发明背景

在A型流感病毒粒子和病毒感染的细胞的膜上表达了三种类型的跨膜蛋白。红细胞凝集素和神经氨酸酶是分别具有大约510个和大约420个氨基酸的大胞外结构域的糖蛋白。红细胞凝集素以同型三聚体的形式装配，而神经氨酸酶以同型四聚体的形式装配，在病毒的膜和病毒成熟的细胞位点上形成13-14nm长的杆状表面突起物的致密层。目前的流感病毒疫苗的目标在于诱导针对这些糖蛋白，特别是红细胞凝集素的强烈的抗体反应，就这一点来说，已知这些抗体对于感染具有高度保护性。问题在于A型流感病毒具有改变被这些保护性抗体所识别的抗原决定簇的高度倾向性，从而需要使用反映了这些抗原性变化的更新的疫苗株进行重复免疫接种。相比之下，第三个病毒跨膜蛋白为基质蛋白2(M2)，它含有的胞外结构域(M2e)在人类的流感病毒株中是高度保守的。利用M2对A型流感病毒感染的广泛的保护性免疫已经被研究(Slepushkin等，(1995)Vaccine 13：1399-1402；Frace等，(1999)Vaccine 17：2237-44；Neirynck等，(1999)Nature Med.5：1157-63；Okuda等，(2001)Vaccine 19：3681-91)。

M2是97个氨基酸的非糖基化跨膜蛋白(Lamb等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：4170-4；Lamb等，(1985)Cell 40：627-33)。它形成同型四聚体(Holsinger和Lamb(1991)Virology 183：32-43；Sugrue和Hay(1991)Virology 180：617-24)，在病毒颗粒的膜上以低密度表达(平均每个病毒粒子有大约10个M2四聚体，与此相比有大约400个红细胞凝集素三聚体和大约100个神经氨酸酶四聚体)，但是在被感染的细胞的质膜上以高密度表达(与红细胞凝集素密度相同)(Zebedee和Lamb(1988)J.Virol.62：2762-72)。M2四聚体表现出pH诱导的质子运输活性(Steinhauer等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11525-9；Pinto等，(1992)Cell 69：517-28)，这似乎利于RNP复合物融合后从病毒膜上的释放(Zhirnov(1990)Virology 176：274-9)，防止在病毒跨膜蛋白从内质网向质膜外运的过程中运输泡内pH的过度降低，从而防止红细胞凝集素在成熟前受酸诱导的构象变化(Steinhauer等，(1991)同上)。在23个氨基酸长的M2e中，N-端的9个氨基酸是完全保守的，在它靠近膜的15个氨基酸长的部分中仅显示出相对低程度的结构多样性(Zebedee和Lamb(1988)同上；Ito等，(1991)J.Virol.65：5491-8)。在人类分离株H1N1、H2N2、H3N2和H5N1亚型中，在7个位置发现了两个可以互相替换的氨基酸，但是这些人类分离株的大部分实际上具有同样的序列。

M2e特异性单克隆抗体14C2在体外不能防止病毒感染，但在掺入培养基或琼脂覆盖层中时能降低病毒的产量，和减小噬菌斑的大小(Zebedee和Lamb(1988)同上；Hughey等，(1995)Virology 212：411-21).不是所有的M2e特异性抗体都表现出这种活性(Hughey等，(1995)同上)，不是所有的病毒株都对它敏感(Zebedee和Lamb(1988)同上).在体内，被动的单克隆抗体14C2同样减少了病毒的生长(Treanor等，(1990)J.Virol.64：1375-7)，针对PR8也是有效的(Mozdzanowska等，(1999)Virology 254：138-46)，而PR8在体外对抗体介导的生长限制是不敏感的(Zebedee和Lamb(1988)同上；Mozdzanowska等，(1999)同上)，这表明抗体介导的病毒生长限制在体外和体内是通过不同机制进行的。

使用各种不同类型的疫苗结构和接种形式已经测试了主动诱导的M2特异性免疫的保护效力。在最初的研究中，使用表达M2的重组痘苗病毒免疫接种小鼠和白鼬，没有显示出保护的征象(Epstein等，(1993)J.Immunol.150：5484-93；Jakeman等，(1989)J.Gen.Virol.70：1523-31)，尽管M2特异性免疫反应的诱导未被证实。随后的研究测试了含有完整的M基因区段(编码M1和M2蛋白)的质粒DNA(Okuda等，(2001)同上)、完整的重组M2蛋白膜制品(Slepushkin等，(1995)同上)、删除了跨膜部分的M2蛋白(以减少毒性并增加溶解度)(Frace等，(1999)同上)、以及M2e与乙肝病毒核心蛋白融合形成的结构(Neirynck等，(1999)同上)。这些后来的免疫接种方案诱导了保护作用，其根据是病毒生长和死亡率的减少。

现在已经发现含有与辅助性T细胞决定簇连接的M2e的多重抗原因子是诱导病毒保护的有效疫苗。M2e-MAAs与霍乱毒素(CT)和带有刺激性的CpG基序的合成寡聚脱氧核苷酸(ODN)一起在小鼠血清中诱导强烈的M2e特异性抗体滴度，并导致针对流感病毒攻击的显著的保护。

发明简述

本发明的一个方面是一种多抗原因子(MAA)，其结构如下：

(SEQ ID NO：1)，其中R1是0-2个氨基酸残基，包含Cys或Gly或核酸序列；m至少为1；n至少为1；Xaa1是0-1个氨基酸残基，包含Lys-R4；R2、R3和R4可以互相独立的是B细胞决定簇、T细胞决定簇或定向分子；以及R5是任何氨基酸、肽或核酸序列。在优选实施方案中，B细胞决定簇是基质蛋白2的胞外结构域或其类似物。在另一个优选实施方案中，位于第一个MAA N-端的Cys残基通过二硫键与通式1中第二个MAA N-端的第二个Cys残基共价结合，产生通式1的MAA二聚体。

本发明的另一个方面是含有MAA和可药用载体的组合物。在优选实施方案中，含有MAA和可药用载体的组合物还可以含有佐剂。这样的组合物可用于预防或治疗病毒感染。因此提供了一种预防或治疗病毒感染的方法，包括对易受感染的对象或表现出病毒感染信号或症状的对象给药有效剂量的本发明的组合物，以预防或治疗病毒感染的信号或症状。在优选情况下，该病毒感染是A型流感病毒。

本发明的这些和其它的方面在后面的本发明的描述中将被更详细地阐述。

发明详述

现在已经发现，用含有多个B细胞决定簇和辅助性T细胞(Th)决定簇的多抗原因子(MAAs)接种的动物，对随后用传染性病毒进行的攻击表现出显著的抗性.根据本文的定义，多抗原因子是含有一种以上能够在动物中诱导特异性免疫反应的肽或核酸部分的因子.B细胞决定簇诱导抗体反应，也可以诱导T细胞反应.本文提供的MAAs的优点是大量的抗原侧链可以被连接到含有Lys-Gly重复单元的核心肽上，从而能够呈递几个结构上相连的决定簇.此外，当Cys残基被连接到核心肽的N-端时，两个核心肽可以通过二硫键共价连接，从而有效地加倍了抗原侧链的数量，因而在哺乳动物中增强了免疫反应.此外，因为本文提供的MAA可以容易地进行化学合成，MAA的生产是高度受控的，并且使污染最小化.

因此，本发明的一个方面提供了一种MAA，其结构如下：

(SEQ ID NO：1)，其中m至少为1，n至少为1。在优选实施方案中，m和n的总和是大约10到30，优选为大约10。

在通式1的MAA中，氨基酸部分Xaa1是0到1个氨基酸残基，其中该氨基酸残基是Lys-R4。

在通式1的MAA中，R1部分是0到2个氨基酸残基，其中该氨基酸残基可以是Gly或Cys，或是核酸序列，例如带有刺激性的CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(ODN)。在优选实施方案中，R1是二肽Cys-Gly。当第一个MAA的N-端氨基酸是Cys残基时，它优选与通式1中的第二个MAA N-端的第二个Cys残基共价连接。第一和第二个半胱氨酸残基之间的二硫键产生了通式1中的共价连接的MAA二聚体。可以预料，二聚体的肽在Lys-Gly重复单元的数量(即m和n的数量)、Xaa1、R2、R3、R4或R5上可以相同，也可以不同。

在通式1的MAA中，R2、R3和R4可以互相独立的是B细胞决定簇、T细胞决定簇或定向分子。在优选实施方案中，在通式1的MAA中存在至少一个B细胞决定簇和一个T细胞决定簇。例如，本发明的单体MAA可以含有5个B细胞决定簇，两个T细胞决定簇和两个定向分子侧链。此外，本发明的单体MAA可以含有例如8个B细胞决定簇、一个T细胞决定簇和一个定向分子侧链。它们的组合没有特别的限制，可以随着选定的B细胞决定簇、T细胞决定簇或定向分子而改变。此外，在一个Lys-Gly重复单元中的R基团，由m和n标明，也可以改变。例如，如果m＝3，第一个Lys-Gly重复单元的R2可以是B细胞决定簇，第二个Lys-Gly重复单元的R2可以是T细胞决定簇，以及第三个Lys-Gly重复单元的R2可以是定向分子。

在本文中使用的B细胞决定簇，在优选情况下引发可测量的B细胞反应，例如通过针对产生的天然病毒蛋白的抗体来确定.可以用于通式1的MAA中的B细胞决定簇包括那些在本领域内已知的以及任何其它的抗原，例如可以引发B细胞反应的聚糖、多肽或核酸.在一个实施方案中，抗原来自有包膜病毒或无包膜病毒.在另一个实施方案中，抗原所来自的病毒包括但不限于腺病毒科、砂粒病毒科(例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉病毒科(例如马动脉炎病毒)、星状病毒科(人类星状病毒1)、双RNA病毒科(例如传染性胰腺坏死病毒、传染性囊病病毒)、布尼亚病毒科(例如加利福尼亚脑炎病毒属)、杯状病毒科(例如杯状病毒)、冠状病毒科(例如人类冠状病毒299E和OC43)、delta病毒科(例如肝炎delta病毒)、线状病毒科(例如马尔堡病毒、埃博拉霍乱病毒)、黄病毒科(例如黄热病病毒属、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如EB病毒、单纯疱疹病毒、Varicellovirus、细胞肥大病毒、玫瑰疹病毒(Roseolovirus)、淋巴滤泡病毒、猴病毒(Rhadinovirus)、正粘液病毒科(例如A、B、C型流感病毒)、乳多空病毒科(例如乳头瘤病毒)、副粘液病毒科(诸如人类副流感病毒1等的副粘液病毒、诸如麻疹病毒等的麻疹病毒、诸如流行性腮腺炎病毒等的Rubulavirus、诸如人类呼吸道合胞病毒等的肺炎病毒(Pneumovirus)、微小RNA病毒科(诸如鼻病毒1A等的鼻病毒、诸如人类甲肝病毒等的肝病毒、人类脊髓灰质炎病毒、诸如脑心肌炎病毒等的心病毒、诸如口蹄疫病毒O等的口疮病毒(Aphthovirus)、科赛奇病毒)、痘病毒科(诸如天花病毒等的正痘病毒)、呼吸道肠道病毒科(例如，诸如A-F族轮状病毒等的轮状病毒)、反转录病毒科(诸如人类免疫缺陷病毒1和2等的灵长目慢病毒属)、杆状病毒科(例如狂犬病病毒)和披膜病毒科(例如，诸如风疹病毒等的Rubivirus)的病毒.

可以用于通式1的MAA中的示例性B细胞决定簇包括但不限于M2e及其类似物。在一个优选实施方案中，通式1的MAA中的B细胞决定簇是来自A型流感病毒的M2e。在另一个实施方案中，B细胞决定簇来自于象B型流感病毒的NB或C型流感病毒的CM2这样的病毒跨膜蛋白的胞外结构域。

T细胞决定簇意思是包括了Th和细胞毒性T细胞的决定簇。T细胞反应的引发可以通过例如本文示例的方法或通过测量产生的细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5或IL-10而检测。可以用于通式1的MAA中的示例性T细胞决定簇包括但不限于，血细胞凝集素T细胞决定簇和限于人类II类MHC蛋白的T细胞决定簇，优选限于广范围的单倍型的T细胞决定簇。

与抗原共价连接的定向分子作为R2、R3或R4部分一般是能够将抗原输送到所需位点的糖、脂类、肽或寡聚核苷酸。可以被包含在本发明的MAAs中的定向分子包括但不限于霍乱毒素、带有刺激性CpG基序的ODNs、以及内源的人类免疫调节因子，例如IL-2、IL-12和GM-CSF。

通式1的MAA中的R5部分没有特别的限制，可以是任何氨基酸(例如β-连接的丙氨酸)、肽或核酸序列，例如带有刺激性CpG基序的ODN。

当核酸序列被包含在通式1中时，该核酸序列可以通过隔离或连接分子例如羟基-羧酸来连接。

通式1的MAA可以按照本文示例的方法或任何其它合适的化学合成肽和肽结合物的方法来制备。

本文提供的例子公开了通式1的MAA的各种不同衍生物，用于在小鼠中诱导免疫反应，其目的是为了说明，而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优点和修饰对于本发明所属的领域的技术人员来说是显而易见的。

M2e-MAAs通过鼻内途径以50μl的剂量给药麻醉的小鼠。初次接种物和加强接种物包含3μg MAA、3μg硫代磷酸酯化的寡聚脱氧核苷酸(ODN)1826和0.5μg霍乱毒素(CT)的磷酸盐缓冲液，以4到5周的间隔给药。单独或与感染性病毒一同通过鼻内接种ODN和CT的小鼠被分别用作阴性和阳性对照。在后者的情况下，第一次感染使用PR8，第二次感染使用PR8-SEQ14，PR8-SEQ14是PR8的变体，在被保护性单克隆抗体识别的血细胞凝集素决定簇中有14个氨基酸的取代，并可以在PR-8免疫的小鼠中容易地诱导感染。

在加强后10到30天，来自纵隔淋巴结(MedLNs)的细胞被测试它们对游离的S1肽、血细胞凝集素和M2e作出反应而增殖的能力。来自导流上呼吸道的脾脏和淋巴结的细胞给出较小的反应，没有进行进一步研究。M2e-MAA免疫的小鼠的反应总是超过用佐剂引发的对照小鼠的反应。数据组中只有两个在统计基础上超出了对照小鼠的反应(成对t试验，p≥0.05)。然而，作为一个整体，M2e-MAA免疫的小鼠表现出明显比对照小鼠高的S1-和血细胞凝集素特异性的反应(非成对t试验，p≤0.05)。M2e-MAA免疫的小鼠的血细胞凝集素特异性反应在大小上与一个感染免疫的小鼠相同，但是在细节特征上有所不同，其中在M2e-MAA免疫的小鼠中检测到了S1-特异性的Th，但是在感染免疫的小鼠中没有检测到。甘露糖基化的MAA在体内诱导S1-特异性的Th反应方面并不优于非甘露糖基化的MAA，这显然与它在体外较大的刺激潜力相反。此外，M2e-MAA免疫的小鼠而不是感染免疫的小鼠含有M2e特异性增殖T细胞，表明M2e本身含有至少一个H2d限制性的Th决定簇。

没有证据表明M2e-MAAs诱导了I类MHC限制性的细胞毒性记忆T细胞(Tc)反应，这与在M2e中缺少特征性的Kd限制性、Dd限制性或Ld限制性基序一致(Engelhard(1994)Curr.Opin.Immunol.6：13-23；Corr等，(1993)J.Exp.Med.178：1877-92)。记忆性Tc在感染免疫的小鼠中可以容易地检测。

M2e特异性的血清抗体滴度通过在固相免疫吸附剂(1)M2e-MAA和JAP-MDCK细胞单层上通过ELISA进行测量。每个分析被标准化并通过同时滴定纯化的M2e特异性单克隆抗体14C2而定量，测试样品中抗体的滴度被定义为每毫升血清的M2e特异性抗体的当量微克数。

来自四个独立的免疫实验的组合数据提供了不同免疫实验的成组滴度的平均值和SEM，这些实验中小鼠在引发后2周和4周、第二次免疫后2周和4-5周，以及第三次免疫后2周和5周被抽血。数据表明(4)M2e-MAA比(1)M2e-MAA诱导了更迅速和更强烈的反应，甘露糖的存在导致抗体反应的进一步减少。这在用(1)M2e-MAA和JAP-MDCK细胞测量的抗体滴度中都适用。用(4)M2e-MAA进行的免疫总是在第二次免疫后2周诱导明显的抗体滴度，有时早在初次免疫后4周就诱导了强烈的反应(在4个独立的实验中，在第一次免疫后4周的平均滴度是1.0、2.0、4.6和1035μg/ml)。(2)M2e-MAA仅仅包含在两个实验中，诱导的反应介于(4)M2e-MAA和(1)M2e-MAA之间。这个发现表明M2e多聚体的呈递通过促进M2e特异性B细胞上膜Ig的交联增强了B细胞反应(Bachmann和Zinkernagel(1997)Annu.Rev.Immunol.15：235-70)。

数据进一步表明来自M2e-MAA免疫的小鼠的血清对M2e-MAA总是表现出比对JAP-MDCK细胞更高的滴度。血清中M2e-MAA反应性抗体与JAP-MDCK反应性抗体的比率平均是10，在个体的血清中范围为从2到31。这表明M2e-MAA免疫后抗体反应的特异性在每个小鼠中是不同的，平均大约10％的M2e-MAA特异性抗体与感染细胞上病毒诱导的M2e发生交叉反应。剩余的抗体可能针对Th决定簇、支架肽、合成的M2e肽上病毒诱导的M2四聚体所不具备的决定簇、或是这些结构的组合。

针对M2e-MAA的ELISA还表明来自病毒感染的小鼠的血清中含有非常低的M2e特异性抗体滴度.针对JAP-MDCK的ELISA检测到针对许多病毒蛋白的抗体，因而不能用于在感染免疫的小鼠中定量M2特异性反应.唯一的例外是一组通过3次连续的感染已被免疫的小鼠，首先用PR8，第二次用JAP，第三次用X31，表现出大约30μg/ml的M2e-MAA特异性滴度，这与在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中观察到的病毒M2e特异性抗体滴度(对JAP-MDCK)在同样的范围内.数据表明(4)M2e-MAA在诱导M2e特异性抗体反应方面比病毒感染更有效.

M2e特异性免疫效应子在用两次连续的感染免疫的小鼠中几乎是不存在的。考虑到M2在被感染细胞的质膜中是高密度表达的(Lamb等，(1985)同上；Zebedee和Lamb(1988)同上)，以及在全呼吸道感染的过程中有大量的上皮细胞被感染(Yilma等，(1979)J.Inf.Disease139：458-64)，这种情况是令人吃惊的。这个发现表明异源亚型保护的强度可以通过伴随诱导由感染和M2e特异性接种诱导的效应子而增强。

在第二次免疫后4到5周，小鼠用X31攻击，3天后测定鼻、气管和肺组织中的病毒滴度。用含有单个M2e、带有或不带甘露糖的MAAs免疫的小鼠与只用佐剂引发的小鼠相比，对鼻和肺组织中病毒的复制没有表现出明显的抗性(ns，斯氏t试验得到的p＞0.01)，但是显示出气管中病毒的复制减少。相反，用(4)M2e-MAA免疫的小鼠显示出在呼吸道的所有部分减少了病毒的生长。与感染免疫的小鼠相比，在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中的抗性强度在鼻和气管组织中是相同的，但是在肺组织中强度较低。

为了与病毒滴度建立相关性测试了小鼠个体中M2e特异性血清抗体的滴度。在(4)M2e-MAA免疫的小鼠中抗体滴度与鼻和肺的病毒滴度反向相关，但是与气管中的病毒滴度不是(鼻和肺的相关系数R2分别为0.53和0.51，p<0.001)。但是，相关性的主要部分是由于单个一只远离中心的小鼠，它在每毫升血清中含有大约90μg抗M2e抗体。将它排除后抗体和病毒滴度的相关性在鼻中减少到了不显著的值，但是在肺中，相关性仍显著(R20.41，p＝0.002)。在气管中和由感染免疫的小鼠中M2e特异性抗体和病毒滴度之间没有观察到相关性。

在这些结果的基础上，本发明的另一个方面提供了使用MAAs作为治疗和预防剂以治疗或预防病毒感染。一般来说，这包括以适当的形式将有效剂量的一种或多种本发明的MAAs给药易感对象或表现出病毒感染的信号或症状的对象。

正如专业技术人员将会意识到的那样，为通式1的MAA选择B细胞决定簇将依赖于将要预防或治疗的病毒感染.例如为了预防或治疗流感病毒感染，通式1的MAA的B细胞决定簇应该来自流感病毒(例如M2e).在使用同源的B细胞决定簇时，预计通式1的MAA将能够有效产生针对有包膜或无包膜病毒的免疫反应，这些病毒包括但不限于腺病毒科、砂粒病毒科(例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉病毒科(例如马动脉炎病毒)、星状病毒科(人类星状病毒1)、双RNA病毒科(例如传染性胰腺坏死病毒、传染性囊病病毒)、布尼亚病毒科(例如加利福尼亚脑炎病毒属)、杯状病毒科(例如杯状病毒)、冠状病毒科(例如人类冠状病毒299E和OC43)、delta病毒科(例如肝炎delta病毒)、线状病毒科(例如马尔堡病毒、埃博拉霍乱病毒)、黄病毒科(例如黄热病病毒属、丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(例如Epstein-Bar病毒、单纯疱疹病毒、Varicellovirus、细胞肥大病毒、玫瑰疹病毒、淋巴滤泡病毒、猴病毒)、正粘液病毒科(例如A、B、C型流感病毒)、乳多空病毒科(例如乳头瘤病毒)、副粘液病毒科(例如人类副流感病毒1这样的副粘液病毒、麻疹病毒这样的麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒这样的Rubulavirus、人类呼吸道合胞病毒这样的Pneumovirus)、微小RNA病毒科(例如人鼻病毒1A这样的鼻病毒、人类甲肝病毒这样的肝病毒、人类脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒这样的心病毒、口蹄疫病毒O这样的Aphthovirus、科赛奇病毒)、痘病毒科(例如天花病毒这样的正痘病毒)、呼吸道肠道病毒科(例如A-F族轮状病毒这样的轮状病毒)、反转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒1和2这样的灵长目慢病毒属)、棒状病毒科(例如狂犬病病毒)和披膜病毒科(例如风疹病毒这样的Rubivirus)的病毒.

对具有病毒感染的个体的治疗包括鉴定表现出病毒感染的信号或症状的对象，然后给该对象给药有效剂量的本发明通式1的MAA。病毒感染的信号或症状一般依赖于具体的病毒，这对于专业临床医生来说是熟知的。例如，病毒感染的典型症状包括但不限于高烧、严重的疼痛、头痛和咽喉痛。用于治疗病毒感染的MAAs可以作为混合物例如以相同的量混合使用或给药，或者分别地按顺序提供，或者马上全部给药，并可以以足够使病毒感染的信号或症状减轻的剂量通过口服、局部或肠胃外的方式给药。此外，本发明的MAAs可以与其它已知的抗原、疫苗或佐剂共同给药。

同样地，针对病毒感染的预防性或保护性主动免疫包括将一种或多种MAAs作为疫苗组分给药。接种可以以口服、局部或肠胃外的方式进行，使用能够使接受的对象产生针对目的病毒的保护性免疫以阻止病毒感染的信号或症状的足够的剂量。如果MAA的剂量、给药途径等足够影响阻止病毒感染的信号或症状这样的反应，这个剂量就被称为足够阻止病毒感染的信号或症状。对MAA给药的反应可以通过分析对象的重要信号来测量。

适合于给药的MAA组合物是能够使接受的对象耐受的组合物。这样的MAA组合物可以按照现有的生产制剂来制备，其中的MAAs与可药用的载体组合成混合物。可药用的载体例如在Remington的《药物科学和实践》，Alfonso R.Gennaro主编，第20版，Lippingcott Williams&Wilkins出版社，Philadelphia，PA，2000中提供了。为了形成适合给药的MAA组合物，这样的组合物将包含有效剂量的MAAs，以及适当量的载体、赋形剂或稳定剂，它们在使用的剂量和浓度下对于它们所接触的细胞或哺乳动物是无毒性的。一般来说，制剂将含有MAA，终浓度在0.2μg/ml到2mg/ml的范围内，优选为5μg/ml到500μg/ml，最优选为大约100μg/ml。通常载体是一种pH缓冲的水溶液。可药用的载体的例子包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)的多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的平衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)和

MAAs、或含有本发明的MAA的组合物或制剂还可以含有佐剂以增强对象对抗原的T细胞反应。这样的佐剂的例子包括但不限于白蛋白盐、不完全弗氏佐剂、胞壁酰二肽的苏氨酰和正丁基衍生物、胞壁酰三肽的亲脂性衍生物、单磷酰脂A、3’-脱氧-乙酰化单磷酰脂A、霍乱毒素、带有CpG基序的硫代磷酸酯化的寡聚脱氧核苷酸、以及例如在美国专利No.6558670中公开的那些佐剂。

MAAs、或含有本文公开的MAA的组合物或制剂的给药可以通过任何适当的方式实施，包括肠胃外的注射(例如腹膜内、皮下或肌肉内注射)、口服、或将MAAs(一般携带于药物制剂中)局部使用于导气管的表面.将MAAs局部使用于导气管的表面可以通过鼻内给药来进行(例如通过使用滴管、拭子或吸入器将药物组合物沉积到鼻内).将MAAs局部使用于导气管的表面也可以通过吸入给药来进行，例如通过将含有MAAs的药物组合物的可呼吸的微粒(包括固相微粒和液相微粒)制成气溶胶悬液，然后使对象吸入可呼吸的微粒.用药物组合物的可呼吸微粒进行给药的方法和装置是众所周知的，任何常规的技术都可以使用.

口服给药可以以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的方式进行，含有10％到95％的活性成分，优选为25％到70％。用于口服给药对象的胶囊、片剂和丸剂可以提供有肠衣，包括例如甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、醋酸纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟基丙基甲基纤维素。

本发明的组合物可以以与剂型相容的方式给药，其剂量将是预防和/或治疗有效的。给药的剂量一般在每剂5μg到250μg MAA的范围内，依赖于被治疗的对象、对象的免疫系统合成抗体的能力以及所需的保护程度。优选的范围是从每剂大约15μg到大约50μg。

合适的剂量大小是大约0.5ml。因此，例如用于肌肉内注射的剂量将为0.5ml，其中含有20μg MAA，与0.5％的佐剂混合。

准确的剂量将由有经验的开业医生根据与需要治疗的对象有关的因素来确定。剂量和给药方式被调整以提供足够水平的活性MAA或维持所需的预防或减轻病毒信号或症状的效力、或减轻病毒感染的严重性。可能需要考虑的因素包括疾病状态的严重性、对象的整体健康状况、对象的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物的组合、反应灵敏性和对治疗的耐受性/反应。

组合物可以以单剂的方式提供，也可以以多剂的方式提供。多剂的方式是在最初的给药过程中使用1-10剂，随后在维持或加强免疫反应所需的时间间隔使用其它剂量，例如在1到4个月内使用第二剂，如果需要，在几个月后使用后续剂量。服药方案也将至少部分由个体的需要所确定，并依赖于开业医生的判断。

本发明将在下面的非限制性的实施例中进行更详细的描述。

实施例1：多抗原因子结构(MAAs)的合成

利用现有的方法(Kragol和Otvos(2001)Tetrahedron 57：957-66)，通过3个准正交的可移除氨基保护基团的组合，固相合成了多价的甘露糖基化的(1)M2e-Man-MAA，结构如下：

(SEQ ID NO：2)以及非甘露糖基化的肽结构(1)M2e-MAA，结构如下：

(SEQ ID NO：3)和(2)M2e-MAA，结构如下：

(SEQ ID NO：4)。二硫键连接的八聚体肽结构(4)M2e-MAA的结构如下：

(SEQ ID NO：5)带有4个拷贝的M2e以及辅助性T细胞决定簇S1和S2各2个拷贝，它是通过带有游离巯基的半胱氨酸衍生物在溶液中形成分子间二硫键而制成的(Kragol等，(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11：1417-20)。组成为

Cys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-β-Ala

(SEQ ID NO：6)的Cys骨架和组成为

(SEQ ID NO：7)的Cys-M2e的肽结构是在连续流动的自动肽合成仪Miligen 9050上使用常规的Fmoc化学来装配的(Fields和Noble(1990)Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214)。在这些结构中，S1是Ser-Phe-Glu-Arg-Phe-Glu-Ile-Phe-Pro-Lys-Glu(SEQ ID NO：8)，S2是His-Asn-Thr-Asn-Gly-Val-Thr-Ala-Ala-Ser-Ser-His-Glu(SEQ ID NO：9)，以及M2e是Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro(SEQ ID NO：10)。使用起始装载量为0.3mmol/g的Fmoc TentaGel S RAM树脂(Advanced Chem Tech，Louisville，KY)。对于链的延伸，4摩尔过量的氨基酸在原位用HATU活化。偶联的时间从1到2.5小时，这由肽参考算法(peptide companionalgorithm)(Windowchem，Fairfield，CA)所预测的偶联难度所决定。在合成Cys骨架的肽结构中，半胱氨酸N-端的氨基基团用Boc基团保护，而赖氨酸的侧链氨基基团带有Aloc保护。通过催化脱氢选择性地移除Aloc基团，然后同时进行两个24-聚体的M2e肽的肽链装配，给出了完全保护的肽结构Cys-M2e。在存在5％thioanisol和5％水的情况下使用三氟乙酸将肽从树脂上切下，然后用PR-HPLC纯化。肽的纯度通过RP-HPLC和MALDI质谱来确认。

肽-DNA嵌合体使用两种方法之一来制备。一种方法包括使用传统的Fmoc化学和适当的羟基羧酸连接子将肽或核酸片段共合成(Soukchareun等，(1995)Bioconjugate Chemistry 6：43-53)。第二种方法包括使用含有巯基(thiol)的双功能偶联试剂来进行化学连接(Soukchareun等，(1998)Bioconjugate Chemistry 9：466-475；Stetsenko和Gait(2000)J.Org.Chem.65：4900-4908).

实施例2：培养基和溶液

ISC-CM的组成为Iscove’s Dulbecco’s培养基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，添加有0.05mM 2-巯基乙醇、0.005mg/ml转铁蛋白(Sigma，St.Louis，MO)、2mM谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)和0.05mg/ml庆大霉素(Mediatech，Herndon，VA)。当指明时，ISC-CM中还进一步添加有胎牛血清(FCS)(HyClone Laboratories，Logan，UT)或牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)。pH7.2的磷酸盐缓冲液中添加有3mM NaN3(PBSN)。

实施例3：病毒

PR8(A/PR/8/34(H1N1))是适应小鼠的病毒株。PR8-SEQ14是在存在14个不同的PR8(HA)特异性单克隆抗体的情况下从PR8通过连续筛选获得的野化突变株。X31是重排病毒，含有除了编码H3和N2的基因以外所有来自PR8的基因，它们来自(A/Aichi/68(H3N2))(Kilbourne(1969)Bull.WHO 41：643-5)。JAP是(A/Japan/305/57(H2N2))，B/LEE是B型流感病毒株B/Lee/40。

实施例4：M2e特异性杂交瘤的产生

三个M2e特异性杂交瘤(M2-56、M2-80、M2-86)来自己用两次连续的感染攻击的BALB/c小鼠，第一次用PR8，第二次用X31。在融合前3天，给小鼠通过静脉内注射5μg(4)M2e-MAA的PBS，将脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合。两个杂交瘤(M2-1、M2-15)来自于已经从三次连续的异源亚型感染(第一次用PR8、第二次用X31、第三次用JAP)中恢复、并用5μg(4)M2e-MAA与3μg硫代磷酸酯化的寡聚脱氧核苷酸(ODN)c1826和0.5μg霍乱毒素(CT)一起通过鼻内加强的小鼠。三天后将来自导流淋巴结(颈浅动脉和纵隔淋巴结)的细胞融合。从杂交培养液中筛选能够在ELISA中与(1)M2e-MAA和/或JAP感染的Madin Darby犬肾(MDCK)细胞反应的抗体的分泌。通过这些步骤产生的所有M2e特异性杂交瘤都与M2e-MAA和JAP感染的MDCK细胞发生交叉反应。杂交瘤14C2在本领域内是众所周知的(Zebedee和Lamb(1988)同上)。

实施例5：通过ELISA测量抗体

Costar血清簇的圆底聚乙烯板的孔用(1)M2e-MAA包被，这是通过用25μl浓度为0.5μg/ml的(1)M2e-MAA的PBSN在室温保温过夜(盖上以避免蒸发)来进行的。在分析前板用含有1％BSA的PBSN封闭1到2小时。JAP-MDCK ELISA板的制备如下：MDCK细胞在Falcon的平底96孔聚苯乙烯微量试验tc板中生长至汇合成片，这通常是通过在每个孔中，接种4×104MDCK细胞的100μl含有5％FCS的ISC-CM来进行的。在保温(37℃，6％CO2)一天后，用PBS清洗单层细胞以除去血清成分，再与50μl含有大约106TCID50的JAP病毒的ISC-CM保温(37℃)以进行感染.1小时后，在每个孔中加入100μl含有5％FCS的ISC-CM，如上述继续保温6到7小时.然后用PBS清洗单层细胞，用5％缓冲的Formalde-Fresh(FisherChemical，Pittsburgh，PA)在室温保温5分钟进行固定，用PBSN清洗，并用含有1％BSA的PBSN在4℃封闭和储存.在ELISA中，所有的测试样品和试剂都用含有1％BSA的PBSN稀释，每个圆底孔使用25μl，每个平底孔使用50μl，在室温保温90分钟.结合的小鼠抗体一般使用生物素化的大鼠抗小鼠Cκ单克隆抗体187.1、然后用链亲和素标记的AP(Sigma，St.Louis，MO)和pNPP(Sigma，St.Louis，MO)来检测.pNPP溶液在每个圆底和平底孔中分别使用50μl和100μl.一般在保温30-45分钟后，使用读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量光吸收，OD405和OD750之间的差(OD405-750)被记录下来。所有的分析中都包括了对具有适当特异性的纯化的单克隆抗体的滴定，以便对测试样品进行定量。ELISA数据用软件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行分析。

实施例6：CD4+T细胞反应的分析

抗原呈递细胞(APC)从首次用于实验的BALB/c小鼠的脾脏制备。PERCOLLTM(Uppsala，Sweden)被添加到细胞悬浮液中至终浓度为33％。悬浮液用少量体积的70％PERCOLLTM覆盖，离心(10分钟，600g，室温)以除去细胞碎片和红细胞。处于33％/70％界面的细胞被收获、清洗、辐射照射(2200拉德)，以5×106细胞/ml的浓度悬浮于ISC-CM中。在平底的组织培养板的每个孔中加入100μl。每个孔中以50μl体积加入抗原的ISC-CM。在每个孔中加入50μl反应细胞悬浮液，这一般是107/ml MedLN细胞或4×105/ml Th克隆的ISC-CM。在保温的第三天(Th克隆)或第四天(LN反应细胞)加入1μCi H3标记的胸苷。然后将板冻融一次，细胞用Skatron细胞收集器(Skatron Instruments Inc.，Sterling，VA)在滤层(Skatron Instruments Inc.，Sterling，VA)上收集。用打孔机打下的滤层片转移到闪烁液中计数以测定放射活性。

实施例7：CD8+记忆性T细胞反应的分析

来自免疫接种小鼠的脾脏细胞象在33％/70％PERCOLLTM梯度中那样纯化，并用作反应细胞。A20细胞(H2d，II类MHC阳性)用PR8感染(106TCID50/106A20，37℃，1小时)，用4400拉德进行辐射照射，清洗，并用作刺激细胞。培养物(6ml)提供在T25Falcon瓶中，包括25×106反应细胞和106刺激细胞的含有5％FCS的ISC-CM。在培养(静置，向上)5天后，活细胞在33％/70％PERCOLLTM梯度中纯化，计数，在4小时的保温期间使用标准的方法(Mozdzanowska等，(1997)Virology 239：217-25)测试它们诱导从PR8和B/Lee感染的P1.HTR靶细胞中释放51Cr的能力。

实施例8：免疫方案

M2e-MAAs和佐剂，总体积为50μl，被放置在麻醉小鼠的鼻孔上(氯胺酮和甲苯噻嗪分别以每公斤体重70mg和7mg的量腹膜内注射)，使其被吸入到呼吸道内。每剂为50μl，含有3μgM2e-MAA、3μg ODN1826(Krieg等，(1995)Nature 374：546-9；Yi等，(1998)J.Immunol.160：4755-61)和0.5μg CT(Sigma，St.Louis，MO)。佐剂的组成和服药基于标准的方法(Mozdzanowska等，(1999)，同上)。以4到5周的间隔给药加强接种。接受不含M2e-MAA的佐剂溶液的小鼠被用作阴性对照，而已进行两次连续的呼吸道感染、第一次用PR8和第二次用PR8-SEQ14的小鼠被用作阳性对照。

实施例9：病毒攻击实验

疫苗诱导的保护的强度通过用大约103MID50(50％小鼠感染剂量)的X31鼻内攻击小鼠来测试。三天后，将小鼠麻醉，通过心脏穿刺放血，解剖以收集鼻、气管和肺组织。感染性病毒的滴度通过在MDCK细胞培养液中或含胚的鸡蛋中使用标准的方法(McCluskie和Davis(2000)同上)滴定组织匀浆液来测定。

实施例10：针对MAAs的免疫反应的体外分析

为了诱导针对天然病毒M2e的Th依赖性抗体反应，M2e-MAAs带有与天然病毒诱导的M2e相同的B细胞决定簇，并含有能够呈递到Th细胞的决定簇.在ELISA中比较了JAP-MDCK细胞和M2e-MAAs与几种M2e特异性单克隆抗体的反应.14C2单克隆抗体从用纯化的病毒M2免疫的小鼠中产生(Zebedee和Lamb(1988)同上)，所有其它的抗体是从连续的A型流感病毒感染中恢复、并在融合前三天用(4)M2E-MAA加强的小鼠中分离.最后用(4)M2e-MAA加强是为了增加M2e特异性杂交瘤的分离频率.所有6种M2e特异性的单克隆抗体与M2e-MAA和JAP-MDCK反应都很好，尽管其中有4个与JAP-MDCK结合比与用1.5ng/孔的(1)M2e-MAA包被的孔的结合稍微有效一些，而另外2个结合稍微低一些.这些数据表明M2e-MAAs有效地模拟了几个天然的病毒诱导的四聚体M2e的B细胞决定簇.

结构上有所不同的M2e-MAAs，当使用与M2e相同的摩尔浓度时，在与M2e特异性单克隆抗体反应时没有明显的不同。

为了最适化Th介导的帮助，两个不同的Th决定簇被整合到MAAs中，一个(S1)被Ed呈递，另一个(S2)被Ad呈递。这两个决定簇被鉴定为BALB/c(H-2d)小鼠HA(PR8)特异性Th反应的两个免疫显性靶(Gerhard等，(1991)J.Virol.65：364-72)。S1对应于HA的110-120区域，S2对应于126-138区域。但是，现在结构中的S2肽与天然的S2相比发生了改变，135位的半胱氨酸被丝氨酸所取代，以避免在S2和包含在M2e肽中的半胱氨酸之间形成二硫键。

MAAs刺激S1和S2特异性Th克隆的效力在含有被辐射的BALB/c脾细胞作为APCs、S1或S2特异性Th克隆作为反应细胞、以及不同浓度的游离S1或S2肽、M2e-MAAs或纯化的HA的培养物中测定。Th克隆的增殖通过在培养的第三天掺入的3H标记的胸苷的量来评估。所有的M2e-MAAs都刺激S1特异性Th克隆V2.1，与游离的S1肽相比能力相当或更高。甘露糖基化的MAA被观察到了高100倍的刺激能力，这很可能是由于在APCs上表达的甘露糖受体提高了该MAA的捕获(Engering等，(1997)Eur.J.Immunol.27：2417-2；Tan等，(199)Eur.J.Immunol.27：2426-35)。该MAA的刺激活性在摩尔的基础上与也含有甘露糖基化的糖侧链的HA分子的活性相同(Keil等，(1985)EMBO J.4：2711-20)。

相反，没有MAAs刺激了S2特异性的Th克隆5.1-5R6。该Th克隆对分离的天然S2肽和完整的HA的刺激反应良好，因此135位的半胱氨酸改变为丝氨酸可能减小了它对该Th克隆的刺激能力。另外两个不相干克隆的S2特异性Th克隆被测验，也不能对MAAs发生反应。因为135位的半胱氨酸改变为丝氨酸不影响肽结合Ad的能力(Sette等，(1989)J.Immunol.142：35-40)，它可能形成了抗原性为新的Th决定簇，该决定簇不能被特异于天然S2决定簇的Th所识别。S2/Ad复合物的晶体结构分析表明135位的氨基酸不是锚定残基(Scott等，(1998)Immunity 8：319-29)。

因此，体外分析表明M2e-MAAs模拟了天然病毒诱导的M2e的B细胞决定簇，并且含有至少一个功能性的Th决定簇。

导言

本发明是在国立过敏反应和传染病研究所资助的研究过程中完成的(NIAID资助号AI-46457和AI-13989)。美国政府可在本发明中拥有一定权利。

序列表

<110>威斯特研究所(THE WISTAR INSTITUTE)

预防或治疗病毒感染的组合物和方法

<120>(COMPOSITION AND METHOD FOR PREVENTING OR

TREATING A VIRUS INFECTION)

<130>SCT052929-47

<150>US 60/441,374

<151>2003-01-16

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>N-terminal amino group has attached R1 which is 0 to 2 amino

acid residues，wherein said amino acid residue may be a Gly or Cys，

or a nucleic acid sequence.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Side chain amino group has attached R2 which is a B cell

determinant，a T cell determinant，or a targeting molecule.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Side chain amino group has attached R3which is a B cell

determinant，a T cell determinant，or a targeting molecule.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>″Xaa″represents 0 to 1 amino acid residue of Lys-R4，wherein R4

is a B cell determinant，a T cell determinant，or a targeting molecule.

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>C-terminus has attached R5 group which is an amino acid，

peptide，or nucleic acid sequence.

<400>1

Lys Gly Lys Gly Xaa

1               5

<210>2

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Mannosylated residue

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Mannosylated serine residue attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>S2 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>S1 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<400>2

Ser Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala

1               5                   10

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Serine attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Serine attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>S2 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>S1 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<400>3

Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala

1               5                   10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Serine residue attached to side chain

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>S2 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>S1peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<400>4

Ser Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala

1               5                   10

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Dimer created by disulfide linkage

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>S2 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>S1 peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>M2e peptide attached to side chain amino group

<400>5

Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Ala

1               5                   10

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<400>6

Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Ala

1               5

<210>7

<211>8

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic multiple antigenic agent

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>M2e petide attached to side chain amino group

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>M2e petide attached to side chain amino group

<400>7

Cys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Ala

1               5

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic S1 peptide

<400>8

Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu

1               5                   10

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic S2 peptide

<400>9

His Asn Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Ser Ser His Glu

1               5                   10

<210>10

<211>24

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic M2e peptide

<400>10

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

1               5                   10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Pro

            20