、440pM、430pM、420pM、410pM、400pM、
390pM、380pM、370pM、360pM、350pM、340pM、330pM、320pM、310pM、300pM、290pM、280pM、
270pM、260pM、250pM、240pM、230pM、220pM、210pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、
150pM、140pM、130pM、120pM、110pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、
10pM、5pM或1pM)的KD值特异性结合至TNFR2的那些。
[0265] 本发明的多肽还可通过多种体外结合测定来表征。可用于确定抗TNFR2多肽的KD或IC50的实验的实例包括例如表面等离子体共振、等温滴定量热法、荧光各向异性和基于
ELISA的测定等。ELISA代表了用于分析抗体活性的特别有用的方法，因为此类测定通常需
要最小浓度的抗体。在典型的ELISA测定中进行分析的常见信号是发光，发光通常是与特异
性地结合一级抗体(例如，本发明的TNFR2抗体)的二级抗体缀合的过氧化物酶的活性的结
果。本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)能够结合TNFR2和源自其的表位，
如含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基142-146(KCRPG，如图2A和2B中所示)中的一个或多
个的表位，以及源自TNFR2的以可模拟这些氨基酸在天然蛋白质中的构象的方式在结构上
预组构各种残基的分离的肽。例如，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)
可结合含有SEQ ID NO:11、19、20、34-117、285或286中任一个的氨基酸序列的肽，或在SEQ
ID NO:7的位置80与130之间含有约10与约30个之间的连续或不连续氨基酸的肽。在直接
ELISA实验中，可例如通过分析在HRP底物(例如，2,2'-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸
盐)与结合至HRP缀合的二级抗体的抗原-抗体复合物一起孵育时发生的发光来定量这种结
合。例如，当在HRP底物存在下与表面固定的抗原和HRP缀合的二级抗体一起孵育时，本发明
的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可诱导约400吸光度单位或更多的发光响应
(参见例如，实施例3)。在一些实施方案中，所观察到的发光可以是约400至约900吸光度单
位(例如，400-900吸光度单位、500-800吸光度单位或600-700吸光度单位)。在一些实施方
案中，所观察到的发光可以是约600至约900吸光度单位(例如，600-900吸光度单位或700-
800吸光度单位)。
ELISA的测定等。ELISA代表了用于分析抗体活性的特别有用的方法，因为此类测定通常需
要最小浓度的抗体。在典型的ELISA测定中进行分析的常见信号是发光，发光通常是与特异
性地结合一级抗体(例如，本发明的TNFR2抗体)的二级抗体缀合的过氧化物酶的活性的结
果。本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)能够结合TNFR2和源自其的表位，
如含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基142-146(KCRPG，如图2A和2B中所示)中的一个或多
个的表位，以及源自TNFR2的以可模拟这些氨基酸在天然蛋白质中的构象的方式在结构上
预组构各种残基的分离的肽。例如，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)
可结合含有SEQ ID NO:11、19、20、34-117、285或286中任一个的氨基酸序列的肽，或在SEQ
ID NO:7的位置80与130之间含有约10与约30个之间的连续或不连续氨基酸的肽。在直接
ELISA实验中，可例如通过分析在HRP底物(例如，2,2'-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸
盐)与结合至HRP缀合的二级抗体的抗原-抗体复合物一起孵育时发生的发光来定量这种结
合。例如，当在HRP底物存在下与表面固定的抗原和HRP缀合的二级抗体一起孵育时，本发明
的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可诱导约400吸光度单位或更多的发光响应
(参见例如，实施例3)。在一些实施方案中，所观察到的发光可以是约400至约900吸光度单
位(例如，400-900吸光度单位、500-800吸光度单位或600-700吸光度单位)。在一些实施方
案中，所观察到的发光可以是约600至约900吸光度单位(例如，600-900吸光度单位或700-
800吸光度单位)。
[0266] 拮抗性TNFR2多肽的动力学性质
[0267] 除了TNFR2-多肽相互作用的热力学参数外，还有可能定量地表征本发明的多肽与TNFR2的动力学缔合和解离。这可例如通过根据已建立的程序监测抗体-抗原复合物形成的
速率来进行。例如，可使用表面等离子体共振(SPR)来确定抗体-TNFR2复合物的形成(kon)和
解离(koff)的速率常数。这些数据还使得能够计算抗体-TNFR2复合物解离的平衡常数(KD)，
因为这种单分子解离的平衡常数可表示为koff与kon值的比率。SPR是特别有利于确定受体-
抗体相互作用的动力学和热力学参数的技术，因为所述实验不需要通过连接化学标记来修
饰一种组分。相反，所述受体通常固定在固体金属表面上，所述表面用增加浓度的抗体溶液
脉冲处理。抗体-受体结合诱导金属表面处入射光的反射角失真，并且在将抗体引入系统
时，可将折射率随时间推移的这种变化拟合至建立的回归模型以计算抗体-受体相互作用
的缔合和解离速率常数。
速率来进行。例如，可使用表面等离子体共振(SPR)来确定抗体-TNFR2复合物的形成(kon)和
解离(koff)的速率常数。这些数据还使得能够计算抗体-TNFR2复合物解离的平衡常数(KD)，
因为这种单分子解离的平衡常数可表示为koff与kon值的比率。SPR是特别有利于确定受体-
抗体相互作用的动力学和热力学参数的技术，因为所述实验不需要通过连接化学标记来修
饰一种组分。相反，所述受体通常固定在固体金属表面上，所述表面用增加浓度的抗体溶液
脉冲处理。抗体-受体结合诱导金属表面处入射光的反射角失真，并且在将抗体引入系统
时，可将折射率随时间推移的这种变化拟合至建立的回归模型以计算抗体-受体相互作用
的缔合和解离速率常数。
[0268] 本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)在与TNFR2相互作用时可表现出高kon和低koff值，与高亲和力受体结合一致。例如，本发明的抗体可在TNFR2存在下表现
出大于104M-1s-1(例如，1.0x 104M-1s-1、1.5x 104M-1s-1、2.0x 104M-1s-1、2.5x 104M-1s-1、3.0x
104M-1s-1、3.5x 104M-1s-1、4.0x 104M-1s-1、4.5x 104M-1s-1、5.0x 104M-1s-1、5.5x 104M-1s-1、
6.0x 104M-1s-1、6.5x 104M-1s-1、7.0x 104M-1s-1、7.5x 104M-1s-1、8.0x 104M-1s-1、8.5x 104M-
1s-1、9.0x 104M-1s-1、9.5x 104M-1s-1、1.0x 105M-1s-1、1.5x 105M-1s-1、2.0x 105M-1s-1、2.5x
105M-1s-1、3.0x 105M-1s-1、3.5x 105M-1s-1、4.0x 105M-1s-1、4.5x 105M-1s-1、5.0x 105M-1s-1、
5.5x 105M-1s-1、6.0x 105M-1s-1、6.5x 105M-1s-1、7.0x 105M-1s-1、7.5x 105M-1s-1、8.0x 105M-
1s-1、8.5x 105M-1s-1、9.0x 105M-1s-1、9.5x 105M-1s-1或1.0x 106M-1s-1)的kon值。当与TNFR2结合时，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可表现出低koff值，因为这些多
肽能够以高亲和力与不同的TNFR2表位相互作用。这些表位内的残基与TFNR2形成强烈的分
子间接触，其用于减缓抗体-TNFR2复合物的解离。这种高受体亲和力表现在低koff值。例如，
本发明的抗体当与TNFR2复合时可表现出小于10-3s-1(例如，1.0x 10-3s-1、9.5x 10-4s-1、
9.0x 10-4s-1、8.5x 10-4s-1、8.0x 10-4s-1、7.5x 10-4s-1、7.0x 10-4s-1、6.5x 10-4s-1、6.0x
10-4s-1、5.5x 10-4s-1、5.0x 10-4s-1、4.5x 10-4s-1、4.0x 10-4s-1、3.5x 10-4s-1、3.0x 10-4s-1、-4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1
2.5x 10 s 、2.0x 10 s 、1.5x 10 s 、1.0x 10 s 、9.5x 10 s 、9.0x 10 s 、8.5x
10-5s-1、8.0x 10-5s-1、7.5x 10-5s-1、7.0x 10-5s-1、6.5x 10-5s-1、6.0x 10-5s-1、5.5x 10-5s-1、
5.0x 10-5s-1、4.5x 10-5s-1、4.0x 10-5s-1、3.5x 10-5s-1、3.0x 10-5s-1、2.5x 10-5s-1、2.0x
10-5s-1、1.5x 10-5s-1或1.0x 10-5s-1)的koff值。
出大于104M-1s-1(例如，1.0x 104M-1s-1、1.5x 104M-1s-1、2.0x 104M-1s-1、2.5x 104M-1s-1、3.0x
104M-1s-1、3.5x 104M-1s-1、4.0x 104M-1s-1、4.5x 104M-1s-1、5.0x 104M-1s-1、5.5x 104M-1s-1、
6.0x 104M-1s-1、6.5x 104M-1s-1、7.0x 104M-1s-1、7.5x 104M-1s-1、8.0x 104M-1s-1、8.5x 104M-
1s-1、9.0x 104M-1s-1、9.5x 104M-1s-1、1.0x 105M-1s-1、1.5x 105M-1s-1、2.0x 105M-1s-1、2.5x
105M-1s-1、3.0x 105M-1s-1、3.5x 105M-1s-1、4.0x 105M-1s-1、4.5x 105M-1s-1、5.0x 105M-1s-1、
5.5x 105M-1s-1、6.0x 105M-1s-1、6.5x 105M-1s-1、7.0x 105M-1s-1、7.5x 105M-1s-1、8.0x 105M-
1s-1、8.5x 105M-1s-1、9.0x 105M-1s-1、9.5x 105M-1s-1或1.0x 106M-1s-1)的kon值。当与TNFR2结合时，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可表现出低koff值，因为这些多
肽能够以高亲和力与不同的TNFR2表位相互作用。这些表位内的残基与TFNR2形成强烈的分
子间接触，其用于减缓抗体-TNFR2复合物的解离。这种高受体亲和力表现在低koff值。例如，
本发明的抗体当与TNFR2复合时可表现出小于10-3s-1(例如，1.0x 10-3s-1、9.5x 10-4s-1、
9.0x 10-4s-1、8.5x 10-4s-1、8.0x 10-4s-1、7.5x 10-4s-1、7.0x 10-4s-1、6.5x 10-4s-1、6.0x
10-4s-1、5.5x 10-4s-1、5.0x 10-4s-1、4.5x 10-4s-1、4.0x 10-4s-1、3.5x 10-4s-1、3.0x 10-4s-1、-4 -1 -4 -1 -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1
2.5x 10 s 、2.0x 10 s 、1.5x 10 s 、1.0x 10 s 、9.5x 10 s 、9.0x 10 s 、8.5x
10-5s-1、8.0x 10-5s-1、7.5x 10-5s-1、7.0x 10-5s-1、6.5x 10-5s-1、6.0x 10-5s-1、5.5x 10-5s-1、
5.0x 10-5s-1、4.5x 10-5s-1、4.0x 10-5s-1、3.5x 10-5s-1、3.0x 10-5s-1、2.5x 10-5s-1、2.0x
10-5s-1、1.5x 10-5s-1或1.0x 10-5s-1)的koff值。
[0269] TNFR2内由拮抗性TNFR2多肽结合的表位
[0270] 开发能够拮抗TNFR2的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)的困难之一一直是阐明TNFR2内参与拮抗性复合物形成的表位而不是促进信号转导的表位。本
发明部分基于TNFR2内当结合时促进受体拮抗作用的表位的发现。结合本发明的拮抗性
TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)并促进受体拮
抗作用的特别重要的表位是含有位于人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置142-146处的KCRPG
基序(SEQ ID NO:19)的一个或多个残基的那些表位。这些残基中的一个或多个位于可与本
发明的拮抗性TNFR2抗体相互作用的较大表位(例如，图2A中所示的SEQ ID NO:7的残基
142-149，和图2B中所示的SEQ ID NO:7的残基137-144)内。选择性地结合拮抗性TNFR2抗体
的那些残基的知识可用于使用文库筛选技术(例如本文所述或本领域中已知的那些技术)
鉴别并设计多种拮抗性TNFR2抗体以及其抗原结合片段。例如，含有KCRPG序列内的一个或
多个残基的肽(例如，人TNFR2内的LRKCRPGFGVA基序(SEQ ID NO:285))可用于筛选和选择
以高亲和力和选择性结合这些表位的抗体和抗体样支架。
发明部分基于TNFR2内当结合时促进受体拮抗作用的表位的发现。结合本发明的拮抗性
TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)并促进受体拮
抗作用的特别重要的表位是含有位于人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置142-146处的KCRPG
基序(SEQ ID NO:19)的一个或多个残基的那些表位。这些残基中的一个或多个位于可与本
发明的拮抗性TNFR2抗体相互作用的较大表位(例如，图2A中所示的SEQ ID NO:7的残基
142-149，和图2B中所示的SEQ ID NO:7的残基137-144)内。选择性地结合拮抗性TNFR2抗体
的那些残基的知识可用于使用文库筛选技术(例如本文所述或本领域中已知的那些技术)
鉴别并设计多种拮抗性TNFR2抗体以及其抗原结合片段。例如，含有KCRPG序列内的一个或
多个残基的肽(例如，人TNFR2内的LRKCRPGFGVA基序(SEQ ID NO:285))可用于筛选和选择
以高亲和力和选择性结合这些表位的抗体和抗体样支架。
[0271] 重要的是，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)能够选择性地结合TNFR2的含有KCRPG基序(SEQ ID NO:19)的一个或
多个残基的表位并且明显不表现出与含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60(KCSPG，
SEQ ID NO:12)的表位的特异性结合。表现出结合含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸
142-146的一个或多个残基的表位和含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60的表位的
能力的多肽已显示缺乏抑制(拮抗)活性。因此，TNFR2多肽区分这些表位并且与包含人
TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基142-146中的一个或多个的表位特异性地相互作用并且不以
与由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60组成的表位特异性结合而接合的能力表征本发
明的拮抗TNFR2信号传导的抗体。
多个残基的表位并且明显不表现出与含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60(KCSPG，
SEQ ID NO:12)的表位的特异性结合。表现出结合含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸
142-146的一个或多个残基的表位和含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60的表位的
能力的多肽已显示缺乏抑制(拮抗)活性。因此，TNFR2多肽区分这些表位并且与包含人
TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基142-146中的一个或多个的表位特异性地相互作用并且不以
与由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基56-60组成的表位特异性结合而接合的能力表征本发
明的拮抗TNFR2信号传导的抗体。
[0272] 除了SEQ ID NO:7的氨基酸142-146的一个或多个残基外，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)还可结合包含人
TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置130-149(KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV，SEQ ID NO:17)的至少五
个连续或不连续残基的较大表位的一个或多个残基，或表现出与此序列的至少85％序列同
一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有
保守氨基酸取代的表位。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体可特异性地结合含有人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的残基142-149(KCRPGFGV，SEQ ID NO:20)的表位，或表现出与此序列的至
少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位(只要
KCRPG序列的一个或多个残基存在于表位中)。另外或者可替代地，本发明的拮抗性TNFR2多
肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7
的残基137-144(CAPLRKCR，SEQ ID NO:11)的表位，或表现出与此序列的至少85％序列同一
性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位(只要KCRPG序列的一个
或多个残基存在于表位中)。
TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置130-149(KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV，SEQ ID NO:17)的至少五
个连续或不连续残基的较大表位的一个或多个残基，或表现出与此序列的至少85％序列同
一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有
保守氨基酸取代的表位。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体可特异性地结合含有人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的残基142-149(KCRPGFGV，SEQ ID NO:20)的表位，或表现出与此序列的至
少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位(只要
KCRPG序列的一个或多个残基存在于表位中)。另外或者可替代地，本发明的拮抗性TNFR2多
肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7
的残基137-144(CAPLRKCR，SEQ ID NO:11)的表位，或表现出与此序列的至少85％序列同一
性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位(只要KCRPG序列的一个
或多个残基存在于表位中)。
[0273] 除了KCRPG基序(SEQ ID NO:19)外，还已经发现人TNFR2内存在的促进受体拮抗作用的另一个重要表位含有SEQ ID NO:7的残基159-171(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID NO:286)。
因此，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可结合KCRPG序列
(SEQ ID NO:19)下游的含有例如人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置150-190
(ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSN TTSSTDICRPHQICNVVAI，SEQ ID NO:22)的至少五个连续或不连
续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、
99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。例如，在一
些实施方案中，拮抗性TNFR2多肽(例如，本发明的单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可
特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置161-169(CKPCAPGTF，SEQ ID NO:21)的
残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、
99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。本发明的拮
抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2
内的SEQ ID NO:7的位置140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID NO:285)的残基的表位，以及表现
出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。另外地或可替代地，本发明的拮抗
性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的位置159-171(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID N O:286)的残基的表位，以及表现
出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。
因此，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可结合KCRPG序列
(SEQ ID NO:19)下游的含有例如人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置150-190
(ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSN TTSSTDICRPHQICNVVAI，SEQ ID NO:22)的至少五个连续或不连
续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、
99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。例如，在一
些实施方案中，拮抗性TNFR2多肽(例如，本发明的单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可
特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置161-169(CKPCAPGTF，SEQ ID NO:21)的
残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、
99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。本发明的拮
抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2
内的SEQ ID NO:7的位置140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID NO:285)的残基的表位，以及表现
出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。另外地或可替代地，本发明的拮抗
性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可特异性地结合包含人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的位置159-171(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID N O:286)的残基的表位，以及表现
出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。
[0274] 除了上述表位外，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)还可特异性地结合人TNFR2内的包含人TNFR2内的SEQ ID
NO:7的位置75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRIC TCRPGWYCAL，SEQ
ID NO:13)的至少五个连续或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同
一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有
保守氨基酸取代的表位。本发明的抗TNFR2多肽还可特异性地结合人TNFR2内的包含人
TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置75-91(CDSCEDSTYTQLWNWVP，SEQ ID NO:14)的至少五个连续
或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、
95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。
在一些实施方案中，本发明的抗TNFR2多肽可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7
的位置80-86(DSTYTQL，SEQ ID NO:8)处的残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序
列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列
含有保守氨基酸取代的表位。本发明的拮抗性TNFR2多肽还可特异性地结合包含人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的位置86-103(LWNWVPECLSCGSRCSSD，SEQ ID NO:15)的至少五个连续或不
连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、
97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。在特
定情况下，本发明的抗体可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置91-98
(PECLSCGS，SEQ ID NO:9)的残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例
如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基
酸取代的表位。本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)还可特异性地结合包
含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置111-128(TREQNRICTCRPGWYCAL，SEQ ID NO:16)的至少
五个连续或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、
90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的
表位。在一些实施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性
地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置116-123(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)的残基的
表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或
100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。例如，本发明的拮
抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性结合含有人TNFR2内的SEQ
ID NO:7的残基116-123(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)和人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基137-
144(CAPLRKCR，SEQ ID NO:11)的表位。
NO:7的位置75-128(CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRIC TCRPGWYCAL，SEQ
ID NO:13)的至少五个连续或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同
一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有
保守氨基酸取代的表位。本发明的抗TNFR2多肽还可特异性地结合人TNFR2内的包含人
TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置75-91(CDSCEDSTYTQLWNWVP，SEQ ID NO:14)的至少五个连续
或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、
95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。
在一些实施方案中，本发明的抗TNFR2多肽可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7
的位置80-86(DSTYTQL，SEQ ID NO:8)处的残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序
列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列
含有保守氨基酸取代的表位。本发明的拮抗性TNFR2多肽还可特异性地结合包含人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的位置86-103(LWNWVPECLSCGSRCSSD，SEQ ID NO:15)的至少五个连续或不
连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、
97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。在特
定情况下，本发明的抗体可特异性地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置91-98
(PECLSCGS，SEQ ID NO:9)的残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例
如，85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基
酸取代的表位。本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)还可特异性地结合包
含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置111-128(TREQNRICTCRPGWYCAL，SEQ ID NO:16)的至少
五个连续或不连续残基的表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、
90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的
表位。在一些实施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性
地结合包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置116-123(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)的残基的
表位，以及表现出与此序列的至少85％序列同一性(例如，85％、90％、95％、97％、99％或
100％序列同一性)的表位和相对于此序列含有保守氨基酸取代的表位。例如，本发明的拮
抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可特异性结合含有人TNFR2内的SEQ
ID NO:7的残基116-123(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)和人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基137-
144(CAPLRKCR，SEQ ID NO:11)的表位。
[0275] 可用于预测本发明的TNFR2多肽的抑制活性的一种示例性程序是将所述抗体或抗体片段对含有KCRPG基序的肽(例如，具有序列LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)或
VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的线性肽)的亲和力与相同抗体或抗体片段对含有KCSPG
序列的肽(例如，具有序列QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18的线性肽)的亲和力进行
比较。例如，拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1特异性地结合由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基
130-149(KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV，SEQ ID NO:17)定义的肽片段，其亲和力比由人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18)定义的肽片段高40
倍。本发明的拮抗性TNFR2抗体和抗原结合片段结合含有KCRPG序列(SEQ ID NO:19)的一个
或多个残基的表位，例如其亲和力比相同抗体或抗原结合片段对含有人TNFR2的KCSPG序列
(SEQ ID NO:12)的肽的亲和力高至少10倍。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多
肽、抗体和抗原结合片段)可结合含有人TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:19)的一个或多个
残基的表位，其亲和力比相同抗体或抗原结合片段对含有人TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID
NO:12)的肽的亲和力高10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、
300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或超过1000倍。以类似的亲和力
(例如，亲和力差异小于10倍)结合含有KCRPG序列(人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸142-
146)的一个或多个残基的表位和含有KCSPG基序(人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸56-
60)的表位的抗体或抗体片段不被认为是本发明的拮抗性TNFR2抗体。
VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的线性肽)的亲和力与相同抗体或抗体片段对含有KCSPG
序列的肽(例如，具有序列QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18的线性肽)的亲和力进行
比较。例如，拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1特异性地结合由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基
130-149(KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV，SEQ ID NO:17)定义的肽片段，其亲和力比由人TNFR2内
的SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18)定义的肽片段高40
倍。本发明的拮抗性TNFR2抗体和抗原结合片段结合含有KCRPG序列(SEQ ID NO:19)的一个
或多个残基的表位，例如其亲和力比相同抗体或抗原结合片段对含有人TNFR2的KCSPG序列
(SEQ ID NO:12)的肽的亲和力高至少10倍。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多
肽、抗体和抗原结合片段)可结合含有人TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:19)的一个或多个
残基的表位，其亲和力比相同抗体或抗原结合片段对含有人TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID
NO:12)的肽的亲和力高10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、
300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或超过1000倍。以类似的亲和力
(例如，亲和力差异小于10倍)结合含有KCRPG序列(人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸142-
146)的一个或多个残基的表位和含有KCSPG基序(人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸56-
60)的表位的抗体或抗体片段不被认为是本发明的拮抗性TNFR2抗体。
[0276] 结合来自非人动物的TNFR2的拮抗性TNFR2多肽
[0277] 除了结合人TFNR2内含有KCRPG基序的表位外，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)还包括特异性地结合含有源
自非人动物的TNFR2内的等效基序的表位的那些，所述基序如源自非人哺乳动物的TNFR2内
(例如，从牛、野牛、小鼠或大鼠等获得的TNFR2中)的KCGPG基序(SEQ ID NO:287)。源自示例
性非人哺乳动物的TNFR2中的等效于人KCRPG基序的序列的位置在以下表2中示出：
自非人动物的TNFR2内的等效基序的表位的那些，所述基序如源自非人哺乳动物的TNFR2内
(例如，从牛、野牛、小鼠或大鼠等获得的TNFR2中)的KCGPG基序(SEQ ID NO:287)。源自示例
性非人哺乳动物的TNFR2中的等效于人KCRPG基序的序列的位置在以下表2中示出：
[0278] 表2.来自非人哺乳动物的TNFR2中的等效于KCRPG的序列的位置
[0279]
[0280] 源自上述非人哺乳动物的TNFR2内的可由拮抗性TNFR2多肽，如本发明的显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)结合表位在下文序列比对中说明。这
种序列比对示出来自人、牛、野牛、小鼠和大鼠的TNFR2的部分序列，以及与人KCRPG基序等
效的表位(以灰色突出显示)。
种序列比对示出来自人、牛、野牛、小鼠和大鼠的TNFR2的部分序列，以及与人KCRPG基序等
效的表位(以灰色突出显示)。
[0281]
[0282] 拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1
[0283] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可含有TNFRAB1(本文也称为TNFR2拮抗剂1)的CDR-H3序列，所述TNFRAB1是拮抗TNFRα-TNFR2相互作用的鼠
类抗体。例如，TNFRAB1的CDR-H3及其变体(例如，相对于此CDR-H3序列表现出保守氨基酸取
代的变体)可用于例如，使用本文所述或本领域中已知的抗体人源化方法来制备本发明的
拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
类抗体。例如，TNFRAB1的CDR-H3及其变体(例如，相对于此CDR-H3序列表现出保守氨基酸取
代的变体)可用于例如，使用本文所述或本领域中已知的抗体人源化方法来制备本发明的
拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
[0284] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)可表现出与TNFRAB1的结合性质相同或相似的结合性质。这些性质是如下：在TNFR2存在下，TNFRAB1表
现出在与TNFR2的复合中4.98x 106M-1s-1的高kon值，以及2.21x 10-4s-1的低koff值和约
44.4pM的KD。KCRPGFGV基序(SEQ ID NO:20)，并且特别是KCRPG序列(SEQ ID NO:19)已被鉴
别为与TNFRAB1建立分子间接触的功能性表位的特别重要的组分，如通过表位作图分析所
确定(图2和3)。这些残基与本发明的抗TNFR2抗体的相互作用选择性地促进拮抗活性。值得
注意的是，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸残基56-60(KCSPG，SEQ ID NO:12)的
TNFR2表位明显不是由本发明的TNFRAB1或拮抗性TNFR2抗体或抗体片段特异性结合的构象
表位的一部分，因为已经显示与这两种表位的特异性结合导致拮抗活性的丧失或显著降
低。因此，特异性地结合这两个表位(KCSPG和至少含有KCR序列的表位，并且更特别地，人
TNFR2的KCRPG序列)的TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)不被认为是本发
明的拮抗性TNFR2抗体。
现出在与TNFR2的复合中4.98x 106M-1s-1的高kon值，以及2.21x 10-4s-1的低koff值和约
44.4pM的KD。KCRPGFGV基序(SEQ ID NO:20)，并且特别是KCRPG序列(SEQ ID NO:19)已被鉴
别为与TNFRAB1建立分子间接触的功能性表位的特别重要的组分，如通过表位作图分析所
确定(图2和3)。这些残基与本发明的抗TNFR2抗体的相互作用选择性地促进拮抗活性。值得
注意的是，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸残基56-60(KCSPG，SEQ ID NO:12)的
TNFR2表位明显不是由本发明的TNFRAB1或拮抗性TNFR2抗体或抗体片段特异性结合的构象
表位的一部分，因为已经显示与这两种表位的特异性结合导致拮抗活性的丧失或显著降
低。因此，特异性地结合这两个表位(KCSPG和至少含有KCR序列的表位，并且更特别地，人
TNFR2的KCRPG序列)的TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原结合片段)不被认为是本发
明的拮抗性TNFR2抗体。
[0285] 除了结合序列KCRPGFGV(SEQ ID NO:20)内包含的表位外，TNFRAB1还结合由人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置161-169(CKPCAPGTF，SEQ ID NO:21)定义的序列内包含的下
游表位。本发明的TNFR2抗体和抗体片段还可结合此表位或TNFR2内含有此表位的较大区域
(例如，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置150-190(ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC
RPHQICNVVAI，SEQ ID NO:22)的至少五个连续或不连续残基的序列)。TNFRAB1含有两条重
链，以及两条轻链，如图1A和1B中所示。TNFRAB1的重链含有以下氨基酸序列(CDR以粗体表
示)：
游表位。本发明的TNFR2抗体和抗体片段还可结合此表位或TNFR2内含有此表位的较大区域
(例如，包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置150-190(ARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC
RPHQICNVVAI，SEQ ID NO:22)的至少五个连续或不连续残基的序列)。TNFRAB1含有两条重
链，以及两条轻链，如图1A和1B中所示。TNFRAB1的重链含有以下氨基酸序列(CDR以粗体表
示)：
[0286]
[0287] TNFRAB1轻链的序列是如下(CDR以粗体表示)：
[0288]
[0289] 拮抗性TNFR2抗体TNFRAB2
[0290] 本发明的拮抗性TNFR2抗体或抗体片段可含有例如TNFRAB2(本文中也称为TNFR2拮抗剂2)的CDR-H3序列，所述TNFRAB2是通过特异性地结合此受体内的各种表位而选择性
地结合和抑制TNFR2的抗体。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原
结合片段)可表现出与TNFRAB2的结合性质相同或相似的结合性质。这些性质是如下：在
TNFR2存在下，TNFRAB2表现出在与TNFR2的复合中3.6099x 105M-1s-1的高kon值，以及2.24x
10-4s-1的低koff值和约621pM的KD。含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基137-144(CAPLRKCR，
SEQ ID NO:11)的表位已被鉴别为与TNFRAB2建立分子间接触的功能性表位的特别重要的
组分，如通过表位作图分析所确定(参见例如，实施例1以及图2B和3B)。本发明包括TNFR2抗
体和特异性地结合此表位的抗体片段。
地结合和抑制TNFR2的抗体。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体和抗原
结合片段)可表现出与TNFRAB2的结合性质相同或相似的结合性质。这些性质是如下：在
TNFR2存在下，TNFRAB2表现出在与TNFR2的复合中3.6099x 105M-1s-1的高kon值，以及2.24x
10-4s-1的低koff值和约621pM的KD。含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的残基137-144(CAPLRKCR，
SEQ ID NO:11)的表位已被鉴别为与TNFRAB2建立分子间接触的功能性表位的特别重要的
组分，如通过表位作图分析所确定(参见例如，实施例1以及图2B和3B)。本发明包括TNFR2抗
体和特异性地结合此表位的抗体片段。
[0291] 除了结合含有残基CAPLRKCR(SEQ ID NO:11)的表位外，TNFRAB2还结合至包含人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置80-86(DSTYTQL，SEQ ID NO:8)、人TNFR2内的SEQ ID NO:7的
位置91-98(PECLSCGS，SEQ ID NO:9)以及人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置116-123
(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)内的一个或多个残基的表位。本发明的TNFR2抗体和抗体片段也
可结合这些表位中的一个或多个。可使用由TNFRAB2特异性结合的表位的知识来设计并鉴
别本发明的抗体和抗体片段。例如，可使用如本文所述或本领域中已知的多种体外肽展示
技术或组合抗体文库筛选中的任一种，以筛选能够以高亲和力和选择性结合这些表位的抗
体。
位置91-98(PECLSCGS，SEQ ID NO:9)以及人TNFR2内的SEQ ID NO:7的位置116-123
(RICTCRPG，SEQ ID NO:10)内的一个或多个残基的表位。本发明的TNFR2抗体和抗体片段也
可结合这些表位中的一个或多个。可使用由TNFRAB2特异性结合的表位的知识来设计并鉴
别本发明的抗体和抗体片段。例如，可使用如本文所述或本领域中已知的多种体外肽展示
技术或组合抗体文库筛选中的任一种，以筛选能够以高亲和力和选择性结合这些表位的抗
体。
[0292] TNFRAB2的重链和轻链CDR在以下示出：
[0293]
[0294] 如上所示，TNFRAB2的CDR-H1序列可在此区域的第八位置处含有亮氨酸或异亮氨酸残基。类似地，TNFRAB2CDR-L2可包含TYS或YTS三肽，并且TNFRAB2CDR-L3可在此区域的第
八位置处含有亮氨酸或异亮氨酸残基。值得注意的是，TNFRAB2的CDR-L2侧接N-末端框架残
基LLIR(SEQ ID NO:262)和C-末端框架残基TLE。因此，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单
链多肽、抗体和抗原结合片段)包括含有TNFRAB2的上述CDR中的一个或多个以及N末端LLIR
(SEQ ID NO:262)和侧接拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段的CDR-L2序列的C-末端TLE残
基的那些。
八位置处含有亮氨酸或异亮氨酸残基。值得注意的是，TNFRAB2的CDR-L2侧接N-末端框架残
基LLIR(SEQ ID NO:262)和C-末端框架残基TLE。因此，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单
链多肽、抗体和抗原结合片段)包括含有TNFRAB2的上述CDR中的一个或多个以及N末端LLIR
(SEQ ID NO:262)和侧接拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段的CDR-L2序列的C-末端TLE残
基的那些。
[0295] 拮抗性TNFR2抗体TNFR2A3
[0296] 本发明的代表性拮抗剂TNFR2抗体是TNFR2A3，其是一种通过用人TNFR2免疫小鼠并随后进行CDR诱变而发现的鼠类抗体。TNFR2A3的前体抗体从鼠类免疫实验被鉴别为
TNFR2结合抗体，其既不是TNFR2的拮抗剂也不是激动剂。使用重组基因表达技术，通过用
CDR-H3序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)替代前体鼠类抗体的CDR-H3序列来产生
TNFR2A3。在将此CDR-H3序列插入前体支架中后，所得TNFR2A3抗体能够表现出对TNFR2靶标
的拮抗作用。另外，发现TNFR2A3抗体结合人TNFR2内的表位，所述表位与由显性拮抗性
TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2结合的那些表位一致。如实施例15中所描述，TNFR2A3结合至
人TNFR2内的两个不同表位。第一表位跨越人TNFR2的残基140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID
NO:285)并含有KCRPG基序(SEQ ID NO:19)。第二表位是下游序列，其含有人TNFR2的残基
159-171(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID NO:286)。例如，本发明的显性拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段可表现出与TNFR2A3的结合性质相同或相似的结合性质。重要的是，TNFR2A3与
TNFR2内的这些表位的结合是位点特异性的，因为TNFR2A3抗体不结合含有不相关的远端氨
基酸序列的人TNFR2来源的肽(参见，例如，实施例15)。总的来说，这些发现证明了CDR-H3序
列关于TNFR2拮抗作用的两个显著特征：(i)拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3序列在很大程度上
决定了系统的抗原结合性质，并且(ii)CDR-H3基序是可被取代为抗TNFR2抗体的模块结构
域，所述抗TNFR2抗体未表现出拮抗活性以便赋予此类抗体TNFR2显性拮抗特征。
TNFR2结合抗体，其既不是TNFR2的拮抗剂也不是激动剂。使用重组基因表达技术，通过用
CDR-H3序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)替代前体鼠类抗体的CDR-H3序列来产生
TNFR2A3。在将此CDR-H3序列插入前体支架中后，所得TNFR2A3抗体能够表现出对TNFR2靶标
的拮抗作用。另外，发现TNFR2A3抗体结合人TNFR2内的表位，所述表位与由显性拮抗性
TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2结合的那些表位一致。如实施例15中所描述，TNFR2A3结合至
人TNFR2内的两个不同表位。第一表位跨越人TNFR2的残基140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID
NO:285)并含有KCRPG基序(SEQ ID NO:19)。第二表位是下游序列，其含有人TNFR2的残基
159-171(VVCKPCAPGTFSN，SEQ ID NO:286)。例如，本发明的显性拮抗性TNFR2抗体或其抗原
结合片段可表现出与TNFR2A3的结合性质相同或相似的结合性质。重要的是，TNFR2A3与
TNFR2内的这些表位的结合是位点特异性的，因为TNFR2A3抗体不结合含有不相关的远端氨
基酸序列的人TNFR2来源的肽(参见，例如，实施例15)。总的来说，这些发现证明了CDR-H3序
列关于TNFR2拮抗作用的两个显著特征：(i)拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3序列在很大程度上
决定了系统的抗原结合性质，并且(ii)CDR-H3基序是可被取代为抗TNFR2抗体的模块结构
域，所述抗TNFR2抗体未表现出拮抗活性以便赋予此类抗体TNFR2显性拮抗特征。
[0297] TNFR2亲和力和拮抗作用的分分子决定簇
[0298] 值得注意的是，在拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-H3区之间存在明显序列相似性。对这些抗体的CDR-H3序列所共有的残基的分析提供了对结合TNFR2
并表现出拮抗作用(如显性拮抗作用)的抗体的分子特征的了解。表位作图分析已经显示，
TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3都结合TNFR2内含有SEQ ID NO:7的残基142-146的表位并且不
结合含有SEQ ID NO:7的残基56-60的表位。相应的CDR-H3区之间的结构相似性为预测可保
持或增强TNFR2亲和力和拮抗作用(例如显性拮抗作用)的残基取代提供了基础。对这些抗
体的CDR-H3序列的检查证明，若干残基和物理化学特征是在整个此区域内保守的，而此CDR
内的其他位置可显著变化而不丧失亲和力和拮抗功能。TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-
H3序列在以下示出：
并表现出拮抗作用(如显性拮抗作用)的抗体的分子特征的了解。表位作图分析已经显示，
TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3都结合TNFR2内含有SEQ ID NO:7的残基142-146的表位并且不
结合含有SEQ ID NO:7的残基56-60的表位。相应的CDR-H3区之间的结构相似性为预测可保
持或增强TNFR2亲和力和拮抗作用(例如显性拮抗作用)的残基取代提供了基础。对这些抗
体的CDR-H3序列的检查证明，若干残基和物理化学特征是在整个此区域内保守的，而此CDR
内的其他位置可显著变化而不丧失亲和力和拮抗功能。TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-
H3序列在以下示出：
[0299]
[0300] 对TNFRAB1、TNFRAB2和TNFR2A3的CDR-H3序列的检查揭示了在整个此CDR中保守的精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基。值得注意的是，在剩余位置中
容许具有不同空间和静电性质的残基。例如，CDR-H3序列的第一位置容许具有差别大小和
氢键形成倾向的氨基酸残基，因为TNFRAB1中的CDR-H3的第一位置的特征是含有具有氢键
供体和受体部分的羧酰胺侧链的极性谷氨酰胺残基，而带有未官能化的甲基侧链的丙氨酸
残基在TNFRAB2和TNFR2A3的相应位置处发现。另外，上述CDR-H3序列中的第三位置的特征
是TNFRAB1中的疏水性缬氨酸和TNFRAB2的相应位置中的阴离子天冬氨酸部分。类似地，
TNFRAB1的CDR-H3的位置十和十一含有芳族系统，而TNFRAB2和TNFR2A3中的相应残基含有
极性和环状脂族取代基。
容许具有不同空间和静电性质的残基。例如，CDR-H3序列的第一位置容许具有差别大小和
氢键形成倾向的氨基酸残基，因为TNFRAB1中的CDR-H3的第一位置的特征是含有具有氢键
供体和受体部分的羧酰胺侧链的极性谷氨酰胺残基，而带有未官能化的甲基侧链的丙氨酸
残基在TNFRAB2和TNFR2A3的相应位置处发现。另外，上述CDR-H3序列中的第三位置的特征
是TNFRAB1中的疏水性缬氨酸和TNFRAB2的相应位置中的阴离子天冬氨酸部分。类似地，
TNFRAB1的CDR-H3的位置十和十一含有芳族系统，而TNFRAB2和TNFR2A3中的相应残基含有
极性和环状脂族取代基。
[0301] 总之，上述CDR-H3序列的共有结构特征提供了对选择性地结合TNFR2内的促进受体拮抗作用(例如，显性受体拮抗作用)的残基来说重要的残基的了解，所述残基如人TNFR2
的残基140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID NO:285)和人TNFR2的残基159-171(VVCKPCAPGTFSN，
SEQ ID NO:286)，并且证明可改变其他氨基酸、同时保留亲和力和显性拮抗活性。例如，本
发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片
段)可含有由式JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5或JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2表示的CDR-H3，其中
1
每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然
存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z3
独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸，每个Z4独立地是甘
氨酸或丙氨酸，并且每个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
的残基140-150(LRKCRPGFGVA，SEQ ID NO:285)和人TNFR2的残基159-171(VVCKPCAPGTFSN，
SEQ ID NO:286)，并且证明可改变其他氨基酸、同时保留亲和力和显性拮抗活性。例如，本
发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片
段)可含有由式JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5或JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2表示的CDR-H3，其中
1
每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然
存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z3
独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸，每个Z4独立地是甘
氨酸或丙氨酸，并且每个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
[0302] 类似地，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可含有由式JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3
(SEQ ID NO:279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ
ID NO:266)表示的CDR-H3。例如，CDR-H3可源自TNFRAB1并且具有氨基酸序列
QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。CDR-H3可源自TNFRAB2并且具有氨基酸序列
ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨
基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
(SEQ ID NO:279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ
ID NO:266)表示的CDR-H3。例如，CDR-H3可源自TNFRAB1并且具有氨基酸序列
QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。CDR-H3可源自TNFRAB2并且具有氨基酸序列
ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨
基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)。
[0303] 除了上述CDR-H3序列外，其他CDR序列可包含于本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)中。可例如通过TNFRAB1和
TNFRAB2的CDR序列的比对来确定促进显性TNFR2拮抗作用的额外CDR序列。例如，TNFRAB1和
TNFRAB2的CDR-H1序列在以下示出：
TNFRAB2的CDR序列的比对来确定促进显性TNFR2拮抗作用的额外CDR序列。例如，TNFRAB1和
TNFRAB2的CDR-H1序列在以下示出：
[0304]
[0305] 所述序列的比对揭示了共享的GXTFXXY基序，其中“X”表示任何氨基酸。这些CDR-H1序列的特征是在第一位置处的保守甘氨酸残基以及分别在第三、第四和第七位置处的保
守苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸残基。对这些序列的检查证明CDR-H1区在剩余位置容许取代。
例如，在第二位置容许具有不同极性的侧链，因为含有未取代且疏水性的苯基部分的苯丙
氨酸和含有质子羟基取代基的酪氨酸两者分别在TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-H1区中的此位
置中发现。另外，虽然第五和第六位置被TNFRAB1的CDR-H1中的极性丝氨酸残基占据，但这
些位置的特征是TNFRAB2中的含有额外疏水性甲基取代基的苏氨酸和在生理pH下为阴离子
的天冬氨酸。这种多样性证明这些位置可被具有不同静电性质的氨基酸取代而不丧失
TNFR2亲和力和拮抗作用。
守苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸残基。对这些序列的检查证明CDR-H1区在剩余位置容许取代。
例如，在第二位置容许具有不同极性的侧链，因为含有未取代且疏水性的苯基部分的苯丙
氨酸和含有质子羟基取代基的酪氨酸两者分别在TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-H1区中的此位
置中发现。另外，虽然第五和第六位置被TNFRAB1的CDR-H1中的极性丝氨酸残基占据，但这
些位置的特征是TNFRAB2中的含有额外疏水性甲基取代基的苏氨酸和在生理pH下为阴离子
的天冬氨酸。这种多样性证明这些位置可被具有不同静电性质的氨基酸取代而不丧失
TNFR2亲和力和拮抗作用。
[0306] 对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-H2区的序列分析类似地揭示了在整个这些区域中的不同位置处的一组保守氨基酸：
[0307]
[0308] 对此序列比对的分析证明CDR-H2序列在CDR-H2区的C-末端表现出保守的GS基序，在剩余位置容许具有可变分子大小、极性和静电荷的侧链。
[0309] 类似的分析揭示了TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L序列所共有的分子特征。例如，TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L1序列在以下示出：
[0310]
[0311] 对这些序列的检查揭示了含羟基的酪氨酸残基是CDR-L1的最终位置处的特征，而在剩余位置容许具有不同物理化学性质的残基。类似地，对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L2区
的分析揭示了两个区中最终位置处的保守氨基酸：
的分析揭示了两个区中最终位置处的保守氨基酸：
[0312]
[0313] 对上述序列比对的分析证明，丝氨酸残基是这些CDR-L2序列的第三位置处的特征，而在剩余残基处广泛容许取代。类似地，TNRAB1和TNFRAB2的CDR-L3序列是如下：
[0314]
[0315] 对TNFRAB1和TNFRAB2的CDR-L3序列的分析揭示了在这些区内的不同位置处对酪氨酸和苏氨酸残基的偏好，而在其他位置容许具有广泛物理化学特征的氨基酸，包括具有
阳离子侧链(Arg)、构象限制的侧链(Pro)和不同极性的侧链(例如，Gln、Asn、Leu和Val)的
残基。总之，上述CDR-H和CDR-L序列的共有结构特征提供了对以反平行二聚体构型选择性
地结合TNFR2的KCRPG表位(SEQ ID NO:7的位置142-146位，如SEQ ID NO:19中所示)的一个
或多个残基来说重要的那些残基的了解，并且证明某些氨基酸可在保持亲和力和显性拮抗
活性的同时变化。
阳离子侧链(Arg)、构象限制的侧链(Pro)和不同极性的侧链(例如，Gln、Asn、Leu和Val)的
残基。总之，上述CDR-H和CDR-L序列的共有结构特征提供了对以反平行二聚体构型选择性
地结合TNFR2的KCRPG表位(SEQ ID NO:7的位置142-146位，如SEQ ID NO:19中所示)的一个
或多个残基来说重要的那些残基的了解，并且证明某些氨基酸可在保持亲和力和显性拮抗
活性的同时变化。
[0316] 因此，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有含有上述共有序列的重链和轻链CDR。例如，本发明的TNFR2拮抗
剂可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4JZ3Z5(J)2Z5J；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基
酸序列(J)5Z4Z3J；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Z5；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基
3 5 3
酸序列(J)2Z ；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Z(J)4Z ；其中每个J独立地是
天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z3独立地是含有
在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨
5
酸；并且每个Z独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
剂可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4JZ3Z5(J)2Z5J；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基
酸序列(J)5Z4Z3J；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列(J)5Z5；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基
3 5 3
酸序列(J)2Z ；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列(J)3Z(J)4Z ；其中每个J独立地是
天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；
每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z3独立地是含有
在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨
5
酸；并且每个Z独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
[0317] 在一些实施方案中，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GJTF
(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；CDR-L1，所述CDR-L1
具有氨基酸序列(J)5Y；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；和/或CDR-L3，所述CDR-
L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T；其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
(J)2YJ(SEQ ID NO:277)；CDR-H2，所述CDR-H2具有氨基酸序列(J)5GSJ；CDR-L1，所述CDR-L1
具有氨基酸序列(J)5Y；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列(J)2S；和/或CDR-L3，所述CDR-
L3具有氨基酸序列(J)3Y(J)4T；其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
[0318] 本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列Z4YZ3Z5TDZ5X；CDR-H2，所述CDR-
H2具有氨基酸序列VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列
QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；和/或CDR-L3，
所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；其中每个Z1独立地是含有在生
理pH下的阳离子侧链的氨基酸；每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸
或丙氨酸；每个Z5独立地是含有疏水性侧链的氨基酸；并且每个X独立地是亮氨酸或异亮氨
酸。
H2具有氨基酸序列VDPEYZ4Z3T(SEQ ID NO:264)；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列
QNINKZ5(SEQ ID NO:268)；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYZ3或YTZ3；和/或CDR-L3，
所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQZ5VNLXZ3(SEQ ID NO:271)；其中每个Z1独立地是含有在生
理pH下的阳离子侧链的氨基酸；每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的氨基酸；
每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸
或丙氨酸；每个Z5独立地是含有疏水性侧链的氨基酸；并且每个X独立地是亮氨酸或异亮氨
酸。
[0319] 在一些实施方案中，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列GYTFTDYX
(SEQ ID NO:257)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-H2，所述
CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸
取代的氨基酸序列；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或相对
于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS
或YTS；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或相对于此
序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列。
(SEQ ID NO:257)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-H2，所述
CDR-H2具有氨基酸序列VDPEYGST(SEQ ID NO:258)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸
取代的氨基酸序列；CDR-L1，所述CDR-L1具有氨基酸序列QNINKY(SEQ ID NO:260)，或相对
于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；CDR-L2，所述CDR-L2具有氨基酸序列TYS
或YTS；和/或CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLXT(SEQ ID NO:261)，或相对于此
序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0320] 例如，在一些实施方案中，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可具有CDR-H1，所述CDR-H1具有氨基酸序列
GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；和
CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)，或相对于此序列具有至
多两个氨基酸取代的氨基酸序列。本发明部分基于以下发现：CDR-H1和CDR-L3区的这种特
定组合促进活化的T-reg细胞的选择性杀死并且加强增强的T效应细胞增殖。如本文所述，
这些表型对于治疗癌症和感染性疾病是有益的，因为在患有此类病理的患者中耗竭活化的
T-reg细胞群体的能力可减轻细胞毒性CD8+ T细胞的衰减，从而使效应细胞能够发动针对
癌细胞和感染性细胞的免疫响应(参见例如，实施例17)。
GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)，或相对于此序列具有至多两个氨基酸取代的氨基酸序列；和
CDR-L3，所述CDR-L3具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)，或相对于此序列具有至
多两个氨基酸取代的氨基酸序列。本发明部分基于以下发现：CDR-H1和CDR-L3区的这种特
定组合促进活化的T-reg细胞的选择性杀死并且加强增强的T效应细胞增殖。如本文所述，
这些表型对于治疗癌症和感染性疾病是有益的，因为在患有此类病理的患者中耗竭活化的
T-reg细胞群体的能力可减轻细胞毒性CD8+ T细胞的衰减，从而使效应细胞能够发动针对
癌细胞和感染性细胞的免疫响应(参见例如，实施例17)。
[0321] 人源化、灵长类化和嵌合抗体
[0322] 本发明的抗体包括人、人源化、灵长类化和嵌合抗体，所述抗体含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于这些CDR-H3序列含
有保守突变的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或
100％序列同一性)的CDR-H3。本发明的抗体还包括人、人源化、灵长类化和嵌合抗体，所述
抗体含有TNFRAB1、TNFAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于这些
CDR-H3序列含有保守突变的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、
97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3。例如，本发明的抗体还包括人、人源化、灵长类化
和嵌合抗体，所述抗体含有除了保守氨基酸取代外与TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3
相同的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化、灵长类化或嵌合抗体可含有TNFRAB1、TNFRAB2
或TNFR2A3的CDR-H3，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于这些CDR-H3序列含有保守突变
的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的CDR。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体可通过将以CDR-H3序列中的任一个掺入人抗体
的框架区(例如，FW1、FW2、FW3和FW4)中来产生。可用于开发含有以上CDR中的一个或多个的
人源化抗TNFR2抗体的示例性框架区包括但不限于在美国专利号7,732,578、美国专利号8,
093,068和WO 2003/105782中描述的那些；所述专利以引用的方式并入本文。
有保守突变的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或
100％序列同一性)的CDR-H3。本发明的抗体还包括人、人源化、灵长类化和嵌合抗体，所述
抗体含有TNFRAB1、TNFAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于这些
CDR-H3序列含有保守突变的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、
97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3。例如，本发明的抗体还包括人、人源化、灵长类化
和嵌合抗体，所述抗体含有除了保守氨基酸取代外与TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3
相同的CDR-H3。在一些实施方案中，人源化、灵长类化或嵌合抗体可含有TNFRAB1、TNFRAB2
或TNFR2A3的CDR-H3，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于这些CDR-H3序列含有保守突变
的序列中的任一个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一
性)的CDR。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体可通过将以CDR-H3序列中的任一个掺入人抗体
的框架区(例如，FW1、FW2、FW3和FW4)中来产生。可用于开发含有以上CDR中的一个或多个的
人源化抗TNFR2抗体的示例性框架区包括但不限于在美国专利号7,732,578、美国专利号8,
093,068和WO 2003/105782中描述的那些；所述专利以引用的方式并入本文。
[0323] 可用于设计本发明的人源化抗体的一种策略是将拮抗性TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的重链可变区和轻链可变区的序列与共有人抗体的重链可变区和轻链
可变区进行比对。共有人抗体重链和轻链序列是本领域中已知的(参见例如，“VBASE”人种
系序列数据库；还参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,
第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；Tomlinson等人,
J.Mol.Biol.227:776-98,1992；以及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；所述文献
以引用的方式并入本文)。以这种方式，可通过序列比对鉴别可变结构域框架残基和CDR(参
见Kabat，同上)。例如，可用拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3)取代共有人抗体的CDR-H3，以产生人源化TNFR2拮抗剂抗体。共有人抗体的示例性
可变结构域包含在美国专利号6,054,297中鉴别的重链可变结构域：
可变区进行比对。共有人抗体重链和轻链序列是本领域中已知的(参见例如，“VBASE”人种
系序列数据库；还参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,
第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；Tomlinson等人,
J.Mol.Biol.227:776-98,1992；以及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；所述文献
以引用的方式并入本文)。以这种方式，可通过序列比对鉴别可变结构域框架残基和CDR(参
见Kabat，同上)。例如，可用拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3)取代共有人抗体的CDR-H3，以产生人源化TNFR2拮抗剂抗体。共有人抗体的示例性
可变结构域包含在美国专利号6,054,297中鉴别的重链可变结构域：
[0324]
[0325] 和轻链可变结构域：
[0326]
[0327] ；所述专利以引用的方式并入本文(以粗体示出的CDR是根据Chothia,等人,J.Mol.Biol,196:901-917,1987的方法所确定)。这些氨基酸取代可例如通过使用本领域已
知的或本文描述的方法在宿主细胞中重组表达编码人源化抗体的重链和轻链的多核苷酸
来进行。
知的或本文描述的方法在宿主细胞中重组表达编码人源化抗体的重链和轻链的多核苷酸
来进行。
[0328] 类似地，这种策略也可用于产生灵长类化的抗TNFR2抗体，因为可用例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3取代例如灵长类动物抗体共有序列的CDR-H3。共有灵长类动物
抗体序列是本领域中已知的(参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780；
所述专利以引用的方式并入本文)。
抗体序列是本领域中已知的(参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780；
所述专利以引用的方式并入本文)。
[0329] 在一些实施方案中，除了来自TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的CDR序列外，可能希望将特定框架残基输入人抗体的重链和/或轻链可变结构域中。例如，美国专
利号6,054,297鉴别了在所得人源化抗体中保留来自特定抗体重链或轻链可变区的某些框
架残基可能是有利的几种情况。在一些实施方案中，框架残基可参与与抗原的非共价相互
作用并且因此有助于抗体对靶抗原的亲和力。在其他情况下，单个框架残基可调节CDR的构
象，并且因此间接影响抗体与抗原的相互作用。或者，某些框架残基可在VH与VL结构域之间
形成界面并且因此可有助于整体抗体结构。在其他情况下，框架残基可构成功能性糖基化
位点(例如，Asn-X-Ser/Thr)，所述位点可在与碳水化合物部分连接后决定抗体结构和抗原
亲和力。在如上文所述的那些的情况下，将TNFR2拮抗剂抗体(例如TNFRAB1、TNFRAB2或
TNFR2A3)的某些框架残基保留在本发明的拮抗性抗体及其抗原结合片段(如人源化抗体)
中可能是有益的，因为各种框架残基可促进所述抗体或其抗原结合片段的高表位亲和力和
改善的生物化学活性。
利号6,054,297鉴别了在所得人源化抗体中保留来自特定抗体重链或轻链可变区的某些框
架残基可能是有利的几种情况。在一些实施方案中，框架残基可参与与抗原的非共价相互
作用并且因此有助于抗体对靶抗原的亲和力。在其他情况下，单个框架残基可调节CDR的构
象，并且因此间接影响抗体与抗原的相互作用。或者，某些框架残基可在VH与VL结构域之间
形成界面并且因此可有助于整体抗体结构。在其他情况下，框架残基可构成功能性糖基化
位点(例如，Asn-X-Ser/Thr)，所述位点可在与碳水化合物部分连接后决定抗体结构和抗原
亲和力。在如上文所述的那些的情况下，将TNFR2拮抗剂抗体(例如TNFRAB1、TNFRAB2或
TNFR2A3)的某些框架残基保留在本发明的拮抗性抗体及其抗原结合片段(如人源化抗体)
中可能是有益的，因为各种框架残基可促进所述抗体或其抗原结合片段的高表位亲和力和
改善的生物化学活性。
[0330] 本发明的抗体还包括抗体片段、Fab结构域、F(ab')分子、F(ab’)2分子、单链可变片段(scFv)、串联scFv片段、双抗体、三抗体、双重可变结构域免疫球蛋白、多特异性抗体、
双特异性抗体以及异种特异性抗体，所述异种特异性抗体含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3
的CDR-H3(例如，QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)或
ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284))或表现出与这些CDR-H3序列中的任一个的至少85％序
列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3。本发明的抗体及其
抗原结合片段包含相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列还含有具有一与三个
之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的CDR-H3序列的那些。这些分子可例如通过
使用本文所述或本领域中已知的技术将编码这些蛋白质的多核苷酸掺入表达载体中以用
于在真核或原核细胞中转染而重组表达或者例如通过本文所述或本领域中已知的固相肽
合成方法化学地合成。
双特异性抗体以及异种特异性抗体，所述异种特异性抗体含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3
的CDR-H3(例如，QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)或
ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284))或表现出与这些CDR-H3序列中的任一个的至少85％序
列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3。本发明的抗体及其
抗原结合片段包含相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列还含有具有一与三个
之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的CDR-H3序列的那些。这些分子可例如通过
使用本文所述或本领域中已知的技术将编码这些蛋白质的多核苷酸掺入表达载体中以用
于在真核或原核细胞中转染而重组表达或者例如通过本文所述或本领域中已知的固相肽
合成方法化学地合成。
[0331] 本发明的多肽另外包含抗体样支架，所述支架含有例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列，或表现出与这些CDR-H3序列或相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TFNR2A3
的CDR-H3序列含有一与三个之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的序列中的任一
个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3序
列。抗体样支架的实例包括含有第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)的蛋白质，所述结构域含
有类似于经典抗体的BC、DE和FG结构环。已经显示10Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的
可变区的三级结构，并且本领域技术人员可通过用TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3的
残基替代10Fn3的BC、DE和FG环的残基来将例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或与
这些CDR-H3序列或相对于这些CDR-H3序列含有保守氨基酸取代的序列中的任一个具有至
少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的序列移植到纤连蛋
10
白支架上。这可通过在原核或真核细胞中重组表达修饰的 Fn3结构域来实现(例如，使用本
文所述的载体和技术)。使用10Fn3结构域作为抗体样支架以用于将来自抗体的CDR移植到
BC、DE和FG结构环上的实例在WO 2000/034784、WO 2009/142773、WO 2012/088006和美国专
利号8,278,419中进行报道；所述专利以引用的方式并入本文。
的CDR-H3序列含有一与三个之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的序列中的任一
个的至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的CDR-H3序
列。抗体样支架的实例包括含有第十纤连蛋白III型结构域(10Fn3)的蛋白质，所述结构域含
有类似于经典抗体的BC、DE和FG结构环。已经显示10Fn3结构域的三级结构类似于IgG重链的
可变区的三级结构，并且本领域技术人员可通过用TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3的
残基替代10Fn3的BC、DE和FG环的残基来将例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或与
这些CDR-H3序列或相对于这些CDR-H3序列含有保守氨基酸取代的序列中的任一个具有至
少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的序列移植到纤连蛋
10
白支架上。这可通过在原核或真核细胞中重组表达修饰的 Fn3结构域来实现(例如，使用本
文所述的载体和技术)。使用10Fn3结构域作为抗体样支架以用于将来自抗体的CDR移植到
BC、DE和FG结构环上的实例在WO 2000/034784、WO 2009/142773、WO 2012/088006和美国专
利号8,278,419中进行报道；所述专利以引用的方式并入本文。
[0332] 拮抗性TNFR2单链多肽
[0333] 本发明的TNFR2拮抗剂可呈单链多肽的形式，如含有本文所述的CDR-H3区(例如，TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3区)的单链多肽，任选地与源自表型-中性TNFR2抗体
(即，既不是TNFR2活化的拮抗剂也不是激动剂的抗体)的CDR组合。单链多肽可呈抗体片段
的形式，例如本文所述或本领域中已知的抗体片段，如scFv片段。单链多肽可以可替代地含
有使用本领域中已知的常规键形成技术，例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或通过接头(如
本文所述或本领域中已知的肽接头或多价亲电子试剂(例如双(溴甲基)芳烃衍生物，如双
(溴甲基)苯或双(溴甲基)吡啶))彼此共价结合的本文所述的一个或多个CDR。
(即，既不是TNFR2活化的拮抗剂也不是激动剂的抗体)的CDR组合。单链多肽可呈抗体片段
的形式，例如本文所述或本领域中已知的抗体片段，如scFv片段。单链多肽可以可替代地含
有使用本领域中已知的常规键形成技术，例如通过酰胺键、硫醚键、碳-碳键或通过接头(如
本文所述或本领域中已知的肽接头或多价亲电子试剂(例如双(溴甲基)芳烃衍生物，如双
(溴甲基)苯或双(溴甲基)吡啶))彼此共价结合的本文所述的一个或多个CDR。
[0334] 例如，本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3区，所述CDR-H3区含有促进与TNFR2表位的选择性结合的上述共有序列之一，如KCRPG基序(SEQ ID NO:19)，并且诱导
TNFR2拮抗作用。例如，本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3，所述CDR-H3具有氨基
酸序列JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5或JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2，其中每个J独立地是天然存
在的氨基酸；每个Z1独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z2独
立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z3独立地是含有在生理pH
下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且每
个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
TNFR2拮抗作用。例如，本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3，所述CDR-H3具有氨基
酸序列JZ1JZ2Z4JZ3JZ5(J)2Z5Z2Z5或JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2，其中每个J独立地是天然存
在的氨基酸；每个Z1独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z2独
立地是含有在生理pH下的阴离子侧链的天然存在的氨基酸；每个Z3独立地是含有在生理pH
下的极性不带电荷的侧链的天然存在的氨基酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；并且每
个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然存在的氨基酸。
[0335] 在一些实施方案中，本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3，所述CDR-H3具有氨基酸序列JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)或JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)，
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
其中每个J独立地是天然存在的氨基酸。
[0336] 本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3，所述CDR-H3具有氨基酸序列QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)，其中
1 2
每个Z独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；每个Z 独立地是含有在生理pH下
的阴离子侧链的氨基酸；每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基
酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；每个Z5独立地是含有疏水性侧链的氨基酸；并且每个X
独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
1 2
每个Z独立地是含有在生理pH下的阳离子侧链的氨基酸；每个Z 独立地是含有在生理pH下
的阴离子侧链的氨基酸；每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的氨基
酸；每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸；每个Z5独立地是含有疏水性侧链的氨基酸；并且每个X
独立地是亮氨酸或异亮氨酸。
[0337] 在一些实施方案中，本发明的拮抗性TNFR2单链多肽可具有CDR-H3，所述CDR-H3具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)、ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)或相对
于这些序列具有至多两个氨基酸取代(例如，一个或两个氨基酸取代，如保守氨基酸取代)
的氨基酸序列。
于这些序列具有至多两个氨基酸取代(例如，一个或两个氨基酸取代，如保守氨基酸取代)
的氨基酸序列。
[0338] 单链多肽可通过多种重组和合成技术，如通过本文所述或本领域中已知的重组基因表达或固相肽合成程序来产生。例如，本领域技术人员可设计编码例如在框内彼此可操
作地连接的两个或更多个CDR的多核苷酸，以产生含有这些CDR的连续单链肽。任选地，所述
CDR可通过间隔区，如通过框架区(例如，本文所述的框架序列或人抗体的种系共有序列的
框架区)或柔性接头(如本文所述或本领域中已知的聚甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸接头)隔开。
当通过化学合成方法产生时，天然化学连接可任选地用作合成长肽(例如，大于50个氨基
酸)的策略。天然化学连接方案是本领域中已知的并且已例如由Dawson等人(Science,266:
776-779,1994)描述；所述文献以引用的方式并入本文。用于产生单链多肽、全长抗体和抗
体片段的技术的详细描述在以下部分中提供。
作地连接的两个或更多个CDR的多核苷酸，以产生含有这些CDR的连续单链肽。任选地，所述
CDR可通过间隔区，如通过框架区(例如，本文所述的框架序列或人抗体的种系共有序列的
框架区)或柔性接头(如本文所述或本领域中已知的聚甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸接头)隔开。
当通过化学合成方法产生时，天然化学连接可任选地用作合成长肽(例如，大于50个氨基
酸)的策略。天然化学连接方案是本领域中已知的并且已例如由Dawson等人(Science,266:
776-779,1994)描述；所述文献以引用的方式并入本文。用于产生单链多肽、全长抗体和抗
体片段的技术的详细描述在以下部分中提供。
[0339] 核酸和表达系统
[0340] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可通过多种已建立的技术中的任一种来制备。例如，本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段可通
过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，可用一
种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述重组表达载体携带编码所述抗体的免疫球蛋白
轻链和重链的DNA片段，以使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达并且任选地分泌到培养
宿主细胞的培养基中，可从所述培养基中回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链和
轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体中并且将所述载体引入宿主细胞中，如在
Molecular Cloning；ALaboratory Manual,第二版(Sambrook,Fritsch和Maniatis(编),
Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel
等人,编,Greene Publishing Associates,1989)以及在美国专利号4,816,397中描述的那
些；所述文献以引用的方式并入本文。
过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，可用一
种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述重组表达载体携带编码所述抗体的免疫球蛋白
轻链和重链的DNA片段，以使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达并且任选地分泌到培养
宿主细胞的培养基中，可从所述培养基中回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链和
轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体中并且将所述载体引入宿主细胞中，如在
Molecular Cloning；ALaboratory Manual,第二版(Sambrook,Fritsch和Maniatis(编),
Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel
等人,编,Greene Publishing Associates,1989)以及在美国专利号4,816,397中描述的那
些；所述文献以引用的方式并入本文。
[0341] 用于表达拮抗性TNFR2多肽的载体
[0342] 病毒基因组提供了可用于将外源基因有效递送到细胞(例如，真核或原核细胞)的基因组中的丰富载体来源。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含在此
类基因组内的多核苷酸通常通过普遍性或特异性转导掺入靶细胞的基因组中。这些过程作
为天然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂以诱导基因整合。病毒
载体的实例包括逆转录病毒、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，
腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病
和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和
甲病毒)和双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-
巴尔病毒、巨细胞病毒)以及痘病毒(例如，牛痘、修饰的牛痘安卡拉(MVA)、禽痘和金丝雀
痘)。适用于递送编码本发明的抗体轻链和重链或抗体片段的多核苷酸的其他病毒包括例
如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转
录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV
组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their
replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等人,编,Lippincott-
Raven Publishers,Philadelphia,1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠
乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病
病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴
肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例例如在McVey等人(美国专利号5,801,
030)中进行了描述；所述专利以引用的方式并入本文。
类基因组内的多核苷酸通常通过普遍性或特异性转导掺入靶细胞的基因组中。这些过程作
为天然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂以诱导基因整合。病毒
载体的实例包括逆转录病毒、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，
腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病
和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和
甲病毒)和双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-
巴尔病毒、巨细胞病毒)以及痘病毒(例如，牛痘、修饰的牛痘安卡拉(MVA)、禽痘和金丝雀
痘)。适用于递送编码本发明的抗体轻链和重链或抗体片段的多核苷酸的其他病毒包括例
如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转
录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV
组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their
replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等人,编,Lippincott-
Raven Publishers,Philadelphia,1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠
乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病
病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴
肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例例如在McVey等人(美国专利号5,801,
030)中进行了描述；所述专利以引用的方式并入本文。
[0343] 基因组编辑技术
[0344] 除病毒载体外，已经开发了多种另外的方法用于将基因(例如，编码抗体轻链和重链、单链多肽、单链可变片段(scFv)、串联scFv、Fab结构域、F(ab’)2结构域、双抗体和三抗
体等的那些基因)掺入用于多肽表达的靶细胞的基因组中。可用于将编码抗TNFR2多肽(例
如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的一种这样的方法
包括转座子。转座子是编码转座酶并且含有侧接5'和3'位置的切除位点的目标多核苷酸序
列或基因的多核苷酸。一旦转座子已被递送到细胞中，转座酶基因的表达就开始并且产生
从转座子裂解目标基因的活性酶。这种活性由转座酶对转座子切除位点的位点特异性识别
介导。在一些实施方案中，这些切除位点可以是末端重复序列或反向末端重复序列。一旦从
转座子切除，目标基因就可通过转座酶催化裂解存在于细胞的核基因组内的类似切除位点
而整合到原核或真核细胞的基因组中。这允许编码抗TNFR2抗体或其片段或结构域的基因
在所述切除位点处插入到裂解的核DNA中，并且随后连接使目标基因连接至原核或真核细
胞基因组的DNA的磷酸二酯键完成了掺入过程。在一些实施方案中，转座子可以是逆转录转
座子，以使得编码抗体的基因首先转录成RNA产物且然后逆转录成DNA，之后掺入原核或真
核细胞基因组中。示例性转座子系统包括piggybac转座子(在WO 2010/085699中详细描述)
和睡美人转座子(在US20050112764中详细描述)；所述专利以引用的方式并入本文。
体等的那些基因)掺入用于多肽表达的靶细胞的基因组中。可用于将编码抗TNFR2多肽(例
如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的一种这样的方法
包括转座子。转座子是编码转座酶并且含有侧接5'和3'位置的切除位点的目标多核苷酸序
列或基因的多核苷酸。一旦转座子已被递送到细胞中，转座酶基因的表达就开始并且产生
从转座子裂解目标基因的活性酶。这种活性由转座酶对转座子切除位点的位点特异性识别
介导。在一些实施方案中，这些切除位点可以是末端重复序列或反向末端重复序列。一旦从
转座子切除，目标基因就可通过转座酶催化裂解存在于细胞的核基因组内的类似切除位点
而整合到原核或真核细胞的基因组中。这允许编码抗TNFR2抗体或其片段或结构域的基因
在所述切除位点处插入到裂解的核DNA中，并且随后连接使目标基因连接至原核或真核细
胞基因组的DNA的磷酸二酯键完成了掺入过程。在一些实施方案中，转座子可以是逆转录转
座子，以使得编码抗体的基因首先转录成RNA产物且然后逆转录成DNA，之后掺入原核或真
核细胞基因组中。示例性转座子系统包括piggybac转座子(在WO 2010/085699中详细描述)
和睡美人转座子(在US20050112764中详细描述)；所述专利以引用的方式并入本文。
[0345] 将编码抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的核酸分子整合到原核或真核细胞的基因组中的另一种有用方法是成簇规律间隔的短回文重复序列
(CRISPR)/Cas系统，所述系统是最初在细菌和古细菌中进化为针对病毒感染的适应性防御
机制的系统。CRISPR/Cas系统由质粒DNA内的回文重复序列和相关的Cas9核酸酶组成。这种
DNA和蛋白质的集合通过首先将外来DNA掺入CRISPR基因座中来指导靶序列的位点特异性
DNA裂解。含有这些外来序列和CRISPR基因座的重复序列-间隔区元件的多核苷酸进而在宿
主细胞中转录以产生指导RNA，所述指导RNA随后可与靶序列退火并将Cas9核酸酶定位于此
位点。以这种方式，高度位点特异性cas9介导的DNA裂解可在外来多核苷酸中产生，因为使
cas9在靶DNA分子附近内的相互作用受RNA:DNA杂交控制。结果，理论上可设计CRISPR/Cas
系统来裂解任何目标靶DNA分子。已经利用这种技术以编辑真核基因组(Hwang等人,
Nat.Biotech.,31:227-229,2013)并且可用作位点特异性编辑真核或原核基因组的有效手
段，以便在掺入编码本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的多
核苷酸之前裂解DNA。CRISPR/Cas调节基因表达的用途已在美国专利号8,697,359中进行了
描述，所述专利以引用的方式并入本文。
(CRISPR)/Cas系统，所述系统是最初在细菌和古细菌中进化为针对病毒感染的适应性防御
机制的系统。CRISPR/Cas系统由质粒DNA内的回文重复序列和相关的Cas9核酸酶组成。这种
DNA和蛋白质的集合通过首先将外来DNA掺入CRISPR基因座中来指导靶序列的位点特异性
DNA裂解。含有这些外来序列和CRISPR基因座的重复序列-间隔区元件的多核苷酸进而在宿
主细胞中转录以产生指导RNA，所述指导RNA随后可与靶序列退火并将Cas9核酸酶定位于此
位点。以这种方式，高度位点特异性cas9介导的DNA裂解可在外来多核苷酸中产生，因为使
cas9在靶DNA分子附近内的相互作用受RNA:DNA杂交控制。结果，理论上可设计CRISPR/Cas
系统来裂解任何目标靶DNA分子。已经利用这种技术以编辑真核基因组(Hwang等人,
Nat.Biotech.,31:227-229,2013)并且可用作位点特异性编辑真核或原核基因组的有效手
段，以便在掺入编码本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的多
核苷酸之前裂解DNA。CRISPR/Cas调节基因表达的用途已在美国专利号8,697,359中进行了
描述，所述专利以引用的方式并入本文。
[0346] 用于在掺入编码本发明的TNFR2抗体或抗体片段的多核苷酸之前位点特异性裂解基因组DNA的替代方法包括使用锌指核酸酶和转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。与
CRISPR/Cas系统不同，这些酶不含用于定位至特异性靶序列的引导多核苷酸。相反，靶特异
性由这些酶内的DNA结合结构域控制。用于基因组编辑应用的锌指核酸酶和TALEN在Urnov
等人(Nat.Rev.Genet.,11:636-646,2010)；和Joung等人,(Nat.Rev.Mol.Cell.Bio.14:49-
55,2013)中进行了描述；所述文献以引用的方式并入本文。可用于将编码本发明抗体的多
核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中的另外基因组编辑技术包括使用可合理设计以便
位点特异性地裂解基因组DNA的ARCUSTM大范围核酸酶。鉴于已经针对此类酶建立的结构活
性关系，使用这些酶来将编码本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结
合片段)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中是特别有利的。因此，可在某些氨基酸
位置修饰单链大范围核酸酶，以产生在所需位置处选择性地裂解DNA的核酸酶。这些单链核
酸酶已例如在美国专利号8,021,867和8,445,251中进行了广泛描述；所述专利以引用的方
式并入本文。
CRISPR/Cas系统不同，这些酶不含用于定位至特异性靶序列的引导多核苷酸。相反，靶特异
性由这些酶内的DNA结合结构域控制。用于基因组编辑应用的锌指核酸酶和TALEN在Urnov
等人(Nat.Rev.Genet.,11:636-646,2010)；和Joung等人,(Nat.Rev.Mol.Cell.Bio.14:49-
55,2013)中进行了描述；所述文献以引用的方式并入本文。可用于将编码本发明抗体的多
核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中的另外基因组编辑技术包括使用可合理设计以便
位点特异性地裂解基因组DNA的ARCUSTM大范围核酸酶。鉴于已经针对此类酶建立的结构活
性关系，使用这些酶来将编码本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结
合片段)的多核苷酸掺入原核或真核细胞的基因组中是特别有利的。因此，可在某些氨基酸
位置修饰单链大范围核酸酶，以产生在所需位置处选择性地裂解DNA的核酸酶。这些单链核
酸酶已例如在美国专利号8,021,867和8,445,251中进行了广泛描述；所述专利以引用的方
式并入本文。
[0347] 多核苷酸序列元件
[0348] 为了表达本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)，可将编码部分或全长轻链和重链的多核苷酸(例如编码如本文所述的CDR-H3区的多核苷
酸)插入表达载体中，以使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。选择表达载体和表
达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。编码TNFR2抗体的轻链基因和重链的多核苷
酸可插入单独的载体中，或者任选地可使用本文所述或本领域中已知的已建立的技术来将
两种多核苷酸掺入同一表达载体中。
酸)插入表达载体中，以使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。选择表达载体和表
达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。编码TNFR2抗体的轻链基因和重链的多核苷
酸可插入单独的载体中，或者任选地可使用本文所述或本领域中已知的已建立的技术来将
两种多核苷酸掺入同一表达载体中。
[0349] 除了编码抗体的重链和轻链的多核苷酸(或编码单链多肽或抗体片段如scFv分子的多核苷酸)外，本发明的重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调
控序列。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于这类因素，如待转化的宿主细胞
的选择、所需的蛋白质的表达水平。例如，用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调控序列包括
指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)(诸如
CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒
主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件以及其序
列的进一步描述，参见例如美国专利号5,168,062、美国专利号4,510,245和美国专利号4,
968,615。
控序列。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于这类因素，如待转化的宿主细胞
的选择、所需的蛋白质的表达水平。例如，用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调控序列包括
指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)(诸如
CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒
主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件以及其序
列的进一步描述，参见例如美国专利号5,168,062、美国专利号4,510,245和美国专利号4,
968,615。
[0350] 除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体还可携带额外的序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有
助于载体已经引入其中的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和
5,179,017)。例如，通常选择型标记基因赋予已向其中引入载体的宿主细胞对细胞毒性药
物如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。合适的选择性标记基因包括
二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR”宿主细胞中使用)和neo
基因(用于G418选择)。为了表达TNFR2抗体或TNFR2抗体片段的轻链和重链，可通过标准技
术将含有编码所述重链和轻链的多核苷酸的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。
助于载体已经引入其中的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和
5,179,017)。例如，通常选择型标记基因赋予已向其中引入载体的宿主细胞对细胞毒性药
物如G418、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。合适的选择性标记基因包括
二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR”宿主细胞中使用)和neo
基因(用于G418选择)。为了表达TNFR2抗体或TNFR2抗体片段的轻链和重链，可通过标准技
术将含有编码所述重链和轻链的多核苷酸的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。
[0351] 编码修饰的拮抗性TNFR2多肽的多核苷酸
[0352] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列，但特征在于相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3
中的相应序列，剩余CDR中的一个或多个的序列中的差异。类似地，本发明的多肽可含有
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，但可特征在于一个或多个框架区中的差异。例如，
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的一个或多个框架区可被人抗体的框架区取代。示例性框架区
包括例如，US 7,829,086中描述的人框架区和如在EP 1945668中描述的灵长类动物框架
区；所述专利以引用的方式并入本文。为了产生编码此类TNFR2抗体的核酸，可通过化学合
成(例如，通过固相多核苷酸合成技术)、体外基因扩增(例如，通过聚合酶链式反应技术)或
通过在宿主生物体中复制多核苷酸来产生编码例如轻链可变区和重链可变区中的至少一
者或两者的DNA片段。例如，编码本发明的抗TNFR2抗体的核酸可通过扩增和修饰编码轻链
和重链可变序列的种系DNA或cDNA以便将TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3掺入共有抗
体的框架残基中而获得。在一些实施方案中，人源化拮抗性TNFR2抗体可包含TFNRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或其与这些CDR-H3序列或相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3
的CDR-H3序列含有一与三个之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的序列中的任一
个具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的变体。例
如，这可通过进行种系DNA或cDNA的定点诱变并且根据已建立的程序使用聚合酶链式反应
(PCR)扩增所得多核苷酸来实现。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域中已知
的(参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；还参见Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；
Tomlinson等人,J.Mol.Biol.227:776-798,1992；以及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-
836,1994；所述文献以引用的方式并入本文)。编码含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-
H3的人重链和轻链可变区的嵌合核酸构建体可例如使用本领域中已知的已建立的克隆技
术来产生。另外，可合成编码含有TNFRAB1、TNFRAB2或TFNR2A3的CDR-H3的重链可变区的多
核苷酸并将其用作诱变的模板，以使用常规诱变技术产生如本文所述的变体。或者，可直接
合成编码变体的DNA片段(例如，通过建立的固相核酸化学合成程序)。
中的相应序列，剩余CDR中的一个或多个的序列中的差异。类似地，本发明的多肽可含有
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，但可特征在于一个或多个框架区中的差异。例如，
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的一个或多个框架区可被人抗体的框架区取代。示例性框架区
包括例如，US 7,829,086中描述的人框架区和如在EP 1945668中描述的灵长类动物框架
区；所述专利以引用的方式并入本文。为了产生编码此类TNFR2抗体的核酸，可通过化学合
成(例如，通过固相多核苷酸合成技术)、体外基因扩增(例如，通过聚合酶链式反应技术)或
通过在宿主生物体中复制多核苷酸来产生编码例如轻链可变区和重链可变区中的至少一
者或两者的DNA片段。例如，编码本发明的抗TNFR2抗体的核酸可通过扩增和修饰编码轻链
和重链可变序列的种系DNA或cDNA以便将TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3掺入共有抗
体的框架残基中而获得。在一些实施方案中，人源化拮抗性TNFR2抗体可包含TFNRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3，或其与这些CDR-H3序列或相对于TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3
的CDR-H3序列含有一与三个之间的氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)的序列中的任一
个具有至少85％序列同一性(例如，90％、95％、97％、99％或100％序列同一性)的变体。例
如，这可通过进行种系DNA或cDNA的定点诱变并且根据已建立的程序使用聚合酶链式反应
(PCR)扩增所得多核苷酸来实现。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域中已知
的(参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；还参见Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991；
Tomlinson等人,J.Mol.Biol.227:776-798,1992；以及Cox等人,Eur.J.Immunol.24:827-
836,1994；所述文献以引用的方式并入本文)。编码含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-
H3的人重链和轻链可变区的嵌合核酸构建体可例如使用本领域中已知的已建立的克隆技
术来产生。另外，可合成编码含有TNFRAB1、TNFRAB2或TFNR2A3的CDR-H3的重链可变区的多
核苷酸并将其用作诱变的模板，以使用常规诱变技术产生如本文所述的变体。或者，可直接
合成编码变体的DNA片段(例如，通过建立的固相核酸化学合成程序)。
[0353] 一旦获得编码含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3的VH区段的DNA片段，就可通过标准重组DNA技术来进一步操作这些DNA片段，例如以将可变区基因转化为全长抗体
链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至
编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。
链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至
编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。
[0354] 可例如通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区结构域(CH1、CH2、CH3和任选的CH4)的另一个DNA分子上来将编码本发明的抗TNFR2抗体的VH区的分离的DNA转化
为全长重链基因(以及Fab重链基因)。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例
如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生
和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的
DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，并且在某些实施方案中是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1结构域
的另一个DNA分子可操作地连接。
为全长重链基因(以及Fab重链基因)。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见例
如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美国卫生
和公共服务部,NIH出版号91-3242,1991)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的
DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，并且在某些实施方案中是IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可与仅编码重链CH1结构域
的另一个DNA分子可操作地连接。
[0355] 可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子来将编码抗TNFR2抗体的VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒
定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版(美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242,1991))，并
且可例如通过在原核或真核细胞中扩增编码这些区的多核苷酸、通过PCR扩增或通过化学
多核苷酸合成来获得涵盖这些区的DNA片段。轻链恒定区可以是κ(κ)或λ(λ)恒定区，但在某
些实施方案中是κ恒定区。为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编
码柔性接头(例如编码柔性亲水性氨基酸序列，如氨基酸序列(Gly4Ser)3的多核苷酸)的另
一片段，以使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过所述接头连接(参
见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85:5879-5883,1988；McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990)。
定区基因的序列是本领域中已知的(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of
Immunological Interest,第五版(美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242,1991))，并
且可例如通过在原核或真核细胞中扩增编码这些区的多核苷酸、通过PCR扩增或通过化学
多核苷酸合成来获得涵盖这些区的DNA片段。轻链恒定区可以是κ(κ)或λ(λ)恒定区，但在某
些实施方案中是κ恒定区。为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编
码柔性接头(例如编码柔性亲水性氨基酸序列，如氨基酸序列(Gly4Ser)3的多核苷酸)的另
一片段，以使得VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过所述接头连接(参
见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85:5879-5883,1988；McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990)。
[0356] 重组DNA技术也可用于除去一些或全部编码并非结合至TNFR2所必需的轻链和重链中的任一者或两者的DNA。由此类截短的DNA分子表达的分子也涵盖于本发明的抗体中。
此外，可产生双功能抗体，其中一条重链含有源自TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序
列，并且另一条重链和/或轻链对除TNFR2以外的抗原具有特异性。可例如通过标准化学交
联方法(例如，通过二硫键形成)通过使含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的重
链和抗TNFR2抗体(如既不具有激动性也不具有拮抗性的抗TNFR2抗体)的轻链交联至二级
抗体的重链和轻链来产生此类抗体。也可通过在原核或真核细胞中表达经工程化以编码双
功能抗体的核酸分子来制备双功能抗体。
此外，可产生双功能抗体，其中一条重链含有源自TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序
列，并且另一条重链和/或轻链对除TNFR2以外的抗原具有特异性。可例如通过标准化学交
联方法(例如，通过二硫键形成)通过使含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的重
链和抗TNFR2抗体(如既不具有激动性也不具有拮抗性的抗TNFR2抗体)的轻链交联至二级
抗体的重链和轻链来产生此类抗体。也可通过在原核或真核细胞中表达经工程化以编码双
功能抗体的核酸分子来制备双功能抗体。
[0357] 可通过突变轻链和/或重链CDR中的氨基酸残基来产生双特异性抗体，即使用同一结合位点结合TNFR2和不同抗原的抗体。在一些实施方案中，可通过突变抗原结合位点外围
的氨基酸残基来产生结合两种抗原(例TNFR2和第二细胞表面受体)的双特异性抗体
(Bostrom等人,Science 323:1610-1614,2009)。可通过表达经工程化以编码双特异性抗体
的多核苷酸来制备双功能抗体。
的氨基酸残基来产生结合两种抗原(例TNFR2和第二细胞表面受体)的双特异性抗体
(Bostrom等人,Science 323:1610-1614,2009)。可通过表达经工程化以编码双特异性抗体
的多核苷酸来制备双功能抗体。
[0358] 也可通过化学合成(例如，通过在Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,111中描述的方法；所述文献以引用的方式并入
本文)来产生本发明的修饰的拮抗性TNFR2抗体和抗体片段。还可使用不含细胞的合成平台
来产生变体抗体(参见，例如，Chu等人,BiochemiaNo.2,2001(Roche Molecular
Biologicals)；所述文献以引用的方式并入本文)。
本文)来产生本发明的修饰的拮抗性TNFR2抗体和抗体片段。还可使用不含细胞的合成平台
来产生变体抗体(参见，例如，Chu等人,BiochemiaNo.2,2001(Roche Molecular
Biologicals)；所述文献以引用的方式并入本文)。
[0359] 用于表达拮抗性TNFR2多肽的宿主细胞
[0360] 有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的表达在
真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中进行，以最佳分泌正确折叠且免疫活性的抗体。用于
表达本发明的重组抗体或其抗原结合片段的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢
细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220)中所
描述的DHFRCHO细胞，其与DHFR选择性标记一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982,
Mol.Biol.159:601-621)中所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。可用
于表达抗体及其片段的其他细胞类型包括细菌细胞，如BL-21(DE3)大肠杆菌细胞，其可根
据已建立的方案用含有外来DNA的载体转化。可用于表达抗体的另外真核细胞包括酵母细
胞，如酿酒酵母的营养缺陷型菌株，其可根据本领域中已知的已建立的程序在不完全培养
基中转化并选择性地生长。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中
时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或者允许抗体分泌到宿主细胞所
生长的培养基中的一段时间来产生抗体。
真核细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中进行，以最佳分泌正确折叠且免疫活性的抗体。用于
表达本发明的重组抗体或其抗原结合片段的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢
细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220)中所
描述的DHFRCHO细胞，其与DHFR选择性标记一起使用，例如如Kaufman和Sharp(1982,
Mol.Biol.159:601-621)中所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、293细胞和SP2/0细胞。可用
于表达抗体及其片段的其他细胞类型包括细菌细胞，如BL-21(DE3)大肠杆菌细胞，其可根
据已建立的方案用含有外来DNA的载体转化。可用于表达抗体的另外真核细胞包括酵母细
胞，如酿酒酵母的营养缺陷型菌株，其可根据本领域中已知的已建立的程序在不完全培养
基中转化并选择性地生长。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中
时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或者允许抗体分泌到宿主细胞所
生长的培养基中的一段时间来产生抗体。
[0361] 可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)。宿主细胞也可用于产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。本发明还包括
根据本领域中已知的已建立的方案改变上述程序的方法。例如，可能希望用编码本发明的
抗TNFR2抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞，以产生所述抗体的抗原结合
片段。
根据本领域中已知的已建立的方案改变上述程序的方法。例如，可能希望用编码本发明的
抗TNFR2抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞，以产生所述抗体的抗原结合
片段。
[0362] 一旦已经通过重组表达产生了本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)，就可通过本领域中已知的任何方法(如适用于纯化免疫球蛋白分子的方
法)将其纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是通过蛋白A或蛋
白G选择后对TNFR2的亲和力，以及尺寸分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化
蛋白质的任何其他标准技术。此外，本发明的抗TNFR2多肽或其片段可与本文所述或本领域
中另外已知的异源多肽序列融合，以促进纯化或产生治疗性缀合物(参见下文的“拮抗性
TNFR2多肽缀合物”)。
法)将其纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是通过蛋白A或蛋
白G选择后对TNFR2的亲和力，以及尺寸分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化
蛋白质的任何其他标准技术。此外，本发明的抗TNFR2多肽或其片段可与本文所述或本领域
中另外已知的异源多肽序列融合，以促进纯化或产生治疗性缀合物(参见下文的“拮抗性
TNFR2多肽缀合物”)。
[0363] 一旦分离，如果需要，可进一步纯化抗TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段，例如通过高效液相色谱法(参见例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology(Work和Burdon,编,Elsevier,1980)；所述文献以引用的方式并入
本文)或通过如SuperdexTM 75柱(Pharmacia BiotechAB,Uppsala,Sweden)上的凝胶过滤色
谱法。
and Molecular Biology(Work和Burdon,编,Elsevier,1980)；所述文献以引用的方式并入
本文)或通过如SuperdexTM 75柱(Pharmacia BiotechAB,Uppsala,Sweden)上的凝胶过滤色
谱法。
[0364] 用于产生拮抗性抗TNFR2多肽并使所述多肽亲和力成熟的平台
[0365] 对TNFR2的促进受体拮抗作用的表位作图
[0366] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可通过针对能够结合TNFR2内选择性地促进受体拮抗作用而不是受体活化的表位的功能性分子筛选
多肽文库(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)来产生。此类表位可通过针对一系列
线性或环状肽筛选抗体或其抗原结合片段来建模，所述线性或环状肽含有对应于TNFR2内
的所需表位的残基。
多肽文库(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)来产生。此类表位可通过针对一系列
线性或环状肽筛选抗体或其抗原结合片段来建模，所述线性或环状肽含有对应于TNFR2内
的所需表位的残基。
[0367] 作为实例，含有从TNFR2分离的促进受体拮抗作用的单个片段的肽可通过本文所述或本领域中已知的肽合成技术合成。可将这些肽固定在固体表面上，并且例如使用基于
ELISA的筛选平台使用已建立的程序筛选结合拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及
其抗原结合片段)(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的分子。使用这种测定，以高亲和力特异
性地结合TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的肽因此含有TNFR2的优先结合这些抗体的表位内的
残基。以这种方式鉴别的肽(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20、34-117、285和286中任一个的
序列的肽，或在SEQ ID NO:7的位置80与130之间含有约10与约30个之间的连续或不连续氨
基酸的肽)可用于筛选抗体文库及其抗原结合片段，以鉴别本发明的抗TNFR2抗体。此外，由
于这些肽充当TNFR2内促进受体拮抗作用的表位的替代物，因此使用这种筛选技术产生的
抗体可结合TNFR2中的相应表位并且预期对受体活性具有拮抗作用。
ELISA的筛选平台使用已建立的程序筛选结合拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及
其抗原结合片段)(如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的分子。使用这种测定，以高亲和力特异
性地结合TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的肽因此含有TNFR2的优先结合这些抗体的表位内的
残基。以这种方式鉴别的肽(例如，具有SEQ ID NO:11、19、20、34-117、285和286中任一个的
序列的肽，或在SEQ ID NO:7的位置80与130之间含有约10与约30个之间的连续或不连续氨
基酸的肽)可用于筛选抗体文库及其抗原结合片段，以鉴别本发明的抗TNFR2抗体。此外，由
于这些肽充当TNFR2内促进受体拮抗作用的表位的替代物，因此使用这种筛选技术产生的
抗体可结合TNFR2中的相应表位并且预期对受体活性具有拮抗作用。
[0368] 筛选拮抗性TNFR2多肽的文库
[0369] 用于针对能够结合TNFR2内的表位(例如，具有SEQ ID NO:285或286的序列的肽)的分子高通量筛选多肽(例如，单链多肽、抗体或抗体片段)文库的方法包括但不限于展示
技术，包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA
展示。使用噬菌体展示来分离结合生物学相关分子的配体已经例如在Felici等人
(Biotechnol .Annual Rev .1:149-183 ,1995)；Katz(Annual
Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997)和Hoogenboom等人(Immunotechnology 4:
1-20,1998)中进行了综述。已经构建了若干随机化组合肽文库以选择结合不同靶标(例如
细胞表面受体或DNA)的多肽(由Kay(Perspect.Drug Discovery Des.2,251-268,1995)；
Kay等人(Mol.Divers.1:139-140,1996)综述)。蛋白质和多聚体蛋白质已被成功地噬菌体
展示为功能性分子(参见EP 0349578A、EP 4527839A、EP0589877A；Chiswell和McCafferty
(Trends Biotechnol.10,80-841992))。此外，已经表达了功能性抗体片段(例如Fab、单链
Fv[scFv])(McCafferty等人(Nature 348:552-554,1990)；Barbas等人(Proc.Natl.Acad
Sci.USA 88:7978-7982,1991)；Clackson等人(Nature 352:624-628,1991))。这些参考文
献特此以引用的方式整体并入。
技术，包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA
展示。使用噬菌体展示来分离结合生物学相关分子的配体已经例如在Felici等人
(Biotechnol .Annual Rev .1:149-183 ,1995)；Katz(Annual
Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997)和Hoogenboom等人(Immunotechnology 4:
1-20,1998)中进行了综述。已经构建了若干随机化组合肽文库以选择结合不同靶标(例如
细胞表面受体或DNA)的多肽(由Kay(Perspect.Drug Discovery Des.2,251-268,1995)；
Kay等人(Mol.Divers.1:139-140,1996)综述)。蛋白质和多聚体蛋白质已被成功地噬菌体
展示为功能性分子(参见EP 0349578A、EP 4527839A、EP0589877A；Chiswell和McCafferty
(Trends Biotechnol.10,80-841992))。此外，已经表达了功能性抗体片段(例如Fab、单链
Fv[scFv])(McCafferty等人(Nature 348:552-554,1990)；Barbas等人(Proc.Natl.Acad
Sci.USA 88:7978-7982,1991)；Clackson等人(Nature 352:624-628,1991))。这些参考文
献特此以引用的方式整体并入。
[0370] (i)噬菌体展示技术
[0371] 作为实例，可使用噬菌体展示技术以便针对能够结合含有TNFR2内的促进受体拮抗作用的表位(例如，具有SEQ ID NO:285或286的序列的肽)的环状或多环肽的功能性分子
筛选多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的文库。例如，可使用已建立的程序
(例如，固相多核苷酸合成或易错PCR技术，参见McCullum等人(Meth.Mol.Biol.,634:103-
109,2010)；所述文献以引用的方式并入本文)获得编码包含随机化高变区的单链抗体片段
(如scFv片段)的多核苷酸文库。随后可将这些随机化的多核苷酸掺入病毒基因组中，以使
得由这些基因编码的随机化抗体链在丝状噬菌体的表面上表达，例如通过抗体链与外壳蛋
白(例如，M13噬菌体的表面上的pIII外壳蛋白)之间的共价键。这提供了抗体链的基因型与
表型之间的物理连接。以这种方式，可针对外部抗体链结合TNFR2表位(例如，具有SEQ ID
NO:285或286的序列的肽)的能力筛选展示在高变区中含有随机突变的不同抗体链的噬菌
体文库，所述表位使用已建立的程序固定至表面。例如，可通过在肽与表位标签(例如，生物
素)之间形成共价键并将所述肽在微量滴定板的孔中孵育来使此类肽可物理地结合至微量
滴定板的表面，所述孔已经先前涂覆有以高亲和力结合与肽连接的标签的互补标签(例如，
抗生物素蛋白)。合适的表位标签包括但不限于，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚
组氨酸标签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这
些分子呈递的表位的肽能够分别固定在含有此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合
物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)的表面上。以这种方式，可使
噬菌体与含有固定的TNFR2源性肽的表面一起孵育适合于允许所述抗体与约束肽结合的一
段时间并且在合适的缓冲系统(例如，含有生理盐浓度、离子强度并通过缓冲剂维持在生理
pH下的系统)存在下。然后可(例如，用含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤表面，以除
去不呈递以大于特定阈值的亲和力与TNFR2源性肽相互作用的抗体链的噬菌体。
筛选多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的文库。例如，可使用已建立的程序
(例如，固相多核苷酸合成或易错PCR技术，参见McCullum等人(Meth.Mol.Biol.,634:103-
109,2010)；所述文献以引用的方式并入本文)获得编码包含随机化高变区的单链抗体片段
(如scFv片段)的多核苷酸文库。随后可将这些随机化的多核苷酸掺入病毒基因组中，以使
得由这些基因编码的随机化抗体链在丝状噬菌体的表面上表达，例如通过抗体链与外壳蛋
白(例如，M13噬菌体的表面上的pIII外壳蛋白)之间的共价键。这提供了抗体链的基因型与
表型之间的物理连接。以这种方式，可针对外部抗体链结合TNFR2表位(例如，具有SEQ ID
NO:285或286的序列的肽)的能力筛选展示在高变区中含有随机突变的不同抗体链的噬菌
体文库，所述表位使用已建立的程序固定至表面。例如，可通过在肽与表位标签(例如，生物
素)之间形成共价键并将所述肽在微量滴定板的孔中孵育来使此类肽可物理地结合至微量
滴定板的表面，所述孔已经先前涂覆有以高亲和力结合与肽连接的标签的互补标签(例如，
抗生物素蛋白)。合适的表位标签包括但不限于，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚
组氨酸标签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这
些分子呈递的表位的肽能够分别固定在含有此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合
物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)的表面上。以这种方式，可使
噬菌体与含有固定的TNFR2源性肽的表面一起孵育适合于允许所述抗体与约束肽结合的一
段时间并且在合适的缓冲系统(例如，含有生理盐浓度、离子强度并通过缓冲剂维持在生理
pH下的系统)存在下。然后可(例如，用含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液)洗涤表面，以除
去不呈递以大于特定阈值的亲和力与TNFR2源性肽相互作用的抗体链的噬菌体。
[0372] 可通过调整洗涤步骤的条件(例如，通过包含弱酸性或碱性组分，或通过包含低浓度的其他TNFR2源性肽以与固定化肽竞争抗原结合位点)来调节在这一初始淘选(即筛选)
步骤后保留的多肽的亲和力。以这种方式，在洗涤步骤之后保持与微量滴定板的表面结合
的噬菌体群体富含结合TNFR2源性肽表位的噬菌体，所述表位促进受体拮抗作用。然后可通
过从含有这些肽的表面洗脱噬菌体(例如，通过改变环境pH、离子强度或温度)以降低蛋白
质-蛋白质相互作用强度来扩增剩余的噬菌体。然后可例如通过感染细菌细胞来扩增分离
的噬菌体，并且可任选地通过额外的筛选重复使所得噬菌体进行淘选，以进一步富集噬菌
体群体以获得具有更高亲和力抗TNFR2多肽的那些噬菌体。在这些淘选阶段之后，随后可分
离展示高亲和力抗体或其抗原结合片段的噬菌体，并且可对这些噬菌体的基因组进行测
序，以鉴别编码的抗体的多核苷酸和多肽序列。诸如此类的噬菌体展示技术可用于产生例
如抗体链，如scFv片段、串联scFv片段以及可用作TNFR2的拮抗剂的本发明的其他抗原结合
片段。用于鉴别以高亲和力结合特定抗原的抗体链及其抗原结合片段的示例性噬菌体展示
方案是公认的，并且描述于例如美国专利号7,846,892、WO 1997/002342、美国专利号8,
846,867和WO 2007/132917中；所述专利以引用的方式并入本文。类似的噬菌体展示技术可
用于产生本发明的抗体样支架(例如，10Fn3结构域)，所述支架结合TNFR2内促进受体拮抗作
用的表位(例如，由具有SEQ ID NO:285或286的序列的肽呈递的表位)。用于鉴别抗体样支
架蛋白的示例性噬菌体展示方案描述于例如WO 2009/086116中；所述专利以引用的方式并
入本文)。
步骤后保留的多肽的亲和力。以这种方式，在洗涤步骤之后保持与微量滴定板的表面结合
的噬菌体群体富含结合TNFR2源性肽表位的噬菌体，所述表位促进受体拮抗作用。然后可通
过从含有这些肽的表面洗脱噬菌体(例如，通过改变环境pH、离子强度或温度)以降低蛋白
质-蛋白质相互作用强度来扩增剩余的噬菌体。然后可例如通过感染细菌细胞来扩增分离
的噬菌体，并且可任选地通过额外的筛选重复使所得噬菌体进行淘选，以进一步富集噬菌
体群体以获得具有更高亲和力抗TNFR2多肽的那些噬菌体。在这些淘选阶段之后，随后可分
离展示高亲和力抗体或其抗原结合片段的噬菌体，并且可对这些噬菌体的基因组进行测
序，以鉴别编码的抗体的多核苷酸和多肽序列。诸如此类的噬菌体展示技术可用于产生例
如抗体链，如scFv片段、串联scFv片段以及可用作TNFR2的拮抗剂的本发明的其他抗原结合
片段。用于鉴别以高亲和力结合特定抗原的抗体链及其抗原结合片段的示例性噬菌体展示
方案是公认的，并且描述于例如美国专利号7,846,892、WO 1997/002342、美国专利号8,
846,867和WO 2007/132917中；所述专利以引用的方式并入本文。类似的噬菌体展示技术可
用于产生本发明的抗体样支架(例如，10Fn3结构域)，所述支架结合TNFR2内促进受体拮抗作
用的表位(例如，由具有SEQ ID NO:285或286的序列的肽呈递的表位)。用于鉴别抗体样支
架蛋白的示例性噬菌体展示方案描述于例如WO 2009/086116中；所述专利以引用的方式并
入本文)。
[0373] (ii)基于细胞的展示技术
[0374] 利用溶剂暴露的多肽的基因型与表型之间的联系的其他体外展示技术包括酵母和细菌展示。酵母展示技术在本领域中已建立并且通常是有利的，因为可在单个酵母细胞
的表面上呈递大量抗体(通常达30,000)(参见，例如，Boder等人(Nat Biotechno.15:553,
1997)；所述文献以引用的方式并入本文)。与丝状噬菌体相比更大尺寸的酵母细胞能够实
现额外的筛选策略，因为可使用流式细胞术来分析并分选酵母文库。例如，已建立的程序可
用于产生表达含有随机化高变区的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的细
菌细胞或酵母细胞文库(参见例如，参见美国专利号7,749,501和US 2013/0085072；所述专
利各自的教义以引用的方式并入本文)。例如，表达编码天然scFv片段的多核苷酸的大型酵
母细胞文库可使用已建立的程序来制备(de Bruin等人,NatBiotechnol 17:397,1999；所
述文献以引用的方式并入本文)。然后可在淘选步骤期间将表达这些多核苷酸的酵母细胞
与两种不同的荧光分子一起孵育：一种结合抗体内的保守残基且因此反映所展示的抗体的
量的染料，以及另一种在不同波长下发荧光并结合抗原且因此指示所结合的抗原的量的染
料。例如，本领域技术人员可使用含有SEQ ID NO:285或286的序列的TNFR2源性肽，所述肽
已经任选地在所述肽的N-或C-末端或在预期不会干扰抗体-抗原结合的残基处与表位标签
(例如，生物素)缀合的。这使得用互补标签(例如，抗生物素蛋白)标记的荧光染料能够定位
至抗体-抗原复合物。这样产生较大灵活性并且可立即反馈选择的进展。与噬菌体展示相
反，通过归一化为抗体展示水平，可容易地选择具有更高亲和力而非更高表达水平的抗体。
事实上，有可能区分并分选亲和力仅相差两倍的抗体(VanAntwerp和Wittrup
(BiotechnolProg 16:31,2000))。
的表面上呈递大量抗体(通常达30,000)(参见，例如，Boder等人(Nat Biotechno.15:553,
1997)；所述文献以引用的方式并入本文)。与丝状噬菌体相比更大尺寸的酵母细胞能够实
现额外的筛选策略，因为可使用流式细胞术来分析并分选酵母文库。例如，已建立的程序可
用于产生表达含有随机化高变区的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的细
菌细胞或酵母细胞文库(参见例如，参见美国专利号7,749,501和US 2013/0085072；所述专
利各自的教义以引用的方式并入本文)。例如，表达编码天然scFv片段的多核苷酸的大型酵
母细胞文库可使用已建立的程序来制备(de Bruin等人,NatBiotechnol 17:397,1999；所
述文献以引用的方式并入本文)。然后可在淘选步骤期间将表达这些多核苷酸的酵母细胞
与两种不同的荧光分子一起孵育：一种结合抗体内的保守残基且因此反映所展示的抗体的
量的染料，以及另一种在不同波长下发荧光并结合抗原且因此指示所结合的抗原的量的染
料。例如，本领域技术人员可使用含有SEQ ID NO:285或286的序列的TNFR2源性肽，所述肽
已经任选地在所述肽的N-或C-末端或在预期不会干扰抗体-抗原结合的残基处与表位标签
(例如，生物素)缀合的。这使得用互补标签(例如，抗生物素蛋白)标记的荧光染料能够定位
至抗体-抗原复合物。这样产生较大灵活性并且可立即反馈选择的进展。与噬菌体展示相
反，通过归一化为抗体展示水平，可容易地选择具有更高亲和力而非更高表达水平的抗体。
事实上，有可能区分并分选亲和力仅相差两倍的抗体(VanAntwerp和Wittrup
(BiotechnolProg 16:31,2000))。
[0375] (iii)核苷酸展示技术
[0376] 利用随机化多核苷酸文库的体外翻译的展示技术也提供了产生本发明的抗TNFR2抗体的有效方法。例如，编码在指定高变区内含有突变的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其
抗原结合片段)的随机化DNA文库可例如使用如本文所述的已建立的基于PCR的诱变技术获
得。这些文库的多核苷酸可含有转录调控序列，如启动子和转录终止序列，并且可另外编码
提高所得mRNA构建体的翻译速率的序列(例如，IRES序列、5'和3'UTR、聚腺苷酸化道等)。这
些多核苷酸文库可在含有RNA聚合酶和RNA核苷三磷酸(NTP)的适当缓冲溶液中孵育，以便
能够将DNA序列转录成感受态mRNA分子，所述mRNA分子随后可通过大和小核糖体亚基、氨基
酰基tRNA分子以及溶液中存在的翻译起始和延伸因子进行翻译(例如，使用
体外蛋白质合成试剂盒，New England )。设计的mRNA修饰可使
抗体产物通过与嘌呤霉素的化学键保持共价结合至mRNA模板(参见例如，Keefe
(Curr.Protoc.Mol.Biol.,第24章,Unit 24.5,2001)；所述以引用的方式并入本文)。因此，
这种基因型-表型联系可用于通过将mRNA:抗体融合构建体与固定至表面的肽一起孵育并
且以类似于噬菌体展示技术的方式进行淘选来选择结合TNFR2源性肽(例如，具有序列SEQ
ID NO:285或286的肽)的抗体(参见例如，WO 2006/072773；所述专利以引用的方式并入本
文)。
抗原结合片段)的随机化DNA文库可例如使用如本文所述的已建立的基于PCR的诱变技术获
得。这些文库的多核苷酸可含有转录调控序列，如启动子和转录终止序列，并且可另外编码
提高所得mRNA构建体的翻译速率的序列(例如，IRES序列、5'和3'UTR、聚腺苷酸化道等)。这
些多核苷酸文库可在含有RNA聚合酶和RNA核苷三磷酸(NTP)的适当缓冲溶液中孵育，以便
能够将DNA序列转录成感受态mRNA分子，所述mRNA分子随后可通过大和小核糖体亚基、氨基
酰基tRNA分子以及溶液中存在的翻译起始和延伸因子进行翻译(例如，使用
体外蛋白质合成试剂盒，New England )。设计的mRNA修饰可使
抗体产物通过与嘌呤霉素的化学键保持共价结合至mRNA模板(参见例如，Keefe
(Curr.Protoc.Mol.Biol.,第24章,Unit 24.5,2001)；所述以引用的方式并入本文)。因此，
这种基因型-表型联系可用于通过将mRNA:抗体融合构建体与固定至表面的肽一起孵育并
且以类似于噬菌体展示技术的方式进行淘选来选择结合TNFR2源性肽(例如，具有序列SEQ
ID NO:285或286的肽)的抗体(参见例如，WO 2006/072773；所述专利以引用的方式并入本
文)。
[0377] 任选地，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可使用类似的技术产生，除了抗体产物可与核糖体-mRNA复合物非共价结合而不是通过嘌呤霉素接头共
价结合。这种平台(称为核糖体展示)已在例如美国专利号7,074,557中进行了描述；所述专
利以引用的方式并入本文。或者，可使用cDNA展示(一种类似于mRNA展示的技术，除了cDNA
而不是mRNA通过嘌呤霉素接头共价结合至抗体产物)来产生抗体。cDNA展示技术提供了能
够在越来越严格的条件下进行淘选步骤的优点，例如，在调整环境的盐浓度、离子强度、pH
和/或温度以便筛选对TNFR2源性肽具有特别高亲和力的抗体的条件下。这是由于双链cDNA
相对于单链mRNA的更高天然稳定性。cDNA展示筛选技术描述于例如Ueno等人(Methods
Mol.Biol.,805:113-135,2012)中；所述文献以引用的方式并入本文。
价结合。这种平台(称为核糖体展示)已在例如美国专利号7,074,557中进行了描述；所述专
利以引用的方式并入本文。或者，可使用cDNA展示(一种类似于mRNA展示的技术，除了cDNA
而不是mRNA通过嘌呤霉素接头共价结合至抗体产物)来产生抗体。cDNA展示技术提供了能
够在越来越严格的条件下进行淘选步骤的优点，例如，在调整环境的盐浓度、离子强度、pH
和/或温度以便筛选对TNFR2源性肽具有特别高亲和力的抗体的条件下。这是由于双链cDNA
相对于单链mRNA的更高天然稳定性。cDNA展示筛选技术描述于例如Ueno等人(Methods
Mol.Biol.,805:113-135,2012)中；所述文献以引用的方式并入本文。
[0378] 除了产生本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)外，体外展示技术(例如，本文所述的那些和本领域中已知的那些)也提供了用于提高本发明的
抗TNFR2多肽的亲和力的方法。例如，不是筛选含有完全随机化的高变区的抗体及其片段的
文库，而是可筛选特征在于高变区内的特定位点处的靶向突变的抗体及其抗原结合片段的
较窄文库。这可例如通过组装编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的文库来实现，所述
抗体或其抗原结合片段仅在高变区内的特定位点编码随机突变。然后可使用例如核糖体展
示、mRNA展示或cDNA展示技术在例如丝状噬菌体、细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞中或
在体外表达这些多核苷酸，以筛选以提高的结合亲和力特异性地结合TNFR2表位(例如，含
有SEQ ID NO:285或286的序列的肽)的抗体或其抗原结合片段。酵母展示例如非常适合于
亲和力成熟，并且先前已用于将单链抗体的亲和力提高至48fM的KD(Boder等人(Proc
NatlAcad Sci USA 97:10701,2000))。
抗TNFR2多肽的亲和力的方法。例如，不是筛选含有完全随机化的高变区的抗体及其片段的
文库，而是可筛选特征在于高变区内的特定位点处的靶向突变的抗体及其抗原结合片段的
较窄文库。这可例如通过组装编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的文库来实现，所述
抗体或其抗原结合片段仅在高变区内的特定位点编码随机突变。然后可使用例如核糖体展
示、mRNA展示或cDNA展示技术在例如丝状噬菌体、细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞中或
在体外表达这些多核苷酸，以筛选以提高的结合亲和力特异性地结合TNFR2表位(例如，含
有SEQ ID NO:285或286的序列的肽)的抗体或其抗原结合片段。酵母展示例如非常适合于
亲和力成熟，并且先前已用于将单链抗体的亲和力提高至48fM的KD(Boder等人(Proc
NatlAcad Sci USA 97:10701,2000))。
[0379] 可用于本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的产生和亲和力成熟的其他体外技术包括针对能够特异性结合TNFR2源性肽(例如，具有SEQ
ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)的功能性分子筛选抗体或其抗原结合片段的组合文
库。组合抗体文库可例如通过在真核或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机
化高变区的多核苷酸来获得。这可例如使用本文所述的或本领域中已知的基因表达技术来
实现。可例如通过蛋白A或蛋白G选择、尺寸分级柱色谱法、离心、差异溶解度和/或通过用于
纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化抗体的异质混合物。可例如通过将这些抗体的异质
混合物与已经固定至表面的TNFR2源性肽(例如，固定至固相树脂的表面或微量滴定板的孔
的具有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)一起孵育足以允许抗体-抗原结合的一段
时间来筛选如此获得的组合文库的文库。可通过用合适的缓冲液(例如，在生理pH(大约
7.4)下缓冲并含有生理盐浓度和离子强度且任选地含有洗涤剂如TWEEN-20的溶液)洗涤表
面来除去非结合抗体或其片段。随后可例如使用基于ELISA的检测方案来检测保持结合的
抗体(参见例如，美国专利号4,661,445；所述专利以引用的方式并入本文)。
ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)的功能性分子筛选抗体或其抗原结合片段的组合文
库。组合抗体文库可例如通过在真核或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机
化高变区的多核苷酸来获得。这可例如使用本文所述的或本领域中已知的基因表达技术来
实现。可例如通过蛋白A或蛋白G选择、尺寸分级柱色谱法、离心、差异溶解度和/或通过用于
纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化抗体的异质混合物。可例如通过将这些抗体的异质
混合物与已经固定至表面的TNFR2源性肽(例如，固定至固相树脂的表面或微量滴定板的孔
的具有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)一起孵育足以允许抗体-抗原结合的一段
时间来筛选如此获得的组合文库的文库。可通过用合适的缓冲液(例如，在生理pH(大约
7.4)下缓冲并含有生理盐浓度和离子强度且任选地含有洗涤剂如TWEEN-20的溶液)洗涤表
面来除去非结合抗体或其片段。随后可例如使用基于ELISA的检测方案来检测保持结合的
抗体(参见例如，美国专利号4,661,445；所述专利以引用的方式并入本文)。
[0380] 用于针对特异性地结合TNFR2源性肽(例如，含有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)的那些多肽筛选多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的组合文库的另
外技术包括筛选抗体片段的一珠一化合物文库。抗体片段可在由亲水性水溶胀性材料组成
的固体珠上化学合成(例如，使用已建立的分裂与汇集(split-and-pool)固相肽合成方
案)，以使得每个珠展示单个抗体片段。然后可将异质珠混合物与TNFR2源性肽一起孵育，所
述肽任选地用可检测部分(例如，荧光染料)标记或者与表位标签(例如，生物素、抗生物素
蛋白、FLAG标签、HA标签)缀合，所述表位标签随后可通过用互补标签(例如，分别为抗生物
素蛋白、生物素、抗FLAG抗体、抗HA抗体)处理来检测。含有特异性地结合TNFR2源性肽(例
如，含有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)的抗体片段的珠可通过在与荧光标记的
抗原或互补标签一起孵育后分析珠的荧光性质来鉴别(例如，通过共焦荧光显微镜或通过
荧光活化珠分选；参见例如，Muller等人(J.Biol.Chem.,16500-16505,1996)；所述文献以
引用的方式并入本文)。因此，可使含有特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的珠与不含
高亲和力抗体片段的那些珠分离。特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的序列可通过本
领域中已知的技术来确定，所述技术包括例如埃德曼降解(Edman degradation)、串联质
谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(参
见例如，WO 2004/062553；所述专利以引用的方式并入本文)。
外技术包括筛选抗体片段的一珠一化合物文库。抗体片段可在由亲水性水溶胀性材料组成
的固体珠上化学合成(例如，使用已建立的分裂与汇集(split-and-pool)固相肽合成方
案)，以使得每个珠展示单个抗体片段。然后可将异质珠混合物与TNFR2源性肽一起孵育，所
述肽任选地用可检测部分(例如，荧光染料)标记或者与表位标签(例如，生物素、抗生物素
蛋白、FLAG标签、HA标签)缀合，所述表位标签随后可通过用互补标签(例如，分别为抗生物
素蛋白、生物素、抗FLAG抗体、抗HA抗体)处理来检测。含有特异性地结合TNFR2源性肽(例
如，含有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的肽)的抗体片段的珠可通过在与荧光标记的
抗原或互补标签一起孵育后分析珠的荧光性质来鉴别(例如，通过共焦荧光显微镜或通过
荧光活化珠分选；参见例如，Muller等人(J.Biol.Chem.,16500-16505,1996)；所述文献以
引用的方式并入本文)。因此，可使含有特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的珠与不含
高亲和力抗体片段的那些珠分离。特异性地结合TNFR2源性肽的抗体片段的序列可通过本
领域中已知的技术来确定，所述技术包括例如埃德曼降解(Edman degradation)、串联质
谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(参
见例如，WO 2004/062553；所述专利以引用的方式并入本文)。
[0381] 多肽的阴性筛选
[0382] 除了上述用于筛选特异性地结合至源自人TNFR2的促进受体拮抗作用的表位的单链多肽、抗体或抗体片段的方法外，还可另外地进行阴性筛选以消除也可结合含有KCSPG序
列的表位的抗体或抗体片段。例如，可针对也特异性地结合至源自人TNFR2的含有KCSPG基
序的肽，如含有SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18)的肽的
抗体或抗体片段筛选由于任何上述筛选技术而分离的抗体或抗体片段的混合物。这可使用
任何上述方法或其变型来实现，例如，以使得所筛选的抗体或抗体片段是先前鉴别为能够
特异性地结合含有KCRPG序列的一个或多个残基(例如，至少KCR序列)的肽的那些。适用于
阴性筛选的示例性技术包括上文或本领域已知的那些技术，如噬菌体展示、酵母展示、细菌
展示、核糖体展示、mRNA展示、cDNA展示或基于表面的组合文库筛选(例如，呈ELISA格式)。
这种筛选技术代表了用于鉴别拮抗性TNFR2抗体或抗体片段的有用策略，因为已显示能够
结合含有KCSPG序列和KCRPG序列的一个或多个残基的TNFR2表位的抗体或抗体片段缺乏或
具有显著降低的拮抗活性。
列的表位的抗体或抗体片段。例如，可针对也特异性地结合至源自人TNFR2的含有KCSPG基
序的肽，如含有SEQ ID NO:7的残基48-67(QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC，SEQ ID NO:18)的肽的
抗体或抗体片段筛选由于任何上述筛选技术而分离的抗体或抗体片段的混合物。这可使用
任何上述方法或其变型来实现，例如，以使得所筛选的抗体或抗体片段是先前鉴别为能够
特异性地结合含有KCRPG序列的一个或多个残基(例如，至少KCR序列)的肽的那些。适用于
阴性筛选的示例性技术包括上文或本领域已知的那些技术，如噬菌体展示、酵母展示、细菌
展示、核糖体展示、mRNA展示、cDNA展示或基于表面的组合文库筛选(例如，呈ELISA格式)。
这种筛选技术代表了用于鉴别拮抗性TNFR2抗体或抗体片段的有用策略，因为已显示能够
结合含有KCSPG序列和KCRPG序列的一个或多个残基的TNFR2表位的抗体或抗体片段缺乏或
具有显著降低的拮抗活性。
[0383] 非人类哺乳动物的免疫
[0384] 可用于产生本发明的拮抗性TNFR2抗体及其抗原结合片段的另一种策略包括免疫非人哺乳动物。可免疫以产生本发明的拮抗性TNFR2抗体及其片段的非人哺乳动物的实例
包括兔、小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、马和绵羊以及非人灵长类动物。例如，用于免疫灵长
类动物的已建立的程序是本领域中已知的(参见例如，WO 1986/6004782；所述专利以引用
的方式并入本文)。免疫代表了通过利用B淋巴细胞的抗原特异性来产生单克隆抗体的稳健
方法。例如，单克隆抗体可通过Kohler-Millstein程序(描述于例如EP 0110716中；所述专
利以引用的方式并入本文)制备，其中来自非人动物(例如，灵长类动物)的脾细胞用呈递促
进受体拮抗作用的TNFR2源性抗原的肽(例如，含有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的
肽)免疫。通过免疫产生的克隆扩增的B淋巴细胞可从动物的血清中分离且随后与骨髓瘤细
胞融合以形成杂交瘤。杂交瘤是用于抗体产生的特别有用的剂，因为这些永生化细胞可提
供持久的抗原特异性抗体供应。随后可使用本领域中已知的技术(例如通过亲和色谱法使
用诸如蛋白A或蛋白G的试剂从细胞培养基中纯化抗体)来分离来自此类杂交瘤的抗体。
包括兔、小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、仓鼠、马和绵羊以及非人灵长类动物。例如，用于免疫灵长
类动物的已建立的程序是本领域中已知的(参见例如，WO 1986/6004782；所述专利以引用
的方式并入本文)。免疫代表了通过利用B淋巴细胞的抗原特异性来产生单克隆抗体的稳健
方法。例如，单克隆抗体可通过Kohler-Millstein程序(描述于例如EP 0110716中；所述专
利以引用的方式并入本文)制备，其中来自非人动物(例如，灵长类动物)的脾细胞用呈递促
进受体拮抗作用的TNFR2源性抗原的肽(例如，含有SEQ ID NO:285或286的氨基酸序列的
肽)免疫。通过免疫产生的克隆扩增的B淋巴细胞可从动物的血清中分离且随后与骨髓瘤细
胞融合以形成杂交瘤。杂交瘤是用于抗体产生的特别有用的剂，因为这些永生化细胞可提
供持久的抗原特异性抗体供应。随后可使用本领域中已知的技术(例如通过亲和色谱法使
用诸如蛋白A或蛋白G的试剂从细胞培养基中纯化抗体)来分离来自此类杂交瘤的抗体。
[0385] 拮抗性TNFR2多肽缀合物
[0386] 在将本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)施用于哺乳动物受试者(例如人)之前，可能希望使抗体或其片段缀合至第二分子，例如以调节
体内抗体活性。拮抗性TNFR2抗体及其片段可使用本领域中熟知的各种已建立的缀合策略
中的任一种在抗体的轻链或重链的N-末端或C-末端处缀合至其他分子。可用于将拮抗性
TNFR2抗体或其片段共价系连至另一分子的反应性官能团对的实例包括但不限于硫醇对、
羧酸和氨基、酮和氨基、醛和氨基、硫醇和α,β-不饱和部分(如马来酰亚胺或脱氢丙氨酸)、
硫醇和α-卤代酰胺、羧酸和酰肼、醛和酰肼以及酮和酰肼。
体内抗体活性。拮抗性TNFR2抗体及其片段可使用本领域中熟知的各种已建立的缀合策略
中的任一种在抗体的轻链或重链的N-末端或C-末端处缀合至其他分子。可用于将拮抗性
TNFR2抗体或其片段共价系连至另一分子的反应性官能团对的实例包括但不限于硫醇对、
羧酸和氨基、酮和氨基、醛和氨基、硫醇和α,β-不饱和部分(如马来酰亚胺或脱氢丙氨酸)、
硫醇和α-卤代酰胺、羧酸和酰肼、醛和酰肼以及酮和酰肼。
[0387] 拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可通过如所描述的化学缀合直接共价附接至另一分子。或者，可从细胞(例如真核细胞或原核细胞)重组表达
含有拮抗性TNFR2抗体及其片段的融合蛋白。这可例如通过将编码融合蛋白的多核苷酸掺
入细胞的核基因组中(例如，使用本文所述的或本领域中已知的技术)来实现。任选地，可通
过在抗体与接头之间形成共价键来将本发明的抗体及其片段连接至第二分子。然后此接头
可随后与另一分子缀合，或者可在连接至抗TNFR2抗体或其片段之前将接头与另一分子缀
合。可用于形成缀合物的接头的实例包括多肽接头，如含有天然存在的或非天然存在的氨
基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不存在于
天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。可使用化学合成技术(如
本文所述的那些)或通过在细胞(例如原核或真核细胞)中重组表达编码融合蛋白的多核苷
酸来制备含有多肽接头的融合蛋白。接头可使用本领域中熟知的各种策略来制备，并且取
决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件下的水解、在碱性条件下的水解、
氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,
20:571-582,2012)。
含有拮抗性TNFR2抗体及其片段的融合蛋白。这可例如通过将编码融合蛋白的多核苷酸掺
入细胞的核基因组中(例如，使用本文所述的或本领域中已知的技术)来实现。任选地，可通
过在抗体与接头之间形成共价键来将本发明的抗体及其片段连接至第二分子。然后此接头
可随后与另一分子缀合，或者可在连接至抗TNFR2抗体或其片段之前将接头与另一分子缀
合。可用于形成缀合物的接头的实例包括多肽接头，如含有天然存在的或非天然存在的氨
基酸的接头。在一些实施方案中，可能需要在接头中包含D-氨基酸，因为这些残基不存在于
天然存在的蛋白质中并且因此对内源性蛋白酶的降解更具抗性。可使用化学合成技术(如
本文所述的那些)或通过在细胞(例如原核或真核细胞)中重组表达编码融合蛋白的多核苷
酸来制备含有多肽接头的融合蛋白。接头可使用本领域中熟知的各种策略来制备，并且取
决于接头的反应性组分可通过酶水解、光解、在酸性条件下的水解、在碱性条件下的水解、
氧化、二硫化物还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解(Leriche等人,Bioorg.Med.Chem.,
20:571-582,2012)。
[0388] 药物-多肽缀合物
[0389] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)可另外与治疗剂(如细胞毒性分子)缀合、混合或分开施用。本发明的缀合物可适用于治疗或预防与异
常细胞增殖相关的疾病，如本文所述的癌症。可与拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用
的示例性细胞毒性剂包括但不限于，抗肿瘤剂如：阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿考达唑；阿
克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿
那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐
替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹
立明；白消安；放线菌素C(cactinomycin)；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；考布他汀a-4；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；daca(n-[2-(二甲基-氨基)乙基]吖啶-4-甲
酰胺)；更生霉素；盐酸柔红霉素；道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍
宁；地吖醌；多西他赛；多拉司他汀；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸
屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依洛尼塞；椭圆玫瑰树碱(ellipticine)；依沙芦星；恩
洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷
酸钠；依他硝唑；乙碘油i 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；
维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-fdump；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；金au 198；高喜树碱；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福
新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-i a；干扰素γ-i b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司
汀；盐酸洛索蒽醌；马索丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美
诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂
红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达
唑；诺加霉素；奥马他辛；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；过磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗昔康；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜
霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；根霉素；根霉属
d；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲佐菌素；氯化锶sr 89；磺氯苯脲；他利霉
索；紫杉烷；紫杉烷类(taxoid)；替可加兰钠；替加氟；盐酸替托蒽酮；替莫卟吩；替尼泊苷；
替罗昔隆；睾内酯；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；噻替派；thymitaq；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；拓
优得(tomudex)；top53；盐酸托泊替康；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲
曲沙；葡醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊
芬；长春碱；硫酸长春碱；长春新碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹
定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；
折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；2-氯脱氧腺苷；2'脱氧霉素；9-氨基喜树碱；雷替曲塞；N-
炔丙基-5,8-二脱氮叶酸；2氯-2'-阿拉伯糖-氟-2'-脱氧腺苷；2-氯-2'-脱氧腺苷；茴香霉
素；曲古抑菌素A；hPRL-G129R；CEP-751；利诺胺；硫芥；氮芥(nitrogen mustard/mechlor
ethamine)；环磷酰胺；美法仑；苯丁酸氮芥；异环磷酰胺；白消安；N-甲基-亚硝基脲(MNU)；
N,N'-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N'环己基-N-亚硝基脲(CCNU)；N-
(2-氯乙基)-N'-(反式-4-甲基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙基)-N'-(二乙基)
乙基膦酸酯-N-亚硝基脲(福莫司汀)；链脲霉素；达卡巴嗪(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；噻
替派；丝裂霉素C；AZQ；阿多来新；顺铂；卡铂；奥马铂；奥沙利铂；C1-973；DWA 2114R；JM216；
JM335；双(铂)；拓优得；阿扎胞苷；阿糖胞苷；吉西他滨；6-巯基嘌呤；6-硫鸟嘌呤；次黄嘌
呤；替尼泊苷9-氨基喜树碱；托泊替康；CPT-11；阿霉素；道诺霉素；表柔比星；依达比星；米
托蒽醌；洛索蒽醌；更生霉素(放线菌素D)；安吖啶；吡唑吖啶；全反式视黄醇；14-羟基-反-
视黄醇；全反式视黄酸；N-(4-羟基苯基)视黄酰胺；13-顺式视黄酸；3-甲基TTNEB；9-顺式视
黄酸；氟达拉滨(2-F-ara-AMP)；或2-氯脱氧腺苷(2-Cda)。
常细胞增殖相关的疾病，如本文所述的癌症。可与拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用
的示例性细胞毒性剂包括但不限于，抗肿瘤剂如：阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿考达唑；阿
克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿
那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐
替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹
立明；白消安；放线菌素C(cactinomycin)；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；考布他汀a-4；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；daca(n-[2-(二甲基-氨基)乙基]吖啶-4-甲
酰胺)；更生霉素；盐酸柔红霉素；道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍
宁；地吖醌；多西他赛；多拉司他汀；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸
屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依洛尼塞；椭圆玫瑰树碱(ellipticine)；依沙芦星；恩
洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷
酸钠；依他硝唑；乙碘油i 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法屈唑；法扎拉滨；
维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-fdump；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；金au 198；高喜树碱；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福
新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-i a；干扰素γ-i b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司
汀；盐酸洛索蒽醌；马索丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美
诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂
红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达
唑；诺加霉素；奥马他辛；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；过磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗昔康；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜
霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；根霉素；根霉属
d；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲佐菌素；氯化锶sr 89；磺氯苯脲；他利霉
索；紫杉烷；紫杉烷类(taxoid)；替可加兰钠；替加氟；盐酸替托蒽酮；替莫卟吩；替尼泊苷；
替罗昔隆；睾内酯；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；噻替派；thymitaq；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；拓
优得(tomudex)；top53；盐酸托泊替康；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲
曲沙；葡醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊
芬；长春碱；硫酸长春碱；长春新碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹
定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；
折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；2-氯脱氧腺苷；2'脱氧霉素；9-氨基喜树碱；雷替曲塞；N-
炔丙基-5,8-二脱氮叶酸；2氯-2'-阿拉伯糖-氟-2'-脱氧腺苷；2-氯-2'-脱氧腺苷；茴香霉
素；曲古抑菌素A；hPRL-G129R；CEP-751；利诺胺；硫芥；氮芥(nitrogen mustard/mechlor
ethamine)；环磷酰胺；美法仑；苯丁酸氮芥；异环磷酰胺；白消安；N-甲基-亚硝基脲(MNU)；
N,N'-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N'环己基-N-亚硝基脲(CCNU)；N-
(2-氯乙基)-N'-(反式-4-甲基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙基)-N'-(二乙基)
乙基膦酸酯-N-亚硝基脲(福莫司汀)；链脲霉素；达卡巴嗪(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；噻
替派；丝裂霉素C；AZQ；阿多来新；顺铂；卡铂；奥马铂；奥沙利铂；C1-973；DWA 2114R；JM216；
JM335；双(铂)；拓优得；阿扎胞苷；阿糖胞苷；吉西他滨；6-巯基嘌呤；6-硫鸟嘌呤；次黄嘌
呤；替尼泊苷9-氨基喜树碱；托泊替康；CPT-11；阿霉素；道诺霉素；表柔比星；依达比星；米
托蒽醌；洛索蒽醌；更生霉素(放线菌素D)；安吖啶；吡唑吖啶；全反式视黄醇；14-羟基-反-
视黄醇；全反式视黄酸；N-(4-羟基苯基)视黄酰胺；13-顺式视黄酸；3-甲基TTNEB；9-顺式视
黄酸；氟达拉滨(2-F-ara-AMP)；或2-氯脱氧腺苷(2-Cda)。
[0390] 可与本发明的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段缀合、混合或分开施用以治疗与异常细胞增殖相关的疾病、预防或研究所述疾病的进展的其他治疗性化合物包
括但不限于，细胞毒性剂如20-pi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；酰基
富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多；阿米
福汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；雄茸交酯；血管生成抑制剂；
拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；
抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸蚜肠霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；嘌呤酸；
ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁；阿他美坦；阿莫司汀；阿新司坦汀1；阿新司坦
汀2；阿新司坦汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；巴卡亭III衍生物；班兰诺；巴马司他；
BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿立辛；贝他霉素B；
桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双萘法德；双崔特(bistratene)
A；比折来新；比锐来特(breflate)；博来霉素A2；博来霉素B2；溴匹立明；布多替钛；丁硫氨
酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物(例如，10-羟基-喜树碱)；金丝雀痘IL-2；
卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰氨基三唑；CaRestM3；CARN 700；软骨来源抑制剂；卡
折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰
胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里斯霉素A；克里斯霉素B；考
布他丁A4；考布他汀类似物；考那格宁(conagenin)；卡那贝西汀(crambescidin)816；克雷
斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；卡拉新(curacin)A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；次
帕霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单
抗；地西他滨；去氢膜海鞘素B；2'脱氧助间型霉素(DCF)；地洛瑞林；右异环磷酰胺；右雷佐
生；右维拉帕米；亚丝醌；膜海鞘素B；地多西(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞嘧啶
核苷；9-二氢紫杉醇；二噁霉素；二苯基螺莫司汀；圆皮海绵内酯(discodermolide)；二十二
醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地
福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；埃博霉素(A，R＝H；B，R＝Me)；
埃坡霉素(epithilone)；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝
唑；依托泊苷；4'-磷酸依托泊苷(etopofos)；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非
格司亭；非那雄安；夫拉平度；氟卓斯汀；氟海星酮；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；
福美司坦；福司曲星；福莫司汀；钆德克萨卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制
剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；和普苏姆；和瑞古林；六亚甲基双乙酰胺；高三尖杉酯碱
(HHT)；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；
白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯苦醇；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；异苯胍唑；异
高软海绵素B；伊他司琼；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；三
乙酸片螺素-N；兰乐肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸香菇多糖；利特斯塔汀
(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙
瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；立索克林酰胺
(lissoclinamide)7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；
勒托替康；德克萨斯卟啉镥；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美登素；抑甘露糖苷酶素
(mannostatin)A；马马司他(marimastat)；马索罗酚；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂；基
质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制
剂；美服培酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；光神霉素(mithracin)；米托胍腙；二溴卫
矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法
罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体、人类绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；
莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制因子1的治疗剂；芥末抗癌剂；美卡普罗
B；分枝杆菌细胞壁提取物；美瑞泡仁(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代苯甲酰胺；那
法瑞林；纳格瑞替；纳洛酮+戊唑星；纳普维；萘特非；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；丽沙霉素；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；里挫林；06-苄
基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克恩；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉新；口服细胞因
子诱导剂、奥马铂；奥沙特隆；奥赛力铂；厄诺霉素；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明；
十六酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；帕拉贝新；帕折普汀；培门冬酶；皮地新
(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他汀；戊四唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏
子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；皮西板尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克
辛；普来司汀A；普来司汀B；血纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺
络合物；鬼臼毒素；卟吩姆钠；泊非霉素；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶抑制剂；基于蛋
白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；
嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑并吖啶；吡哆醛化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮
抗剂；雷替曲赛；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲
基化瑞替立汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫
肽；罗喹美克；鲁滨吉隆(rubiginone)B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈；圣特平(saintopin)；
SarCNU；沙卡弗托A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；有义寡核苷酸；
信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐糖；索布佐生；硼卡钠；苯基乙
酸钠；索佛罗；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；斯皮卡霉素(spicamycin)D；螺莫司
汀；斯兰罗皮汀；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂；斯替匹酰胺
(stipiamide)；基质溶素抑制剂；索非罗新；超活性血管活性肠肽拮抗剂；苏拉迪司塔
(suradista)；苏拉明；苦马豆素；合成葡糖氨基葡聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫
司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；碲哌喃鎓；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼
泊苷；四氯十氧化物；替唑明；噻立拉斯汀(thaliblastine)；萨力多胺；噻考瑞林；血小板生
成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激
素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；托泊替康；托普升替；托瑞米芬；全能干细胞因
子；翻译抑制剂、维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄
脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长
抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡瑞林B；载体系统、红细胞基因治疗剂；维拉雷琐；
凡拉明；凡啶；维替泊芬；维萨汀；维他欣；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；
以及净司他丁斯酯。
括但不限于，细胞毒性剂如20-pi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；酰基
富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；艾美多；阿米
福汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；雄茸交酯；血管生成抑制剂；
拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；
抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸蚜肠霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；嘌呤酸；
ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；奥沙那宁；阿他美坦；阿莫司汀；阿新司坦汀1；阿新司坦
汀2；阿新司坦汀3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；巴卡亭III衍生物；班兰诺；巴马司他；
BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-阿立辛；贝他霉素B；
桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双萘法德；双崔特(bistratene)
A；比折来新；比锐来特(breflate)；博来霉素A2；博来霉素B2；溴匹立明；布多替钛；丁硫氨
酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物(例如，10-羟基-喜树碱)；金丝雀痘IL-2；
卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰氨基三唑；CaRestM3；CARN 700；软骨来源抑制剂；卡
折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰
胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里斯霉素A；克里斯霉素B；考
布他丁A4；考布他汀类似物；考那格宁(conagenin)；卡那贝西汀(crambescidin)816；克雷
斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；卡拉新(curacin)A；环戊蒽醌；环铂(cycloplatam)；次
帕霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷酯；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单
抗；地西他滨；去氢膜海鞘素B；2'脱氧助间型霉素(DCF)；地洛瑞林；右异环磷酰胺；右雷佐
生；右维拉帕米；亚丝醌；膜海鞘素B；地多西(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞嘧啶
核苷；9-二氢紫杉醇；二噁霉素；二苯基螺莫司汀；圆皮海绵内酯(discodermolide)；二十二
醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地
福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；埃博霉素(A，R＝H；B，R＝Me)；
埃坡霉素(epithilone)；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝
唑；依托泊苷；4'-磷酸依托泊苷(etopofos)；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非
格司亭；非那雄安；夫拉平度；氟卓斯汀；氟海星酮；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；
福美司坦；福司曲星；福莫司汀；钆德克萨卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制
剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；和普苏姆；和瑞古林；六亚甲基双乙酰胺；高三尖杉酯碱
(HHT)；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；
白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯苦醇；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；异苯胍唑；异
高软海绵素B；伊他司琼；杰斯普拉克立德(jasplakinolide)；卡哈拉得(kahalalide)F；三
乙酸片螺素-N；兰乐肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；硫酸香菇多糖；利特斯塔汀
(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+雌激素+孕酮；亮丙
瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；立索克林酰胺
(lissoclinamide)7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；
勒托替康；德克萨斯卟啉镥；立索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美登素；抑甘露糖苷酶素
(mannostatin)A；马马司他(marimastat)；马索罗酚；马司非(maspin)；基质溶素抑制剂；基
质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制
剂；美服培酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；光神霉素(mithracin)；米托胍腙；二溴卫
矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法
罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体、人类绒毛膜促性腺激素；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；
莫哌达醇；多重抗药性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制因子1的治疗剂；芥末抗癌剂；美卡普罗
B；分枝杆菌细胞壁提取物；美瑞泡仁(myriaporone)；N-乙酰基地那林；N-取代苯甲酰胺；那
法瑞林；纳格瑞替；纳洛酮+戊唑星；纳普维；萘特非；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；丽沙霉素；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；里挫林；06-苄
基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克恩；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉新；口服细胞因
子诱导剂、奥马铂；奥沙特隆；奥赛力铂；厄诺霉素；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕诺明；
十六酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；帕拉贝新；帕折普汀；培门冬酶；皮地新
(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他汀；戊四唑(pentrozole)；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏
子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；皮西板尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克
辛；普来司汀A；普来司汀B；血纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺
络合物；鬼臼毒素；卟吩姆钠；泊非霉素；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶抑制剂；基于蛋
白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂、微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；
嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑并吖啶；吡哆醛化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮
抗剂；雷替曲赛；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲
基化瑞替立汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫
肽；罗喹美克；鲁滨吉隆(rubiginone)B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈；圣特平(saintopin)；
SarCNU；沙卡弗托A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源性抑制剂1；有义寡核苷酸；
信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐糖；索布佐生；硼卡钠；苯基乙
酸钠；索佛罗；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；斯皮卡霉素(spicamycin)D；螺莫司
汀；斯兰罗皮汀；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂；斯替匹酰胺
(stipiamide)；基质溶素抑制剂；索非罗新；超活性血管活性肠肽拮抗剂；苏拉迪司塔
(suradista)；苏拉明；苦马豆素；合成葡糖氨基葡聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫
司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；喃氟啶；碲哌喃鎓；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；替莫唑胺；替尼
泊苷；四氯十氧化物；替唑明；噻立拉斯汀(thaliblastine)；萨力多胺；噻考瑞林；血小板生
成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激
素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；托泊替康；托普升替；托瑞米芬；全能干细胞因
子；翻译抑制剂、维甲酸；三乙酰基尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄
脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长
抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；凡瑞林B；载体系统、红细胞基因治疗剂；维拉雷琐；
凡拉明；凡啶；维替泊芬；维萨汀；维他欣；伏罗唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C(zilascorb)；
以及净司他丁斯酯。
[0391] 标记的抗TNFR2多肽
[0392] 在一些实施方案中，拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段可出于纯化或检测的目的与另一分子(例如表位标签)缀合。可用于蛋白质纯化的此类分子的实例包括呈
现能够被第二分子识别的结构表位的那些分子。这是通过亲和色谱法在蛋白质纯化中采用
的常用策略，其中将分子固定在固体支撑物上并暴露于含有与能够结合固定的化合物的分
子缀合的靶蛋白的异质混合物。可出于分子识别的目的与拮抗性TNFR2抗体或其片段缀合
的表位标签分子的实例包括但不限于麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、多组氨酸标
签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这些分子呈
递的表位的缀合物能够分别被此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合物、抗FLAG抗
体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)识别。例如，可通过用含有互补分子的固相
树脂处理其他蛋白质和生物分子(例如，DNA、RNA、碳水化合物、磷脂等)的复杂混合物来纯
化已经与来自所述混合物的表位标签缀合的本发明的拮抗性TNFR2抗体或其片段，所述互
补分子可选择性地识别并结合所述拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的表位标签。固相树脂的
实例包括琼脂糖珠，其与水溶液中的纯化相容。
现能够被第二分子识别的结构表位的那些分子。这是通过亲和色谱法在蛋白质纯化中采用
的常用策略，其中将分子固定在固体支撑物上并暴露于含有与能够结合固定的化合物的分
子缀合的靶蛋白的异质混合物。可出于分子识别的目的与拮抗性TNFR2抗体或其片段缀合
的表位标签分子的实例包括但不限于麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、多组氨酸标
签、FLAG-标签、myc-标签、人流感血凝素(HA)标签、生物素、链霉亲和素。含有由这些分子呈
递的表位的缀合物能够分别被此类互补分子(如麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合物、抗FLAG抗
体、抗myc抗体、抗HA抗体、链霉亲和素或生物素)识别。例如，可通过用含有互补分子的固相
树脂处理其他蛋白质和生物分子(例如，DNA、RNA、碳水化合物、磷脂等)的复杂混合物来纯
化已经与来自所述混合物的表位标签缀合的本发明的拮抗性TNFR2抗体或其片段，所述互
补分子可选择性地识别并结合所述拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的表位标签。固相树脂的
实例包括琼脂糖珠，其与水溶液中的纯化相容。
[0393] 本发明的拮抗性TNFR2单链多肽、抗体或其抗原结合片段也可共价附接至荧光分子，例如以通过荧光测定法和/或通过使用荧光显微镜直接可视化来检测所述抗体或其抗
原结合片段。可与本发明的抗体缀合的示例性荧光分子包括绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、
黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚
(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗丹明和花菁。适用于与本发明的抗体
缀合的荧光分子的其他实例是本领域中熟知的，并且已在例如美国专利号7,417,131和7,
413,874中进行了详细描述，所述专利各自以引用的方式并入本文。
原结合片段。可与本发明的抗体缀合的示例性荧光分子包括绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、
黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、赫斯特、4',6-二脒基-2-苯基吲哚
(DAPI)、碘化丙啶、荧光素、香豆素、罗丹明、四甲基罗丹明和花菁。适用于与本发明的抗体
缀合的荧光分子的其他实例是本领域中熟知的，并且已在例如美国专利号7,417,131和7,
413,874中进行了详细描述，所述专利各自以引用的方式并入本文。
[0394] 含有荧光分子的拮抗性TNFR2多肽特别适用于监测本发明的抗体及其片段的细胞表面定位性质。例如，可使培养的哺乳动物细胞(例如，T-reg细胞)暴露于已与荧光分子共
价缀合的本发明的拮抗性TNFR2抗体或其片段，并且随后使用本领域中已知的常规荧光显
微镜技术分析这些细胞。共聚焦荧光显微镜是用于确定拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的细
胞表面定位的特别有效的方法，因为可分析细胞的各个平面以区分已经内化到细胞内部
(例如通过受体介导的内吞作用)的抗体或其片段与结合至细胞膜外表面的那些抗体或其
片段。另外，可用缀合至发射特定波长的可见光的荧光分子(例如，荧光素，其在约535nm下
发荧光)和另一荧光分子的拮抗性TNFR2抗体处理细胞，所述另一荧光分子已知定位于T-
reg细胞表面上的特定位点并且在不同波长下发荧光(例如，定位于CD25并且在约599nm下
发荧光的分子)。可通过共聚焦荧光显微镜可视化所得发射图案，并且可合并来自这两个波
长的图像，以揭示关于拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段在T-reg细胞表面上相对于其他
受体的位置的信息。
价缀合的本发明的拮抗性TNFR2抗体或其片段，并且随后使用本领域中已知的常规荧光显
微镜技术分析这些细胞。共聚焦荧光显微镜是用于确定拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的细
胞表面定位的特别有效的方法，因为可分析细胞的各个平面以区分已经内化到细胞内部
(例如通过受体介导的内吞作用)的抗体或其片段与结合至细胞膜外表面的那些抗体或其
片段。另外，可用缀合至发射特定波长的可见光的荧光分子(例如，荧光素，其在约535nm下
发荧光)和另一荧光分子的拮抗性TNFR2抗体处理细胞，所述另一荧光分子已知定位于T-
reg细胞表面上的特定位点并且在不同波长下发荧光(例如，定位于CD25并且在约599nm下
发荧光的分子)。可通过共聚焦荧光显微镜可视化所得发射图案，并且可合并来自这两个波
长的图像，以揭示关于拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段在T-reg细胞表面上相对于其他
受体的位置的信息。
[0395] 为了检测和可视化拮抗性抗TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其片段)，也可将生物发光蛋白掺入融合蛋白中。生物发光蛋白(如荧光素酶和水母发光蛋白)作为与底物(例如
荧光素和腔肠素)的化学反应的一部分发光。适合用作诊断序列的示例性生物发光蛋白及
其使用方法描述于例如美国专利号5,292,658、5,670,356、6,171,809和7,183,092中，所述
专利各自以引用的方式并入本文。用生物发光蛋白标记的拮抗性TNFR2抗体或其片段是在
体外测定后检测本发明抗体的有用工具。例如，可通过使用本领域中已知的凝胶电泳方法
(例如，天然凝胶分析)分离另外蛋白质的复杂混合物的组分且随后将分离的蛋白质转移到
膜上以进行蛋白质印迹来在所述混合物中检测已与生物发光蛋白缀合的拮抗性TNFR2抗体
的存在。可通过用适当的荧光素酶底物处理膜并随后使用已建立的方案使膜上的蛋白质混
合物可视化来实现在其他蛋白质的混合物中检测拮抗性TNFR2抗体。
荧光素和腔肠素)的化学反应的一部分发光。适合用作诊断序列的示例性生物发光蛋白及
其使用方法描述于例如美国专利号5,292,658、5,670,356、6,171,809和7,183,092中，所述
专利各自以引用的方式并入本文。用生物发光蛋白标记的拮抗性TNFR2抗体或其片段是在
体外测定后检测本发明抗体的有用工具。例如，可通过使用本领域中已知的凝胶电泳方法
(例如，天然凝胶分析)分离另外蛋白质的复杂混合物的组分且随后将分离的蛋白质转移到
膜上以进行蛋白质印迹来在所述混合物中检测已与生物发光蛋白缀合的拮抗性TNFR2抗体
的存在。可通过用适当的荧光素酶底物处理膜并随后使用已建立的方案使膜上的蛋白质混
合物可视化来实现在其他蛋白质的混合物中检测拮抗性TNFR2抗体。
[0396] 本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)也可与包含放射性核的分子缀合，以使得可通过分析核的放射性发射图案来检测本发明的抗体或其片段。或者，
可通过在蛋白质制备过程中在抗体内掺入放射性核来直接修饰拮抗性TNFR2抗体或其片
段。甲硫氨酸(35S)、氮(15N)或碳(13C)的放射性同位素可通过例如在补充有含有这些同位素
的营养素的培养基中培养细菌而掺入本发明的抗体或其片段中。任选地，含有放射性卤素
的酪氨酸衍生物可通过例如在补充有放射性标记的酪氨酸的培养基中培养细菌细胞而掺
入拮抗性TNFR2抗体或其片段中。已经表明，使用体内内源性翻译酶，在酚系统的C2位置用
放射性卤素官能化的酪氨酸迅速掺入延伸多肽链中(美国专利号4,925,651；所述专利以引
用的方式并入本文)。卤素包括氟、氯、溴、碘和砹。另外，拮抗性TNFR2抗体或其片段可在通
过用放射性同位素官能化本发明的抗体或其片段从细胞培养物中分离和纯化后进行修饰。
卤素代表一类同位素，所述同位素可通过酪氨酸或色氨酸处的芳族取代而容易地掺入纯化
的蛋白质中，例如通过这些残基中的一个或多个与亲电子卤素物质的反应。放射性卤素同
位素的实例包括18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I或211At。
可通过在蛋白质制备过程中在抗体内掺入放射性核来直接修饰拮抗性TNFR2抗体或其片
段。甲硫氨酸(35S)、氮(15N)或碳(13C)的放射性同位素可通过例如在补充有含有这些同位素
的营养素的培养基中培养细菌而掺入本发明的抗体或其片段中。任选地，含有放射性卤素
的酪氨酸衍生物可通过例如在补充有放射性标记的酪氨酸的培养基中培养细菌细胞而掺
入拮抗性TNFR2抗体或其片段中。已经表明，使用体内内源性翻译酶，在酚系统的C2位置用
放射性卤素官能化的酪氨酸迅速掺入延伸多肽链中(美国专利号4,925,651；所述专利以引
用的方式并入本文)。卤素包括氟、氯、溴、碘和砹。另外，拮抗性TNFR2抗体或其片段可在通
过用放射性同位素官能化本发明的抗体或其片段从细胞培养物中分离和纯化后进行修饰。
卤素代表一类同位素，所述同位素可通过酪氨酸或色氨酸处的芳族取代而容易地掺入纯化
的蛋白质中，例如通过这些残基中的一个或多个与亲电子卤素物质的反应。放射性卤素同
位素的实例包括18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I或211At。
[0397] 用于掺入放射性同位素的另一种替代策略是螯合基团与拮抗性抗TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其片段)的共价连接。可通过连接至反应性官能团(如硫醇、氨基、醇或羧
酸)来使螯合基团共价附接至拮抗性TNFR2抗体或其片段。然后可将螯合基团修饰为含有各
125 67
种金属放射性同位素中的任一种，所述金属放射性同位素包括但不限于诸如 I、Ga、
111In、99Tc、169Yb、186Re、123I、124I、125I、131I、99mTc、111In、64Cu、67Cu、186Re、188Re、177Lu、90Y、77As、72As、86Y、89Zr、211At、212Bi、213Bi或225Ac的此类放射性核素。
酸)来使螯合基团共价附接至拮抗性TNFR2抗体或其片段。然后可将螯合基团修饰为含有各
125 67
种金属放射性同位素中的任一种，所述金属放射性同位素包括但不限于诸如 I、Ga、
111In、99Tc、169Yb、186Re、123I、124I、125I、131I、99mTc、111In、64Cu、67Cu、186Re、188Re、177Lu、90Y、77As、72As、86Y、89Zr、211At、212Bi、213Bi或225Ac的此类放射性核素。
[0398] 在一些实施方案中，可能希望将本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体或其片段)与3+ 3+ 3+ 2+
能够结合来自重元素或稀土离子的金属离子(如Gd 、Fe 、Mn 或Cr )的螯合基团共价缀
合。含有与此类顺磁性金属配位的螯合基团的缀合物可用于MRI成像应用。顺磁性金属包括
但不限于铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)以及镱(III)。以这种方式，可通过MRI
光谱检测拮抗性TNFR2抗体。例如，可将缀合至与顺磁性离子结合的螯合基团的拮抗性
TNFR2抗体或其片段施用至哺乳动物受试者(例如，人患者)，以监测施用后抗体的分布。这
可通过本文所述的任何施用途径(如静脉内)向患者施用所述抗体并且随后通过根据建立
的方案记录患者的MRI来分析所施用的抗体的位置而实现。
能够结合来自重元素或稀土离子的金属离子(如Gd 、Fe 、Mn 或Cr )的螯合基团共价缀
合。含有与此类顺磁性金属配位的螯合基团的缀合物可用于MRI成像应用。顺磁性金属包括
但不限于铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)以及镱(III)。以这种方式，可通过MRI
光谱检测拮抗性TNFR2抗体。例如，可将缀合至与顺磁性离子结合的螯合基团的拮抗性
TNFR2抗体或其片段施用至哺乳动物受试者(例如，人患者)，以监测施用后抗体的分布。这
可通过本文所述的任何施用途径(如静脉内)向患者施用所述抗体并且随后通过根据建立
的方案记录患者的MRI来分析所施用的抗体的位置而实现。
[0399] 拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可另外与其他分子缀合，以提高蛋白质在水溶液中的溶解度和稳定性。此类分子的实例包括PEG、PSA、牛血清
白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)等。例如，可使拮抗性TNFR2抗体或其片段与碳水化合物
部分缀合，以避免接受治疗的患者的免疫系统检测所述抗体或其片段。这种高糖基化过程
通过空间抑制蛋白质与循环中的B细胞受体的相互作用而降低治疗性蛋白质的免疫原性。
或者，拮抗性TNFR2抗体或其片段可与防止从人血清中清除并改进本发明抗体的药代动力
学概况的分子缀合。可缀合或插入本发明的抗TNFR2抗体或其片段内以减弱清除并改进这
些抗体和片段的药代动力学概况的示例性分子包括补救受体结合表位。这些表位在IgG免
疫球蛋白的Fc区内发现，并且已显示结合Fc受体并延长人血清中的抗体半衰期。将补救受
体结合表位插入抗TNFR2抗体或其片段中可例如，如美国专利号5,739,277中所描述来实
现；所述专利以引用的方式并入本文。
白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)等。例如，可使拮抗性TNFR2抗体或其片段与碳水化合物
部分缀合，以避免接受治疗的患者的免疫系统检测所述抗体或其片段。这种高糖基化过程
通过空间抑制蛋白质与循环中的B细胞受体的相互作用而降低治疗性蛋白质的免疫原性。
或者，拮抗性TNFR2抗体或其片段可与防止从人血清中清除并改进本发明抗体的药代动力
学概况的分子缀合。可缀合或插入本发明的抗TNFR2抗体或其片段内以减弱清除并改进这
些抗体和片段的药代动力学概况的示例性分子包括补救受体结合表位。这些表位在IgG免
疫球蛋白的Fc区内发现，并且已显示结合Fc受体并延长人血清中的抗体半衰期。将补救受
体结合表位插入抗TNFR2抗体或其片段中可例如，如美国专利号5,739,277中所描述来实
现；所述专利以引用的方式并入本文。
[0400] 修饰的拮抗性TFNR2多肽
[0401] 除了与其他治疗剂和标记缀合以进行鉴别或可视化外，还可修饰本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)以改进其药代动力学概况、生物物
理稳定性或抑制能力。例如，任何不参与维持抗TNFR2抗体或其片段的正确构象的半胱氨酸
残基可被异构或等电子氨基酸(例如丝氨酸)取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交
联。相反，可将一个或多个胱氨酸键添加至抗体或其片段以改善其稳定性(特别是当抗体是
抗体片段，如Fv片段时)。这可例如通过改变编码抗体重链和轻链的多核苷酸或编码抗体片
段的多核苷酸以编码一个或多个另外的半胱氨酸残基对来实现，所述半胱氨酸残基可在氧
化条件下形成二硫键以增强抗体三级结构(参见例如，美国专利号7,422,899；所述专利以
引用的方式并入本文)。
理稳定性或抑制能力。例如，任何不参与维持抗TNFR2抗体或其片段的正确构象的半胱氨酸
残基可被异构或等电子氨基酸(例如丝氨酸)取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交
联。相反，可将一个或多个胱氨酸键添加至抗体或其片段以改善其稳定性(特别是当抗体是
抗体片段，如Fv片段时)。这可例如通过改变编码抗体重链和轻链的多核苷酸或编码抗体片
段的多核苷酸以编码一个或多个另外的半胱氨酸残基对来实现，所述半胱氨酸残基可在氧
化条件下形成二硫键以增强抗体三级结构(参见例如，美国专利号7,422,899；所述专利以
引用的方式并入本文)。
[0402] 可对本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)进行的另一种有用的修饰包括改变这些抗体及其片段的糖基化概况。这可例如通过在拮抗性TNFR2
抗体中取代、插入或缺失氨基酸以插入或除去糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常以N-
连接或O-连接的方式发生。N-连接糖基化是其中碳水化合物部分与抗体的连接发生在天冬
酰胺残基的侧链处的过程。用于N-连接糖基化的共有氨基酸序列包括三肽序列天冬酰胺-
X-丝氨酸(NXS)和天冬酰胺-X-苏氨酸(NXT)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。将这些
三肽序列中的任一个插入多肽(例如，抗TNFR2抗体)中产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基
化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨
酸或苏氨酸，但是5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也是糖苷形成的有效底物。因此，可通过改
变TNFR2抗体的氨基酸序列(例如，使用如本文所述的重组表达技术)来实现将糖基化位点
添加至所述抗体，以使得所述抗体含有上述三肽序列中的一个或多个以促进N-连接的糖基
化，或者原始抗体的序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基产生O-连接的糖基化(参见例
如，美国专利号7,422,899；所述专利以引用的方式并入本文)。
抗体中取代、插入或缺失氨基酸以插入或除去糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常以N-
连接或O-连接的方式发生。N-连接糖基化是其中碳水化合物部分与抗体的连接发生在天冬
酰胺残基的侧链处的过程。用于N-连接糖基化的共有氨基酸序列包括三肽序列天冬酰胺-
X-丝氨酸(NXS)和天冬酰胺-X-苏氨酸(NXT)，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。将这些
三肽序列中的任一个插入多肽(例如，抗TNFR2抗体)中产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基
化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨
酸或苏氨酸，但是5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也是糖苷形成的有效底物。因此，可通过改
变TNFR2抗体的氨基酸序列(例如，使用如本文所述的重组表达技术)来实现将糖基化位点
添加至所述抗体，以使得所述抗体含有上述三肽序列中的一个或多个以促进N-连接的糖基
化，或者原始抗体的序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基产生O-连接的糖基化(参见例
如，美国专利号7,422,899；所述专利以引用的方式并入本文)。
[0403] 在替代情况下，就效应子功能而言，可能需要修饰本发明的抗体或其片段，例如以便增强所述抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性
(CDC)。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，可将半胱氨酸
残基引入抗TNFR2抗体或其片段的Fc区中(例如，通过如本文所述的重组表达技术)，以促进
此区域中的额外链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可具有增加的构象约束，这可
促进提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具
有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体也可以使用如，例如在Wolff等人(Canc.Res.,53:
2560-2565,1993)中描述的异双功能交联剂来制备；所述文献以引用的方式并入本文。或
者，可工程化具有双Fc区的抗体，并且所述抗体可由此具有增强的补体溶解和ADCC能力(参
见Stevenson等人(Anti-Canc.Drug Des.,3:219-230,1989)；所述文献以引用的方式并入
本文)。
(CDC)。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，可将半胱氨酸
残基引入抗TNFR2抗体或其片段的Fc区中(例如，通过如本文所述的重组表达技术)，以促进
此区域中的额外链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可具有增加的构象约束，这可
促进提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。具
有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体也可以使用如，例如在Wolff等人(Canc.Res.,53:
2560-2565,1993)中描述的异双功能交联剂来制备；所述文献以引用的方式并入本文。或
者，可工程化具有双Fc区的抗体，并且所述抗体可由此具有增强的补体溶解和ADCC能力(参
见Stevenson等人(Anti-Canc.Drug Des.,3:219-230,1989)；所述文献以引用的方式并入
本文)。
[0404] 在一些实施方案中，可通过掺入一种或多种氨基酸修饰(如通过改变Fab结构域的CH1或CL区以引入补救受体基序(例如在IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中发现的补救受
体基序)来改进本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的血清
半衰期。此类改变例如在美国专利号5,869,046和美国专利号6,121,022中进行了描述；所
述专利以引用的方式并入本文。还可进行另外的框架修饰以降低抗体或其片段的免疫原性
或减少或除去其中存在的T细胞表位，如例如在US2003/0153043中所描述；所述专利以引用
的方式并入本文。
体基序)来改进本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的血清
半衰期。此类改变例如在美国专利号5,869,046和美国专利号6,121,022中进行了描述；所
述专利以引用的方式并入本文。还可进行另外的框架修饰以降低抗体或其片段的免疫原性
或减少或除去其中存在的T细胞表位，如例如在US2003/0153043中所描述；所述专利以引用
的方式并入本文。
[0405] 治疗方法
[0406] 含有源自表型-中性TNFR2抗体的CDR-H1和CDR-H2以及由下式表示的CDR-H3的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可用于
治疗患有细胞增殖病症(如本文所述的癌症)、感染性疾病(如本文所述的病毒、细菌、真菌
1 2 4 3 5 5 2 5
或寄生虫感染)或由TNFR2信号传导介导的另一种疾病的患者：JZJZ ZJZJZ (J)2ZZZ 或
JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2(其中每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在
生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧
链的天然存在的氨基酸，每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存
在的氨基酸，每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸，并且每个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然
存在的氨基酸)。
治疗患有细胞增殖病症(如本文所述的癌症)、感染性疾病(如本文所述的病毒、细菌、真菌
1 2 4 3 5 5 2 5
或寄生虫感染)或由TNFR2信号传导介导的另一种疾病的患者：JZJZ ZJZJZ (J)2ZZZ 或
JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2(其中每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在
生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧
链的天然存在的氨基酸，每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存
在的氨基酸，每个Z4独立地是甘氨酸或丙氨酸，并且每个Z5独立地是含有疏水性侧链的天然
存在的氨基酸)。
[0407] 例如，含有源自表型-中性TNFR2抗体的CDR-H1和CDR-H2以及由下式表示的CDR-H3的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)可
用于治疗患有细胞增殖病症(如本文所述的癌症)、感染性疾病(如本文所述的病毒、细菌、
真菌或寄生虫感染)或由TNFR2信号传导介导的另一种疾病的患者：JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ
1 2 4 3 5 5 2 5
ID NO:278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)、QZ VZ ZYZSZWYZZ Z (SEQ ID NO:
265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)。
用于治疗患有细胞增殖病症(如本文所述的癌症)、感染性疾病(如本文所述的病毒、细菌、
真菌或寄生虫感染)或由TNFR2信号传导介导的另一种疾病的患者：JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ
1 2 4 3 5 5 2 5
ID NO:278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:279)、QZ VZ ZYZSZWYZZ Z (SEQ ID NO:
265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)。
[0408] 在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFRAB1并且具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。CDR-H3可源自TNFRAB2并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:
259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ
ID NO:284)。
259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ
ID NO:284)。
[0409] 治疗细胞增殖病症的方法
[0410] 本发明的拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)是用于治疗多种癌症和细胞增殖病症的有用治疗剂。拮抗性TNFR2多肽，
如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可施用于患有细胞增
殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(如人)，例如以增强针对靶癌细胞的适应性免疫响应的
有效性。
如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可施用于患有细胞增
殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(如人)，例如以增强针对靶癌细胞的适应性免疫响应的
有效性。
[0411] 特别地，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可施用于哺乳动物受试者(如人)，以减少或抑制T-reg细胞生长和活化，其允许肿瘤浸润性
T淋巴细胞定位于呈递肿瘤相关抗原的细胞并促进细胞毒性。此外，本发明的多肽可与现有
的过继性T细胞治疗平台协同作用，因为关于这种策略的有效性的限制之一一直是难以在
输注到哺乳动物受试者(例如，人)后延长肿瘤反应性T细胞的细胞毒性。本发明的多肽还可
促进同种异体T淋巴细胞的活性，所述T淋巴细胞可表达外来MHC蛋白并且可越来越易于通
过宿主免疫系统失活。例如，本发明的抗体及其抗原结合片段可通过遏制通常伴随T细胞输
注的T-reg细胞的生长和增殖来减轻T-reg介导的肿瘤反应性T细胞的耗竭。例如，本发明的
多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可能能够使T-reg细胞的生长相对于未处
理的细胞减少约50％至约200％(例如，50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％)。细
胞生长的减少不需要TNFα的存在。在一些实施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体
以及其抗原结合片段)可能能够在TNFα存在下使T-reg细胞的生长相对于未处理的细胞限
制至90％与150％之间(例如，90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％)。本发明的
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)还能够使T-reg细胞的增殖
限制至未处理的T-reg细胞群体的增殖的小于70％(例如，60％、50％、40％、30％、20％、
10％、5％或1％)。本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)
还能够使T-reg细胞的存活相对于未处理的T-reg细胞群体降低约10％(例如，约20％、
30％、40％或50％或更多)。
T淋巴细胞定位于呈递肿瘤相关抗原的细胞并促进细胞毒性。此外，本发明的多肽可与现有
的过继性T细胞治疗平台协同作用，因为关于这种策略的有效性的限制之一一直是难以在
输注到哺乳动物受试者(例如，人)后延长肿瘤反应性T细胞的细胞毒性。本发明的多肽还可
促进同种异体T淋巴细胞的活性，所述T淋巴细胞可表达外来MHC蛋白并且可越来越易于通
过宿主免疫系统失活。例如，本发明的抗体及其抗原结合片段可通过遏制通常伴随T细胞输
注的T-reg细胞的生长和增殖来减轻T-reg介导的肿瘤反应性T细胞的耗竭。例如，本发明的
多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可能能够使T-reg细胞的生长相对于未处
理的细胞减少约50％至约200％(例如，50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％)。细
胞生长的减少不需要TNFα的存在。在一些实施方案中，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体
以及其抗原结合片段)可能能够在TNFα存在下使T-reg细胞的生长相对于未处理的细胞限
制至90％与150％之间(例如，90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％)。本发明的
拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)还能够使T-reg细胞的增殖
限制至未处理的T-reg细胞群体的增殖的小于70％(例如，60％、50％、40％、30％、20％、
10％、5％或1％)。本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)
还能够使T-reg细胞的存活相对于未处理的T-reg细胞群体降低约10％(例如，约20％、
30％、40％或50％或更多)。
[0412] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可施用于患有癌症的哺乳动物受试者(例如，人)，以便通过促进针对癌细胞和致瘤性物质的免疫响
应来改善患者的病状。本发明的抗体可例如通过本文所述的任何施用途径施用于受试者。
本发明的抗体还可与赋形剂、生物学上可接受的载体一起配制，并且可任选地与另外的治
疗剂(如抗癌剂)缀合、混合或分开地(例如，顺序地)共同施用。可通过施用本发明的抗体或
其抗原结合片段来治疗的癌症包括此类癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀
胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌(laryngeal cancer)、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌(throat
cancer)。可通过施用本发明的抗体或其抗原结合片段来治疗的特定癌症包括但不限于，急
性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢
性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾
癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、
骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽
管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增
生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉
神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃
肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿
童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴
瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格
汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、
间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿
瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、
非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分
泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、
垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺
癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、
甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌
以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
应来改善患者的病状。本发明的抗体可例如通过本文所述的任何施用途径施用于受试者。
本发明的抗体还可与赋形剂、生物学上可接受的载体一起配制，并且可任选地与另外的治
疗剂(如抗癌剂)缀合、混合或分开地(例如，顺序地)共同施用。可通过施用本发明的抗体或
其抗原结合片段来治疗的癌症包括此类癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀
胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌(laryngeal cancer)、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌以及喉癌(throat
cancer)。可通过施用本发明的抗体或其抗原结合片段来治疗的特定癌症包括但不限于，急
性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢
性骨髓性白血病(CML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾
癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文肉瘤家族、
骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽
管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增
生性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、成感觉
神经母细胞瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃
肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿
童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴
瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆斯肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤、朗格
汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、
间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿
瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、
非小细胞肺癌(NSCLC)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分
泌肿瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、
垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺
癌、卡波济肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、
甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌
以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
[0413] 例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可施用于患者(例如，哺乳动物患者，如人患者)以治疗T细胞淋巴瘤(例如，霍奇金氏或皮肤非
霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。
霍奇金氏淋巴瘤细胞)、卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或肾细胞癌。
[0414] 本发明的抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)也可与对癌细胞表现出反应性的治疗性抗体共同施用。以这种方式，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，抗体
或其片段)不仅可与适应性免疫响应协同作用(例如通过延长T淋巴细胞肿瘤反应性)，而且
可与肿瘤细胞生长的其他抑制剂协同作用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症的另外治
疗性抗体的实例包括表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋白的反应
性的那些。可与本发明的拮抗性TNFR2抗体混合、共同施用或顺序施用的示例性抗体包括但
不限 于曲 妥珠单抗 贝伐单抗 西妥昔单抗
帕尼单抗 伊匹单抗 利妥昔单抗(
和 )、阿仑单抗 奥法木单抗
吉妥珠单抗奥佐米星 贝伦妥单抗维多汀
90Y-替伊莫单抗 以及131I-托西莫单抗 其
在Scott等人(Cancer Immun.,12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式
并入本文。
或其片段)不仅可与适应性免疫响应协同作用(例如通过延长T淋巴细胞肿瘤反应性)，而且
可与肿瘤细胞生长的其他抑制剂协同作用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症的另外治
疗性抗体的实例包括表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋白的反应
性的那些。可与本发明的拮抗性TNFR2抗体混合、共同施用或顺序施用的示例性抗体包括但
不限 于曲 妥珠单抗 贝伐单抗 西妥昔单抗
帕尼单抗 伊匹单抗 利妥昔单抗(
和 )、阿仑单抗 奥法木单抗
吉妥珠单抗奥佐米星 贝伦妥单抗维多汀
90Y-替伊莫单抗 以及131I-托西莫单抗 其
在Scott等人(Cancer Immun.,12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式
并入本文。
[0415] 本领域普通技术人员可容易地确定用于施用至有需要的哺乳动物受试者(例如，人)的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)的有效量。例如，医生可以低于所需
剂量的水平开始开出本发明多肽的剂量以实现所需的治疗作用，并且逐渐增加剂量直到实
现所需作用。或者，医生可通过以高剂量施用拮抗性TFNR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片
段)开始治疗方案，并且随后逐渐施用较低剂量直到实现治疗作用(例如，一个或多个肿瘤
的体积减小、T-reg细胞群体的减少或细胞增殖病症的缓解)。一般来说，本发明的单链多
肽、抗体或其抗原结合片段的合适每日剂量将为化合物有效产生治疗作用的最低剂量的
量。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过注射，例如通过静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下
注射，任选地接近靶组织部位(例如肿瘤)施用。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗组
合物的每日剂量可作为单一剂量或作为在一天、一周、一个月或一年中任选地以单位剂型
以适当的间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个剂量施用。尽管本发明的抗
体或其片段有可能单独施用，但它也可作为与赋形剂、载体和任选的另外治疗剂组合的药
物制剂施用。
剂量的水平开始开出本发明多肽的剂量以实现所需的治疗作用，并且逐渐增加剂量直到实
现所需作用。或者，医生可通过以高剂量施用拮抗性TFNR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片
段)开始治疗方案，并且随后逐渐施用较低剂量直到实现治疗作用(例如，一个或多个肿瘤
的体积减小、T-reg细胞群体的减少或细胞增殖病症的缓解)。一般来说，本发明的单链多
肽、抗体或其抗原结合片段的合适每日剂量将为化合物有效产生治疗作用的最低剂量的
量。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过注射，例如通过静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下
注射，任选地接近靶组织部位(例如肿瘤)施用。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗组
合物的每日剂量可作为单一剂量或作为在一天、一周、一个月或一年中任选地以单位剂型
以适当的间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个剂量施用。尽管本发明的抗
体或其片段有可能单独施用，但它也可作为与赋形剂、载体和任选的另外治疗剂组合的药
物制剂施用。
[0416] 可通过本领域中已知的多种方法中的任一种来监测本发明的多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)减弱细胞增殖疾病(如癌症)的进展的能力。例如，医生可通
过分析患者体内的一个或多个肿瘤的体积来监测哺乳动物受试者(例如，人)对用本发明的
多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)治疗的反应。例如，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗
体以及其抗原结合片段)可能能够是肿瘤体积减小1％与100％之间(例如，1％、5％、10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。或者，医生可通过分析特定受试者的淋巴中的T-reg细胞群体来监测受试者(例如，人)对用本发明的拮抗性TNFR2
多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)治疗的反应性。例如，医生可从哺乳动物受试者
(例如，人)取出血液样本并使用已建立的程序(如荧光活化细胞分选)来确定T-reg细胞(例
如，CD4+ CD25+FOXP3+ T-reg细胞或CD17+ T-reg细胞)的数量或密度。
过分析患者体内的一个或多个肿瘤的体积来监测哺乳动物受试者(例如，人)对用本发明的
多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)治疗的反应。例如，本发明的多肽(例如，单链多肽、抗
体以及其抗原结合片段)可能能够是肿瘤体积减小1％与100％之间(例如，1％、5％、10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)。或者，医生可通过分析特定受试者的淋巴中的T-reg细胞群体来监测受试者(例如，人)对用本发明的拮抗性TNFR2
多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)治疗的反应性。例如，医生可从哺乳动物受试者
(例如，人)取出血液样本并使用已建立的程序(如荧光活化细胞分选)来确定T-reg细胞(例
如，CD4+ CD25+FOXP3+ T-reg细胞或CD17+ T-reg细胞)的数量或密度。
[0417] 治疗感染性疾病的方法
[0418] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)也可用于治疗感染性疾病，如由病毒、细菌、真菌或寄生虫(例如，真核寄生虫)中的任何一种或多种
引起的感染性疾病。例如，拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可
施用于患有感染性疾病的哺乳动物受试者(例如，人)以治疗所述疾病，以及减轻所述疾病
的一种或多种症状。
引起的感染性疾病。例如，拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可
施用于患有感染性疾病的哺乳动物受试者(例如，人)以治疗所述疾病，以及减轻所述疾病
的一种或多种症状。
[0419] 例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可用于治疗或减轻哺乳动物受试者(如人)中由以下引起的病毒感染的一种或多种症状：例如
黄病毒科的成员(例如，黄病毒属、瘟病毒属和肝炎病毒属的成员)，其包括丙型肝炎病毒、
黄热病病毒；蜱传病毒，如加德格兹谷病毒(Gadgets Gully virus)、凯丹姆病毒、科萨努尔
森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱
传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒，如米班病
毒、索马里兹礁病毒和秋列尼病毒；蚊子传播的病毒，如阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病
毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌
苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列
火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边
山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病
毒；和无已知节肢动物载体的病毒，如恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊
病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里
岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、
塔马纳蝙蝠病毒和细胞融合因子病毒；沙粒病毒科的成员，其包括伊皮病毒、拉沙病毒(例
如，Josiah、LP或GA391菌株)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病
毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利
华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病
毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒和卢约病毒；布尼亚病毒科家族的成员(例如，汉坦病
毒属、内罗病毒属、正本雅病毒属和白蛉病毒属的成员)，其包括汉坦病毒、辛诺柏病毒、道
格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚
果出血热(CCHF)病毒；丝状病毒科的成员，其包括埃博拉病毒(例如，扎伊尔、苏丹、象牙海
岸、莱斯顿和乌干达菌株)和马尔堡病毒(例如，安哥拉、Ci67、穆索克、波普、雷文(Ravn)和
维多利亚湖菌株)；披膜病毒科的成员(例如，甲病毒属的成员)，其包括委内瑞拉马脑炎病
毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利
基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔
肯雅病毒；痘病毒科的成员(例如，正痘病毒属的成员)，其包括天花病毒、猴痘病毒和牛痘
病毒；疱疹病毒科的成员，其包括单纯疱疹病毒(HSV；1型、2型和6型)、人疱疹病毒(例如，7
型和8型)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒和卡波西氏肉
瘤相关疱疹病毒(KSHV)；正粘病毒科的成员，其包括流感病毒(A、B和C)，如H5N1禽流感病毒
或H1N1猪流感；冠状病毒科的成员，其包括严重急性呼吸综合征(SARS)病毒；弹状病毒科的
成员，其包括狂犬病毒和水疱性口炎病毒(VSV)；副粘病毒科的成员，其包括人呼吸道合胞
病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病
毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒；小核糖核酸病毒科的成员，其包
括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；嗜肝DNA病毒科
的成员，其包括乙型肝炎病毒；乳头瘤病毒科的成员，其包括人乳头状瘤病毒；细小病毒科
的成员，其包括腺相关病毒；星状病毒科的成员，其包括星状病毒；多瘤病毒科的成员，其包
括JC病毒、BK病毒和SV40病毒；杯状病毒科的成员，其包括诺沃克病毒；呼肠孤病毒科的成
员，其包括轮状病毒；逆转录病毒科的成员，其包括人免疫缺陷病毒(HIV；例如1型和2型)和
人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型(分别HTLV-1和HTLV-2)；以及传染性海绵状脑病，如慢性耗
竭疾病。特别地，本发明的方法包括向人施用拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有
TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出
与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，
如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗HIV感染
(如患有AIDS的人)。
黄病毒科的成员(例如，黄病毒属、瘟病毒属和肝炎病毒属的成员)，其包括丙型肝炎病毒、
黄热病病毒；蜱传病毒，如加德格兹谷病毒(Gadgets Gully virus)、凯丹姆病毒、科萨努尔
森林病病毒、兰加特病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、皇家农场病毒、喀什病毒、蜱
传脑炎病毒、纽多佛病毒、索夫吉病毒、跳跃病病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒，如米班病
毒、索马里兹礁病毒和秋列尼病毒；蚊子传播的病毒，如阿罗阿病毒、登革病毒、凯杜古病
毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌
苏图病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、科科贝拉病毒、巴加扎病毒、伊利乌斯病毒、以色列
火鸡脑脊膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、班齐病毒、博博衣病毒、边
山病毒、朱格拉病毒、萨沃亚病毒，赛皮克病毒、乌干达S病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病
毒；和无已知节肢动物载体的病毒，如恩德培蝙蝠病毒、横须贺病毒、阿波依病毒、牛骨山脊
病毒、胡蒂亚帕病毒、摩多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒，布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里
岛病毒、达卡尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、
塔马纳蝙蝠病毒和细胞融合因子病毒；沙粒病毒科的成员，其包括伊皮病毒、拉沙病毒(例
如，Josiah、LP或GA391菌株)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亚病
毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉蒂诺病毒、马邱波病毒、奥利
华斯病毒、巴拉那病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、太米阿米病
毒、怀特沃特阿罗约病毒、查帕雷病毒和卢约病毒；布尼亚病毒科家族的成员(例如，汉坦病
毒属、内罗病毒属、正本雅病毒属和白蛉病毒属的成员)，其包括汉坦病毒、辛诺柏病毒、道
格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚
果出血热(CCHF)病毒；丝状病毒科的成员，其包括埃博拉病毒(例如，扎伊尔、苏丹、象牙海
岸、莱斯顿和乌干达菌株)和马尔堡病毒(例如，安哥拉、Ci67、穆索克、波普、雷文(Ravn)和
维多利亚湖菌株)；披膜病毒科的成员(例如，甲病毒属的成员)，其包括委内瑞拉马脑炎病
毒(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒(WEE)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、塞姆利
基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong’nyong virus)和基孔
肯雅病毒；痘病毒科的成员(例如，正痘病毒属的成员)，其包括天花病毒、猴痘病毒和牛痘
病毒；疱疹病毒科的成员，其包括单纯疱疹病毒(HSV；1型、2型和6型)、人疱疹病毒(例如，7
型和8型)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒和卡波西氏肉
瘤相关疱疹病毒(KSHV)；正粘病毒科的成员，其包括流感病毒(A、B和C)，如H5N1禽流感病毒
或H1N1猪流感；冠状病毒科的成员，其包括严重急性呼吸综合征(SARS)病毒；弹状病毒科的
成员，其包括狂犬病毒和水疱性口炎病毒(VSV)；副粘病毒科的成员，其包括人呼吸道合胞
病毒(RSV)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病
毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒、腮腺炎病毒；小核糖核酸病毒科的成员，其包
括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(A、B、C和D)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；嗜肝DNA病毒科
的成员，其包括乙型肝炎病毒；乳头瘤病毒科的成员，其包括人乳头状瘤病毒；细小病毒科
的成员，其包括腺相关病毒；星状病毒科的成员，其包括星状病毒；多瘤病毒科的成员，其包
括JC病毒、BK病毒和SV40病毒；杯状病毒科的成员，其包括诺沃克病毒；呼肠孤病毒科的成
员，其包括轮状病毒；逆转录病毒科的成员，其包括人免疫缺陷病毒(HIV；例如1型和2型)和
人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型(分别HTLV-1和HTLV-2)；以及传染性海绵状脑病，如慢性耗
竭疾病。特别地，本发明的方法包括向人施用拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有
TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出
与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，
如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗HIV感染
(如患有AIDS的人)。
[0420] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)还可用于治疗或减轻哺乳动物受试者(例如，人)的细菌感染的一种或多种症状。可通过施用本发明
的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)治疗的细菌感染的实例包括但不限于
由以下属内的细菌引起的那些细菌感染：链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、
诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属(例如，大肠杆菌，如O157:
H7)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变
形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属(如百日咳
博德特氏菌)、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌
属、弧菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、分枝杆菌属(如结核分枝杆菌和副结核鸟分枝杆菌)
以及幽门螺杆菌属(如幽门螺杆菌和肝螺杆菌)。特别地，本发明的方法包括向人或非人哺
乳动物施用拮抗性TNFR2多肽，如含有如本文所述的CDR-H3区的单链多肽、抗体或其抗原结
合片段(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个
或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的
表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2
抗体)以治疗结核分枝杆菌感染。本发明的特定方法包括向牛科哺乳动物或野牛施用拮抗
性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的
一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-
60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或
其变体的TNFR2抗体)以治疗结核分枝杆菌感染。另外，本发明的方法包括向人或非人哺乳
动物施用拮抗性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残
基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:
7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。本发明的特定方法包括
向牛科哺乳动物或野牛施用拮抗性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列
(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的
KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。
的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)治疗的细菌感染的实例包括但不限于
由以下属内的细菌引起的那些细菌感染：链球菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、
诺卡氏菌属、奈瑟氏菌属、放线杆菌属、莫拉氏菌属、肠杆菌属(例如，大肠杆菌，如O157:
H7)、假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、变
形杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、博德特氏菌属(如百日咳
博德特氏菌)、军团菌属、巴斯德氏菌属、弗朗西斯氏菌属、布鲁氏菌属、巴尔通氏体属、梭菌
属、弧菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、分枝杆菌属(如结核分枝杆菌和副结核鸟分枝杆菌)
以及幽门螺杆菌属(如幽门螺杆菌和肝螺杆菌)。特别地，本发明的方法包括向人或非人哺
乳动物施用拮抗性TNFR2多肽，如含有如本文所述的CDR-H3区的单链多肽、抗体或其抗原结
合片段(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个
或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的
表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2
抗体)以治疗结核分枝杆菌感染。本发明的特定方法包括向牛科哺乳动物或野牛施用拮抗
性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残基142-146)的
一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-
60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或
其变体的TNFR2抗体)以治疗结核分枝杆菌感染。另外，本发明的方法包括向人或非人哺乳
动物施用拮抗性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列(SEQ ID NO:7的残
基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:
7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。本发明的特定方法包括
向牛科哺乳动物或野牛施用拮抗性TNFR2多肽(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列
(SEQ ID NO:7的残基142-146)的一个或多个残基的表位并且不表现出与含有TNFR2的
KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列或其变体的TNFR2抗体)以治疗副结核鸟分枝杆菌感染。
[0421] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)也可施用于哺乳动物受试者(例如，人)以用于治疗或减轻由以下引起的寄生虫感染的一种或多种症
状：原生动物寄生虫(例如，肠道原生动物、组织原生动物或血液原生动物)或蠕虫寄生虫
(例如，线虫、蠕虫、有腺纲、侧尾腺口纲(secementea)、吸虫(trematode)、吸虫(fluke)(血
吸虫、肝吸虫、肠吸虫和肺吸虫)或绦虫)。可根据本发明的方法治疗的示例性原生动物寄生
虫包括但不限于，溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥
虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜
氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、约氏疟原
虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二
指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本
血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和
细粒棘球绦虫。可根据本发明的方法治疗的其他寄生虫感染包括旋盘尾丝虫。
状：原生动物寄生虫(例如，肠道原生动物、组织原生动物或血液原生动物)或蠕虫寄生虫
(例如，线虫、蠕虫、有腺纲、侧尾腺口纲(secementea)、吸虫(trematode)、吸虫(fluke)(血
吸虫、肝吸虫、肠吸虫和肺吸虫)或绦虫)。可根据本发明的方法治疗的示例性原生动物寄生
虫包括但不限于，溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、鼠型隐孢子虫、冈比亚锥虫、罗德西亚锥
虫、克氏锥虫、墨西哥利什曼原虫、巴西利什曼原虫、硕大利什曼原虫、热带利什曼原虫、杜
氏利什曼原虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、镰状疟原虫、约氏疟原
虫、阴道毛滴虫和火鸡组织滴虫。示例性蠕虫寄生虫包括毛首鞭形线虫、豚蛔虫、蛲虫、十二
指肠钩虫、美洲钩虫、粪类圆线虫、班氏丝虫和麦地那龙线虫、曼氏血吸虫、住血吸虫、日本
血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、异形吸虫、卫氏并殖吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、短膜壳绦虫和
细粒棘球绦虫。可根据本发明的方法治疗的其他寄生虫感染包括旋盘尾丝虫。
[0422] 拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)也可施用于哺乳动物受试者(例如，人)以治疗或减轻真菌感染的一种或多种症状。可根据本发明的方法治疗
的真菌感染的实例包括但不限于由以下引起的真菌感染：例如，曲霉属、假丝酵母属、马拉
色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属和犁头霉属。可
根据本发明的方法治疗的示例性真菌感染还包括卡氏肺囊虫、巴西副球孢子菌和荚膜组织
胞浆菌。
的真菌感染的实例包括但不限于由以下引起的真菌感染：例如，曲霉属、假丝酵母属、马拉
色氏霉菌属、毛孢子菌属、镰刀菌属、枝顶孢霉属、根霉属、毛霉属、肺囊虫属和犁头霉属。可
根据本发明的方法治疗的示例性真菌感染还包括卡氏肺囊虫、巴西副球孢子菌和荚膜组织
胞浆菌。
[0423] 药物组合物
[0424] 可使用本领域中已知的方法来制备含有本发明的拮抗性TNFR2多肽(如单链多肽、抗体或其抗原结合片段)的药物组合物。本发明的药物组合物可含有拮抗性TNFR2抗体，如
显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)，所述抗体含有源自表型-
1 2 4 3 5 5 2 5
中性TNFR2抗体的CDR-H1和CDR-H2以及由下式表示的CDR-H3：JZJZZ JZJZ (J)2Z ZZ 或
JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2(其中每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在
生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧
链的天然存在的氨基酸，每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存
4 5
在的氨基酸，每个Z独立地是甘氨酸或丙氨酸，并且每个Z独立地是含有疏水性侧链的天然
存在的氨基酸)。
显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)，所述抗体含有源自表型-
1 2 4 3 5 5 2 5
中性TNFR2抗体的CDR-H1和CDR-H2以及由下式表示的CDR-H3：JZJZZ JZJZ (J)2Z ZZ 或
JZ1JZ2Z4Z3Z5(J)2Z5Z2Z5(J)2(其中每个J独立地是天然存在的氨基酸，每个Z1独立地是含有在
生理pH下的阳离子侧链的天然存在的氨基酸，每个Z2独立地是含有在生理pH下的阴离子侧
链的天然存在的氨基酸，每个Z3独立地是含有在生理pH下的极性不带电荷的侧链的天然存
4 5
在的氨基酸，每个Z独立地是甘氨酸或丙氨酸，并且每个Z独立地是含有疏水性侧链的天然
存在的氨基酸)。
[0425] 例如，本发明的药物组合物可含有拮抗性TNFR2多肽，如显性拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其抗原结合片段)，所述多肽含有源自表型-中性TNFR2抗体的CDR-H1
和CDR-H2以及由式JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:
279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)
表示的CDR-H3。
和CDR-H2以及由式JRJDGJSJY(J)2FDJ(SEQ ID NO:278)、JRJDGSY(J)2FD(J)3(SEQ ID NO:
279)、QZ1VZ2Z4YZ3SZ5WYZ5Z2Z5(SEQ ID NO:265)或AZ1DZ2Z4Z3Z5SPZ5Z2Z5WG(SEQ ID NO:266)
表示的CDR-H3。
[0426] 在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFRAB1并且具有氨基酸序列QRVDGYSSYWYFDV(SEQ ID NO:25)。CDR-H3可源自TNFRAB2并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:
259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ
ID NO:284)。
259)。在一些实施方案中，CDR-H3是源自TNFR2A3并且具有氨基酸序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ
ID NO:284)。
[0427] 本发明的药物组合物可使用例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)；其以引用的方式并
入本文)并且以所需的形式，例如以冻干制剂或水溶液的形式来制备。还可制备组合物以便
含有所需浓度的活性剂(例如，拮抗性抗TNFR2抗体或其片段)。例如，本发明的药物组合物
可含有按重量计(w/w)至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)的活性剂。
入本文)并且以所需的形式，例如以冻干制剂或水溶液的形式来制备。还可制备组合物以便
含有所需浓度的活性剂(例如，拮抗性抗TNFR2抗体或其片段)。例如，本发明的药物组合物
可含有按重量计(w/w)至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)的活性剂。
[0428] 另外，可掺入药物制剂中的活性剂(例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本发明的显性拮抗性TNFR2多肽)本身可具有所需的纯度水平。例如，本发明的多肽(如单链多肽、抗
体或其抗原结合片段)可在从细胞培养基中分离抗体后或在通过已建立的固相肽合成方法
或如本文所述的天然化学连接化学合成(例如)单链抗体片段(例如，scFv)后通过一定程度
的纯度进行表征。在将抗体掺入药物组合物之前，本发明的拮抗性TNFR2可以是至少10％纯
(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、
99.5％、99.9％、99.99％或100％纯)。
体或其抗原结合片段)可在从细胞培养基中分离抗体后或在通过已建立的固相肽合成方法
或如本文所述的天然化学连接化学合成(例如)单链抗体片段(例如，scFv)后通过一定程度
的纯度进行表征。在将抗体掺入药物组合物之前，本发明的拮抗性TNFR2可以是至少10％纯
(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、
99.5％、99.9％、99.99％或100％纯)。
[0429] 可通过将具有所需纯度的抗体与本领域中通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂和其
他混杂添加剂)混合来制备本发明的抗TNFR2多肽的药物组合物用于作为冻干制剂或水溶
液储存。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol,编1980；其以引
用的方式并入本文)。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下必须对接受者无毒性。
他混杂添加剂)混合来制备本发明的抗TNFR2多肽的药物组合物用于作为冻干制剂或水溶
液储存。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol,编1980；其以引
用的方式并入本文)。此类添加剂在所使用的剂量和浓度下必须对接受者无毒性。
[0430] 缓冲剂
[0431] 缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于与本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合
片段)一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂{例如，柠檬酸单
钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸
盐缓冲剂{例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠
混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒
石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂{例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富
马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如，葡糖酸-葡糖
酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂{例如，
草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂{例如，
乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸盐缓冲剂(例
如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓
冲剂和三甲胺盐如Tris。
片段)一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂{例如，柠檬酸单
钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸
盐缓冲剂{例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠
混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒
石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂{例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富
马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如，葡糖酸-葡糖
酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂{例如，
草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂{例如，
乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸盐缓冲剂(例
如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓
冲剂和三甲胺盐如Tris。
[0432] 防腐剂
[0433] 可将防腐剂添加至本发明的组合物中以延缓微生物生长，并且可以0.2％-1％(w/v)范围内的量添加。适用于与本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原
结合片段)一起使用的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙
酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵{例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)、氯化六
烃季铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二
酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时称为“稳定剂”的等渗剂(Isotonifier)以确保本发明的液
体组合物的等渗性，并且包括多元醇糖醇，例如三元或更高级的糖醇，如甘油、阿拉伯糖醇、
木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指功能范围可从填充剂至添加剂的广泛类别的赋
形剂，所述稳定剂可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附至容器壁。典型的稳定剂可以是
多元糖醇(上文列举的)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、
丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括诸如肌醇的环
醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代
甘油、a-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；蛋白质，如
人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单
糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，如棉子糖；以及多糖，如葡聚糖。稳定剂可以每重量份的活性蛋白质0.1至10,000重量的范围存在。
结合片段)一起使用的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙
酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵{例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)、氯化六
烃季铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二
酚、环己醇和3-戊醇。可添加有时称为“稳定剂”的等渗剂(Isotonifier)以确保本发明的液
体组合物的等渗性，并且包括多元醇糖醇，例如三元或更高级的糖醇，如甘油、阿拉伯糖醇、
木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指功能范围可从填充剂至添加剂的广泛类别的赋
形剂，所述稳定剂可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附至容器壁。典型的稳定剂可以是
多元糖醇(上文列举的)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、
丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括诸如肌醇的环
醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代
甘油、a-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更少的肽)；蛋白质，如
人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单
糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；和三糖，如棉子糖；以及多糖，如葡聚糖。稳定剂可以每重量份的活性蛋白质0.1至10,000重量的范围存在。
[0434] 洗涤剂
[0435] 可添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，其还允许制剂暴露于受到应力的剪切表面而不会导
致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188
等)、普朗尼克多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚( -20、 -80等)。非
离子表面活性剂可以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存
在。
致蛋白质变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188
等)、普朗尼克多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚( -20、 -80等)。非
离子表面活性剂可以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL、例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存
在。
[0437] 其他药物载体
[0438] 可掺入本发明组合物中的替代药学上可接受的载体可包括右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、橡胶可食用物、磷酸钾、精氨酸盐、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂
酸镁和矿物油，但不限于此。含有本发明的拮抗性TNFR2抗体的组合物还可包含润滑剂、保
湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。合适的药学上可接受的载体和制剂的细节
可在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版,1995)中找到，所述文献以引用的方
式并入本文。
酸镁和矿物油，但不限于此。含有本发明的拮抗性TNFR2抗体的组合物还可包含润滑剂、保
湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。合适的药学上可接受的载体和制剂的细节
可在Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版,1995)中找到，所述文献以引用的方
式并入本文。
[0439] 用于组合疗法的组合物和方法
[0440] 本发明的药物组合物可任选地包含多于一种活性剂。例如，本发明的组合物可含有与另一种药物活性分子(例如，细胞毒性剂、抗生素或T淋巴细胞(例如，用于CAR-T疗法中
的基因编辑的T淋巴细胞)缀合、混合或分开施用的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体
或其抗原结合片段)。例如，拮抗性TNFR2多肽或其治疗性缀合物(例如，本文所述的药物-抗
体缀合物)可与一种或多种可用于治疗癌症或另一种细胞增殖病症(例如，肿瘤)的另外活
性剂混合。或者，本发明的药物组合物可被配制成与一种或多种可用于治疗癌症或其他细
胞增殖病症的另外活性剂共同施用或顺序施用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症并且
可与本发明的拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用的另外活性剂的实例包括细胞毒性
剂(例如，本文所述的那些)以及表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋
白的反应性的抗体。可与本发明的拮抗性TNFR2抗体缀合、混合或分开施用的示例性抗体包
括但不限于曲妥珠单抗 贝伐单抗 西妥昔单抗
帕尼单抗 伊匹单抗 利妥昔单抗(
和 )、阿仑单抗 奥法木单抗
吉妥珠单抗奥佐米星 贝伦妥单抗维多汀 90Y-替伊莫
单抗 以及131I-托西莫单抗 其在Scott等人(Cancer Immun.,
12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式并入本文。
的基因编辑的T淋巴细胞)缀合、混合或分开施用的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体
或其抗原结合片段)。例如，拮抗性TNFR2多肽或其治疗性缀合物(例如，本文所述的药物-抗
体缀合物)可与一种或多种可用于治疗癌症或另一种细胞增殖病症(例如，肿瘤)的另外活
性剂混合。或者，本发明的药物组合物可被配制成与一种或多种可用于治疗癌症或其他细
胞增殖病症的另外活性剂共同施用或顺序施用。可用于治疗癌症和其他细胞增殖病症并且
可与本发明的拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用的另外活性剂的实例包括细胞毒性
剂(例如，本文所述的那些)以及表现出与在癌细胞表面上过表达的肿瘤抗原或细胞表面蛋
白的反应性的抗体。可与本发明的拮抗性TNFR2抗体缀合、混合或分开施用的示例性抗体包
括但不限于曲妥珠单抗 贝伐单抗 西妥昔单抗
帕尼单抗 伊匹单抗 利妥昔单抗(
和 )、阿仑单抗 奥法木单抗
吉妥珠单抗奥佐米星 贝伦妥单抗维多汀 90Y-替伊莫
单抗 以及131I-托西莫单抗 其在Scott等人(Cancer Immun.,
12:14-21,2012)中进行了详细描述；所述文献以引用的方式并入本文。
[0441] 可与本发明的拮抗性TNFR2多肽缀合、混合或分开施用的另外剂包括表现出与特定病理学相关的特异性抗原的反应性的T-淋巴细胞。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽可被
配制用于与表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)一起施用，以治疗细胞增殖病症，如本文所
述的癌症。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可通过阻止T-reg
细胞使已进行遗传修饰以表达肿瘤反应性抗原受体的T淋巴细胞失活而与CAR-T疗法协同
作用。以这种方式，可在施用拮抗性TNFR2多肽之前、同时或之后向患者施用CAR-T细胞，以
治疗患有细胞增殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(例如，人)。
配制用于与表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)一起施用，以治疗细胞增殖病症，如本文所
述的癌症。拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可通过阻止T-reg
细胞使已进行遗传修饰以表达肿瘤反应性抗原受体的T淋巴细胞失活而与CAR-T疗法协同
作用。以这种方式，可在施用拮抗性TNFR2多肽之前、同时或之后向患者施用CAR-T细胞，以
治疗患有细胞增殖病症(如癌症)的哺乳动物受试者(例如，人)。
[0442] 鉴于遗传工程化T淋巴细胞以表达对肿瘤相关抗原具有特异性的抗原受体的能力，CAR-T疗法是用于靶向癌细胞的特别稳健的平台。例如，鉴别在肿瘤和其他癌细胞表面
上过表达的抗原可为嵌合T细胞受体的设计和发现提供信息，嵌合T细胞受体通常由源自天
然存在的T细胞受体的细胞质和跨膜结构域组成，所述结构域可操作地连接至特异性地结
合特定抗原肽的细胞外scFv片段。可通过本文所述或本领域中已知的多种基因组编辑技术
中的任一种对T细胞进行遗传修饰，以表达特异性地结合至特定肿瘤抗原的抗原受体。用于
修饰T细胞基因组以掺入编码嵌合抗原受体的基因的示例性技术包括本文所述的CRISPER/
Cas、锌指核酸酶、TALEN、ARCUSTM平台。用于CAR-T淋巴细胞的遗传工程化的方法已在例如WO
2014/127261、WO 2014/039523、WO 2014/099671和WO 20120790000中进行了描述；所述专
利各自的公开内容均以引用的方式并入本文。
上过表达的抗原可为嵌合T细胞受体的设计和发现提供信息，嵌合T细胞受体通常由源自天
然存在的T细胞受体的细胞质和跨膜结构域组成，所述结构域可操作地连接至特异性地结
合特定抗原肽的细胞外scFv片段。可通过本文所述或本领域中已知的多种基因组编辑技术
中的任一种对T细胞进行遗传修饰，以表达特异性地结合至特定肿瘤抗原的抗原受体。用于
修饰T细胞基因组以掺入编码嵌合抗原受体的基因的示例性技术包括本文所述的CRISPER/
Cas、锌指核酸酶、TALEN、ARCUSTM平台。用于CAR-T淋巴细胞的遗传工程化的方法已在例如WO
2014/127261、WO 2014/039523、WO 2014/099671和WO 20120790000中进行了描述；所述专
利各自的公开内容均以引用的方式并入本文。
[0443] 可用于本发明组合物和方法中的CAR-T细胞包括已进行遗传修饰以使得细胞不表达内源性T细胞受体的那些细胞。例如，可通过基因组编辑技术(如本文所述的那些)修饰
CAR-T细胞，以遏制内源性T细胞受体的表达，从而预防接受CAR-T输注的患者中的移植物抗
宿主反应。另外或可替代地，可对CAR-T细胞进行遗传修饰以降低一种或多种内源性MHC蛋
白的表达。这是用于输注同种异体T淋巴细胞的特别有用的技术，因为外来MHC蛋白的识别
代表了促进同种异体移植物排斥的一种机制。本领域技术人员还可修饰T淋巴细胞以遏制
免疫抑制蛋白的表达，如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
(CTLA-4)。这些蛋白质是当活化时减弱T细胞活化的细胞表面受体。输注已进行遗传修饰以
减少一种或多种免疫抑制蛋白的表达的CAR-T细胞代表了可用于延长体内T淋巴细胞介导
的细胞毒性的一种策略。
CAR-T细胞，以遏制内源性T细胞受体的表达，从而预防接受CAR-T输注的患者中的移植物抗
宿主反应。另外或可替代地，可对CAR-T细胞进行遗传修饰以降低一种或多种内源性MHC蛋
白的表达。这是用于输注同种异体T淋巴细胞的特别有用的技术，因为外来MHC蛋白的识别
代表了促进同种异体移植物排斥的一种机制。本领域技术人员还可修饰T淋巴细胞以遏制
免疫抑制蛋白的表达，如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4
(CTLA-4)。这些蛋白质是当活化时减弱T细胞活化的细胞表面受体。输注已进行遗传修饰以
减少一种或多种免疫抑制蛋白的表达的CAR-T细胞代表了可用于延长体内T淋巴细胞介导
的细胞毒性的一种策略。
[0444] 除了缺失特定基因外，还可修饰CAR-T细胞以表达具有所需抗原特异性的T细胞受体。例如，可遗传修饰T淋巴细胞以表达特异性地结合至肿瘤相关抗原、以使输注的T细胞靶
向癌细胞的T细胞受体。可由CAR-T细胞表达的示例性T细胞受体是结合PD-L1的T细胞受体，
PD-L1是经常在各种肿瘤细胞上过表达的细胞表面蛋白。当PD-L1活化T淋巴细胞表面上的
PD-1时，用CAR-T疗法靶向这种肿瘤抗原可与本发明的拮抗性TNFR2抗体或抗体片段协同作
用，以增加由体内T淋巴细胞介导的免疫响应的持续时间。还可修饰CAR-T细胞以表达特异
性地结合与一种或多种感染性疾病相关的抗原(如来自病毒蛋白、细菌细胞、真菌或其他寄
生生物体的抗原)的T细胞受体。
向癌细胞的T细胞受体。可由CAR-T细胞表达的示例性T细胞受体是结合PD-L1的T细胞受体，
PD-L1是经常在各种肿瘤细胞上过表达的细胞表面蛋白。当PD-L1活化T淋巴细胞表面上的
PD-1时，用CAR-T疗法靶向这种肿瘤抗原可与本发明的拮抗性TNFR2抗体或抗体片段协同作
用，以增加由体内T淋巴细胞介导的免疫响应的持续时间。还可修饰CAR-T细胞以表达特异
性地结合与一种或多种感染性疾病相关的抗原(如来自病毒蛋白、细菌细胞、真菌或其他寄
生生物体的抗原)的T细胞受体。
[0445] 本发明的其他药物组合物包括含有拮抗性TNFR2抗体或抗体片段、干扰素α和/或一种或多种抗生素的药物组合物，所述药物组合物可施用于患有感染性疾病的患者(例如，
人患者)。例如，拮抗性TNFR2抗体或抗体片段可与适用于治疗一种或多种感染性疾病的抗
生素缀合、混合或分开施用，所述抗生素如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米
星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄(cefazlexin)、头
孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、克林霉素、林可霉
素、达托霉素、红霉素、利奈唑胺、特地佐利、阿莫西林、氨苄青霉素、杆菌肽、环丙沙星、强力霉素和四环素等。
人患者)。例如，拮抗性TNFR2抗体或抗体片段可与适用于治疗一种或多种感染性疾病的抗
生素缀合、混合或分开施用，所述抗生素如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米
星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄(cefazlexin)、头
孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、克林霉素、林可霉
素、达托霉素、红霉素、利奈唑胺、特地佐利、阿莫西林、氨苄青霉素、杆菌肽、环丙沙星、强力霉素和四环素等。
[0446] 免疫治疗剂
[0447] 本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可与免疫治疗剂混合、缀合、一起施用或分开施用，例如以用于治疗癌症或感染性疾病，如
本文所述的癌症或感染性疾病。可与本发明的组合物和方法结合使用的示例性免疫治疗剂
包括但不限于抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗TNF-α交联剂、抗TRAIL交联
剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗
TRAILR2剂和抗TWEAKR剂，以及例如针对在Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-
584(2015)的表1中描述的免疫靶标的剂，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本
文。例如，可用抗4-1BB配体抗体靶向免疫靶标4-1BB配体；可用抗OX40L抗体靶向免疫靶标
OX40L；可用抗GITR抗体靶向免疫靶标GITR；可用抗CD27抗体靶向免疫靶标CD27；可用抗
TL1A抗体靶向免疫靶标TL1A；可用抗CD40L抗体靶向免疫靶标CD40L；可用抗LIGHT抗体靶向
免疫靶标LIGHT；可用抗BTLA抗体靶向免疫靶标BTLA；可用抗LAG3抗体靶向免疫靶标LAG3；
可用抗TIM3抗体靶向免疫靶标TIM3；可用抗Singlecs抗体靶向免疫靶标Singlecs；可用抗
ICOS配体抗体靶向免疫靶标ICOS配体；可用抗B7-H3抗体靶向免疫靶标B7-H3；可用抗B7-H4
抗体靶向免疫靶标B7-H4；可用抗VISTA抗体靶向免疫靶标VISTA；可用抗TMIGD2抗体靶向免
疫靶标TMIGD2；可用抗BTNL2抗体靶向免疫靶标BTNL2；可用抗CD48抗体靶向免疫靶标CD48；
可用抗KIR抗体靶向免疫靶标KIR；可用抗LIR抗体靶向免疫靶标LIR；可用抗ILT抗体靶向免
疫靶标ILT；可用抗NKG2D抗体靶向免疫靶标NKG2D；可用抗NKG2A抗体靶向免疫靶标NKG2A；
可用抗MICA抗体靶向免疫靶标MICA；可用抗MICB抗体靶向免疫靶标MICB；可用抗CD244抗体
靶向免疫靶标CD244；可用抗CSF1R抗体靶向免疫靶标CSF1R；可用抗IDO抗体靶向免疫靶标
IDO；可用抗TGFβ抗体靶向免疫靶标TGFβ；可用抗CD39抗体靶向免疫靶标CD39；可用抗CD73
抗体靶向免疫靶标CD73；可用抗CXCR4抗体靶向免疫靶标CXCR4；可用抗CXCL12抗体靶向免
疫靶标CXCL12；可用抗SIRPA抗体靶向免疫靶标SIRPA；可用抗CD47抗体靶向免疫靶标CD47；
可用抗VEGF抗体靶向免疫靶标VEGF；可用抗神经纤毛蛋白抗体靶向免疫靶标神经纤毛蛋白
(参见例如，Mahoney等人的表1)。
本文所述的癌症或感染性疾病。可与本发明的组合物和方法结合使用的示例性免疫治疗剂
包括但不限于抗CTLA-4剂、抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、抗TNF-α交联剂、抗TRAIL交联
剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗
TRAILR2剂和抗TWEAKR剂，以及例如针对在Mahoney等人,Cancer Immunotherapy,14:561-
584(2015)的表1中描述的免疫靶标的剂，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本
文。例如，可用抗4-1BB配体抗体靶向免疫靶标4-1BB配体；可用抗OX40L抗体靶向免疫靶标
OX40L；可用抗GITR抗体靶向免疫靶标GITR；可用抗CD27抗体靶向免疫靶标CD27；可用抗
TL1A抗体靶向免疫靶标TL1A；可用抗CD40L抗体靶向免疫靶标CD40L；可用抗LIGHT抗体靶向
免疫靶标LIGHT；可用抗BTLA抗体靶向免疫靶标BTLA；可用抗LAG3抗体靶向免疫靶标LAG3；
可用抗TIM3抗体靶向免疫靶标TIM3；可用抗Singlecs抗体靶向免疫靶标Singlecs；可用抗
ICOS配体抗体靶向免疫靶标ICOS配体；可用抗B7-H3抗体靶向免疫靶标B7-H3；可用抗B7-H4
抗体靶向免疫靶标B7-H4；可用抗VISTA抗体靶向免疫靶标VISTA；可用抗TMIGD2抗体靶向免
疫靶标TMIGD2；可用抗BTNL2抗体靶向免疫靶标BTNL2；可用抗CD48抗体靶向免疫靶标CD48；
可用抗KIR抗体靶向免疫靶标KIR；可用抗LIR抗体靶向免疫靶标LIR；可用抗ILT抗体靶向免
疫靶标ILT；可用抗NKG2D抗体靶向免疫靶标NKG2D；可用抗NKG2A抗体靶向免疫靶标NKG2A；
可用抗MICA抗体靶向免疫靶标MICA；可用抗MICB抗体靶向免疫靶标MICB；可用抗CD244抗体
靶向免疫靶标CD244；可用抗CSF1R抗体靶向免疫靶标CSF1R；可用抗IDO抗体靶向免疫靶标
IDO；可用抗TGFβ抗体靶向免疫靶标TGFβ；可用抗CD39抗体靶向免疫靶标CD39；可用抗CD73
抗体靶向免疫靶标CD73；可用抗CXCR4抗体靶向免疫靶标CXCR4；可用抗CXCL12抗体靶向免
疫靶标CXCL12；可用抗SIRPA抗体靶向免疫靶标SIRPA；可用抗CD47抗体靶向免疫靶标CD47；
可用抗VEGF抗体靶向免疫靶标VEGF；可用抗神经纤毛蛋白抗体靶向免疫靶标神经纤毛蛋白
(参见例如，Mahoney等人的表1)。
[0448] 可与本文所述的组合物和方法结合使用的免疫治疗剂的其他实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨
蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴
因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴
因子的抗体、针对表面癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
[0449] 使用本发明的方法，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可与免疫治疗剂共同施用(例如，混合)或与免疫治疗剂分开施用。例
如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可
同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症或感染性疾病的人患者。在一些实施方案中，在
向患者施用免疫治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗原
结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在免疫治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽
(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在免疫疗法治疗失
败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或
构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测免疫疗法治疗
的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如癌症或感染性疾病，例如本文
所述的癌症或感染性疾病)。
如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可
同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症或感染性疾病的人患者。在一些实施方案中，在
向患者施用免疫治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗原
结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在免疫治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽
(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在免疫疗法治疗失
败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或
构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测免疫疗法治疗
的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如癌症或感染性疾病，例如本文
所述的癌症或感染性疾病)。
[0450] 例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代
地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT
扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者
体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关
抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的
癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一
种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、
5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领
域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结
合片段或构建体。类似地，本领域的医生或熟练的医生可监测从患有感染性疾病(如本文所
述的感染性疾病)的患者分离的样品中的细菌、真菌或寄生细胞的数量或病毒颗粒的数量。
另外地或可替代地，本领域的熟练医生可通过评价患有这种病理的患者的症状来监测感染
性疾病的进展。例如，医生可通过确定感染性疾病的一种或多种症状的频率和/或严重程度
在用免疫治疗剂治疗后是否已经稳定(例如，保持相同)或降低来监测患者。从患者分离的
样品中的细菌、真菌或寄生细胞或病毒颗粒的数量和/或感染性疾病的一种或多种症状的
频率或严重程度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学
上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善感染性疾病。基于此适应症，本领域的熟
练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体。
地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT
扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者
体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关
抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的
癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一
种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、
5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领
域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结
合片段或构建体。类似地，本领域的医生或熟练的医生可监测从患有感染性疾病(如本文所
述的感染性疾病)的患者分离的样品中的细菌、真菌或寄生细胞的数量或病毒颗粒的数量。
另外地或可替代地，本领域的熟练医生可通过评价患有这种病理的患者的症状来监测感染
性疾病的进展。例如，医生可通过确定感染性疾病的一种或多种症状的频率和/或严重程度
在用免疫治疗剂治疗后是否已经稳定(例如，保持相同)或降低来监测患者。从患者分离的
样品中的细菌、真菌或寄生细胞或病毒颗粒的数量和/或感染性疾病的一种或多种症状的
频率或严重程度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用免疫治疗剂后没有降低例如统计学
上显著的量的发现可表明免疫疗法治疗未能改善感染性疾病。基于此适应症，本领域的熟
练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体。
[0451] 化学治疗剂和放射疗法
[0452] 另外地或可替代地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可与化学治疗剂混合、缀合、一起施用或分开施用，例如以用于治疗癌
症，如本文所述的癌症。适用于与本发明的组合物和方法结合使用的示例性化学治疗剂包
括但不限于，醋酸阿比特龙， (甲氨蝶呤)， (紫杉醇白蛋
白)， 博来霉素、长春碱和达卡巴嗪(ABVD)， 博来
霉素、硫酸长春新碱和磷酸依托泊苷(ABVE)， 博来霉素、硫酸长春新
碱、磷酸依托泊苷、泼尼松和环磷酰胺(ABVE-PC)，阿霉素和环磷酰胺(AC)，阿霉素、环磷酰
胺和紫杉醇或多西他赛(AC-T)， (贝伦妥单抗维多汀)、阿糖胞苷、柔红霉素
和依托泊苷(ADE)，阿多-曲妥珠单抗恩他新， (盐酸阿霉素)，二马来酸
阿法替尼， (依维莫司)， (奈妥吡坦(netupitant)和盐酸帕
洛诺司琼)， (咪喹莫特)，阿地白介素， (艾乐替尼)，艾乐替
尼，阿仑单抗，注射用 (盐酸美法仑)， 片剂(美法仑)，
(培美曲塞二钠)， (盐酸帕洛诺司琼)， (苯丁
酸氮芥)， (苯丁酸氮芥)，氨基乙酰丙酸，阿那曲唑，阿瑞匹坦，
(帕米膦酸二钠)， (阿那曲唑)， (依西美坦)，
(奈拉滨)，三氧化二砷， (奥法木单抗)，天冬酰胺酶菊欧文
氏菌， (贝伐单抗)，阿西替尼，阿扎胞苷，BEACOPP Becenum(卡莫司汀)，
(贝利司他)，贝利司他，盐酸苯达莫司汀，博来霉素、依托泊苷和顺铂
131
(BEP)，贝伐单抗，蓓萨罗丁， (托西莫单抗和碘 I托西莫单抗)，比卡鲁胺，
BiCNU(卡莫司汀)，博来霉素，博纳吐单抗， (博纳吐单抗)，硼替佐米、
(博舒替尼)，博舒替尼，贝伦妥单抗-维多汀，白消安， (白消
安)，卡巴他塞，S-苹果酸卡博替尼，CAF， (阿仑单抗)， (盐
酸伊立替康)，卡培他滨，CAPOX， (氟尿嘧啶)，卡铂，卡铂-- 卡非佐
米， (卡莫司汀)，卡莫司汀，卡莫司汀植入物， (比卡鲁
胺)，CEENU(洛莫司汀)，顺铂、依托泊苷和甲氨蝶呤(CEM)，色瑞替尼， (盐
酸柔红霉素)， (重组HPV二价疫苗)，西妥昔单抗，苯丁酸氮芥，苯丁酸氮芥-
泼尼松，CHOP，顺铂， (环磷酰胺)，氯法拉滨， (氯法拉滨)，
(氯法拉滨)，CMF，考比替尼，cometriq(S-苹果酸卡博替尼)，COPDAC，COPP，
COPP-ABV， (更生霉素)， (考比替尼)，克唑替尼，CVP，环磷
酰胺， (异环磷酰胺)， (雷莫芦单抗)，阿糖胞苷，阿糖胞苷脂质
体，CYTOSAR- (阿糖胞苷)， (环磷酰胺)，达拉菲尼，达卡巴嗪，
(地西他滨)，更生霉素，达雷木单抗， (达雷木单抗)，达沙
替尼，盐酸柔红霉素，地西他滨，地加瑞克，地尼白介素-毒素连接物，地诺单抗，
(阿糖胞苷脂质体)，地塞米松，盐酸地塞米松，达妥昔单抗，多西他赛，
(盐酸阿霉素)，盐酸阿霉素，DOX- (盐酸阿霉素)，DTIC- (达卡巴
嗪)，EFUDEX(氟尿嘧啶)， (拉布立酶)， (盐酸表柔比星)，乐沙定
(奥沙利铂)，依洛珠单抗， (奥沙利铂)，艾曲波帕乙醇胺， (阿瑞
吡坦)， (依洛珠单抗)，恩扎鲁胺，盐酸表柔比星，EPOCH， (西
妥昔单抗)，甲磺酸艾日布林， (维莫德吉)，盐酸埃罗替尼，
(天门冬酰胺酶菊欧文氏菌)， (磷酸依托泊苷)，依托泊苷，磷酸依托泊
苷， (盐酸阿霉素脂质体)，依维莫司， (盐酸雷洛昔芬)，
(盐酸美法仑)，依西美坦，5-FU(5-氟尿嘧啶)， (托瑞米
芬)， (帕比司他)， (氟维司群)，FEC， (来曲
唑)，非格司亭， (磷酸氟达拉滨)，磷酸氟达拉滨， (氟尿
嘧啶)，氟尿嘧啶， (甲氨蝶呤)， PFS(甲氨蝶呤)，FOLFIRI，FOLFIRI-
贝伐单抗，FOLFIRI-西妥昔单抗，FOLFIRINOX，FOLFOX， (普拉曲沙)，FU-LV，
氟维司群， (重组HPV四价疫苗)，GARDASIL (重组HPV九价疫苗)，
(奥比妥珠单抗)，吉非替尼，盐酸吉西他滨，吉西他滨-顺铂，吉西他滨-奥沙
利铂，吉妥珠单抗奥佐米星， (盐酸吉西他滨)、 (二马来酸阿法
替尼)， (甲磺酸伊马替尼)， (卡莫司汀植入物)，
晶片(卡莫司汀植入物)，羧肽酶，醋酸戈舍瑞林， (甲磺酸艾日布林)，
(曲妥珠单抗)，HPV二价疫苗， (盐酸托泊替康)，Hyper-
CVAD，IBRANCE(帕博西尼)， 替伊莫单抗，依布替尼，ICE，
(盐酸普那替尼)， (盐酸伊达比星)，盐酸伊达比星，艾代拉里斯，
(异环磷酰胺)，异环磷酰胺(ifosfamide)，异环磷酰胺(ifosfamidum)，IL-2(阿地白介素)，
甲磺酸伊马替尼， (伊布替尼)，咪喹莫特， (拉他莫金冻干
混悬剂)，INLYTA(阿昔替尼)，重组干扰素α-2b，内含子A，托西莫单抗，如131I托西莫单抗，伊匹单抗， (吉非替尼)，盐酸伊立替康， (罗米地辛)，伊沙匹隆，柠
檬酸伊沙佐米， (伊沙匹隆)， (磷酸鲁索替尼)， (卡
巴他赛)， (阿多-曲妥珠单抗恩他新)， (盐酸雷洛昔芬)，
(帕利夫明)， (派姆单抗)， (卡非佐米)，
醋酸兰瑞肽，二甲苯磺酸拉帕替尼，来那度胺，甲磺酸乐伐替尼， (甲磺酸乐
伐替尼)，来曲唑，甲酰四氢叶酸钙，瘤可宁(苯丁酸氮芥)，醋酸亮丙瑞林，levulan(氨基乙
酰丙酸)， (苯丁酸氮芥)， (盐酸阿霉素脂质体)，洛莫司汀，
(三氟尿苷和盐酸地匹福林) ， (醋酸亮丙瑞林)，
(奥拉帕尼)， (硫酸长春新碱脂质体)， (盐
酸丙卡巴肼)，盐酸氮芥，醋酸甲地孕酮， (曲美替尼)，美法仑，盐酸美法仑，
巯嘌呤， (美司钠)， (替莫唑胺)，甲氨蝶呤，甲氨
蝶呤LPF， (甲氨蝶呤)，MEXATE- (甲氨蝶呤)，丝裂霉素C，盐酸米托蒽醌，
(丝裂霉素C)，MOPP， (普乐沙福)，
(盐酸氮芥)， (丝裂霉素C)， (白消安)，
(阿扎胞苷)， (吉妥单抗奥佐米星)，纳米颗粒紫杉醇，
(酒石酸长春瑞滨)，NECITUMUMAB，奈拉滨， (环磷酰胺)，奈妥吡坦和盐酸帕洛
诺司琼， (非格司亭)， (甲苯磺酸索拉非尼)，尼洛替尼，
(柠檬酸伊沙佐米)，纳武单抗， (柠檬酸他莫昔芬)，
(罗米司亭)，奥比妥珠单抗， (索尼德吉)，OEPA，奥法木单抗，
OFF，奥拉帕尼，高三尖杉酯碱， (培门冬酶)，盐酸昂丹司琼，
(盐酸伊立替康脂质体)， (地尼白介素-毒素连接物)， (纳武单抗)，
OPPA，奥希替尼，奥沙利铂，紫杉醇，紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂，PAD，帕博西尼，帕
利夫明，盐酸帕洛诺司琼，盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦，帕米膦酸二钠，帕尼单抗，帕比司
他， (卡铂)， (卡铂)，盐酸帕唑帕尼，PCV，培门冬酶，聚乙二
醇干扰素α-2b，PEG- (聚乙二醇干扰素α-2b)，派姆单抗，培美曲塞二钠，
(帕妥珠单抗)，帕妥珠单抗， (顺铂)，PLATINOL- (顺
铂)，普乐沙福，泊马度胺， (泊马度胺)，盐酸帕纳替尼，
(耐昔妥珠单抗)，普拉曲沙，泼尼松，盐酸丙卡巴肼， (阿地白介素)，
(地诺单抗)，PROMACTA(艾曲波帕乙醇胺)， (西普鲁塞-T)，
(巯基嘌呤)， (巯基嘌呤)，二氯化223Ra，盐酸雷洛昔芬，
雷莫芦单抗，拉布立酶，R-CHOP，R-CVP，重组人乳头瘤病毒(HPV)，重组干扰素α-2b，瑞戈非
尼，R-EPOCH， (来那度胺)， (甲氨蝶呤)，
(利妥昔单抗)，盐酸罗拉吡坦，罗米地辛，罗米司亭，红比霉素(盐酸柔红霉素)，磷酸鲁索替
尼， 胸膜内气雾剂(滑石)，司妥昔单抗，西普鲁塞-T，索马杜林储库(醋酸
兰瑞肽)，索尼德吉，甲苯磺酸索拉非尼， (达沙替尼)，斯坦福V，无菌滑石粉
(滑石)， (滑石)， (瑞戈非尼)，苹果酸舒尼替尼，
(苹果酸舒尼替尼)， (聚乙二醇干扰素α-2b)，
(司妥昔单抗)， (沙利度胺)， (高三尖杉酯碱)，硫鸟嘌呤，TAC，
(达拉菲尼)， (奥希替尼)，拉他莫金冻干混悬剂，柠檬酸他
莫昔芬，tarabine PFS(阿糖胞苷)，TARCEVA(盐酸埃罗替尼)， (蓓萨罗
丁)， (尼罗替尼)， (紫杉醇)， (多西他赛)，
(替莫唑胺)，坦罗莫司，沙利度胺， (沙利度胺)，硫鸟嘌呤，
噻替派， (局部氟尿嘧啶)，盐酸托泊替康，托瑞米芬， (坦罗莫司)，
(盐酸右雷佐生)，TPF，曲贝替定，曲美替尼， (盐酸苯达莫司
汀)，三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶， (三氧化二砷)， (二甲苯磺酸
拉帕替尼)， (达妥昔单抗)，三乙酸尿苷，VAC，凡德他尼，VAMP，
(盐酸罗拉吡坦)，维克替比(帕尼单抗)，VelP， (硫酸长春碱)，
(硼替佐米)，VELSAR(硫酸长春碱)，威罗非尼，VIADUR(醋酸亮丙瑞林)，
VIDAZA(阿扎胞苷)，硫酸长春碱， PFS(硫酸长春新碱)，硫酸长春新碱，酒石
酸长春瑞滨，VIP，维莫德吉， (三乙酸尿苷)， (羧肽酶)，
伏立诺他， (盐酸帕唑帕尼)， (甲酰四氢叶酸钙)，
(克唑替尼)， (卡培他滨)，XELIRI，XELOX， (地诺单
抗)， (二氯化223Ra)， (恩杂鲁胺)， (伊匹单抗)，
(曲贝替定)， (阿柏西普)， (非格司亭)，
(威罗菲尼)， (替伊莫单抗)， (盐酸右雷佐
生)，阿柏西普， (盐酸昂丹司琼)， (g醋酸戈舍瑞林)，唑来膦酸，
(伏立诺他)， (唑来膦酸)， (艾代拉里斯)，
(色瑞替尼)以及ZYTIGA(醋酸阿比特龙)。
症，如本文所述的癌症。适用于与本发明的组合物和方法结合使用的示例性化学治疗剂包
括但不限于，醋酸阿比特龙， (甲氨蝶呤)， (紫杉醇白蛋
白)， 博来霉素、长春碱和达卡巴嗪(ABVD)， 博来
霉素、硫酸长春新碱和磷酸依托泊苷(ABVE)， 博来霉素、硫酸长春新
碱、磷酸依托泊苷、泼尼松和环磷酰胺(ABVE-PC)，阿霉素和环磷酰胺(AC)，阿霉素、环磷酰
胺和紫杉醇或多西他赛(AC-T)， (贝伦妥单抗维多汀)、阿糖胞苷、柔红霉素
和依托泊苷(ADE)，阿多-曲妥珠单抗恩他新， (盐酸阿霉素)，二马来酸
阿法替尼， (依维莫司)， (奈妥吡坦(netupitant)和盐酸帕
洛诺司琼)， (咪喹莫特)，阿地白介素， (艾乐替尼)，艾乐替
尼，阿仑单抗，注射用 (盐酸美法仑)， 片剂(美法仑)，
(培美曲塞二钠)， (盐酸帕洛诺司琼)， (苯丁
酸氮芥)， (苯丁酸氮芥)，氨基乙酰丙酸，阿那曲唑，阿瑞匹坦，
(帕米膦酸二钠)， (阿那曲唑)， (依西美坦)，
(奈拉滨)，三氧化二砷， (奥法木单抗)，天冬酰胺酶菊欧文
氏菌， (贝伐单抗)，阿西替尼，阿扎胞苷，BEACOPP Becenum(卡莫司汀)，
(贝利司他)，贝利司他，盐酸苯达莫司汀，博来霉素、依托泊苷和顺铂
131
(BEP)，贝伐单抗，蓓萨罗丁， (托西莫单抗和碘 I托西莫单抗)，比卡鲁胺，
BiCNU(卡莫司汀)，博来霉素，博纳吐单抗， (博纳吐单抗)，硼替佐米、
(博舒替尼)，博舒替尼，贝伦妥单抗-维多汀，白消安， (白消
安)，卡巴他塞，S-苹果酸卡博替尼，CAF， (阿仑单抗)， (盐
酸伊立替康)，卡培他滨，CAPOX， (氟尿嘧啶)，卡铂，卡铂-- 卡非佐
米， (卡莫司汀)，卡莫司汀，卡莫司汀植入物， (比卡鲁
胺)，CEENU(洛莫司汀)，顺铂、依托泊苷和甲氨蝶呤(CEM)，色瑞替尼， (盐
酸柔红霉素)， (重组HPV二价疫苗)，西妥昔单抗，苯丁酸氮芥，苯丁酸氮芥-
泼尼松，CHOP，顺铂， (环磷酰胺)，氯法拉滨， (氯法拉滨)，
(氯法拉滨)，CMF，考比替尼，cometriq(S-苹果酸卡博替尼)，COPDAC，COPP，
COPP-ABV， (更生霉素)， (考比替尼)，克唑替尼，CVP，环磷
酰胺， (异环磷酰胺)， (雷莫芦单抗)，阿糖胞苷，阿糖胞苷脂质
体，CYTOSAR- (阿糖胞苷)， (环磷酰胺)，达拉菲尼，达卡巴嗪，
(地西他滨)，更生霉素，达雷木单抗， (达雷木单抗)，达沙
替尼，盐酸柔红霉素，地西他滨，地加瑞克，地尼白介素-毒素连接物，地诺单抗，
(阿糖胞苷脂质体)，地塞米松，盐酸地塞米松，达妥昔单抗，多西他赛，
(盐酸阿霉素)，盐酸阿霉素，DOX- (盐酸阿霉素)，DTIC- (达卡巴
嗪)，EFUDEX(氟尿嘧啶)， (拉布立酶)， (盐酸表柔比星)，乐沙定
(奥沙利铂)，依洛珠单抗， (奥沙利铂)，艾曲波帕乙醇胺， (阿瑞
吡坦)， (依洛珠单抗)，恩扎鲁胺，盐酸表柔比星，EPOCH， (西
妥昔单抗)，甲磺酸艾日布林， (维莫德吉)，盐酸埃罗替尼，
(天门冬酰胺酶菊欧文氏菌)， (磷酸依托泊苷)，依托泊苷，磷酸依托泊
苷， (盐酸阿霉素脂质体)，依维莫司， (盐酸雷洛昔芬)，
(盐酸美法仑)，依西美坦，5-FU(5-氟尿嘧啶)， (托瑞米
芬)， (帕比司他)， (氟维司群)，FEC， (来曲
唑)，非格司亭， (磷酸氟达拉滨)，磷酸氟达拉滨， (氟尿
嘧啶)，氟尿嘧啶， (甲氨蝶呤)， PFS(甲氨蝶呤)，FOLFIRI，FOLFIRI-
贝伐单抗，FOLFIRI-西妥昔单抗，FOLFIRINOX，FOLFOX， (普拉曲沙)，FU-LV，
氟维司群， (重组HPV四价疫苗)，GARDASIL (重组HPV九价疫苗)，
(奥比妥珠单抗)，吉非替尼，盐酸吉西他滨，吉西他滨-顺铂，吉西他滨-奥沙
利铂，吉妥珠单抗奥佐米星， (盐酸吉西他滨)、 (二马来酸阿法
替尼)， (甲磺酸伊马替尼)， (卡莫司汀植入物)，
晶片(卡莫司汀植入物)，羧肽酶，醋酸戈舍瑞林， (甲磺酸艾日布林)，
(曲妥珠单抗)，HPV二价疫苗， (盐酸托泊替康)，Hyper-
CVAD，IBRANCE(帕博西尼)， 替伊莫单抗，依布替尼，ICE，
(盐酸普那替尼)， (盐酸伊达比星)，盐酸伊达比星，艾代拉里斯，
(异环磷酰胺)，异环磷酰胺(ifosfamide)，异环磷酰胺(ifosfamidum)，IL-2(阿地白介素)，
甲磺酸伊马替尼， (伊布替尼)，咪喹莫特， (拉他莫金冻干
混悬剂)，INLYTA(阿昔替尼)，重组干扰素α-2b，内含子A，托西莫单抗，如131I托西莫单抗，伊匹单抗， (吉非替尼)，盐酸伊立替康， (罗米地辛)，伊沙匹隆，柠
檬酸伊沙佐米， (伊沙匹隆)， (磷酸鲁索替尼)， (卡
巴他赛)， (阿多-曲妥珠单抗恩他新)， (盐酸雷洛昔芬)，
(帕利夫明)， (派姆单抗)， (卡非佐米)，
醋酸兰瑞肽，二甲苯磺酸拉帕替尼，来那度胺，甲磺酸乐伐替尼， (甲磺酸乐
伐替尼)，来曲唑，甲酰四氢叶酸钙，瘤可宁(苯丁酸氮芥)，醋酸亮丙瑞林，levulan(氨基乙
酰丙酸)， (苯丁酸氮芥)， (盐酸阿霉素脂质体)，洛莫司汀，
(三氟尿苷和盐酸地匹福林) ， (醋酸亮丙瑞林)，
(奥拉帕尼)， (硫酸长春新碱脂质体)， (盐
酸丙卡巴肼)，盐酸氮芥，醋酸甲地孕酮， (曲美替尼)，美法仑，盐酸美法仑，
巯嘌呤， (美司钠)， (替莫唑胺)，甲氨蝶呤，甲氨
蝶呤LPF， (甲氨蝶呤)，MEXATE- (甲氨蝶呤)，丝裂霉素C，盐酸米托蒽醌，
(丝裂霉素C)，MOPP， (普乐沙福)，
(盐酸氮芥)， (丝裂霉素C)， (白消安)，
(阿扎胞苷)， (吉妥单抗奥佐米星)，纳米颗粒紫杉醇，
(酒石酸长春瑞滨)，NECITUMUMAB，奈拉滨， (环磷酰胺)，奈妥吡坦和盐酸帕洛
诺司琼， (非格司亭)， (甲苯磺酸索拉非尼)，尼洛替尼，
(柠檬酸伊沙佐米)，纳武单抗， (柠檬酸他莫昔芬)，
(罗米司亭)，奥比妥珠单抗， (索尼德吉)，OEPA，奥法木单抗，
OFF，奥拉帕尼，高三尖杉酯碱， (培门冬酶)，盐酸昂丹司琼，
(盐酸伊立替康脂质体)， (地尼白介素-毒素连接物)， (纳武单抗)，
OPPA，奥希替尼，奥沙利铂，紫杉醇，紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂，PAD，帕博西尼，帕
利夫明，盐酸帕洛诺司琼，盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦，帕米膦酸二钠，帕尼单抗，帕比司
他， (卡铂)， (卡铂)，盐酸帕唑帕尼，PCV，培门冬酶，聚乙二
醇干扰素α-2b，PEG- (聚乙二醇干扰素α-2b)，派姆单抗，培美曲塞二钠，
(帕妥珠单抗)，帕妥珠单抗， (顺铂)，PLATINOL- (顺
铂)，普乐沙福，泊马度胺， (泊马度胺)，盐酸帕纳替尼，
(耐昔妥珠单抗)，普拉曲沙，泼尼松，盐酸丙卡巴肼， (阿地白介素)，
(地诺单抗)，PROMACTA(艾曲波帕乙醇胺)， (西普鲁塞-T)，
(巯基嘌呤)， (巯基嘌呤)，二氯化223Ra，盐酸雷洛昔芬，
雷莫芦单抗，拉布立酶，R-CHOP，R-CVP，重组人乳头瘤病毒(HPV)，重组干扰素α-2b，瑞戈非
尼，R-EPOCH， (来那度胺)， (甲氨蝶呤)，
(利妥昔单抗)，盐酸罗拉吡坦，罗米地辛，罗米司亭，红比霉素(盐酸柔红霉素)，磷酸鲁索替
尼， 胸膜内气雾剂(滑石)，司妥昔单抗，西普鲁塞-T，索马杜林储库(醋酸
兰瑞肽)，索尼德吉，甲苯磺酸索拉非尼， (达沙替尼)，斯坦福V，无菌滑石粉
(滑石)， (滑石)， (瑞戈非尼)，苹果酸舒尼替尼，
(苹果酸舒尼替尼)， (聚乙二醇干扰素α-2b)，
(司妥昔单抗)， (沙利度胺)， (高三尖杉酯碱)，硫鸟嘌呤，TAC，
(达拉菲尼)， (奥希替尼)，拉他莫金冻干混悬剂，柠檬酸他
莫昔芬，tarabine PFS(阿糖胞苷)，TARCEVA(盐酸埃罗替尼)， (蓓萨罗
丁)， (尼罗替尼)， (紫杉醇)， (多西他赛)，
(替莫唑胺)，坦罗莫司，沙利度胺， (沙利度胺)，硫鸟嘌呤，
噻替派， (局部氟尿嘧啶)，盐酸托泊替康，托瑞米芬， (坦罗莫司)，
(盐酸右雷佐生)，TPF，曲贝替定，曲美替尼， (盐酸苯达莫司
汀)，三氟尿苷和盐酸替吡嘧啶， (三氧化二砷)， (二甲苯磺酸
拉帕替尼)， (达妥昔单抗)，三乙酸尿苷，VAC，凡德他尼，VAMP，
(盐酸罗拉吡坦)，维克替比(帕尼单抗)，VelP， (硫酸长春碱)，
(硼替佐米)，VELSAR(硫酸长春碱)，威罗非尼，VIADUR(醋酸亮丙瑞林)，
VIDAZA(阿扎胞苷)，硫酸长春碱， PFS(硫酸长春新碱)，硫酸长春新碱，酒石
酸长春瑞滨，VIP，维莫德吉， (三乙酸尿苷)， (羧肽酶)，
伏立诺他， (盐酸帕唑帕尼)， (甲酰四氢叶酸钙)，
(克唑替尼)， (卡培他滨)，XELIRI，XELOX， (地诺单
抗)， (二氯化223Ra)， (恩杂鲁胺)， (伊匹单抗)，
(曲贝替定)， (阿柏西普)， (非格司亭)，
(威罗菲尼)， (替伊莫单抗)， (盐酸右雷佐
生)，阿柏西普， (盐酸昂丹司琼)， (g醋酸戈舍瑞林)，唑来膦酸，
(伏立诺他)， (唑来膦酸)， (艾代拉里斯)，
(色瑞替尼)以及ZYTIGA(醋酸阿比特龙)。
[0453] 使用本发明的方法，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可与用于治疗癌症的化学治疗剂共同施用(例如，混合)或与化学治疗
剂分开施用。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片
段或构建体)可同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症的人患者。在一些实施方案中，
在向患者施用化学治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗
原结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在化学治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多
肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法治疗
失败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测化学疗法治
疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。
剂分开施用。例如，本发明的拮抗性TNFR2多肽(如本文所述单链多肽、抗体、其抗原结合片
段或构建体)可同时或在不同时间施用于患者，如患有癌症的人患者。在一些实施方案中，
在向患者施用化学治疗剂之前，将拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述单链多肽、抗体、其抗
原结合片段或构建体)施用于患者。或者，可在化学治疗剂之后向患者施用拮抗性TNFR2多
肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法治疗
失败之后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体)。本领域的熟练医生可使用本文所述和本领域中已知的方法来监测化学疗法治
疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。
[0454] 例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代
地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT
扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者
体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关
抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的
癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一
种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、
5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领
域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结
合片段或构建体。
地，本领域的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT
扫描、MRI或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者
体内的肿瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关
抗原或分泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的
癌症)的进展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一
种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、
5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领
域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结
合片段或构建体。
[0455] 另外地或可替代地，本文所述的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可与放射疗法同时施用或与放射疗法分开施用。例如，本领域的熟练医
生可通过用外部和/或内部电磁辐射治疗患者来向患者(如患有本文所述癌症的人患者)施
用放射疗法。这种辐射所传递的能量(通常呈X射线、γ射线的形式以及类似形式的低波长
能量)可对癌细胞的DNA造成氧化损伤，从而导致细胞死亡(例如通过细胞凋亡)。例如，可使
用诸如辐射束的机器来施用外部放射疗法，以使患者暴露于受控的电磁辐射脉冲。另外地
或可替代地，可例如通过向患者施用含有放射性取代基的治疗剂(如含有223Ra或131I的剂，
其分别发射高能α和β颗粒)来向患者施用内部辐射。可与放射性标记缀合的示例性治疗剂
包括例如，小分子化学治疗剂、抗体以及其抗原结合片段等。例如，本发明的拮抗性TNFR2多
肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可例如使用本领域中已知或本文所述
的键形成技术与放射性取代基或连接这种取代基的部分缀合。可将此类缀合物施用于受试
者，以便在同时施用中递送治疗剂量的放射疗法和本发明的TNFR2拮抗剂(参见例如，上文
“拮抗性TNFR2多肽缀合物”)。
生可通过用外部和/或内部电磁辐射治疗患者来向患者(如患有本文所述癌症的人患者)施
用放射疗法。这种辐射所传递的能量(通常呈X射线、γ射线的形式以及类似形式的低波长
能量)可对癌细胞的DNA造成氧化损伤，从而导致细胞死亡(例如通过细胞凋亡)。例如，可使
用诸如辐射束的机器来施用外部放射疗法，以使患者暴露于受控的电磁辐射脉冲。另外地
或可替代地，可例如通过向患者施用含有放射性取代基的治疗剂(如含有223Ra或131I的剂，
其分别发射高能α和β颗粒)来向患者施用内部辐射。可与放射性标记缀合的示例性治疗剂
包括例如，小分子化学治疗剂、抗体以及其抗原结合片段等。例如，本发明的拮抗性TNFR2多
肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)可例如使用本领域中已知或本文所述
的键形成技术与放射性取代基或连接这种取代基的部分缀合。可将此类缀合物施用于受试
者，以便在同时施用中递送治疗剂量的放射疗法和本发明的TNFR2拮抗剂(参见例如，上文
“拮抗性TNFR2多肽缀合物”)。
[0456] 在一些实施方案中，在放射治疗失败后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。本领域的熟练医生可使用例如本文所述的方法监
测放射治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。
例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离
的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域
的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI
或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿
瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分
泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的癌症)的进
展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿
瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7
天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用辐射疗法后没有降低例如统计
学上显著的量的发现可表明辐射治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可
施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
测放射治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。
例如，本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离
的样品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域
的熟练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI
或X射线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿
瘤生物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分
泌的肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标来监测癌症(如本文所述的癌症)的进
展。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的样品中存在的一种或多种肿
瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7
天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用辐射疗法后没有降低例如统计
学上显著的量的发现可表明辐射治疗未能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可
施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
[0457] 在一些实施方案中，本领域的熟练医生可向患有癌症的患者施用化学治疗剂、放射疗法和本发明的TNFR2拮抗剂(如本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建
体)。本发明的TNFR2拮抗剂、化学治疗剂和放射疗法可同时(例如，在单一药物组合物中或
作为同时施用于患者的多种组合物)或在不同时间施用于患者。在一些实施方案中，首先将
TNFR2拮抗剂(如本发明的抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体)施用于患者，并且然
后施用化学治疗剂和放射疗法。或者，可在化学疗法和放射治疗后向患者施用TNFR2拮抗剂
(如本发明的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法和/或放射治
疗失败后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体)。
体)。本发明的TNFR2拮抗剂、化学治疗剂和放射疗法可同时(例如，在单一药物组合物中或
作为同时施用于患者的多种组合物)或在不同时间施用于患者。在一些实施方案中，首先将
TNFR2拮抗剂(如本发明的抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体)施用于患者，并且然
后施用化学治疗剂和放射疗法。或者，可在化学疗法和放射治疗后向患者施用TNFR2拮抗剂
(如本发明的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体)。例如，可在化学疗法和/或放射治
疗失败后向患者施用拮抗性TNFR2多肽(例如，本文所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段
或构建体)。
[0458] 本领域的熟练医生可使用本文所述(如上文所述的方法)来监测化学疗法和放射治疗的功效以确定所述疗法是否已成功改善了所治疗的病理(如本文所述的癌症)。例如，
本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样
品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟
练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射
线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生
物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的
肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标并且甚至测量血清可溶性TNFR2来监测癌
症(如本文所述的癌症)的进展。本领域技术人员将预期活化的T-reg的数量减少，以及T效
应子的数量增加和癌细胞的总数减少。由于这些TNFR2抗体对癌症的特异性，临床监测将预
期在肿瘤微环境中是最显著的。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的
样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1
天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂和辐射后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法和辐射治疗未
能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文
所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
本领域的熟练医生可例如使用流式细胞术或FACS分析来监测从患者(如人患者)分离的样
品(例如，血液样品或活组织检查样品)中的癌细胞的数量。另外地或可替代地，本领域的熟
练医生可例如的通过监测患者体内的一个或多个肿瘤的大小(例如，通过CT扫描、MRI或X射
线分析)来监测患者的癌症疾病的进展。本领域的熟练医生可通过评价患者体内的肿瘤生
物标志物的数量和/或浓度，如患者血液中存在的细胞表面结合的肿瘤相关抗原或分泌的
肿瘤抗原的数量和/或浓度作为肿瘤存在的指标并且甚至测量血清可溶性TNFR2来监测癌
症(如本文所述的癌症)的进展。本领域技术人员将预期活化的T-reg的数量减少，以及T效
应子的数量增加和癌细胞的总数减少。由于这些TNFR2抗体对癌症的特异性，临床监测将预
期在肿瘤微环境中是最显著的。癌细胞的数量、肿瘤的大小和/或患者体内或从患者分离的
样品中存在的一种或多种肿瘤抗原的数量或浓度在特定时间段内(例如，1天至6个月，如1
天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月)施用化学治疗剂和辐射后没有降低例如统计学上显著的量的发现可表明化学疗法和辐射治疗未
能改善癌症。基于此适应症，本领域的熟练医生可施用本发明的拮抗性TNFR2多肽，如本文
所述的单链多肽、抗体、其抗原结合片段或构建体。
[0459] 血脑屏障渗透
[0460] 在某些实施方案中，可配制本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)以确保体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。
为确保本发明的治疗组合物穿过BBB(如果需要)，所述治疗组合物可配制到例如脂质体中。
已经描述了制造脂质体的方法，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂
质体可包含被选择性地输送到特定细胞或器官中、从而增强靶向药物递送的一个或多个部
分(参见例如V.V.Ranade(J.Clin.Pharmacol.29:685,1989))。示例性靶向部分包括例如，
叶酸或生物素(参见例如，美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人
(Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038,1988))；抗体(P.G.Bloeman等人(FEBS
Lett.357:140,1995)；M.Owais等人(Antimicrob.Agents Chemother.39:180,1995))；表面
活性蛋白A受体(Briscoe等人(Am.J.Physiol.1233:134,1995))；所述文献各自的公开内容
均以引用的方式并入本文。
为确保本发明的治疗组合物穿过BBB(如果需要)，所述治疗组合物可配制到例如脂质体中。
已经描述了制造脂质体的方法，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂
质体可包含被选择性地输送到特定细胞或器官中、从而增强靶向药物递送的一个或多个部
分(参见例如V.V.Ranade(J.Clin.Pharmacol.29:685,1989))。示例性靶向部分包括例如，
叶酸或生物素(参见例如，美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人
(Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038,1988))；抗体(P.G.Bloeman等人(FEBS
Lett.357:140,1995)；M.Owais等人(Antimicrob.Agents Chemother.39:180,1995))；表面
活性蛋白A受体(Briscoe等人(Am.J.Physiol.1233:134,1995))；所述文献各自的公开内容
均以引用的方式并入本文。
[0461] 施用途径和剂量
[0462] 本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)可通过多种途径施用于哺乳动物受试者(例如，人)，所述途径如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉
内、眼内、肿瘤内、胃肠外、局部、鞘内和脑室内。在任何给定情况下最合适的施用途径将取
决于所施用的特定多、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的
年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食以及患者的排泄率。
内、眼内、肿瘤内、胃肠外、局部、鞘内和脑室内。在任何给定情况下最合适的施用途径将取
决于所施用的特定多、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的
年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食以及患者的排泄率。
[0463] 本发明的抗TNFR2多肽的有效剂量可在每单次(例如，大丸剂)施用、多次施用或连续施用约0.0001至约100mg/kg体重的范围内，或者每单次(例如，大丸剂)施用、多次施用或
连续施用实现0.0001-5000μg/mL的血清浓度，或者其中的任何有效范围或值，其取决于所
治疗的病状、施用途径以及受试者的年龄、体重和状况。在某些实施方案中，例如，对于癌症
的治疗，每个剂量可在约0.0001mg至约500mg/kg体重的范围内。例如，本发明的药物组合物
可以0.001-100mg/kg(体重)范围内的每日剂量施用。剂量可每天、每周、每月或每年施用于
有需要的哺乳动物受试者(例如，人)一次或多次(例如，2-10次)。
连续施用实现0.0001-5000μg/mL的血清浓度，或者其中的任何有效范围或值，其取决于所
治疗的病状、施用途径以及受试者的年龄、体重和状况。在某些实施方案中，例如，对于癌症
的治疗，每个剂量可在约0.0001mg至约500mg/kg体重的范围内。例如，本发明的药物组合物
可以0.001-100mg/kg(体重)范围内的每日剂量施用。剂量可每天、每周、每月或每年施用于
有需要的哺乳动物受试者(例如，人)一次或多次(例如，2-10次)。
[0464] 治疗组合物可使用本领域中已知的医疗装置来施用。例如，在一个实施方案中，本发明的治疗组合物可使用无针皮下注射装置，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,
312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置来施用。可用于本
发明中的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开以受控速率分配药
物的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，其公开通过皮肤施用药物的治疗装置；美
国专利号4,447,233，其公开以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,
224，其公开用于连续药物递送的变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具
有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开渗透药物递送系
统。这些专利以引用的方式并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术
人员已知的。
312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置来施用。可用于本
发明中的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开以受控速率分配药
物的可植入微型输注泵；美国专利号4,486,194，其公开通过皮肤施用药物的治疗装置；美
国专利号4,447,233，其公开以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,
224，其公开用于连续药物递送的变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具
有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开渗透药物递送系
统。这些专利以引用的方式并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术
人员已知的。
[0465] 含有拮抗性抗TNFR2多肽的试剂盒
[0466] 本发明还包括含有拮抗性抗TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)的试剂盒。本文提供的试剂盒可含有上述拮抗性TNFR2多肽中的任一种以及编码这些抗
体的任何多核苷酸、含有这些多核苷酸的载体或经工程化以表达和分泌本发明的抗体的细
胞(例如，原核或真核细胞)。本发明的试剂盒可包括可用于产生本发明组合物的试剂(例
如，拮抗性抗TNFR2多肽，如单链多肽、抗体，含有拮抗性抗TNFR2多肽的缀合物，编码拮抗性
TNFR2多肽的多核苷酸，含有这些多核苷酸的载体)。任选地，本发明的试剂盒可包括可诱导
细胞(例如，哺乳动物细胞)内的拮抗性TNFR2多肽表达的试剂，如多西环素或四环素。在其
他情况下，本发明的试剂盒可含有能够结合并检测含有拮抗性TNFR2抗体和表位标签的融
合蛋白的化合物。例如，在此类情况下，本发明的试剂盒可含有麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合
物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、生物素或链霉亲和素。
体的任何多核苷酸、含有这些多核苷酸的载体或经工程化以表达和分泌本发明的抗体的细
胞(例如，原核或真核细胞)。本发明的试剂盒可包括可用于产生本发明组合物的试剂(例
如，拮抗性抗TNFR2多肽，如单链多肽、抗体，含有拮抗性抗TNFR2多肽的缀合物，编码拮抗性
TNFR2多肽的多核苷酸，含有这些多核苷酸的载体)。任选地，本发明的试剂盒可包括可诱导
细胞(例如，哺乳动物细胞)内的拮抗性TNFR2多肽表达的试剂，如多西环素或四环素。在其
他情况下，本发明的试剂盒可含有能够结合并检测含有拮抗性TNFR2抗体和表位标签的融
合蛋白的化合物。例如，在此类情况下，本发明的试剂盒可含有麦芽糖、谷胱甘肽、含镍复合
物、抗FLAG抗体、抗myc抗体、抗HA抗体、生物素或链霉亲和素。
[0467] 本发明的试剂盒还可包括能够直接检测拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体或其片段)的试剂。此类试剂的实例包括二级抗体，所述二级抗体选择性地识别并结合本发
明的抗TNFR2抗体的Fc区内的特定结构特征。本发明的试剂盒可含有识别拮抗性TNFR2抗体
的Fc区并与荧光分子缀合的二级抗体。这些抗体-荧光团缀合物提供了用于使用已建立的
免疫荧光技术分析拮抗性抗TNFR2抗体例如在特定组织或培养的哺乳动物细胞中的定位的
工具。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包括表现出已知的亚细胞定位模式的额外荧
光化合物。这些试剂可与另一种抗体-荧光团缀合物，例如特异性地识别细胞表面上的不同
受体的抗体-荧光团缀合物组合使用，以分析抗TNFR2抗体相对于其他细胞表面蛋白的定
位。
明的抗TNFR2抗体的Fc区内的特定结构特征。本发明的试剂盒可含有识别拮抗性TNFR2抗体
的Fc区并与荧光分子缀合的二级抗体。这些抗体-荧光团缀合物提供了用于使用已建立的
免疫荧光技术分析拮抗性抗TNFR2抗体例如在特定组织或培养的哺乳动物细胞中的定位的
工具。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包括表现出已知的亚细胞定位模式的额外荧
光化合物。这些试剂可与另一种抗体-荧光团缀合物，例如特异性地识别细胞表面上的不同
受体的抗体-荧光团缀合物组合使用，以分析抗TNFR2抗体相对于其他细胞表面蛋白的定
位。
[0468] 本发明的试剂盒还可含有可用于通过施用本发明的拮抗性TNFR2多肽(例如，单链多肽、抗体以及其抗原结合片段)来分析患者对治疗的反应的试剂。例如，本发明的试剂盒
可包括拮抗性TNFR2抗体和一种或多种试剂，所述试剂可用于确定从正在用本发明的抗体
治疗的受试者(例如，人)中抽取的血液样品中T-reg细胞的数量。这种试剂盒可含有例如选
择性地结合由T-reg细胞呈递的细胞表面抗原(如CD4和CD25)的抗体。任选地，这些抗体可
用荧光染料(如荧光素或四甲基罗丹明)标记，以便有助于通过本领域中已知的荧光活化细
胞分选(FACS)方法分析T-reg细胞。本发明的试剂盒可任选地含有一种或多种试剂，所述试
剂可用于定量肿瘤反应性T淋巴细胞，以确定本发明的拮抗性TNFR2抗体在恢复肿瘤浸润性
淋巴细胞增殖方面的有效性。例如，本发明的试剂盒可含有选择性地结合细胞毒性T细胞表
面上的细胞表面标志物(如CD8或CD3)的抗体。任选地，可用荧光分子标记这些抗体，以便能
够通过FACS分析进行定量。
可包括拮抗性TNFR2抗体和一种或多种试剂，所述试剂可用于确定从正在用本发明的抗体
治疗的受试者(例如，人)中抽取的血液样品中T-reg细胞的数量。这种试剂盒可含有例如选
择性地结合由T-reg细胞呈递的细胞表面抗原(如CD4和CD25)的抗体。任选地，这些抗体可
用荧光染料(如荧光素或四甲基罗丹明)标记，以便有助于通过本领域中已知的荧光活化细
胞分选(FACS)方法分析T-reg细胞。本发明的试剂盒可任选地含有一种或多种试剂，所述试
剂可用于定量肿瘤反应性T淋巴细胞，以确定本发明的拮抗性TNFR2抗体在恢复肿瘤浸润性
淋巴细胞增殖方面的有效性。例如，本发明的试剂盒可含有选择性地结合细胞毒性T细胞表
面上的细胞表面标志物(如CD8或CD3)的抗体。任选地，可用荧光分子标记这些抗体，以便能
够通过FACS分析进行定量。
[0469] 本发明的试剂盒还可含有一种或多种可用于测定本发明的拮抗性TNFR2多肽对一种或多种源自TNFR2的肽(例如，含有SEQ ID NO:11、19、20、34-117、285或286中任一个的序
列的肽)的亲和力和选择性的试剂。例如，试剂盒可含有拮抗性TNFR2多肽和一种或多种试
剂，所述试剂可用于ELISA测定中以测定本发明的抗体对一种或多种肽的KD，所述肽呈现与
天然蛋白质中的表位的构象类似的构象的TNFR2表位。试剂盒可含有例如先前已与抗生物
素蛋白缀合的孔的微量滴定板，并且可含有TNFR2源性肽的文库，所述肽各自与生物素部分
缀合。这种试剂盒可任选地含有特异性地结合至本发明的拮抗性TNFR2抗体的Fc区的二级
抗体，并且所述二级抗体可与催化化学反应的酶(例如，辣根过氧化物酶)缀合，所述化学反
应产生发光的发射。
列的肽)的亲和力和选择性的试剂。例如，试剂盒可含有拮抗性TNFR2多肽和一种或多种试
剂，所述试剂可用于ELISA测定中以测定本发明的抗体对一种或多种肽的KD，所述肽呈现与
天然蛋白质中的表位的构象类似的构象的TNFR2表位。试剂盒可含有例如先前已与抗生物
素蛋白缀合的孔的微量滴定板，并且可含有TNFR2源性肽的文库，所述肽各自与生物素部分
缀合。这种试剂盒可任选地含有特异性地结合至本发明的拮抗性TNFR2抗体的Fc区的二级
抗体，并且所述二级抗体可与催化化学反应的酶(例如，辣根过氧化物酶)缀合，所述化学反
应产生发光的发射。
[0470] 本发明的试剂盒还可含有本发明的拮抗性TNFR2多肽以及可与这种抗体缀合的试剂，所述试剂包括先前描述的那些(例如，细胞毒性剂、荧光分子、生物发光分子、含有放射
性同位素的分子、含有与顺磁离子结合的螯合基团的分子等)。这些试剂盒可另外含有关于
可实现本发明的拮抗性TNFR2抗体与第二分子(如上文所述的那些)的缀合的方式的说明
书。
性同位素的分子、含有与顺磁离子结合的螯合基团的分子等)。这些试剂盒可另外含有关于
可实现本发明的拮抗性TNFR2抗体与第二分子(如上文所述的那些)的缀合的方式的说明
书。
[0471] 本发明的试剂盒还可含有载体，所述载体含有编码拮抗性抗TNFR2多肽的多核苷酸，如本文所述的任何载体。或者，试剂盒可包括哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，所述细胞
已被遗传改变以自细胞的核基因组表达和分泌拮抗性TNFR2抗体或其片段。这种试剂盒还
可含有描述可诱导自多核苷酸表达拮抗性TNFR2抗体或其片段的方式的说明书，并且可另
外包括可用于促进这些多核苷酸的转录的试剂(例如像强力霉素或四环素)。此类试剂盒可
用于制备本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
已被遗传改变以自细胞的核基因组表达和分泌拮抗性TNFR2抗体或其片段。这种试剂盒还
可含有描述可诱导自多核苷酸表达拮抗性TNFR2抗体或其片段的方式的说明书，并且可另
外包括可用于促进这些多核苷酸的转录的试剂(例如像强力霉素或四环素)。此类试剂盒可
用于制备本发明的拮抗性TNFR2抗体或其抗原结合片段。
[0472] 本发明的其他试剂盒可包括用于工程化原核或真核细胞(例如，CHO细胞或BL21(DE3)大肠杆菌细胞)以便自所述细胞的核基因组表达和分泌本发明的拮抗性TNFR2多肽的
工具。例如，试剂盒可含有储存在适当培养基中并且任选地根据本领域中已知的方法冷冻
的CHO细胞。所述试剂盒还可提供含有编码核酸酶(例如，如本文所述的CRISPER/Cas、锌指
核酸酶、TALEN、ARCUSTM核酸酶)的多核苷酸的载体以及用于在细胞中表达核酸酶的试剂。所
述试剂盒可另外提供用于修饰编码核酸酶以能够改变所述核酸酶的DNA序列来指导特定目
标靶DNA序列的裂解的多核苷酸的工具。此类工具的实例包括用于编码目标核酸酶的多核
苷酸的扩增和定点诱变的引物。所述试剂盒还可包括限制酶，所述限制酶可用于从载体中
选择性地切除编码核酸酶的多核苷酸，并且一旦使用者已经修饰基因，随后就将修饰的多
核苷酸重新引入载体中。这种试剂盒还可包括DNA连接酶，所述DNA连接酶可用于催化修饰
的编码核酸酶的多核苷酸和靶载体之间的共价磷酸二酯键联的形成。本发明的试剂盒还可
提供编码拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的多核苷酸，以及描述可用于选择性地裂解细胞基
因组中的特定DNA序列以便将编码拮抗性TNFR2抗体的多核苷酸在此位点掺入基因组中的
方法的包装说明书。任选地，所述试剂盒可提供编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含
有拮抗性TNFR2抗体或其片段和另外的多肽，例如像本文所述的那些。
工具。例如，试剂盒可含有储存在适当培养基中并且任选地根据本领域中已知的方法冷冻
的CHO细胞。所述试剂盒还可提供含有编码核酸酶(例如，如本文所述的CRISPER/Cas、锌指
核酸酶、TALEN、ARCUSTM核酸酶)的多核苷酸的载体以及用于在细胞中表达核酸酶的试剂。所
述试剂盒可另外提供用于修饰编码核酸酶以能够改变所述核酸酶的DNA序列来指导特定目
标靶DNA序列的裂解的多核苷酸的工具。此类工具的实例包括用于编码目标核酸酶的多核
苷酸的扩增和定点诱变的引物。所述试剂盒还可包括限制酶，所述限制酶可用于从载体中
选择性地切除编码核酸酶的多核苷酸，并且一旦使用者已经修饰基因，随后就将修饰的多
核苷酸重新引入载体中。这种试剂盒还可包括DNA连接酶，所述DNA连接酶可用于催化修饰
的编码核酸酶的多核苷酸和靶载体之间的共价磷酸二酯键联的形成。本发明的试剂盒还可
提供编码拮抗性抗TNFR2抗体或其片段的多核苷酸，以及描述可用于选择性地裂解细胞基
因组中的特定DNA序列以便将编码拮抗性TNFR2抗体的多核苷酸在此位点掺入基因组中的
方法的包装说明书。任选地，所述试剂盒可提供编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含
有拮抗性TNFR2抗体或其片段和另外的多肽，例如像本文所述的那些。
[0473] 实施例
[0475] 实施例1.对TNFR2内与TNFRAB1和TNFRAB2相互作用的离散表位作图
[0476] 将源自人TNFR2的线性肽、环状肽和双环肽的文库针对蛋白质内对TNFR2抗体TNFRAB2表现出高亲和力的不同序列进行筛选。为了筛选TFNR2内的构象表位，使来自初级
蛋白质序列的不同区域的肽彼此缀合以形成嵌合肽。这些肽在其一级序列内的策略位置含
有半胱氨酸残基(参见例如图3，SEQ ID NO:34-117和134-252)。这促进了分子内交联策略，
所述策略用于将单独肽约束为多种三维构象中的一种。使未受保护的半胱氨酸残基的硫醇
通过亲核取代反应与二价和三价亲电子试剂如2,6-双(溴甲基)吡啶和1,3,5-三(溴甲基)
苯交联，以便分别形成构象限制的环状肽和双环肽。以这种方式，约束含有来自TNFR2一级
序列的不同区域的氨基酸的独特组合的肽，以便在结构上预组构可类似于天然TNFR2三级
结构中呈现的那些表位的表位。通过将肽固定至固体表面的不同区域并且在过氧化氢存在
下依次用TNFRAB1或TNFRAB2、与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体和HRP底物(2,2'-偶
氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐)处理所述表面来筛选含有这些肽的文库。在用连续试剂
处理之间洗涤所述固体表面，以除去过量或非特异性结合的物质。随后使用电荷耦合器件
(CCD)-相机和图像处理系统分析每个表面的每个区域的发光。
蛋白质序列的不同区域的肽彼此缀合以形成嵌合肽。这些肽在其一级序列内的策略位置含
有半胱氨酸残基(参见例如图3，SEQ ID NO:34-117和134-252)。这促进了分子内交联策略，
所述策略用于将单独肽约束为多种三维构象中的一种。使未受保护的半胱氨酸残基的硫醇
通过亲核取代反应与二价和三价亲电子试剂如2,6-双(溴甲基)吡啶和1,3,5-三(溴甲基)
苯交联，以便分别形成构象限制的环状肽和双环肽。以这种方式，约束含有来自TNFR2一级
序列的不同区域的氨基酸的独特组合的肽，以便在结构上预组构可类似于天然TNFR2三级
结构中呈现的那些表位的表位。通过将肽固定至固体表面的不同区域并且在过氧化氢存在
下依次用TNFRAB1或TNFRAB2、与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体和HRP底物(2,2'-偶
氮-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐)处理所述表面来筛选含有这些肽的文库。在用连续试剂
处理之间洗涤所述固体表面，以除去过量或非特异性结合的物质。随后使用电荷耦合器件
(CCD)-相机和图像处理系统分析每个表面的每个区域的发光。
[0477] “表面上肽的受约束文库”(CLIPS)平台开始于使用组合矩阵设计将靶蛋白(例如TNFR2)转化为多达10,000个重叠肽构建体的文库(Timmerman等人,J.Mol.Recognit.,20:
283-29,2007)。在固体载体上，合成线性肽的矩阵，随后将所述线性肽成形为空间限定的
CLIPS构建体。表示呈正确构象的不连续表位的多个部分的构建体以高亲和力结合抗体，对
其进行检测和定量。呈递不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含表位的构建
体根本不结合。在迭代筛选中使用亲和力信息来详细定义表位的序列和构象。对于TNFRAB1
和TNFRAB2，分别在图3A和3B中报道了从这些ELISA实验获得的原始发光数据。这些结果告
知了TNFR2表面上存在的结合拮抗性TNFR2抗体的表位的分析。说明结合此类抗体的表位的
TNFR2的结构模型在图4和15A-15C中示出。
283-29,2007)。在固体载体上，合成线性肽的矩阵，随后将所述线性肽成形为空间限定的
CLIPS构建体。表示呈正确构象的不连续表位的多个部分的构建体以高亲和力结合抗体，对
其进行检测和定量。呈递不完整表位的构建体以较低亲和力结合抗体，而不含表位的构建
体根本不结合。在迭代筛选中使用亲和力信息来详细定义表位的序列和构象。对于TNFRAB1
和TNFRAB2，分别在图3A和3B中报道了从这些ELISA实验获得的原始发光数据。这些结果告
知了TNFR2表面上存在的结合拮抗性TNFR2抗体的表位的分析。说明结合此类抗体的表位的
TNFR2的结构模型在图4和15A-15C中示出。
[0478] 肽合成
[0479] 为了重新构建靶分子的表位，合成了肽文库。通过使用二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)经由与叔丁氧基羰基-六亚甲基二胺(BocHMDA)反应移植专有亲水
性聚合物制剂并且随后使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc基团来获得氨基官能化的聚丙烯支撑
物。使用标准Fmoc肽合成来通过定制改良的 液体处理站(Perkin Elmer)在氨基
官能化的固体支撑物上合成肽。CLIPS技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片状折叠、螺
旋状折叠以及其组合。将CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。将肽中的多个半胱氨酸的侧链与
一个或两个CLIPS模板偶联。例如，在碳酸氢铵(20mM，pH 7.8)/乙腈(1:3(v/v))中溶解
0.5mM的CLIPS模板(2,6-双(溴甲基)吡啶)溶液。将此溶液添加至表面结合的肽阵列中。
CLIPS模板将与存在于肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧
链反应。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，用过量的
H2O充分洗涤肽阵列，并且在70℃下在PBS(pH 7.2)中的含有1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的破
坏缓冲液中超声处理30分钟，接着在H2O中再进行超声处理45分钟。
性聚合物制剂并且随后使用三氟乙酸(TFA)裂解Boc基团来获得氨基官能化的聚丙烯支撑
物。使用标准Fmoc肽合成来通过定制改良的 液体处理站(Perkin Elmer)在氨基
官能化的固体支撑物上合成肽。CLIPS技术允许将肽构建成单环、双环、三环、片状折叠、螺
旋状折叠以及其组合。将CLIPS模板与半胱氨酸残基偶联。将肽中的多个半胱氨酸的侧链与
一个或两个CLIPS模板偶联。例如，在碳酸氢铵(20mM，pH 7.8)/乙腈(1:3(v/v))中溶解
0.5mM的CLIPS模板(2,6-双(溴甲基)吡啶)溶液。将此溶液添加至表面结合的肽阵列中。
CLIPS模板将与存在于肽阵列(具有3μl孔的455孔板)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧
链反应。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时完全覆盖在溶液中。最后，用过量的
H2O充分洗涤肽阵列，并且在70℃下在PBS(pH 7.2)中的含有1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的破
坏缓冲液中超声处理30分钟，接着在H2O中再进行超声处理45分钟。
[0480] 通过表面等离子体共振分析拮抗性TNFR2抗体的结合亲和力
[0481] 使用BIACORETMAnalysis Services(Precision Antibody)测量拮抗性TNFR2抗体对重组人TNFR2的亲和力。简言之，使用PBS中的生物素-LC-LC-NOSE(Thermo-Fisher)以5:1
的化学计量比使抗体生物素化。通过离心色谱法除去过量的生物素化试剂，并将生物素化
的抗体在3000RU的链霉亲和素表面上捕获至100RU的水平。具有该抗体捕获水平的TNFR2的
信号的理论最大值是26RU，并且在运行缓冲液中使用500nM TNFR2的初步实验情况下达到
该信号。以60μL/分钟的流速注入2分钟进行抗原结合的动力学分析。将抗体以1mg/ml的浓
度注入至100RU的最终捕获。所使用的仪器是具有BioCap芯片的BIACORETM3000(GE
Healthcare)。双重参考方法用于分析。参考通道含有相同水平的链霉亲和素。如使用此测
定测量的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2与TNFR2的结合的热力学和动力学参数在图
13A中示出。
的化学计量比使抗体生物素化。通过离心色谱法除去过量的生物素化试剂，并将生物素化
的抗体在3000RU的链霉亲和素表面上捕获至100RU的水平。具有该抗体捕获水平的TNFR2的
信号的理论最大值是26RU，并且在运行缓冲液中使用500nM TNFR2的初步实验情况下达到
该信号。以60μL/分钟的流速注入2分钟进行抗原结合的动力学分析。将抗体以1mg/ml的浓
度注入至100RU的最终捕获。所使用的仪器是具有BioCap芯片的BIACORETM3000(GE
Healthcare)。双重参考方法用于分析。参考通道含有相同水平的链霉亲和素。如使用此测
定测量的拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2与TNFR2的结合的热力学和动力学参数在图
13A中示出。
[0482] ELISA筛选
[0483] 以ELISA形式测试抗体与合成的肽中的每一种的结合。将表面固定的肽阵列与一级抗体溶液一起孵育(在4℃下过夜)。在洗涤后，将肽阵列与1/1000稀释的合适的抗体过氧
化物酶缀合物(SBA)一起在25℃下孵育1小时。在洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-连氮
基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。在一小时后，测量显色。使用电
荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行定量。从CCD相机获得的值在0至
3000mAU的范围内，类似于标准96孔板ELISA读取器。将结果量化并存储到Peplab数据库中。
有时，孔含有气泡，从而导致假阳性值，手动检查卡片，并且将由气泡引起的任何值计分为
0。
化物酶缀合物(SBA)一起在25℃下孵育1小时。在洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-连氮
基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。在一小时后，测量显色。使用电
荷耦合器件(CCD)-照相机和图像处理系统对显色进行定量。从CCD相机获得的值在0至
3000mAU的范围内，类似于标准96孔板ELISA读取器。将结果量化并存储到Peplab数据库中。
有时，孔含有气泡，从而导致假阳性值，手动检查卡片，并且将由气泡引起的任何值计分为
0。
[0484] 为了验证合成肽的质量，平行合成了一组单独的阳性和阴性对照肽。用阴性对照抗体57.9筛选这些，抗体57.9是不特异性结合TNFR2的抗体(Posthumus等人
(J.Virology.64:3304-3309,1990))。
(J.Virology.64:3304-3309,1990))。
[0485] 以高亲和力结合TNFRAB1和TNFRAB2的肽分别在图3A和3B中突出显示。这些肽因此含有TNFR2内的残基，所述残基在结构上构造成优先被TNFRAB1和TNFRAB2结合的表位。
[0486] 表位作图
[0487] ELISA也用于确定TNFR2细胞外表面上存在的线性表位。对应于TNFR2一级序列内的不同区域的线性肽购自GenScript(Piscataway,NJ)，在包被缓冲液中稀释并以1μg/孔的
浓度置于Immulon 4HBX平底微量滴定板(Thermo Scientific)上。将一级TNFR2拮抗性抗体
(0.1μg/孔)与底物一起孵育。针对啮齿动物IgG的二级抗体用于检测一级抗体。使用
190吸光度读板仪测量吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(Molecular
Devices)进行分析。这些基于ELISA的测定的结果在图13B和13C中示出。
浓度置于Immulon 4HBX平底微量滴定板(Thermo Scientific)上。将一级TNFR2拮抗性抗体
(0.1μg/孔)与底物一起孵育。针对啮齿动物IgG的二级抗体用于检测一级抗体。使用
190吸光度读板仪测量吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(Molecular
Devices)进行分析。这些基于ELISA的测定的结果在图13B和13C中示出。
[0488] 实施例2.拮抗性TNFR2抗体抑制T-reg细胞增殖
[0489] 材料和方法
[0490] ·人T-reg FlowTM试剂盒(BioLegend，目录号320401)
[0491] o混合物抗人CD4PE-Cy5/CD25PE(BioLegend，料号78930)
[0492] o Alexa 488抗人FOXP3，克隆259D(BioLegend，料号79467)
[0493] o Alexa 488小鼠IgG1，k同种型对照(ICFC)，克隆MOPC-21(BioLegend，料号79486)
[0494] o FOXP3固定/透化缓冲液(4X)(BioLegend，目录号421401)
[0495] o FOXP3透化缓冲液(10X)(BioLegend，目录号421402)
[0496] ·PE抗人CD25，克隆：BC96(BioLegend，目录号302606)
[0497] ·Alexa 488抗人FOXP3，克隆259D(BioLegend，目录号320212)
[0498] ·PBS pH 7.4(1X)(Gibco目录号10010-023)
[0499] ·HBSS(1X)(Gibco目录号14175-095)
[0500] ·FBS(热灭活)
[0501] ·15ml管
[0503] 对拮抗性TNFR2抗体(TNFRAB1和TNFRAB2)遏制T-reg细胞增殖的能力进行了测试。在存在和不存在刺激性生长因子(例如TNFα)的情况下，用不同浓度的拮抗性TNFR2抗体处
理培养的T-reg细胞持续设定时间段。在存在和不存在TNFα的情况下，还将T-reg细胞在
TNFRAB1存在下以0.0008-25μg/ml范围内的各种浓度进行了培养。作为对照，还将T-reg细
胞以0-40ng/ml范围内的浓度与单独TNFα一起孵育，以选择诱导T-reg细胞计数的高分数增
加的TNFα水平。另外，在单独的IL-2存在下和在单独TNFRAB2存在下培养T-reg细胞。
理培养的T-reg细胞持续设定时间段。在存在和不存在TNFα的情况下，还将T-reg细胞在
TNFRAB1存在下以0.0008-25μg/ml范围内的各种浓度进行了培养。作为对照，还将T-reg细
胞以0-40ng/ml范围内的浓度与单独TNFα一起孵育，以选择诱导T-reg细胞计数的高分数增
加的TNFα水平。另外，在单独的IL-2存在下和在单独TNFRAB2存在下培养T-reg细胞。
[0504] 在上述条件下孵育T-reg细胞后，使用流式细胞术分析测定细胞计数。将密度为0.2-1x 106个细胞/100μl的T-reg细胞分配到15-ml锥形管中并离心5分钟以沉淀细胞。丢
弃上清液，并将细胞重新悬浮于100μl洗涤缓冲液(含2％FBS的1x HBSS)中。向此混合物中
添加5μl的PE抗人CD25荧光团-抗体缀合物，且随后将细胞涡旋并在黑暗中孵育25分钟。然
后通过加入1ml的洗涤缓冲液洗涤细胞且随后离心5分钟。然后丢弃上清液，并向细胞中添
加1ml的FoxP3固定/透化缓冲液(4x FOXP3固定/透化缓冲液在PBS中的1:4稀释液)。然后将
细胞涡旋并在黑暗中孵育20分钟。随后将细胞离心5分钟并丢弃上清液。然后将细胞重新悬
浮于1ml新鲜洗涤缓冲液中，涡旋并离心5分钟。随后将细胞重新悬浮于1ml的1x FOXP3透化
缓冲液(10x FOXP3透化缓冲液在PBS中的1:10稀释液)中，涡旋并在黑暗中孵育15分钟。在
孵育后，将细胞离心5分钟且随后丢弃上清液。然后将细胞团块重新悬浮于100μl的1xFOXP3
透化缓冲液中。此时，向细胞中添加5μl的k同种型对照，Alexa 488抗人FOXP3或
Alexa 488小鼠IgG1。然后将细胞涡旋并在黑暗中孵育35分钟。在孵育后，通过向细
胞中添加1ml新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞，涡旋细胞并离心5分钟。然后丢弃上清液，并将细胞
团块重新悬浮于0.2-0.5ml的不含FBS的1x HBSS中。然后通过流式细胞术分析确定细胞计
数。
弃上清液，并将细胞重新悬浮于100μl洗涤缓冲液(含2％FBS的1x HBSS)中。向此混合物中
添加5μl的PE抗人CD25荧光团-抗体缀合物，且随后将细胞涡旋并在黑暗中孵育25分钟。然
后通过加入1ml的洗涤缓冲液洗涤细胞且随后离心5分钟。然后丢弃上清液，并向细胞中添
加1ml的FoxP3固定/透化缓冲液(4x FOXP3固定/透化缓冲液在PBS中的1:4稀释液)。然后将
细胞涡旋并在黑暗中孵育20分钟。随后将细胞离心5分钟并丢弃上清液。然后将细胞重新悬
浮于1ml新鲜洗涤缓冲液中，涡旋并离心5分钟。随后将细胞重新悬浮于1ml的1x FOXP3透化
缓冲液(10x FOXP3透化缓冲液在PBS中的1:10稀释液)中，涡旋并在黑暗中孵育15分钟。在
孵育后，将细胞离心5分钟且随后丢弃上清液。然后将细胞团块重新悬浮于100μl的1xFOXP3
透化缓冲液中。此时，向细胞中添加5μl的k同种型对照，Alexa 488抗人FOXP3或
Alexa 488小鼠IgG1。然后将细胞涡旋并在黑暗中孵育35分钟。在孵育后，通过向细
胞中添加1ml新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞，涡旋细胞并离心5分钟。然后丢弃上清液，并将细胞
团块重新悬浮于0.2-0.5ml的不含FBS的1x HBSS中。然后通过流式细胞术分析确定细胞计
数。
[0505] 如图5中所示，即使当细胞与20ng/ml TNFα共孵育时，拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1的孵育也以剂量依赖性方式遏制T-reg细胞增殖。显著地，在用单独TNFα处理的T-reg样品中
分析的TNFα剂量中，这种TNFα浓度能够诱导T-reg细胞计数的最大分数增加。即使在活化水
平的TNFα存在下，该TNFRAB1也能够减少T-reg细胞增殖，表明拮抗性TNFR2抗体不仅能够与
TNFα竞争受体结合，而且表现出抑制导致T-reg细胞生长和增殖的下游信号传导级联的能
力。例如，当T-reg细胞以20ng/ml与单独TNFα一起孵育时，所得到的T-reg群体增加至未处
理对照细胞的130％。然而，在20ng/ml的T-reg细胞与TNFRAB1共孵育后，观察到细胞增殖的
稳定的剂量依赖性抑制，其中TNFRAB1的浓度范围为0.004-1.25μg/ml。
分析的TNFα剂量中，这种TNFα浓度能够诱导T-reg细胞计数的最大分数增加。即使在活化水
平的TNFα存在下，该TNFRAB1也能够减少T-reg细胞增殖，表明拮抗性TNFR2抗体不仅能够与
TNFα竞争受体结合，而且表现出抑制导致T-reg细胞生长和增殖的下游信号传导级联的能
力。例如，当T-reg细胞以20ng/ml与单独TNFα一起孵育时，所得到的T-reg群体增加至未处
理对照细胞的130％。然而，在20ng/ml的T-reg细胞与TNFRAB1共孵育后，观察到细胞增殖的
稳定的剂量依赖性抑制，其中TNFRAB1的浓度范围为0.004-1.25μg/ml。
[0506] 实施例3.通过噬菌体展示产生拮抗性TNFR2抗体
[0507] 用于本发明的拮抗性TNFR2抗体的体外蛋白质进化的示例性方法是噬菌体展示，其是本领域中熟知的技术。可通过在抗体的CDR或抗体样支架的类似区域(例如，10Fn3结构
域的BC、CD和DE环)的编码序列内进行一系列设计的突变或变异来产生噬菌体展示文库。这
些突变引入其中的模板抗体编码序列可以是例如，如本文所述的天然人种系序列。可使用
本文描述或本领域中已知的标准诱变技术来进行这些突变。因此，每个突变体序列编码在
总体结构上与模板对应的抗体，除了在模板的序列中具有一个或多个氨基酸变异。可使用
如本文所述或本领域中已知的标准载体构建技术来工程化逆转录病毒和噬菌体展示载体。
如本领域所熟知的，P3噬菌体展示载体连同相容性蛋白质表达载体可用来产生用于如本文
所述的抗体多样化的噬菌体展示载体。
域的BC、CD和DE环)的编码序列内进行一系列设计的突变或变异来产生噬菌体展示文库。这
些突变引入其中的模板抗体编码序列可以是例如，如本文所述的天然人种系序列。可使用
本文描述或本领域中已知的标准诱变技术来进行这些突变。因此，每个突变体序列编码在
总体结构上与模板对应的抗体，除了在模板的序列中具有一个或多个氨基酸变异。可使用
如本文所述或本领域中已知的标准载体构建技术来工程化逆转录病毒和噬菌体展示载体。
如本领域所熟知的，P3噬菌体展示载体连同相容性蛋白质表达载体可用来产生用于如本文
所述的抗体多样化的噬菌体展示载体。
[0508] 突变的DNA提供序列多样性，并且每个转化体噬菌体展示由所述DNA编码的初始模板氨基酸序列的一个变体，从而产生展示大量不同但结构相关的氨基酸序列的噬菌体群体
(文库)。由于抗体高变区的结构明确，所以预期在噬菌体展示筛选中引入的氨基酸变异会
改变结合肽或结构域的结合性质而不会显著改变其结构。
(文库)。由于抗体高变区的结构明确，所以预期在噬菌体展示筛选中引入的氨基酸变异会
改变结合肽或结构域的结合性质而不会显著改变其结构。
[0509] 在典型的筛选中，使噬菌体文库与TNFR2源性肽(例如，具有序列SEQ ID NO:285或286的肽)或其特定亚组分接触并允许结合。为了促进结合者和非结合者的分离，方便的是
将靶标固定在固体支撑物上。带有TNFR2结合部分的噬菌体可在固体支撑物上与靶标形成
复合物，而非结合噬菌体保留在溶液中并且可用过量缓冲液洗掉。然后可通过将缓冲液改
变至极端pH(pH 2或pH 10)、改变缓冲液的离子强度、添加变性剂或其他已知方式来从靶标
释放结合的噬菌体。为了分离表现出本发明的多肽的结合噬菌体，进行蛋白质洗脱。
将靶标固定在固体支撑物上。带有TNFR2结合部分的噬菌体可在固体支撑物上与靶标形成
复合物，而非结合噬菌体保留在溶液中并且可用过量缓冲液洗掉。然后可通过将缓冲液改
变至极端pH(pH 2或pH 10)、改变缓冲液的离子强度、添加变性剂或其他已知方式来从靶标
释放结合的噬菌体。为了分离表现出本发明的多肽的结合噬菌体，进行蛋白质洗脱。
[0510] 然后可通过感染细菌细胞来扩增回收的噬菌体，并且可使用现在耗尽非结合抗体并富含结合至靶肽的抗体的新的汇集物来重复筛选过程。即使少数结合噬菌体的回收也足
以扩增噬菌体以用于随后的筛选迭代。在几轮选择后，通过常规方法测定编码源自结合汇
集物中的选定噬菌体克隆的抗体或其抗原结合片段的基因序列，从而揭示赋予噬菌体与靶
标结合亲和力的肽序列。在淘选过程中，群体的序列多样性随着每轮选择而降低，直到剩余
所希望的肽结合抗体。所述序列可在少量相关抗体或其抗原结合片段上会聚，通常来自每
个文库的约109至1010个原始候选物中的10-50个。在每轮选择中回收的噬菌体数量的增加
是在筛选中发生文库会聚的良好指示。在鉴别一组结合多肽后，序列信息可用于设计其他
二级噬菌体文库，偏向具有另外所需性质的成员(参见WO 2014/152660；其以引用的方式并
入本文)。
以扩增噬菌体以用于随后的筛选迭代。在几轮选择后，通过常规方法测定编码源自结合汇
集物中的选定噬菌体克隆的抗体或其抗原结合片段的基因序列，从而揭示赋予噬菌体与靶
标结合亲和力的肽序列。在淘选过程中，群体的序列多样性随着每轮选择而降低，直到剩余
所希望的肽结合抗体。所述序列可在少量相关抗体或其抗原结合片段上会聚，通常来自每
个文库的约109至1010个原始候选物中的10-50个。在每轮选择中回收的噬菌体数量的增加
是在筛选中发生文库会聚的良好指示。在鉴别一组结合多肽后，序列信息可用于设计其他
二级噬菌体文库，偏向具有另外所需性质的成员(参见WO 2014/152660；其以引用的方式并
入本文)。
[0511] 实施例4.通过施用拮抗性抗TNFR2抗体治疗人患者的癌症
[0512] 可将本发明的拮抗性TNFR2抗体施用于人患者，以治疗细胞增殖病症，如癌症。施用这些抗体遏制T-reg细胞的生长和增殖。还可将本发明的抗体施用于患者以遏制T-reg介
导的免疫响应。例如，可在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/
kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体来治疗患有癌症
(例如，本文所述的癌症)的人患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对
抗TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体的药代动力学概况。
导的免疫响应。例如，可在数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/
kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体来治疗患有癌症
(例如，本文所述的癌症)的人患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对
抗TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体的药代动力学概况。
[0513] 用本发明的拮抗性TNFR2抗体治疗的癌症的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何
响应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析，以确定肿瘤是否已经转移或肿
瘤的大小是否已经改变，例如响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而降低。任选地，可从患
者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定各种生长因子受体(如表皮生长因子
受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/
更低剂量或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
响应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析，以确定肿瘤是否已经转移或肿
瘤的大小是否已经改变，例如响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而降低。任选地，可从患
者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定各种生长因子受体(如表皮生长因子
受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/
更低剂量或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
[0514] 实施例5.产生scFv TNFR2拮抗剂
[0515] 本发明的抗体片段包括scFv片段，所述片段由在单一肽链中组合的轻链和重链的抗体可变区组成。表型中性TNFR2抗体可用作通过重组表达编码TNFR2抗体的轻链的可变区
的多核苷酸来开发scFv抗体片段的框架，所述轻链的可变区可操作地连接至该抗体的重链
的可变区。编码重链的可变区的多核苷酸可含有源自例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3序列。编码此类可变区的重组多核苷酸可例如使用如本文所述或本领域中已知的已
建立的诱变方案来产生。然后可在细胞(例如，CHO细胞)中表达此多核苷酸，且随后可从细
胞培养基中分离scFv片段。
的多核苷酸来开发scFv抗体片段的框架，所述轻链的可变区可操作地连接至该抗体的重链
的可变区。编码重链的可变区的多核苷酸可含有源自例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的
CDR-H3序列。编码此类可变区的重组多核苷酸可例如使用如本文所述或本领域中已知的已
建立的诱变方案来产生。然后可在细胞(例如，CHO细胞)中表达此多核苷酸，且随后可从细
胞培养基中分离scFv片段。
[0516] 或者，可通过化学合成方法(例如，通过基于Fmoc的固相肽合成，如本文所述)产生源自TNFR2拮抗剂的scFv片段。本领域技术人员可化学合成由表型中性TNFR2抗体的轻链的
可变区组成的肽链，所述轻链的可变区可操作地连接至所述抗体的重链的可变区，以使得
所述重链的可变区含有拮抗性TNFR2抗体(例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的CDR-H3序
列。天然化学连接可用作合成长肽(例如，大于50个氨基酸)的策略。天然化学连接方案是本
领域中已知的并且已例如由Dawson等人(Science,266:776-779,1994)描述；所述文献以引
用的方式并入本文。
可变区组成的肽链，所述轻链的可变区可操作地连接至所述抗体的重链的可变区，以使得
所述重链的可变区含有拮抗性TNFR2抗体(例如TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的CDR-H3序
列。天然化学连接可用作合成长肽(例如，大于50个氨基酸)的策略。天然化学连接方案是本
领域中已知的并且已例如由Dawson等人(Science,266:776-779,1994)描述；所述文献以引
用的方式并入本文。
[0517] 实施例6.产生人源化TNFR2抗体
[0518] 用于产生本发明的人源化TNFR2抗体的一种方法是将TNFR2抗体的CDR输入人抗体共有序列中。共有人抗体重链和轻链序列是本领域中已知的(参见例如，“VBASE”人种系序
列数据库；Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美
国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242,1991)；Tomlinson等人(J.Mol.Biol.227:776-
798,1992)；以及Cox等人(Eur.J.Immunol.24:827-836,1994)；所述文献以引用的方式并入
本文)。使用已建立的程序，可鉴别共有抗体序列的可变结构域框架残基和CDR(例如，通过
序列比对(参见Kabat，同上))。可用表型-中性抗TNFR2抗体的相应序列取代例如抗体的
CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，以及用具有拮抗性TNFR2抗体(例如
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的CDR-H3取代共有人抗体的CDR-H3，以产生人源化的拮抗性
TNFR2。编码上述CDR序列的多核苷酸可合成或重组产生，例如，使用本文所述或本领域中已
知的基因编辑技术。共有人抗体的可变结构域的一个实例包括在美国专利号6,054,297中
鉴别的重链可变结构域
和轻链可变结构域
所述专利以引用的方式并入本文(CDR以粗体显示)。
列数据库；Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,美
国卫生和人类服务部,NIH出版号91-3242,1991)；Tomlinson等人(J.Mol.Biol.227:776-
798,1992)；以及Cox等人(Eur.J.Immunol.24:827-836,1994)；所述文献以引用的方式并入
本文)。使用已建立的程序，可鉴别共有抗体序列的可变结构域框架残基和CDR(例如，通过
序列比对(参见Kabat，同上))。可用表型-中性抗TNFR2抗体的相应序列取代例如抗体的
CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列，以及用具有拮抗性TNFR2抗体(例如
TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3)的CDR-H3取代共有人抗体的CDR-H3，以产生人源化的拮抗性
TNFR2。编码上述CDR序列的多核苷酸可合成或重组产生，例如，使用本文所述或本领域中已
知的基因编辑技术。共有人抗体的可变结构域的一个实例包括在美国专利号6,054,297中
鉴别的重链可变结构域
和轻链可变结构域
所述专利以引用的方式并入本文(CDR以粗体显示)。
[0519] 为了产生人源化的拮抗性TNFR2抗体，可重组表达编码上述共有序列的多核苷酸，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列被表型-中性TNFR2特异性抗体的相应
CDR序列替代。共有人抗体的CDR-H3序列可被拮抗性TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2或
TNFR2A3)的CDR-H3(即分别SEQ ID NO:25、259或284)取代。
CDR序列替代。共有人抗体的CDR-H3序列可被拮抗性TNFR2抗体(如TNFRAB1、TNFRAB2或
TNFR2A3)的CDR-H3(即分别SEQ ID NO:25、259或284)取代。
[0520] 可将编码上述彼此可操作地连接的重链和轻链可变结构域的多核苷酸掺入表达载体(例如，如本文所述或本领域中已知的针对在原核或真核细胞中的蛋白质表达优化的
表达载体)中。单链抗体片段(scFv)因此可在宿主细胞中表达，且随后使用已建立的技术
(例如如本文所述的尺寸排阻色谱法和/或亲和色谱法)从宿主细胞培养基中纯化。
表达载体)中。单链抗体片段(scFv)因此可在宿主细胞中表达，且随后使用已建立的技术
(例如如本文所述的尺寸排阻色谱法和/或亲和色谱法)从宿主细胞培养基中纯化。
[0521] 实施例7.通过施用拮抗性抗TNFR2抗体治疗人患者的HIV
[0522] 本发明的拮抗性TNFR2抗体可施用于人患者，以治疗病毒感染，如HIV。施用这些抗体遏制T-reg细胞的生长和增殖，所述抗体通过允许能够对受感染的细胞发动攻击的细胞
毒性T淋巴细胞的生长和增殖而增强患者的免疫响应。例如，可通过在数天、数周、数月或数
年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用
本发明的拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列的一个或多个残基
(SEQ ID NO:7的残基142-146)的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:
7的残基56-60)的表位的特异性结合并且具有非天然恒定区的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2抗体)来治疗患有HIV的人患者。如果需要，可例如
通过高糖基化或通过与PEG缀合来对抗TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体
的药代动力学概况。
毒性T淋巴细胞的生长和增殖而增强患者的免疫响应。例如，可通过在数天、数周、数月或数
年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径(例如，静脉内)施用
本发明的拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序列的一个或多个残基
(SEQ ID NO:7的残基142-146)的表位并且不表现出与含有TNFR2的KCSPG序列(SEQ ID NO:
7的残基56-60)的表位的特异性结合并且具有非天然恒定区的TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、
TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2抗体)来治疗患有HIV的人患者。如果需要，可例如
通过高糖基化或通过与PEG缀合来对抗TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体
的药代动力学概况。
[0523] 用本发明的拮抗性TNFR2抗体治疗的HIV的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何
响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细胞计数，以
便确定受感染的细胞的数量是否响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而改变(例如，减少)。
基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体
或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细胞计数，以
便确定受感染的细胞的数量是否响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而改变(例如，减少)。
基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体
或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
[0524] 实施例8.通过施用拮抗性抗TNFR2抗体治疗非人哺乳动物中的结核分枝杆菌
[0525] 本发明的拮抗性TNFR2抗体可施用于非人哺乳动物(例如，牛科哺乳动物、猪、野牛、马、绵羊、山羊、奶牛、猫、狗、兔、仓鼠、豚鼠或其他非人哺乳动物)以治疗细菌感染，如结核分枝杆菌。施用这些抗体遏制T-reg细胞的生长和增殖，所述抗体通过允许能够对病原生
物体发动攻击的细胞毒性T淋巴细胞的生长和增殖而增强患者的免疫响应。例如，可通过在
数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径
(例如，静脉内)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序
列的一个或多个残基(SEQ ID NO:7的残基142-146)的表位并且不表现出与含有TNFR2的
KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合并且具有非天然恒定区的
TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2抗体)来治疗患有结
核分枝杆菌的非人哺乳动物。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对抗
TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体的药代动力学概况。
物体发动攻击的细胞毒性T淋巴细胞的生长和增殖而增强患者的免疫响应。例如，可通过在
数天、数周、数月或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间)通过适当途径
(例如，静脉内)施用本发明的拮抗性TNFR2抗体(例如，特异性地结合含有TNFR2的KCRPG序
列的一个或多个残基(SEQ ID NO:7的残基142-146)的表位并且不表现出与含有TNFR2的
KCSPG序列(SEQ ID NO:7的残基56-60)的表位的特异性结合并且具有非天然恒定区的
TNFR2抗体，如含有TNFRAB1、TNFRAB2或TNFR2A3的CDR-H3序列的TNFR2抗体)来治疗患有结
核分枝杆菌的非人哺乳动物。如果需要，可例如通过高糖基化或通过与PEG缀合来对抗
TNFR2抗体进行修饰以逃避免疫识别和/或改进抗体的药代动力学概况。
[0526] 用本发明的拮抗性TNFR2抗体治疗的结核分枝杆菌感染的进展可通过若干已建立的方法中的任一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出
的症状如何响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细
胞计数，以便确定免疫响应是否响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而改变(例如，增加)。
基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体
或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
的症状如何响应于治疗而改变。还可从患者中抽取血液样品以分析一个或多个白细胞的细
胞计数，以便确定免疫响应是否响应于用本发明的抗TNFR2抗体治疗而改变(例如，增加)。
基于这些分析的结果，医生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体
或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体给药。
[0527] 实施例9.拮抗性TNFR2抗体在IL-2和TNF存在下抑制T-reg细胞增殖
[0528] T-reg细胞数量升高的存在可阻碍免疫系统对抗癌症和感染性疾病的能力。TNFR2代表T-reg增殖的重要检查点并且因此构成免疫调节的理想靶标。为了表征两种拮抗性
TNFR2单克隆抗体(mAb)TNFRAB1和TNFRAB2的功能活性，采用了针对均质T-reg扩增开发的
基于细胞的测定法。首先证实，用增加浓度的TNFα孵育的正常人CD4+细胞导致T-reg细胞的
剂量依赖性增加(图6A和7A)。还证实，T-reg增殖需要IL-2的存在(图6B)。如图6B-6G中所
示，相对于用单独IL-2处理，使用20ng/ml的TNF对T-reg增殖的影响是显著的(>20％扩增)
并且通过与TNFR2激动剂共孵育进一步增强(>60％扩增)。
TNFR2单克隆抗体(mAb)TNFRAB1和TNFRAB2的功能活性，采用了针对均质T-reg扩增开发的
基于细胞的测定法。首先证实，用增加浓度的TNFα孵育的正常人CD4+细胞导致T-reg细胞的
剂量依赖性增加(图6A和7A)。还证实，T-reg增殖需要IL-2的存在(图6B)。如图6B-6G中所
示，相对于用单独IL-2处理，使用20ng/ml的TNF对T-reg增殖的影响是显著的(>20％扩增)
并且通过与TNFR2激动剂共孵育进一步增强(>60％扩增)。
[0529] 如使用这种测定所测量，拮抗性TNFR2抗体对T-reg增殖引发相反作用。两种TNFR2拮抗性抗体均诱导对T-reg增殖的遏制性作用，其导致正常血液供体中剩余T-reg细胞百分
比降低4％-15％。值得注意的是，TNFR2拮抗作用是显性的，并且甚至能够克服大量TNFα
(20mg/ml)的存在(图6C-6G)。对T-reg的TNFR2拮抗作用是剂量依赖性的(图6D-6G)。更显著
的是观察到当在TNFα存在下研究两种TNFR2拮抗性抗体时，两种TNFR2拮抗剂抗体都能够以
剂量依赖性方式克服TNFα激动作用。两种拮抗性抗体都能够减弱T-reg扩增并逆转TNFα激
动曲线(图6A和6C-6G)。还通过将T-reg细胞与固定量的TNFR2拮抗性抗体和递增剂量的TNF
α一起孵育来进行了这种测定(图6D-6G)。同样，呈剂量依赖性方式的两种TNFR2拮抗剂都能
够逆转TNFα激动作用。应注意，这种48小时T-reg扩增测定是在培养物中用IL-2(激动剂)进
行的，以防止非特异性人CD4+ T细胞死亡。当对从这些实验获得的数据进行处理以确定与
单独IL-2存在下相比，在拮抗性TNFR2抗体存在下T-reg增殖的相对变化，两种抗体的拮抗
性质均持续存在(图7A-7E)。这些结果一起证明了两种TNFR2拮抗剂抗体遏制人CD4+细胞中
的T-reg增殖的功能，并且所述作用显著优于由中等至高剂量TNFα驱动的激动作用。
比降低4％-15％。值得注意的是，TNFR2拮抗作用是显性的，并且甚至能够克服大量TNFα
(20mg/ml)的存在(图6C-6G)。对T-reg的TNFR2拮抗作用是剂量依赖性的(图6D-6G)。更显著
的是观察到当在TNFα存在下研究两种TNFR2拮抗性抗体时，两种TNFR2拮抗剂抗体都能够以
剂量依赖性方式克服TNFα激动作用。两种拮抗性抗体都能够减弱T-reg扩增并逆转TNFα激
动曲线(图6A和6C-6G)。还通过将T-reg细胞与固定量的TNFR2拮抗性抗体和递增剂量的TNF
α一起孵育来进行了这种测定(图6D-6G)。同样，呈剂量依赖性方式的两种TNFR2拮抗剂都能
够逆转TNFα激动作用。应注意，这种48小时T-reg扩增测定是在培养物中用IL-2(激动剂)进
行的，以防止非特异性人CD4+ T细胞死亡。当对从这些实验获得的数据进行处理以确定与
单独IL-2存在下相比，在拮抗性TNFR2抗体存在下T-reg增殖的相对变化，两种抗体的拮抗
性质均持续存在(图7A-7E)。这些结果一起证明了两种TNFR2拮抗剂抗体遏制人CD4+细胞中
的T-reg增殖的功能，并且所述作用显著优于由中等至高剂量TNFα驱动的激动作用。
[0530] 为了进行上述T-reg遏制测定，使用外周血单核细胞(PBMC)作为响应者。使用Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare,Piscataway,NJ)密度梯度在静脉穿刺当天分离
PBMC，并且在-80℃下冷冻保存。将细胞在与T-reg细胞混合前一天解冻，并在RPMI 1640和
IL-2(10U/ml)中静置过夜。第二天，将响应细胞用1μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
(CFSE)染色。然后将响应细胞(5x 104个细胞)与扩增的T-reg细胞以不同比例(0:1，4:1，2:
1，1:1)混合，并用抗CD3mAb(HIT3a,BD Biosciences)和IL-2(50U/ml)刺激。在4天后收集细
胞并通过流式细胞术进行分析。
PBMC，并且在-80℃下冷冻保存。将细胞在与T-reg细胞混合前一天解冻，并在RPMI 1640和
IL-2(10U/ml)中静置过夜。第二天，将响应细胞用1μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
(CFSE)染色。然后将响应细胞(5x 104个细胞)与扩增的T-reg细胞以不同比例(0:1，4:1，2:
1，1:1)混合，并用抗CD3mAb(HIT3a,BD Biosciences)和IL-2(50U/ml)刺激。在4天后收集细
胞并通过流式细胞术进行分析。
[0531] 人受试者
[0532] 根据由马萨诸塞州综合医院人类研究委员会(Massachusetts General Hospital Human Studies Committee，MGH-2001P001379)批准的人类研究方案收集来自超过100个供
体的人血液样品。所有供体都提供了书面知情同意书。将血液收集到BD Vacutainer EDTA
管(BD Diagnostics)中并在静脉切开术2小时内加工。从卵巢癌患者中分离的T-reg样品在
照射之前和化学疗法之前从患有新诊断的卵巢癌的女性获得。这些人研究由马萨诸塞州综
合医院人类研究委员会(MGH-2015P002489；参见下文实施例14)批准。
体的人血液样品。所有供体都提供了书面知情同意书。将血液收集到BD Vacutainer EDTA
管(BD Diagnostics)中并在静脉切开术2小时内加工。从卵巢癌患者中分离的T-reg样品在
照射之前和化学疗法之前从患有新诊断的卵巢癌的女性获得。这些人研究由马萨诸塞州综
合医院人类研究委员会(MGH-2015P002489；参见下文实施例14)批准。
[0533] 血液和细胞培养
[0534] 在静脉穿刺2小时内处理新鲜人血液。用1x HBSS(Invitrogen)加2％FBS(Sigma-Aldrich)洗涤血液两次，并使用 CD4阳性分离试剂盒(Invitrogen)分离CD4+
细胞。将分离的CD4+细胞重新悬浮于RPMI GlutaMAXTM(Life Technologies)加10％FBS
(Sigma-Aldrich)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)中。将细胞以0.2-1x 106个细
胞/孔的浓度接种在96-圆底孔板中，用TNFR2拮抗剂抗体或TNFR2激动剂(如每个实施例中
所示)处理，且然后在37℃与5％CO2下孵育达48小时。由于分离和培养的人T细胞在细胞培
养基中不存在IL-2的情况下死亡，所以本文所述的所有基于细胞的实验在培养基中使用低
水平的IL-2(100U/ml)以防止IL-2去除影响数据。通过首先将细胞浓缩在50ml锥形管中且
然后悬浮细胞团块以获得CD4+细胞分离物来获得从无菌卵巢癌腹水中分离的T-reg细胞
(参见下文实施例14)。
细胞。将分离的CD4+细胞重新悬浮于RPMI GlutaMAXTM(Life Technologies)加10％FBS
(Sigma-Aldrich)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)中。将细胞以0.2-1x 106个细
胞/孔的浓度接种在96-圆底孔板中，用TNFR2拮抗剂抗体或TNFR2激动剂(如每个实施例中
所示)处理，且然后在37℃与5％CO2下孵育达48小时。由于分离和培养的人T细胞在细胞培
养基中不存在IL-2的情况下死亡，所以本文所述的所有基于细胞的实验在培养基中使用低
水平的IL-2(100U/ml)以防止IL-2去除影响数据。通过首先将细胞浓缩在50ml锥形管中且
然后悬浮细胞团块以获得CD4+细胞分离物来获得从无菌卵巢癌腹水中分离的T-reg细胞
(参见下文实施例14)。
[0535] 试剂和流式细胞术
[0536] 重组人TNF购自Sigma-Aldrich，并且重组人IL-2购自Life Technologies。使用Pierce F(ab’)2制备试剂盒(Life Technologies)制备TNFRAB1和TNFRAB2的F(ab’)2片段。
针对啮齿动物IgG的交联抗体(ab9165和ab99670)购自Abcam(Cambridge,MA)。根据制造商
的说明书，使用人T-reg FlowTM试剂盒(BioLegend)制备细胞用于流式细胞术。用于流式细
胞术的抗体包括用于FOXP3的细胞内染色的Alexa 488抗人FOXP3克隆259D，和用于
CD25的细胞表面染色的PE抗人CD25克隆BC96(BioLegend)。将荧光染色的细胞重新悬浮于
1x HBSS(Invitrogen)中，并使用BD FACS Calibur流式细胞仪机器(BectonDickinson)进
行分析。使用FlowJo软件(版本10.0.8)处理FACS数据。
针对啮齿动物IgG的交联抗体(ab9165和ab99670)购自Abcam(Cambridge,MA)。根据制造商
的说明书，使用人T-reg FlowTM试剂盒(BioLegend)制备细胞用于流式细胞术。用于流式细
胞术的抗体包括用于FOXP3的细胞内染色的Alexa 488抗人FOXP3克隆259D，和用于
CD25的细胞表面染色的PE抗人CD25克隆BC96(BioLegend)。将荧光染色的细胞重新悬浮于
1x HBSS(Invitrogen)中，并使用BD FACS Calibur流式细胞仪机器(BectonDickinson)进
行分析。使用FlowJo软件(版本10.0.8)处理FACS数据。
[0537] 统计分析
[0538] 使用Excel(Microsoft)或GraphPad Prism-5软件(GraphPad Software,La Jolla,CA)通过配对学生t检验进行数据分析。通过小于0.05的双侧p值确定显著性。
[0539] 实施例10.TNFR2拮抗剂抗体对活化的T-reg细胞的短期培养作用
[0540] 为了研究拮抗性TNFR2抗体调节TNFR2分泌的能力，使用 ELISA(R&D Systems)从细胞培养物上清液测量了可溶性人TNFR2。简言之，在CD4+细胞与单独IL-2
(200U/ml)或与TNF(20ng/ml)或拮抗性TNFR2抗体(12.5μg/ml)一起孵育24-42小时后收集
上清液，并且立即使用或冷冻在-20℃。根据制造商的说明书进行ELISA。使用
190吸光度读板仪测量吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(MolecularDevices)
进行分析。
(200U/ml)或与TNF(20ng/ml)或拮抗性TNFR2抗体(12.5μg/ml)一起孵育24-42小时后收集
上清液，并且立即使用或冷冻在-20℃。根据制造商的说明书进行ELISA。使用
190吸光度读板仪测量吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(MolecularDevices)
进行分析。
[0541] T-reg细胞以两种状态存在：活化(aT-reg)和静息(rT-reg)；可基于CD45RA的表达来区分两种状态。aT-reg细胞的表型是CD25高CD45RA低，而rT-reg细胞的表型是CD25中CD45RA
高。aT-reg细胞是更有效的免疫功能遏制剂，并且因此是免疫治疗的理想靶标。为了研究抑
制aT-reg细胞的功效，首先证实，当用TNFR2拮抗剂处理CD4+细胞时，T-reg细胞的总数而不
是简单的T-reg细胞的比例减少(图8A-8H)。接下来，为了确定哪种类别的T-reg受TNFR2拮
抗剂抑制，将细胞用CD45RA染色。据发现虽然两种类别的T-reg细胞都被抑制，但是aT-reg
细胞被遏制至比rT-reg细胞更大的程度。这些数据表明TNFR2拮抗剂抗体选择性地抑制aT-
reg细胞的增殖。高TNFR2表达是遏制性T-reg细胞的另一特征。测量TNFR2表达的水平，并且
据发现TNFR2拮抗剂处理减少了表达TNFR2高的细胞的数量。相比之下，TNFR2表达的平均荧
光强度(MFI)在所有处理中保持相似(图9A)。总之，这些数据表明拮抗性TNFR2抗体(如
高 低
TNFRAB1和TNFRAB2)能够选择性地减弱CD25 +、CD45RA + T-reg细胞的增殖。
高。aT-reg细胞是更有效的免疫功能遏制剂，并且因此是免疫治疗的理想靶标。为了研究抑
制aT-reg细胞的功效，首先证实，当用TNFR2拮抗剂处理CD4+细胞时，T-reg细胞的总数而不
是简单的T-reg细胞的比例减少(图8A-8H)。接下来，为了确定哪种类别的T-reg受TNFR2拮
抗剂抑制，将细胞用CD45RA染色。据发现虽然两种类别的T-reg细胞都被抑制，但是aT-reg
细胞被遏制至比rT-reg细胞更大的程度。这些数据表明TNFR2拮抗剂抗体选择性地抑制aT-
reg细胞的增殖。高TNFR2表达是遏制性T-reg细胞的另一特征。测量TNFR2表达的水平，并且
据发现TNFR2拮抗剂处理减少了表达TNFR2高的细胞的数量。相比之下，TNFR2表达的平均荧
光强度(MFI)在所有处理中保持相似(图9A)。总之，这些数据表明拮抗性TNFR2抗体(如
高 低
TNFRAB1和TNFRAB2)能够选择性地减弱CD25 +、CD45RA + T-reg细胞的增殖。
[0542] 免疫响应的特征通常在于由于高蛋白质转换细胞所致的可溶性TNFR2的增加。因此在用TNFR2调节剂处理后，在培养物上清液中测量可溶性TNFR2的水平，以确定这些分子
对免疫活性的影响。观察到TNF和TNFR2激动剂增加了可溶性TNFR2的数量，而TNFR2拮抗剂
降低了可溶性TNFR2的水平(图9B)。另外，T-reg遏制剂测定证实了TNFR2拮抗作用对CD8+细
胞的有效遏制(图9A和9C)。这些数据证明用TNFR2拮抗剂处理人CD4+细胞有效地减少了活
化且高度遏制性T-reg细胞的数量，并具有抑制可溶性诱饵TNFR2分泌的额外益处。
对免疫活性的影响。观察到TNF和TNFR2激动剂增加了可溶性TNFR2的数量，而TNFR2拮抗剂
降低了可溶性TNFR2的水平(图9B)。另外，T-reg遏制剂测定证实了TNFR2拮抗作用对CD8+细
胞的有效遏制(图9A和9C)。这些数据证明用TNFR2拮抗剂处理人CD4+细胞有效地减少了活
化且高度遏制性T-reg细胞的数量，并具有抑制可溶性诱饵TNFR2分泌的额外益处。
[0543] 为了进行如上所述的T-reg遏制测定，使用外周血单核细胞(PBMC)作为响应者。使用Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare,Piscataway,NJ)密度梯度在静脉穿刺当天分离
PBMC，并且在-80℃下冷冻保存。将PBMC在与T-reg细胞混合前一天解冻，并在RPMI 1640和
IL-2(10U/ml)中静置过夜。第二天，将响应细胞用1μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
(CFSE)染色。然后将响应细胞(5x 104个细胞)与扩增的T-reg细胞以不同比例(0:1、4:1、2:
1、1:1)混合，并用抗CD3mAb(HIT3a,BD Biosciences)和IL-2(50U/ml)刺激。在4天后收集细
胞并通过流式细胞术进行分析。
PBMC，并且在-80℃下冷冻保存。将PBMC在与T-reg细胞混合前一天解冻，并在RPMI 1640和
IL-2(10U/ml)中静置过夜。第二天，将响应细胞用1μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯
(CFSE)染色。然后将响应细胞(5x 104个细胞)与扩增的T-reg细胞以不同比例(0:1、4:1、2:
1、1:1)混合，并用抗CD3mAb(HIT3a,BD Biosciences)和IL-2(50U/ml)刺激。在4天后收集细
胞并通过流式细胞术进行分析。
[0544] 为了测量如上所述的分泌的TNFR2的浓度，使用 ELISA测定试剂盒(R&D Systems)。简言之，在CD4+细胞与单独IL-2(200U/ml)或与TNFα(20ng/ml)或
TNFR2拮抗剂抗体(12.5μg/ml)一起孵育24-42小时后收集上清液，并且立即使用或冷冻在-
20℃。根据制造商的说明书进行ELISA测定。使用 190吸光度读板仪测量
吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(Molecular Devices)进行分析。
TNFR2拮抗剂抗体(12.5μg/ml)一起孵育24-42小时后收集上清液，并且立即使用或冷冻在-
20℃。根据制造商的说明书进行ELISA测定。使用 190吸光度读板仪测量
吸光度，并用SoftMax Pro 6.3(Molecular Devices)进行分析。
[0545] 实施例11.TNFR2拮抗剂活性不依赖于非特异性Fc区结合或交联
[0546] 抗体Fc区的非特异性结合可导致任意功能活性。在有或没有TNF的情况下用NFR2mAb F(ab’)2片段处理CD4+细胞导致如使用完整单克隆抗体观察到的T-reg细胞数量
的类似剂量响应(图10A-10D)。这证实了拮抗性TNFR2抗体的F(ab’)2区与TNFR2的特异性结
合而不是Fc区介导的非特异性结合可能是遏制活性的原因。通过SDS-PAGE分析评估F
(ab’)2片段和完整抗体的纯度(图11A-11D)。
的类似剂量响应(图10A-10D)。这证实了拮抗性TNFR2抗体的F(ab’)2区与TNFR2的特异性结
合而不是Fc区介导的非特异性结合可能是遏制活性的原因。通过SDS-PAGE分析评估F
(ab’)2片段和完整抗体的纯度(图11A-11D)。
[0547] 交联还可导致抗体的异常功能活性。为了排除非特异性交联是观察到的功能活性的原因的可能性，进行了剂量响应测定，其中将TNFR2拮抗剂抗体在有或无抗IgG抗体的情
况下与T-reg细胞一起孵育。TNFR2拮抗剂抗体对T-reg细胞的剂量依赖性遏制不受抗-IgG
存在的影响(图10C和10D)。总之，这些数据证实TNFR2拮抗剂抗体的功能活性不依赖于非特
异性Fc区活性或交联。
况下与T-reg细胞一起孵育。TNFR2拮抗剂抗体对T-reg细胞的剂量依赖性遏制不受抗-IgG
存在的影响(图10C和10D)。总之，这些数据证实TNFR2拮抗剂抗体的功能活性不依赖于非特
异性Fc区活性或交联。
[0548] 为了进行上述SDS-PAGE分析，将蛋白质样品与PRECISION PLUSTM(BioRad)或PERFECT PROTEINTM(EMD Millipore)标记在具有MOPS SDS运行缓冲液(Life
Technologies)的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶上在100V下一起运行1小时。用SIMPLYBLUETM
Safe Stain(Invitrogen)将凝胶染色24小时。
Technologies)的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶上在100V下一起运行1小时。用SIMPLYBLUETM
Safe Stain(Invitrogen)将凝胶染色24小时。
[0549] 实施例12.通过拮抗性TNFR2抗体抑制NFkB活化和基因表达
[0550] NFkB信号传导是TNF介导的细胞响应所必需的，并且已被提出作为癌症治疗的潜在靶标。在观察到用TNFR2拮抗剂抗体处理后T-reg细胞增殖减少时，假设潜在信号传导机
制将涉及NFkB活化的减少。为了研究对TNFR2拮抗作用的分子响应，通过实时PCR分析测量
了8种NFkB活化启动子的表达。这些蛋白质包括：CHUK、NFKBIE、KNKBIA、MAP3K11、TRAF2、
TRAF3、relB、cIAP2/BIRCH。另外监测TNF和淋巴毒素的表达，以及T-reg细胞的两种标志物
FoxP3和CD25。在每种情况下，与用TNF处理相比，用TNFRAB2处理导致基因表达的下调(图
12A和12B)。接下来，使用磷酸化的RelA/NFkB p65作为标记，证明了用任一TNFR2拮抗剂抗
体处理CD4+细胞减少NFkB活化，而用TNF处理增加NFkB活化(图12C-12E)。这表明两种TNFR2
拮抗剂抗体对TNFR2信号转导的作用非常相似。另外，对拮抗剂TNFR2抗体与重组人TNFR2的
结合的动力学参数的分析揭示在TNFRAB1与TNFRAB2之间的缔合或解离速率没有显著差异
(图13A)。
制将涉及NFkB活化的减少。为了研究对TNFR2拮抗作用的分子响应，通过实时PCR分析测量
了8种NFkB活化启动子的表达。这些蛋白质包括：CHUK、NFKBIE、KNKBIA、MAP3K11、TRAF2、
TRAF3、relB、cIAP2/BIRCH。另外监测TNF和淋巴毒素的表达，以及T-reg细胞的两种标志物
FoxP3和CD25。在每种情况下，与用TNF处理相比，用TNFRAB2处理导致基因表达的下调(图
12A和12B)。接下来，使用磷酸化的RelA/NFkB p65作为标记，证明了用任一TNFR2拮抗剂抗
体处理CD4+细胞减少NFkB活化，而用TNF处理增加NFkB活化(图12C-12E)。这表明两种TNFR2
拮抗剂抗体对TNFR2信号转导的作用非常相似。另外，对拮抗剂TNFR2抗体与重组人TNFR2的
结合的动力学参数的分析揭示在TNFRAB1与TNFRAB2之间的缔合或解离速率没有显著差异
(图13A)。
[0551] 为了进行基因表达测定，将分离的CD4+细胞在IL-2(50U/ml)和TNFα(20ng/ml)或TNFR2拮抗剂抗体(2.5μg/ml)存在下孵育3小时。收集细胞并使用RNAqueous-4PCR试剂盒
(Ambion)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied-Biosystems)逆转录总RNA。
使用具有 基因表达主混合物的 阵列人NFkB途径96孔板和ABI Prism
7000序列检测系统(Applied-Biosystems)进行实时PCR。
(Ambion)分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied-Biosystems)逆转录总RNA。
使用具有 基因表达主混合物的 阵列人NFkB途径96孔板和ABI Prism
7000序列检测系统(Applied-Biosystems)进行实时PCR。
[0552] 使用基于细胞的人Phospho-RelA/NFkB p65免疫测定(R&D Systems)测量NFkB活化。简言之，在37℃下在单独IL-2(200U/ml)存在下或在所指示浓度的TNF或TNFR2拮抗剂存
在下，在96孔平底板(0.2x 106个细胞/孔)中培养新鲜CD4+细胞10分钟。通过离心和固定使
细胞粘附至板上，且然后根据制造商的说明书进行染色。使用 多标记读板仪
(Perkin Elmer)读取荧光，并计算归一化的相对荧光单位(RFU)。
在下，在96孔平底板(0.2x 106个细胞/孔)中培养新鲜CD4+细胞10分钟。通过离心和固定使
细胞粘附至板上，且然后根据制造商的说明书进行染色。使用 多标记读板仪
(Perkin Elmer)读取荧光，并计算归一化的相对荧光单位(RFU)。
[0553] 实施例13.拮抗性TNFR2抗体与TNFR2的结合作图至重叠区域
[0554] 为了进一步研究TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB1和TNFRAB2的特异性结合性质，进行了表位作图分析，并且使人TNFR2内结合这些抗体的表位与受体表面上的不同位置相关。两种
TNFR2拮抗剂的线性肽作图揭示，虽然两种拮抗性抗体对全长靶蛋白表现出高亲和力，但这
些抗体对线性肽表现出不同的亲和力。具体地，TNFRAB1对含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的
氨基酸112-139的表位表现出中等亲和力，并且对含有SEQ ID NO:7的氨基酸128-155的表
位表现出强亲和力。TNFRAB2不与任何线性肽区域结合(图13B)。TNFRAB1对TNFR2的亲和力
不受TNFα的存在的干扰，从而表明TNFα不是此抗体与TNFR2结合的竞争者(图13C)。为了检
查结合两种拮抗剂抗体的构象表位，进行了三维结合分析。对于TNFRAB1，3D数据与线性肽
作图分析一致，并且表明人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸142-149的区域以高亲和力被
TNFRAB1结合。另外，3D分析揭示了人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸161-169处的新结合
区(图13A-13C和15A-15C)。对于TNFRAB2，即使没有成功的线性肽结合，但也通过3D分析对
四个结合区域进行了作图(图15A-15C)。令人感兴趣的是，在人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨
基酸142-144处的两种TNFR2拮抗剂抗体的精确不连续表位中存在部分重叠。
TNFR2拮抗剂的线性肽作图揭示，虽然两种拮抗性抗体对全长靶蛋白表现出高亲和力，但这
些抗体对线性肽表现出不同的亲和力。具体地，TNFRAB1对含有人TNFR2内的SEQ ID NO:7的
氨基酸112-139的表位表现出中等亲和力，并且对含有SEQ ID NO:7的氨基酸128-155的表
位表现出强亲和力。TNFRAB2不与任何线性肽区域结合(图13B)。TNFRAB1对TNFR2的亲和力
不受TNFα的存在的干扰，从而表明TNFα不是此抗体与TNFR2结合的竞争者(图13C)。为了检
查结合两种拮抗剂抗体的构象表位，进行了三维结合分析。对于TNFRAB1，3D数据与线性肽
作图分析一致，并且表明人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸142-149的区域以高亲和力被
TNFRAB1结合。另外，3D分析揭示了人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨基酸161-169处的新结合
区(图13A-13C和15A-15C)。对于TNFRAB2，即使没有成功的线性肽结合，但也通过3D分析对
四个结合区域进行了作图(图15A-15C)。令人感兴趣的是，在人TNFR2内的SEQ ID NO:7的氨
基酸142-144处的两种TNFR2拮抗剂抗体的精确不连续表位中存在部分重叠。
[0555] 这一后来数据引起了人们的兴趣，因为产生针对TNFR2三聚体信号传导复合物的TNFR2结合位点和/或三聚体结合位点的外部区的拮抗性TNFR2抗体以防止TNFα进入并阻止
TNF三聚体的稳定化的先前尝试一直不成功。TNFα和TNFR2复合物的溶液结构已经限定了由
三种TNFR2受体包围的中心TNFα同源三聚体(Mukai等人Science Signaling 3:ra83
(2010))。通过许多先前的TNF超家族成员也观察到这种排列，所述成员包括TNFR1与淋巴毒
素、DR5与TRAIL配体和Ox40受体与Ox40L(Banner等人Cell 73:431-445(1993)；Cha等人
J.Biol.Chem.275:31171-31177(2000)；Compaan等人Structure 14:1321-1330(2006)；
Hymowitz等人Mol.Cell 4:563-571(1999)；Mongkolsapaya等人Nat.Struct.Biol.6:1048-
1053(1999))。
TNF三聚体的稳定化的先前尝试一直不成功。TNFα和TNFR2复合物的溶液结构已经限定了由
三种TNFR2受体包围的中心TNFα同源三聚体(Mukai等人Science Signaling 3:ra83
(2010))。通过许多先前的TNF超家族成员也观察到这种排列，所述成员包括TNFR1与淋巴毒
素、DR5与TRAIL配体和Ox40受体与Ox40L(Banner等人Cell 73:431-445(1993)；Cha等人
J.Biol.Chem.275:31171-31177(2000)；Compaan等人Structure 14:1321-1330(2006)；
Hymowitz等人Mol.Cell 4:563-571(1999)；Mongkolsapaya等人Nat.Struct.Biol.6:1048-
1053(1999))。
[0556] 产生针对这些区域的拮抗性抗体以阻止TNFα结合和TNFR2三聚体的先前尝试产生了具有轻度TNFR2抑制活性的隐性拮抗性抗体，所述抗体在T-reg增殖测定中具有共同性
状。如图14A-14D所示，在48小时T-reg测定中，这些隐性拮抗性抗体在不存在TNFR2刺激剂
的情况下作为拮抗剂进行。实际上，隐性拮抗剂TNFR2抗体A和B本身都具有剂量响应T-reg
拮抗作用的证明，剂量响应从0-25μg/ml(图14A和14C)。重要的是，当向培养物中添加TNFα
(20mg/ml)时，这些TNFR2指导的隐性拮抗性抗体A和B与TNFα竞争不良。在每种情况下，TNFα
驱动的激动作用优于这种形式的拮抗作用，至少用于防止TNFα或TNFR2三聚体形成的抗体
的部分和弱拮抗作用(图15C)。这种行为与显性拮抗TNFR2抗体(如本文鉴别和描述的结合
TNFR2内的特定表位，如含有TNFR2的KCRPG基序的表位以及如在本文提供的TNFRAB1和
TNFRAB2描述中鉴别的其他表位的TNFRAB1和TNFRAB2)的能力形成对比。与隐性拮抗性
TNFR2抗体A和B相反，TNFR2拮抗性抗体TNFRAB1和TNFRAB2即使在TNFR2激动剂如TNFα和IL-
2存在下也显示出减弱TNFR2信号传导和T-reg增殖的能力。重要的是，本文鉴别的表位可用
于产生拮抗性TNFR2抗体，所述抗体显示出在TNFR2刺激剂存在下持续存在的拮抗作用。
状。如图14A-14D所示，在48小时T-reg测定中，这些隐性拮抗性抗体在不存在TNFR2刺激剂
的情况下作为拮抗剂进行。实际上，隐性拮抗剂TNFR2抗体A和B本身都具有剂量响应T-reg
拮抗作用的证明，剂量响应从0-25μg/ml(图14A和14C)。重要的是，当向培养物中添加TNFα
(20mg/ml)时，这些TNFR2指导的隐性拮抗性抗体A和B与TNFα竞争不良。在每种情况下，TNFα
驱动的激动作用优于这种形式的拮抗作用，至少用于防止TNFα或TNFR2三聚体形成的抗体
的部分和弱拮抗作用(图15C)。这种行为与显性拮抗TNFR2抗体(如本文鉴别和描述的结合
TNFR2内的特定表位，如含有TNFR2的KCRPG基序的表位以及如在本文提供的TNFRAB1和
TNFRAB2描述中鉴别的其他表位的TNFRAB1和TNFRAB2)的能力形成对比。与隐性拮抗性
TNFR2抗体A和B相反，TNFR2拮抗性抗体TNFRAB1和TNFRAB2即使在TNFR2激动剂如TNFα和IL-
2存在下也显示出减弱TNFR2信号传导和T-reg增殖的能力。重要的是，本文鉴别的表位可用
于产生拮抗性TNFR2抗体，所述抗体显示出在TNFR2刺激剂存在下持续存在的拮抗作用。
[0557] 由于线性肽作图仅部分回答了为什么TNFRAB1和TNFRAB2是优异拮抗剂的问题，所以接下来探索了鉴别两种TNFR2拮抗剂的构象表位。使用Pepscan技术(Pepscan,The
Netherlands)进行三维(3D)结合分析。对于TNFRAB1和TNFRAB2，3D数据显示重叠区域从约
aa138-aa150。显而易见的是，这些结合区似乎不能与具有三聚体TNFα的经典TNFR2三聚体
结合，因为所述位点将位于三聚体的内部(图15B)。由于其他研究小组报告了为平行或反平
行模型的TNF超家族成员的TNF独立形式的替代形式，所以在那些位点上对表位进行了作图
(Naismith等人J.Biol.Chem.270:13303-13307(1995)；Naismith等人Structure 4:1251-
1262(1996))。出人意料地是，只有一种TNFR2拮抗剂结合模型是最佳的：其中反平行二聚体
(图15A)含有两个TNFR2拮抗性抗体结合区的模型，所述两个TNFR2拮抗性抗体结合区对于
专性铰接TNFR2拮抗剂是间隔开的并且似乎使这种TNFα-独立性复合物稳定，这是这些抗体
的另一种功能性状。通过进一步模拟，很明显反平行复合物而不是平行二聚体复合物将具
有彼此远离的细胞内区域，并且如同在功能测定中所观察到的那样将抑制NFkB信号传导。
由于TNF受体超家族的所有成员都能够显示这些不常研究的反平行构象，因此可通过设计
或筛选结合反平行TNFRS成员蛋白质内的表面暴露的表位的抗体或其抗原结合片段来制备
针对TNFR超家族的任何受体的拮抗性抗体(参见，例如，实施例15，下文)。这些抗体或其抗
原结合片段可使这些蛋白质的反平行形式稳定且由此防止信号传导，以及这些受体的通常
也结合可溶性同源配体的活性三聚体形式的形成。已知表现出反平行二聚体结构的TNF受
体超家族的已知成员包括：TNFR1、TNFR2、Fas、DCR3、DR3、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、
TRAIL-R3、TRAIL-R4、DR6、EDAR、CD271、OPG、RANK、LTβR、TWEAK-R、HVEM、CD27、CD30、CD40、CD137、OX40、GITR、BCMA、TACI、BAFFR、EDAR2、TROY和RELT等。
Netherlands)进行三维(3D)结合分析。对于TNFRAB1和TNFRAB2，3D数据显示重叠区域从约
aa138-aa150。显而易见的是，这些结合区似乎不能与具有三聚体TNFα的经典TNFR2三聚体
结合，因为所述位点将位于三聚体的内部(图15B)。由于其他研究小组报告了为平行或反平
行模型的TNF超家族成员的TNF独立形式的替代形式，所以在那些位点上对表位进行了作图
(Naismith等人J.Biol.Chem.270:13303-13307(1995)；Naismith等人Structure 4:1251-
1262(1996))。出人意料地是，只有一种TNFR2拮抗剂结合模型是最佳的：其中反平行二聚体
(图15A)含有两个TNFR2拮抗性抗体结合区的模型，所述两个TNFR2拮抗性抗体结合区对于
专性铰接TNFR2拮抗剂是间隔开的并且似乎使这种TNFα-独立性复合物稳定，这是这些抗体
的另一种功能性状。通过进一步模拟，很明显反平行复合物而不是平行二聚体复合物将具
有彼此远离的细胞内区域，并且如同在功能测定中所观察到的那样将抑制NFkB信号传导。
由于TNF受体超家族的所有成员都能够显示这些不常研究的反平行构象，因此可通过设计
或筛选结合反平行TNFRS成员蛋白质内的表面暴露的表位的抗体或其抗原结合片段来制备
针对TNFR超家族的任何受体的拮抗性抗体(参见，例如，实施例15，下文)。这些抗体或其抗
原结合片段可使这些蛋白质的反平行形式稳定且由此防止信号传导，以及这些受体的通常
也结合可溶性同源配体的活性三聚体形式的形成。已知表现出反平行二聚体结构的TNF受
体超家族的已知成员包括：TNFR1、TNFR2、Fas、DCR3、DR3、TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、
TRAIL-R3、TRAIL-R4、DR6、EDAR、CD271、OPG、RANK、LTβR、TWEAK-R、HVEM、CD27、CD30、CD40、CD137、OX40、GITR、BCMA、TACI、BAFFR、EDAR2、TROY和RELT等。
[0558] 实施例14.对癌细胞的TNFR2拮抗剂活性
[0559] 存在于患有癌症的患者中的T-reg细胞是有效的免疫抑制剂。与癌症患者或对照受试者的外周血的T-reg细胞相比，对于来自肿瘤部位的T-reg细胞尤其如此。为了开始理
解TNFR2拮抗剂抗体对卵巢癌T-reg细胞的效力，分离新鲜卵巢癌T-reg细胞，并如实施例2
中所述表征它们的增殖。首先使用TNF且然后使用TNFR2激动剂，事实确实是存在T-reg细胞
的卵巢癌扩增远远大于来自正常供体的T-reg细胞，这是超活化的标志(图16A-16B和17A-
17H)。与从分离自健康供体的T-reg细胞的增殖的分析获得的紧密剂量响应数据相比，
TNFR2拮抗性抗体以剂量依赖性方式并以更高的变化性抑制T-reg细胞增殖。另外，与健康
供体相比，两种拮抗性抗体更有效地抑制自卵巢癌患者分离的T-reg细胞的增殖。
解TNFR2拮抗剂抗体对卵巢癌T-reg细胞的效力，分离新鲜卵巢癌T-reg细胞，并如实施例2
中所述表征它们的增殖。首先使用TNF且然后使用TNFR2激动剂，事实确实是存在T-reg细胞
的卵巢癌扩增远远大于来自正常供体的T-reg细胞，这是超活化的标志(图16A-16B和17A-
17H)。与从分离自健康供体的T-reg细胞的增殖的分析获得的紧密剂量响应数据相比，
TNFR2拮抗性抗体以剂量依赖性方式并以更高的变化性抑制T-reg细胞增殖。另外，与健康
供体相比，两种拮抗性抗体更有效地抑制自卵巢癌患者分离的T-reg细胞的增殖。
[0560] 上述实验证明，拮抗性TNFR2抗体能够抑制正常和癌症相关的T-reg细胞增殖。就培养物中的T-reg细胞的数量以及T-reg增殖而言，此类抗体可消除或灭活有效的遏制性T-
reg细胞。这些抗体的性状包括减弱在NFkB活化之前的细胞内早期磷酸化事件的能力以及
改变剩余T-reg细胞的表型以使得这些细胞表达减少量的活化标志物(如CD45RO)的能力。
另外，拮抗性TNFR2抗体可减少可溶性TNFR2(一种促炎性蛋白)的分泌。值得注意的是，即使
在添加至细胞培养基中的大量激动性TNFα或激动性TNFR2抗体的存在下，拮抗性TNFR2抗体
仍然充当显性拮抗剂。
reg细胞。这些抗体的性状包括减弱在NFkB活化之前的细胞内早期磷酸化事件的能力以及
改变剩余T-reg细胞的表型以使得这些细胞表达减少量的活化标志物(如CD45RO)的能力。
另外，拮抗性TNFR2抗体可减少可溶性TNFR2(一种促炎性蛋白)的分泌。值得注意的是，即使
在添加至细胞培养基中的大量激动性TNFα或激动性TNFR2抗体的存在下，拮抗性TNFR2抗体
仍然充当显性拮抗剂。
[0561] 值得对比TNFα受体的抗体或配体激动作用与抗体拮抗作用。对天然配体的TNF和其他TNF超家族激动作用的需求进行了充分研究，并且需要聚集和聚类以进行有效信号转
导(Das等人J.Mol.Endocrinol.53:81-91(2014)；Siegel等人J.Cell.Biol.167:735-744
(2004)；Takeda等人Oncogene 26:3745-3757(2007))。对肿瘤坏死因子受体超家族的最常
见的确认是与配体的三聚体配对的三聚体受体(Gommerman等人Nat.Rev.Immunol.3:642-
655(2003)；Loetscher等人J.Biol.Chem.266:18324-18329(1991)；Smith等人Cell 76:
959-962(1994)；Tartaglia J.Biol.Chem.267:4304-4307(1992)；
WareAnnu.Rev.Immunol.23:787-819(2005))。激动剂抗体似乎遵循相同的原则，并且通常
还需要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制将其受体的Fc部分用于相关细胞，
这将稳定细胞外晶格。在TNFR2激动作用下观察到的这种外部受体寡聚化和聚集允许相互
TRAF晶格网络的内部寡聚化以用于快速NFkB信号传导(Cabal-Hierro等人Cell
Signal.26:2658-2666(2014)；Yin等人Nat.Struct.Mol.Biol.16:658-666(2009)；Zheng等
人Mol.Cell.38:101-113(2010))。通过添加的配体与受体的协同也促进了激动剂的稳定
化。对于许多TNF受体超家族成员而言，这对于治疗有效性似乎重要(Graves等人Cancer
Cell 26:177-189(2014))。
导(Das等人J.Mol.Endocrinol.53:81-91(2014)；Siegel等人J.Cell.Biol.167:735-744
(2004)；Takeda等人Oncogene 26:3745-3757(2007))。对肿瘤坏死因子受体超家族的最常
见的确认是与配体的三聚体配对的三聚体受体(Gommerman等人Nat.Rev.Immunol.3:642-
655(2003)；Loetscher等人J.Biol.Chem.266:18324-18329(1991)；Smith等人Cell 76:
959-962(1994)；Tartaglia J.Biol.Chem.267:4304-4307(1992)；
WareAnnu.Rev.Immunol.23:787-819(2005))。激动剂抗体似乎遵循相同的原则，并且通常
还需要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)机制将其受体的Fc部分用于相关细胞，
这将稳定细胞外晶格。在TNFR2激动作用下观察到的这种外部受体寡聚化和聚集允许相互
TRAF晶格网络的内部寡聚化以用于快速NFkB信号传导(Cabal-Hierro等人Cell
Signal.26:2658-2666(2014)；Yin等人Nat.Struct.Mol.Biol.16:658-666(2009)；Zheng等
人Mol.Cell.38:101-113(2010))。通过添加的配体与受体的协同也促进了激动剂的稳定
化。对于许多TNF受体超家族成员而言，这对于治疗有效性似乎重要(Graves等人Cancer
Cell 26:177-189(2014))。
[0562] 本文研究的两种TNFR2拮抗剂抗体的共有受体结合区得到与TNFR2受体结合以引起稳定和显性拮抗作用的抗体的非常不同的可能模型。通常研究的三聚体形式的TNFR2不
允许新鉴别的抗体拮抗剂与其氨基酸序列结合并解释这些拮抗性抗体如何优于TNFα或IL-
2(Mukai等人Science Signal.3:ra83(2010))。实际上，产生针对三聚体TNFR2结构中的TNF
α结合区或三聚体的TNFα结合区的外表面的TNFR2抗体的多年工作未产生在TNFR2激动剂存
在下维持对受体信号传导的显性抑制的有效拮抗剂。被设计为与TNFα竞争的针对TNFR2三
聚体的抗体不是显性的，但在用TNFα或IL-2的炎性环境激发时表现出中和作用。
允许新鉴别的抗体拮抗剂与其氨基酸序列结合并解释这些拮抗性抗体如何优于TNFα或IL-
2(Mukai等人Science Signal.3:ra83(2010))。实际上，产生针对三聚体TNFR2结构中的TNF
α结合区或三聚体的TNFα结合区的外表面的TNFR2抗体的多年工作未产生在TNFR2激动剂存
在下维持对受体信号传导的显性抑制的有效拮抗剂。被设计为与TNFα竞争的针对TNFR2三
聚体的抗体不是显性的，但在用TNFα或IL-2的炎性环境激发时表现出中和作用。
[0563] 三聚体形式的TNFR2是最常研究的TNFα受体形式，因为它与涉及NFkB的细胞生长信号有关。以前的研究已经提出TNFR2和类似的TNFα超家族成员如淋巴毒素受体也可以平
行和反平行的形式存在。这些形式缺乏TNF结合位点(Naismith等人J.Biol.Chem.270:
13303-13307(1995)；Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。本文描述的数据未显
示添加交联剂以增强拮抗作用或将拮抗作用转化为激动作用的额外益处。很难想象TNFα与
三聚体TNFR2的高亲和力TNFα结合可被抗体竞争性地抑制，即使具有极高的亲和力。TNFR2
的反平行二聚体形式与拮抗性抗体的可及结合位点和功能测定最佳拟合，但还存在支持这
一观察结果的另一种特征-外部界面相当更广泛且因此这也将导致TNFR2的细胞内尾部相
距更远，如由其他数据所支持(Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。随着TNFR2
三聚化，TNFR2的细胞内信号传导区域被拉近，从而促进TRAF直接或间接募集这些TNF超家
族受体的细胞内结构域(Napetschnig等人Annu.Rev.Biophys.42:443-468(2013)；Yin等人
Nat.Struct.Mol.Biol.16:658-666(2009))。这种激动剂信号随后将接合其他信号传导蛋
白以活化kB(IkB)激酶(IKK)和MAP激酶的抑制剂，从而最终活化NFkB。受体后信号传导途径
被TNFR2拮抗性抗体不同程度地阻断的事实表明，外部TNFR2结构的显性稳定性抑制了细胞
内TRAF的募集。其他人先前已经提出TNFR1的反平行二聚体可能是抑制性复合物并且不能
结合TNF。(Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。反平行模型更密切地证实了这
种复合物的拮抗形成如何解释相对对TNF共培养的优势，因为不能形成新的活化三聚体。
行和反平行的形式存在。这些形式缺乏TNF结合位点(Naismith等人J.Biol.Chem.270:
13303-13307(1995)；Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。本文描述的数据未显
示添加交联剂以增强拮抗作用或将拮抗作用转化为激动作用的额外益处。很难想象TNFα与
三聚体TNFR2的高亲和力TNFα结合可被抗体竞争性地抑制，即使具有极高的亲和力。TNFR2
的反平行二聚体形式与拮抗性抗体的可及结合位点和功能测定最佳拟合，但还存在支持这
一观察结果的另一种特征-外部界面相当更广泛且因此这也将导致TNFR2的细胞内尾部相
距更远，如由其他数据所支持(Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。随着TNFR2
三聚化，TNFR2的细胞内信号传导区域被拉近，从而促进TRAF直接或间接募集这些TNF超家
族受体的细胞内结构域(Napetschnig等人Annu.Rev.Biophys.42:443-468(2013)；Yin等人
Nat.Struct.Mol.Biol.16:658-666(2009))。这种激动剂信号随后将接合其他信号传导蛋
白以活化kB(IkB)激酶(IKK)和MAP激酶的抑制剂，从而最终活化NFkB。受体后信号传导途径
被TNFR2拮抗性抗体不同程度地阻断的事实表明，外部TNFR2结构的显性稳定性抑制了细胞
内TRAF的募集。其他人先前已经提出TNFR1的反平行二聚体可能是抑制性复合物并且不能
结合TNF。(Naismith等人Structure 4:1251-1262(1996))。反平行模型更密切地证实了这
种复合物的拮抗形成如何解释相对对TNF共培养的优势，因为不能形成新的活化三聚体。
[0564] 值得提及的是，正如其他人所报道的，与非癌供体的T-reg细胞或甚至自癌性供体的外周血中分离的T-reg细胞相比，癌症环境中的T-reg细胞是非常有效的(Govindaraj等
人Clin.Cancer Res.20:724-735(2013))。如本文所述，拮抗性TNFR2抗体能够抑制自卵巢
癌患者分离的有效T-reg细胞的增殖。还已经观察到，用TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB1和
TNFRAB2实现了对自卵巢癌患者分离的T-reg细胞的加重抑制。鉴于鉴别TNFR2基因序列的
特征的最近报道，这种活性是有益的，所述序列赋予癌症患者中的TNFR2信号传导增强的效
力。例如，在皮肤T细胞淋巴瘤的情况下，TNFR2的基因是基因复制和/或可在细胞内区域中
突变以赋予组成型激动作用。这种持续维持TNFR2生长信号的遗传压力与加剧的生长一致。
人Clin.Cancer Res.20:724-735(2013))。如本文所述，拮抗性TNFR2抗体能够抑制自卵巢
癌患者分离的有效T-reg细胞的增殖。还已经观察到，用TNFR2拮抗剂抗体TNFRAB1和
TNFRAB2实现了对自卵巢癌患者分离的T-reg细胞的加重抑制。鉴于鉴别TNFR2基因序列的
特征的最近报道，这种活性是有益的，所述序列赋予癌症患者中的TNFR2信号传导增强的效
力。例如，在皮肤T细胞淋巴瘤的情况下，TNFR2的基因是基因复制和/或可在细胞内区域中
突变以赋予组成型激动作用。这种持续维持TNFR2生长信号的遗传压力与加剧的生长一致。
[0565] 本文所述的拮抗剂抗体结合至TNFR2受体的限制性区域，所述区域在TNFα存在下调节T-reg抑制和甚至显性抑制。这些拮抗剂与本文也进行了描述的隐性拮抗剂非常不同，
所述隐性拮抗剂可温和地抑制T-reg细胞增殖，但是当在TNF和IL-2的炎性环境中使用时，
激动作用占主导(图14A-14D)。总之，上述数据提供了用于产生除本文所述的那些以外的额
外拮抗性TNFR2抗体的新平台，所述拮抗性TNFR2抗体能够调节患有癌症(其中癌细胞表达
升高数量的TNFR2(例如，卵巢癌))的患者的T-reg细胞生长并且即使在TNFR2激动剂存在下
也可表现出拮抗作用。值得注意的是，此类拮抗性TNFR2抗体在卵巢癌患者的T-reg细胞上
比在非癌性供体的T-reg细胞上更有效。
所述隐性拮抗剂可温和地抑制T-reg细胞增殖，但是当在TNF和IL-2的炎性环境中使用时，
激动作用占主导(图14A-14D)。总之，上述数据提供了用于产生除本文所述的那些以外的额
外拮抗性TNFR2抗体的新平台，所述拮抗性TNFR2抗体能够调节患有癌症(其中癌细胞表达
升高数量的TNFR2(例如，卵巢癌))的患者的T-reg细胞生长并且即使在TNFR2激动剂存在下
也可表现出拮抗作用。值得注意的是，此类拮抗性TNFR2抗体在卵巢癌患者的T-reg细胞上
比在非癌性供体的T-reg细胞上更有效。
[0566] 实施例15.通过CDR-H3序列取代开发拮抗性TNFR2抗体
[0567] 为了产生抗TNFR2抗体，使用已建立的免疫程序用全长人TNFR2免疫小鼠。随后从免疫的小鼠中分离血清，并纯化了12种不同的单克隆抗体。使用涂覆有人TNFR2的微量滴定
板，通过ELISA(图18A)验证这12种抗体对人TNFR2的亲和力。将在这些实验中使用的微量滴
定板的孔涂覆5μg/ml的抗原。随后将鼠类抗体以1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300、1:
72900和1:218799的稀释度从微量滴定板的行A至G添加至每个孔中。从行H得到的读数对应
于本底荧光。值得注意的是，阳性滴度将在1:2700稀释度下具有两倍于本底的光密度读数。
通过添加显色抗体，如与荧光剂缀合的标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白来检测添加的抗体。
随后使用荧光读板仪分析微量滴定板。然后使用Excel以数字方式分析ELISA筛选原始数
据。具有大于阳性阈值的光密度(OD)值的任何涂覆有抗原的微量滴定孔被认为是“阳性命
中”，条件是计数器筛选涂覆板上的相应孔具有小于阴性阈值的OD。
板，通过ELISA(图18A)验证这12种抗体对人TNFR2的亲和力。将在这些实验中使用的微量滴
定板的孔涂覆5μg/ml的抗原。随后将鼠类抗体以1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300、1:
72900和1:218799的稀释度从微量滴定板的行A至G添加至每个孔中。从行H得到的读数对应
于本底荧光。值得注意的是，阳性滴度将在1:2700稀释度下具有两倍于本底的光密度读数。
通过添加显色抗体，如与荧光剂缀合的标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白来检测添加的抗体。
随后使用荧光读板仪分析微量滴定板。然后使用Excel以数字方式分析ELISA筛选原始数
据。具有大于阳性阈值的光密度(OD)值的任何涂覆有抗原的微量滴定孔被认为是“阳性命
中”，条件是计数器筛选涂覆板上的相应孔具有小于阴性阈值的OD。
[0568] 基于其对TNFR2的高亲和力(例如，如通过图18A中的行B，第3列中所示的荧光读数证明)，选择鼠类克隆3用于CDR-H3诱变。使用本领域中已知的重组基因表达技术，用氨基酸
序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)取代克隆3的CDR-H3序列，以产生拮抗性TNFR2抗体
TNFR2A3。前体克隆3不能拮抗TNFR2靶标，而重组产生的TNFR2A3表现出拮抗特性。如图18B
和18C的第3列以及图20的第2列和第3列中所示，TNFR2A3能够特异性地结合分别具有氨基
酸序列LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)和VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的两种人TNFR2源
性肽。这种选择性结合通过微量滴定板的每个孔中增加浓度的TNFR2A3内的荧光的剂量依
赖性增加来证明。TNFR2A3以位点特异性方式结合TNFR2，因为发现这种抗体对从人TNFR2一
级结构的远端区域分离的不相关的TNFR2源性肽表现出可忽略的结合亲和力(参见，例如，
图19的第3列)。总之，这些发现证明CDR-H3序列关于TNFR2拮抗作用的两个重要方面。首先，
拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3序列是抗体的抗原结合性质的主要分子决定簇。其次，CDR-H3基
序是模块结构域，可输入不表现出拮抗活性的抗TNFR2抗体以赋予这种抗体结合TNFR2的促
进受体拮抗作用的区域的能力。
序列ARDDGSYSPFDYFG(SEQ ID NO:284)取代克隆3的CDR-H3序列，以产生拮抗性TNFR2抗体
TNFR2A3。前体克隆3不能拮抗TNFR2靶标，而重组产生的TNFR2A3表现出拮抗特性。如图18B
和18C的第3列以及图20的第2列和第3列中所示，TNFR2A3能够特异性地结合分别具有氨基
酸序列LRKCRPGFGVA(SEQ ID NO:285)和VVCKPCAPGTFSN(SEQ ID NO:286)的两种人TNFR2源
性肽。这种选择性结合通过微量滴定板的每个孔中增加浓度的TNFR2A3内的荧光的剂量依
赖性增加来证明。TNFR2A3以位点特异性方式结合TNFR2，因为发现这种抗体对从人TNFR2一
级结构的远端区域分离的不相关的TNFR2源性肽表现出可忽略的结合亲和力(参见，例如，
图19的第3列)。总之，这些发现证明CDR-H3序列关于TNFR2拮抗作用的两个重要方面。首先，
拮抗性TNFR2抗体的CDR-H3序列是抗体的抗原结合性质的主要分子决定簇。其次，CDR-H3基
序是模块结构域，可输入不表现出拮抗活性的抗TNFR2抗体以赋予这种抗体结合TNFR2的促
进受体拮抗作用的区域的能力。
[0569] 实施例16.通过施用拮抗性抗TNFR2抗体与免疫治疗剂的组合来治疗人患者的癌症或感染性疾病
[0570] 本发明的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽和构建体可与免疫治疗剂组合(例如，与免疫治疗剂混合、共同施用或分开施用)施用于人患者以治疗细胞增殖病症如
癌症，或感染性疾病如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。施用所述抗体、抗原结合片段、单链
多肽或构建体可遏制表达TNFR2的T-reg细胞和/或癌细胞的生长和增殖。诸如抗CTLA-4剂、
抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂以及抗TWEAKR剂的免疫治
疗剂可与拮抗剂TNFR2抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体协同起作用，因为免疫治
疗剂能够下调免疫检查点受体和/或配体的信号转导，否则所述信号转导将导致对肿瘤相
关抗原的耐受性以及细胞毒性T细胞响应的下调。可与拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段、
单链多肽或构建体结合使用的免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、
Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、
抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面
癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
癌症，或感染性疾病如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。施用所述抗体、抗原结合片段、单链
多肽或构建体可遏制表达TNFR2的T-reg细胞和/或癌细胞的生长和增殖。诸如抗CTLA-4剂、
抗PD-1剂、抗PD-L1剂、抗PD-L2剂、TNF-α交联剂、TRAIL交联剂、抗CD27剂、抗CD30剂、抗CD40剂、抗4-1BB剂、抗GITR剂、抗OX40剂、抗TRAILR1剂、抗TRAILR2剂以及抗TWEAKR剂的免疫治
疗剂可与拮抗剂TNFR2抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体协同起作用，因为免疫治
疗剂能够下调免疫检查点受体和/或配体的信号转导，否则所述信号转导将导致对肿瘤相
关抗原的耐受性以及细胞毒性T细胞响应的下调。可与拮抗性TNFR2抗体、其抗原结合片段、
单链多肽或构建体结合使用的免疫治疗剂的另外实例包括塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、
Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、
抗趋化因子、伏立诺他、加巴喷丁、针对淋巴细胞表面受体和/或淋巴因子的抗体、针对表面
癌蛋白的抗体和/或小分子疗法如伏立诺他。
[0571] 本领域的熟练医生可向患有癌症或感染性疾病的人患者施用与免疫治疗剂组合的作为拮抗剂的例如如本文所述的特异性结合TNFR2的抗体、其抗原结合片段、单链多肽或
构建体。所述抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体和免疫治疗剂可在数天、数周、数月
或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间，以及其他范围)通过适当施用
途径(例如，静脉内、肌肉内或皮下等)施用于患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过
与PEG缀合来对抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体进行修饰以逃避免疫识别
和/或改进所述抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体的药代动力学概况。
构建体。所述抗体、其抗原结合片段、单链多肽或构建体和免疫治疗剂可在数天、数周、数月
或数年时程内以特定剂量(例如，0.001与100mg/kg/天之间，以及其他范围)通过适当施用
途径(例如，静脉内、肌肉内或皮下等)施用于患者。如果需要，可例如通过高糖基化或通过
与PEG缀合来对抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体进行修饰以逃避免疫识别
和/或改进所述抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体的药代动力学概况。
[0572] 以这种方式治疗的癌症或感染性疾病的进展可通过若干已建立的方法中的任何一种或多种来监测。医生可通过直接观察来监测患者，以评价患者所表现出的症状如何响
应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析以确定肿瘤是否已经转移或肿瘤
的大小是否已经改变，例如，响应于用抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体和免
疫治疗剂治疗而降低。任选地，可从患者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定
各种生长因子受体(如表皮生长因子受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医
生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多
肽或构建体和免疫治疗剂给药或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链
多肽或构建体和免疫治疗剂给药。
应于治疗而改变。还可对患者进行MRI、CT扫描或PET分析以确定肿瘤是否已经转移或肿瘤
的大小是否已经改变，例如，响应于用抗TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多肽或构建体和免
疫治疗剂治疗而降低。任选地，可从患者中提取细胞，并且可进行定量生物化学分析以确定
各种生长因子受体(如表皮生长因子受体)的相对细胞表面浓度。基于这些分析的结果，医
生可在随后的治疗轮次中开出更高/更低剂量的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链多
肽或构建体和免疫治疗剂给药或更高/更低频率的拮抗性TNFR2抗体、抗原结合片段、单链
多肽或构建体和免疫治疗剂给药。
[0573] 实施例17.拮抗性TNFR2多肽的CDR-H和CDR-L区对活化的T-reg细胞的杀伤和T效应细胞的增殖的影响的组合分析
[0574] 目前已发现含有CDR-H和CDR-L区的某些组合的拮抗性TNFR2多肽(如抗体、抗原结合片段、单链多肽和构建体)特别能够促进T-reg细胞死亡和增强T效应细胞(例如，CD8+T细
胞)增殖。为了测试CDR-H1和CDR-L3区的各种组合对抗TNFR2多肽的拮抗活性的影响，开发
了一系列含有两个CDR-H1区：GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)和GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)以及
两个CDR-L3区：CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)和CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)的所有四种可能
组合的单克隆抗体。剩余的CDR区与针对TNFRAB2描述的那些相同(CDR-H2：VDPEYGST(SEQ
ID NO:258)；CDR-H3：ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；CDR-L1：QNINKY(SEQ ID NO:260)，
CDR-L2：TYS或YTS)。
胞)增殖。为了测试CDR-H1和CDR-L3区的各种组合对抗TNFR2多肽的拮抗活性的影响，开发
了一系列含有两个CDR-H1区：GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)和GYTFTDYI(SEQ ID NO:275)以及
两个CDR-L3区：CLQYVNLLT(SEQ ID NO:272)和CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)的所有四种可能
组合的单克隆抗体。剩余的CDR区与针对TNFRAB2描述的那些相同(CDR-H2：VDPEYGST(SEQ
ID NO:258)；CDR-H3：ARDDGSYSPFDYWG(SEQ ID NO:259)；CDR-L1：QNINKY(SEQ ID NO:260)，
CDR-L2：TYS或YTS)。
[0575] 然后使用标准CD4+ CD25+和CD8+细胞计数程序(如上文实施例2中描述的那些)测试了含有前述CDR-H1和CDR-L3区的四种可能组合中的每一种的单克隆抗体诱导T-reg细胞
死亡和促进CD8+细胞增殖的能力。每种单克隆抗体诱导T-reg细胞死亡和诱导CD8+ T细胞
增殖的能力按1至5的定性等级排序，其中1对应于可测量的生物活性，并且5对应于稳健生
物活性。这些实验的结果总结在以下表3中：
死亡和促进CD8+细胞增殖的能力。每种单克隆抗体诱导T-reg细胞死亡和诱导CD8+ T细胞
增殖的能力按1至5的定性等级排序，其中1对应于可测量的生物活性，并且5对应于稳健生
物活性。这些实验的结果总结在以下表3中：
[0576] 表3.CDR-H1和CDR-L3组合对拮抗性TNFR2单克隆抗体的T-reg遏制和CD8+ T细胞诱导性质的影响
[0577]
[0578] 表3中报告的结果证明了含有具有氨基酸序列GYTFTDYL(SEQ ID NO:274)的CDR-H1和具有氨基酸序列CLQYVNLIT(SEQ ID NO:273)的CDR-L3的拮抗性TNFR2多肽(如本文所
述的抗体、抗原结合片段、单链多肽和构建体)在促进活化的T-reg细胞的选择性杀伤和加
强增强的T效应细胞增殖方面特别有效。如本文所述，这些表型对于治疗癌症和感染性疾病
是有益的，因为在患有此类病理的患者中耗竭活化的T-reg细胞群体的能力可减轻细胞毒
性CD8+ T细胞的衰减，从而使效应细胞能够起作用和或扩增以发动针对癌细胞和感染性细
胞的免疫响应。
述的抗体、抗原结合片段、单链多肽和构建体)在促进活化的T-reg细胞的选择性杀伤和加
强增强的T效应细胞增殖方面特别有效。如本文所述，这些表型对于治疗癌症和感染性疾病
是有益的，因为在患有此类病理的患者中耗竭活化的T-reg细胞群体的能力可减轻细胞毒
性CD8+ T细胞的衰减，从而使效应细胞能够起作用和或扩增以发动针对癌细胞和感染性细
胞的免疫响应。
[0579] 实施例18.拮抗性TNFR2多肽对T-reg细胞、T效应细胞和TNFR2+癌细胞表现出作用
[0580] 拮抗性TFNR2多肽(如本文所述的抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建体)可对T-reg细胞和T效应细胞发挥生物学活性。为了研究这些作用，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1
和TNFRAB2与培养的T-reg细胞以递增的抗体浓度一起孵育，并且随后记录培养物中T-reg
细胞数量的变化百分比。这些实验的结果在图21A和21B中示出，并且证明拮抗性TNFR2抗体
TNFRAB1和TNFRAB2以剂量依赖性方式降低或抑制培养物中T-reg细胞的增殖。
和TNFRAB2与培养的T-reg细胞以递增的抗体浓度一起孵育，并且随后记录培养物中T-reg
细胞数量的变化百分比。这些实验的结果在图21A和21B中示出，并且证明拮抗性TNFR2抗体
TNFRAB1和TNFRAB2以剂量依赖性方式降低或抑制培养物中T-reg细胞的增殖。
[0581] 另外，拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2促进T效应细胞的增殖。为了研究这种活性，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2与培养的CD8+ T细胞以递增的抗体浓度一起
孵育，并且随后记录培养物中CD8+ T细胞数量的变化百分比。这些实验的结果在图21C中示
出，并且证明拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2以剂量依赖性方式增加T效应细胞的增
殖。
孵育，并且随后记录培养物中CD8+ T细胞数量的变化百分比。这些实验的结果在图21C中示
出，并且证明拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2以剂量依赖性方式增加T效应细胞的增
殖。
[0582] 拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1和TNFRAB2还直接杀死表达TNFR2的癌细胞。将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1与培养的OVCAR3细胞(一种TNFR2+卵巢癌细胞系)以递增的抗体浓度一
起孵育，并且随后记录培养物中CD8+ T细胞数量的变化百分比。此实验的结果在图21D中示
出，并且证明拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1以剂量依赖性方式遏制TNFR2+癌细胞的增殖。
起孵育，并且随后记录培养物中CD8+ T细胞数量的变化百分比。此实验的结果在图21D中示
出，并且证明拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1以剂量依赖性方式遏制TNFR2+癌细胞的增殖。
[0583] 总之，图21A-21D中所示的数据证明，拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的抗TNFR2抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建体)能够通过若干不同的机制发挥治疗作用。拮抗性
TNFR2多肽可遏制T-reg细胞增殖并增加T效应细胞的增殖，所述T效应细胞然后可发动针对
例如癌细胞或感染性病原体的细胞的免疫响应。另外，拮抗性TNFR2多肽可直接杀死表达
TNFR2的癌细胞。通过这些机制，例如，拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的那些)可用于治疗患
有各种癌症和感染性疾病(如本文所述的那些病状)的患者。
TNFR2多肽可遏制T-reg细胞增殖并增加T效应细胞的增殖，所述T效应细胞然后可发动针对
例如癌细胞或感染性病原体的细胞的免疫响应。另外，拮抗性TNFR2多肽可直接杀死表达
TNFR2的癌细胞。通过这些机制，例如，拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的那些)可用于治疗患
有各种癌症和感染性疾病(如本文所述的那些病状)的患者。
[0584] 实施例19.拮抗性TNFR2多肽在肿瘤微环境中杀死T-reg细胞并扩增T效应细胞
[0585] 拮抗性TFNR2多肽(如本文所述的抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建体)可优先减少T-reg细胞的增殖并增加癌症患者的肿瘤微环境中的T效应细胞的增殖。为了研究这
种性质，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1与新鲜人卵巢癌腹水或从未患癌症的人受试者获得的
血液样品一起孵育。TNFRAB1以递增剂量存在于这些样品中，并且在孵育期后记录每个样品
中存在的T-reg细胞和T效应细胞的数量。这些实验的结果报告在图22A和22B中。如其中所
示，TNFRAB1以剂量依赖性方式杀死卵巢癌腹水样品中的T-reg细胞或减少其增殖。TNFRAB1
还杀死从未患癌症的人获得的样品中的T-reg细胞或减少其增殖，但程度较小。相反，
TNFRAB1使卵巢癌腹水样品中的T效应细胞增殖增加至比自未患癌症的人获得的样品中更
大的程度。总之，这些数据证明，拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的抗TNFR2抗体、其抗原结合
片段、单链多肽和构建体)可相对于不含癌细胞的环境中(如健康人受试者中)的T-reg细胞
优先耗竭肿瘤微环境中(如患有本文所述的癌症的患者中)的T-reg细胞。
种性质，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1与新鲜人卵巢癌腹水或从未患癌症的人受试者获得的
血液样品一起孵育。TNFRAB1以递增剂量存在于这些样品中，并且在孵育期后记录每个样品
中存在的T-reg细胞和T效应细胞的数量。这些实验的结果报告在图22A和22B中。如其中所
示，TNFRAB1以剂量依赖性方式杀死卵巢癌腹水样品中的T-reg细胞或减少其增殖。TNFRAB1
还杀死从未患癌症的人获得的样品中的T-reg细胞或减少其增殖，但程度较小。相反，
TNFRAB1使卵巢癌腹水样品中的T效应细胞增殖增加至比自未患癌症的人获得的样品中更
大的程度。总之，这些数据证明，拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的抗TNFR2抗体、其抗原结合
片段、单链多肽和构建体)可相对于不含癌细胞的环境中(如健康人受试者中)的T-reg细胞
优先耗竭肿瘤微环境中(如患有本文所述的癌症的患者中)的T-reg细胞。
[0586] 实施例20.拮抗性TNFR2多肽杀死T-reg细胞、扩增T效应细胞并耗竭TNFR2+ CD26-细胞
[0587] 拮抗性TFNR2多肽(如本文所述的抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建体)表现出在肿瘤微环境中杀死T-reg细胞、增加T效应细胞增殖和杀死表达TNFR2的癌细胞的能力。
为了进一步研究这些活性，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1与自健康人受试者和患有晚期皮肤
T细胞淋巴瘤的人患者获得的血液样品一起孵育。这些患者接受一种或多种免疫治疗剂(如
塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙
罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他和加巴喷丁等)的背景治疗，并且在
进行本发明实验时未能对免疫疗法作出响应。
为了进一步研究这些活性，将拮抗性TNFR2抗体TNFRAB1与自健康人受试者和患有晚期皮肤
T细胞淋巴瘤的人患者获得的血液样品一起孵育。这些患者接受一种或多种免疫治疗剂(如
塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米地辛、贝沙
罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他和加巴喷丁等)的背景治疗，并且在
进行本发明实验时未能对免疫疗法作出响应。
[0588] 在孵育期后，测量每个样品中的效应T细胞、T-reg细胞和TNFR2+ CD26-细胞的数量。T细胞不存在CD26表达是T细胞淋巴瘤的指标。因此，对这些细胞施加的作用表明对T细
胞淋巴瘤患者的癌细胞的作用。这些实验的结果报告在图23A-23C中。这些数据表明拮抗性
TNFR2多肽(如TNFRAB1)可同时调节癌症患者的T-reg细胞群体、T效应细胞群体和TNFR2+
CD26-细胞群体。本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建
体)可展示所有这三种有益特征，从而赋予对患有癌症(如T细胞淋巴瘤或本文所述的另一
种癌症)的患者的治疗作用。
胞淋巴瘤患者的癌细胞的作用。这些实验的结果报告在图23A-23C中。这些数据表明拮抗性
TNFR2多肽(如TNFRAB1)可同时调节癌症患者的T-reg细胞群体、T效应细胞群体和TNFR2+
CD26-细胞群体。本文所述的拮抗性TNFR2多肽(如抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建
体)可展示所有这三种有益特征，从而赋予对患有癌症(如T细胞淋巴瘤或本文所述的另一
种癌症)的患者的治疗作用。
[0589] 另外，图23A-23C中所示的结果证明拮抗性TNFR2多肽(如本文所述的抗体、其抗原结合片段、单链多肽和构建体)可与免疫治疗剂组合用于治疗患者的癌症。在前述实验中研
究的T细胞淋巴瘤患者对单独免疫疗法没有响应。在用TNFRAB1处理从这些患者分离的血液
样品后，观察到有利的体外响应，因为T-reg细胞和TNFR2+ CD26-细胞的增殖减少并且T效
应细胞的增殖增加。这些结果表明拮抗性TNFR2多肽可与免疫治疗剂，如本文所述的免疫治
疗剂(例如，塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米
地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他和加巴喷丁)组合使用以
改进癌症患者的治疗功效。
究的T细胞淋巴瘤患者对单独免疫疗法没有响应。在用TNFRAB1处理从这些患者分离的血液
样品后，观察到有利的体外响应，因为T-reg细胞和TNFR2+ CD26-细胞的增殖减少并且T效
应细胞的增殖增加。这些结果表明拮抗性TNFR2多肽可与免疫治疗剂，如本文所述的免疫治
疗剂(例如，塔革雷汀、干扰素-α、氯倍他索、Peg干扰素(例如， )、泼尼松、罗米
地辛、贝沙罗汀、甲氨蝶呤、曲安西龙乳膏、抗趋化因子、伏立诺他和加巴喷丁)组合使用以
改进癌症患者的治疗功效。
[0590] 此外，上述实验的结果证明，本发明的拮抗性TNFR2多肽在患有各种癌症的患者中表现出治疗作用。如目前所述，拮抗性TNFR2抗体可用于遏制卵巢癌细胞增殖(参见例如实
施例14，上文)和T细胞淋巴瘤细胞增殖。这两种癌症的细胞均表现出表达TNFR2的共同性
质。因此，拮抗性TNFR2多肽可用于治疗多种癌症类型，如其中TNFR2在癌细胞表面上表达的
那些癌症类型。
施例14，上文)和T细胞淋巴瘤细胞增殖。这两种癌症的细胞均表现出表达TNFR2的共同性
质。因此，拮抗性TNFR2多肽可用于治疗多种癌症类型，如其中TNFR2在癌细胞表面上表达的
那些癌症类型。
[0591] 其他实施方案
[0592] 本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用的程度犹如每个独立的公布或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入。
[0593] 尽管本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，但应了解能够对它进行进一步的修改并且本申请意图涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的改变、用途或
改编，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或常规实践的和属于上文
所述的实质特征的以及符合权利要求书范围之内的变更。
改编，并且包括虽然不属于本发明但属于本发明所属领域的已知或常规实践的和属于上文
所述的实质特征的以及符合权利要求书范围之内的变更。
[0594] 其他实施方案在权利要求书内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种用于治疗肿瘤的中药 | 2021-08-28 | 4 |
| 海嘧啶抗肿瘤作用及其机制的研究 | 2021-09-09 | 5 |
| 用于脑肿瘤的内服药物 | 2020-08-21 | 6 |
| 肿瘤标志物LIMK1及其应用 | 2020-09-30 | 4 |
| 一种治疗肿瘤的药物及其应用 | 2021-11-27 | 2 |
| 一种循环肿瘤细胞检测芯片及其应用 | 2021-07-17 | 5 |
| 超声肿瘤治疗机换能器 | 2020-08-30 | 4 |
| 一种头颈肿瘤精准重建模型系统 | 2022-08-18 | 5 |
| 一种改进的骨肿瘤标本取样装置 | 2022-09-27 | 0 |
| 一种肿瘤内科化疗护理装置 | 2022-05-26 | 3 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈