急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
阅读：30发布：2023-03-09
专利汇可以提供急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且当急性 肝炎 发展为爆发性肝炎时， 肝细胞 急剧且大量被破坏，结果 预后 极不良。因此，应尽早预知从急性肝炎发展为爆发性肝炎的情况，并迅速采取适宜处理尤为重要。但是，虽然近年来随着检查方法或者诊断技术的发展已经可预知肝炎爆发性化，但仍无合适的爆发性肝炎 预防 、 治疗 剂。本 发明 的课题是提供 副作用 少的急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂。含有载脂蛋白A-II的药物组合物解决了上述课题。，下面是急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂专利的具体信息内容。
技术领域
【0001】本发明涉及含有载脂蛋白A-II作为有效成分的急性肝 炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂。
背景技术
【0002】肝脏在合成身体必需物质、排泄废物等生命活动中担 任重要角色。具有上述作用的肝细胞被病毒、酒精、药物等破坏时导 致的肝脏发炎、肝功能下降的疾病即为肝炎。
肝炎的症状表现为全身乏力，食欲不振，呕吐，发热，黄疸等。 将肝炎发生6个月之内表现出症状的特称为急性肝炎。将呈现急性肝 炎症状后8周以内基于高度肝细胞功能障碍而引发肝昏迷II级以上的 脑症、凝血酶原时间40％以下的情况称为爆发性肝炎。
在爆发性肝炎中，肝细胞被急剧且大量破坏，导致肝细胞来不及 增殖、再生，预后极不良。所以应尽早预知从急性肝炎发展为爆发性 肝炎的情况，以便尽早开始适宜处理。
【0003】据称，日本每年患急性肝炎的患者人数达35万，其中 发展为爆发性肝炎的患者人数是每年数千人。
爆发性肝炎的发病机理被认为是伴随机体免疫应答，且与肝局部 的各种因素密切相关，但对其全局的认识尚有诸多不明确之处。
【0004】为了预知从急性肝炎发展为爆发性肝炎的情况，有必 要注意患者的主观症状及肝功能检查中的各种异常值。
一般情况下，从急性肝炎发展为爆发性肝炎的过程依以下顺序发 生：由肝细胞急剧破坏导致肝合成功能下降，肝解毒代谢功能随继下 降。肝细胞大量且急剧破坏会呈现出强烈的全身乏力、食欲不振等主 观症状，并伴随丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶 (AST)等氨基转移酶水平和LDH(乳酸脱氢酶)水平的升高而引发 黄疸的症状。另外，随着肝解毒代谢功能下降而出现肝昏迷I或II级 神经症状，所以诊断时进行脑波检查也是重要的。最近也有有关预测、 诊断爆发性肝炎等肝炎的病情的诊断试剂盒和诊断标记的报道(专利 文献1)。受益于发现症状、检查结果、诊断技术的不断发展、如今 也有可能以相当高的准确率预知从急性肝炎到爆发性肝炎的发展。
【0005】急性肝炎的治疗以静养为基本，随着病情发展而实施 甘草皂苷等保肝剂的对症疗法。作为急性肝炎或爆发性肝炎的治疗剂， 有人提议使用含有丙氨酸、谷胱甘肽、鸟氨酸中至少一种的制剂(专 利文献2)、含有血小板活性因子拮抗剂的制剂(专利文献3)含有胰 岛素样生长因子或其衍生物的制剂(专利文献4)等，但均非十分有 效、尚未达到实用化。
爆发性肝炎的治疗方法有：血浆交换、输血、血液透析及其他的 治疗方法。最近还有人尝试肝移植，但预后不良，存活率为约30％。 又当病毒为病原时，也有人正在尝试用干扰素疗法作为抗病毒疗法， 但这种疗法会带来发烧、关节痛、肌痛、白血球和血小板数减少，食 欲降低、体重下降、脱发、甲状腺功能异常、心肌障碍、糖尿病恶化、 蛋白尿等副作用，故也非十分有效。
专利文献1：特开2008-17777号公报
专利文献2：特开平5-221858号公报
专利文献3：特开平7-304689号公报
专利文献4：特开平9-143094号公报
肝炎的症状表现为全身乏力，食欲不振，呕吐，发热，黄疸等。 将肝炎发生6个月之内表现出症状的特称为急性肝炎。将呈现急性肝 炎症状后8周以内基于高度肝细胞功能障碍而引发肝昏迷II级以上的 脑症、凝血酶原时间40％以下的情况称为爆发性肝炎。
在爆发性肝炎中，肝细胞被急剧且大量破坏，导致肝细胞来不及 增殖、再生，预后极不良。所以应尽早预知从急性肝炎发展为爆发性 肝炎的情况，以便尽早开始适宜处理。
【0003】据称，日本每年患急性肝炎的患者人数达35万，其中 发展为爆发性肝炎的患者人数是每年数千人。
爆发性肝炎的发病机理被认为是伴随机体免疫应答，且与肝局部 的各种因素密切相关，但对其全局的认识尚有诸多不明确之处。
【0004】为了预知从急性肝炎发展为爆发性肝炎的情况，有必 要注意患者的主观症状及肝功能检查中的各种异常值。
一般情况下，从急性肝炎发展为爆发性肝炎的过程依以下顺序发 生：由肝细胞急剧破坏导致肝合成功能下降，肝解毒代谢功能随继下 降。肝细胞大量且急剧破坏会呈现出强烈的全身乏力、食欲不振等主 观症状，并伴随丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶 (AST)等氨基转移酶水平和LDH(乳酸脱氢酶)水平的升高而引发 黄疸的症状。另外，随着肝解毒代谢功能下降而出现肝昏迷I或II级 神经症状，所以诊断时进行脑波检查也是重要的。最近也有有关预测、 诊断爆发性肝炎等肝炎的病情的诊断试剂盒和诊断标记的报道(专利 文献1)。受益于发现症状、检查结果、诊断技术的不断发展、如今 也有可能以相当高的准确率预知从急性肝炎到爆发性肝炎的发展。
【0005】急性肝炎的治疗以静养为基本，随着病情发展而实施 甘草皂苷等保肝剂的对症疗法。作为急性肝炎或爆发性肝炎的治疗剂， 有人提议使用含有丙氨酸、谷胱甘肽、鸟氨酸中至少一种的制剂(专 利文献2)、含有血小板活性因子拮抗剂的制剂(专利文献3)含有胰 岛素样生长因子或其衍生物的制剂(专利文献4)等，但均非十分有 效、尚未达到实用化。
爆发性肝炎的治疗方法有：血浆交换、输血、血液透析及其他的 治疗方法。最近还有人尝试肝移植，但预后不良，存活率为约30％。 又当病毒为病原时，也有人正在尝试用干扰素疗法作为抗病毒疗法， 但这种疗法会带来发烧、关节痛、肌痛、白血球和血小板数减少，食 欲降低、体重下降、脱发、甲状腺功能异常、心肌障碍、糖尿病恶化、 蛋白尿等副作用，故也非十分有效。
专利文献1：特开2008-17777号公报
专利文献2：特开平5-221858号公报
专利文献3：特开平7-304689号公报
专利文献4：特开平9-143094号公报
发明内容
拟解决的技术课题
【0006】根据以上情况，非常希望开发出具有以下效果的急性 肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂：通过预知从急性肝炎至爆发 性肝炎的发展而早期开始治疗而防止爆发性化、且即便在爆发性化发 生后也有治疗效果，并且副作用少。
解决课题的技术方案
【0007】本发明人在研究作为血液中的高密度脂蛋白HDL(高 密度脂蛋白)成分的载脂蛋白A-II对机体的作用时偶然发现，所述载 脂蛋白A-II对治疗急性肝炎，预防、治疗爆发性肝炎有效，且也观察 不到副作用。并基于此进行更多研究而完成了本发明。
即，本发明是含有载脂蛋白A-II作为有效成分的急性肝炎治疗剂 或爆发性肝炎预防、治疗剂。
【0008】作为本发明的有效成分的载脂蛋白A-II是高密度脂蛋白 HDL的主要成分。HDL的化学组成的约50重量％是蛋白，其余约50 重量％是以磷脂和胆固醇为主的脂类成分。HDL的蛋白成分中载脂蛋白 A-II的含量仅次于载脂蛋白A-I，其占蛋白成分全体的约20重量％。
已知载脂蛋白A-II的化学结构，其为由77个氨基酸构成的分子 量约为8700的多肽。已知血液中的HDL为在第六个残基半胱氨酸处 以二硫键结合的二聚体结构(The Lipid Vol.2，No.3243-249，1991-4)。
有体外实验报道载脂蛋白A-II的生理作用，如通过将载脂蛋白 A-II取代为载脂蛋白A-I，可活化肝脂肪酶、抑制LCAT(卵磷脂-胆 固醇-酰基转移酶，Lecithin-cholesterol acyltransferase)的活性，载 脂蛋白A-II抑制由凝血因子Vlla的凝血因子V的活化，但尚未明确 其体内作用。
而且，有报道称高脂血症患者的血中载脂蛋白A-II的浓度呈现升 高的趋势，而肝病(例如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等)患 者的血中载脂蛋白A-II的浓度呈现下降的趋势(临床病理 XXIX：2，135～138(1981))。但也仅记载了肝炎患者的载脂蛋白A-II 减少的事实，而未记载向患肝病(尤其是具有患急性肝炎和爆发性肝 炎可能性的患者)施用载脂蛋白A-II可预防或治疗肝炎。
【0009】可通过常规蛋白分离提纯方法从人血浆分离到作为本 发明的有效成分的载脂蛋白A-II，也可使用利用生物的基因重组技术 生产所述载脂蛋白A-II。例如，特开昭63-237789号公报记载了可通 过培养转入了编码载脂蛋白A-II基因的表达载体的大肠杆菌、枯草杆 菌、放线菌等原核细胞生物及酵母等真核生物细胞来制备作为本发明 的有效成分的载脂蛋白A-II。
载脂蛋白A-II只要是具有预防、治疗急性肝炎或爆发性肝炎的效 果的即可，可使用在动物体内的或由动物细胞生产出的载脂蛋白A-II， 也可使用通过基因重组技术使载脂蛋白A-II的结构的一部分缺失、将 结构中的氨基酸取代为其他氨基酸或经修饰的变体，及其糖链经修饰 或缺失的类似物。对于纯度而言，只要是经纯化而在例如还原凝胶电 泳中呈现单一条带的程度即可，无需限定纯化方法或原材料。
【0010】载脂蛋白A-II的具有代表性的制法有，从人血浆或其 衍生物中分离纯化的方法(例如Analytical Biochemistry 178，301-305 (1989))以及利用基因重组技术制备的方法等。人血浆的衍生物是 例如将人血浆用科恩低温乙醇分级分离法得到的沉淀级分IV-1或用 Kistler and Nitschmann法通过低温乙醇分级分离法得到的沉淀级分 B等。
【0011】用人血浆或血浆级分衍生物制备出载脂蛋白A-II的具 体方法有例如以下方法。
首先将含有载脂蛋白A-II的人血浆或人血浆级分衍生物在低温 (例如10℃以下)溶于缓冲液。然后加入例如乙醇/氯仿溶液进行混合， 离心，将下层的脂类成分去除，回收上清蛋白成分。向回收的上清中 添加乙醇，进行离心，将沉淀下来的高分子蛋白去除，回收上清。再 向回收的上清中添加乙醇进行离心，去除沉淀下来的载脂蛋白A-1， 回收含有载脂蛋白A-II的上清。用氯化钠溶液超滤处理含有载脂蛋白 A-II的上清，以去除乙醇。然后再用磷酸缓冲液进行超滤处理后浓缩 至合适浓度。对于脱脂不充分的经纯化载脂蛋白A-II，则通过加入乙 醇/氯仿溶液进行混合，离心而去除下层的脂类成分。上清载脂蛋白 A-II用如上所述的方法进行超滤而去除乙醇，并浓缩至合适浓度。通 过这些操作得到了经纯化的载脂蛋白A-II。
【0012】制备载脂蛋白A-II的另一优选例为利用基因重组技术 的方法。
根据基因重组技术制备载脂蛋白A-II时，首先从DNA文库中得 到编码人载脂蛋白A-II基因的cDNA，用合适的引物扩增所述基因而 得到编码载脂蛋白A-II的多核苷酸。将所述多核苷酸插入克隆载体中 进行克隆后，切出编码载脂蛋白A-II的多核苷酸，并根据本领域公知 的方法将其插入合适的表达载体内。用所述表达载体转化合适的宿主 细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞，或酵母、昆虫细胞、哺 乳动物细胞等真核细胞)，并从所述经转化细胞的培养物中分离纯化 所述载脂蛋白A-II。
优选的宿主细胞有短芽孢杆菌(Bacillus brevis)等细菌类、裂殖 酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母菌。
【0013】当根据基因重组技术由杆菌等微生物进行生产时，用 具有可在微生物中复制的复制原点、启动子、核糖体结合位点、DNA 克隆位点、终止子等的表达载体制成重组了编码载脂蛋白A-II的多核 苷酸的表达载体。可通过用所述表达载体转化宿主细胞后进行培养而 得到的转化体，并从培养物中分离、纯化目的蛋白来得到载脂蛋白 A-II。其中，当向任意的翻译区域前后附加起始密码子和终止密码子 时，可得到含任意区域的蛋白片段。另外，还可作为与其他蛋白的融 合蛋白进行表达。可通过将该融合蛋白用合适的蛋白酶切断来得到重 组的载脂蛋白A-II。
【0014】含有载脂蛋白A-II的制剂可有水溶液、悬浊剂、冻干 剂等，可通过适宜混合药学上可接受的添加剂(稀释剂、pH调节剂、 等渗剂、表面活性剂等)，根据制剂制备中的常规手法将这些制成制 剂。另外，冻干剂在使用时用注射用蒸馏水等溶解液溶解。
【0015】用真核细胞生产重组载脂蛋白A-II时，将编码载脂蛋 白A-II的多核苷酸插入具有启动子、剪接区域、多聚(A)附加位点 等的真核细胞用表达载体来制成重组载体，将所述载体导入真核细胞 内，并从其培养物中分离、纯化目的蛋白即可。其中所述真核细胞一 般使用猴肾细胞COS7、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细 胞，出芽酵母、分裂酵母、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但只要是能 表达重组载脂蛋白A-II的真核细胞均可。将表达载体导入真核细胞的 方法可使用公知的电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE右旋糖酐 法等。
【0016】将重组的载脂蛋白A-II在原核细胞和真核细胞内表达 后，为从培养物中分离纯化目的蛋白，可使用公知的分离操作组合。 例如用尿素等变性剂和表面活性剂进行处理、超声波处理、酶消化、 盐析和溶剂沉淀法、透析、离心、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等 电点电泳、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、逆相层析法 等。
【0017】此外，在宿主细胞内表达的蛋白在经翻译后可在细胞 内经各种修饰。因此，本发明中使用的重组载脂蛋白A-II也包括经N 末端甲硫氨酸脱离、N末端乙酰化、糖链附加、被细胞内蛋白酶的限 制性分解、十四酰化、异戊烯化、磷酸化等翻译后修饰的蛋白。
【0018】这样得到的载脂蛋白A-II中不含有残留杂质。又可与 药学上可接受的媒质均匀混合而制成制剂。其中所述媒质可根据药剂 的施用形态从宽范围内适宜选择。可根据需要将盐、氨基酸、有机酸、 糖醇、白蛋白等蛋白与多元醇等合适的稳定剂共保存。
【0019】本发明的制剂的施用途径非特限于经口和非经口，但 优选静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等非经口施用，其中 静脉注射尤佳。作为注射剂，可根据常规方法将一定量的经纯化载脂 蛋白A-II在无菌条件下与注射用蒸馏水混合即可，此时优选适量配合 缓冲剂、等渗剂、稳定剂等。作为具体例，优选使用磷酸钠、柠檬酸 钠、氯化钠、L-谷氨酸等。
【0020】作为本发明涉及的急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预 防、治疗剂的施用量，可根据对象施用充分发挥效果的量，可根据剂 型、施用方法、每天施用次数、症状程度、体重、年龄等适宜增减。 在对成年人静脉注射的情况下，载脂蛋白A-II通常为约1～ 1000mg/kg，优选约3～500mg/kg。可将所述量分成每天1～3次施用。
发明效果
【0021】本发明涉及的急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治 疗剂以载脂蛋白A-II作为有效成分，无副作用或副作用甚微，安全且 可有效治疗急性肝炎或预防、治疗爆发性肝炎。
实施方式
【0022】以下通过例举实施例及实验例来具体说明本发明。
实施例
实施例1
【0023】含有载脂蛋白A-II的制剂的配制
将基本去除肝炎病毒和其他病原微生物的人血浆作为原料，用人 血浆科恩低温乙醇分级分离法得到IV-1级分。将1.2kg所述级分IV-1 在2～8℃的低温室中溶于含100mM三(羟甲基)氨基甲烷和6M尿 素的，pH被调至7.8～8.2的2.4L溶液中。然后再加入与溶解液等量 的乙醇/氯仿溶液(1∶1)进行混合，在4℃下、以12000g、离心10分 钟，回收上清蛋白成分。向回收的3.4L上清中添加4.1L(1.2倍的量) 乙醇，在4℃下、12000g、离心10分钟，回收上清6.8L。又向回收的 上清中添加5.4L(0.8倍的量)的乙醇，在4℃下、12000g、离心10 分钟，回收含有载脂蛋白A-II的上清12L。对于含有载脂蛋白A-II 的上清，则用截留分子量为10000的超滤膜(Pole公司制造)，通过 注入120L的150mM氯化钠溶液进行超滤，以去除乙醇。接着注入含 有20L 150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7)进行超滤，以置 换溶液。然后，通过超滤将载脂蛋白A-II浓缩至4mg/ml。
接着，向500ml载脂蛋白A-II浓缩液加入等量的乙醇/氯仿(1∶ 1)溶液进行混合，在4℃下、12000g、离心10分钟，去除下层，回 收上清750ml。将上清用截留分子量为10000的超滤膜(Millipore公 司制造)，通过注入25L 150mM氯化钠溶液进行超滤，以去除乙醇。 接着注入20L含有150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7)进行 超滤，以置换溶液。然后进行浓缩至含有22mg/ml载脂蛋白A-II。随 后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器(Millipore公司制造)进行无菌 过滤，得到载脂蛋白A-II制剂。
对载脂蛋白A-II制剂的分析结果示于表1。
【0024】【表1】
载脂蛋白含量(mg/ml) 21.5 pH 7.3 渗透压比 1.0 内毒素含量(EU/ml) 0.2 磷脂含量(mg/ml) 0.6 性状 呈淡黄色的澄清液 乙醇浓度(％) 0.01
可将通过上述方法制得的制剂直接作为注射液使用。
实施例2
【0025】(1)基因重组人载脂蛋白A-II表达载体的构建
将人肝脏cDNA文库(宝生物公司制造，商品代码9505)作为模 板，通过PCR法克隆人载脂蛋白A-II基因。其中将序列表中SEQ ID NO：1所示序列作为正向引物，以序列表中SEQ ID NO：2所示序列 作为反向引物。将得到的PCR片段用TOPO TA克隆试剂盒 (Invitrogen公司制造)根据TA克隆法克隆于pCR2.1载体 (Invitrogen公司制造)中。
(2)用短芽孢杆菌(Bacillus brevis)制备人载脂蛋白A-II表达 株
通过用含有所得人载脂蛋白A-II基因的载体转化短芽孢杆菌 (Bacillus brevis)来构建表达株。构建表达株的方法根据专利公报第 3734593号记载的方法进行。
首先根据所述专利实施例1的方法构建质粒载体，然后构建插入 了人载脂蛋白A-II基因的质粒载体。然后，根据所述专利实例5所述 方法，用电穿孔法转化短芽孢杆菌H102(FERM BP-1087)。
(3)将所述转化体在TMN培养基中，于30℃下培养3天后，离 心培养液分离上清，得到培养上清。
为了证实所得人载脂蛋白A-II的氨基酸序列，用3100型DNA测 序仪(ABI公司制造)分析pCR2.1载体的碱基序列，当将其转变为 氨基酸时，得到序列表中SEQ ID NO：3所示序列。
此氨基酸序列是与记载于Swiss-Prot Protein Knowledgebase的 人载脂蛋白A-II(初次登录号为P02652)的成熟蛋白部分相同的序列。
实施例3
【0026】由基因重组人载脂蛋白A-II的表达株(短芽孢杆菌) 的培养上清配制含有载脂蛋白A-II的制剂
将表达、分泌人载脂蛋白A-II的短芽孢杆菌的培养上清和含有 1M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH6.6～7.0)等量混合，搅拌后， 使其通过0.45μm过滤器(Millipore公司制造)以去除沉淀。将此滤 液装载于预先用含有0.5M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4) 平衡的His trap FF(GE Healthcare公司制造)上。然后用与进行平 衡时相同的溶液进行洗涤，随后再用含有0.5M氯化钠和40mM咪唑 的20mM磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)洗涤。最后用含有0.5M氯化钠 和500mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)洗脱吸附于His trap FF上的级分。将吸附于His trap FF上的级分的洗脱液用截留分子量 10000的离心超滤膜(Millipore公司制造)通过注入含有150mM氯 化钠的20mM磷酸缓冲液进行超滤，以置换液体。再进行超滤浓缩， 使浓缩至含13mg/ml载脂蛋白A-II。接着用孔径0.22μm的无菌过滤 器(Millipore公司制造)进行无菌过滤，作为载脂蛋白A-II制剂。
实施例4
【0027】同实施例3一样实施His trap FF，将得到的洗脱液组 分用截留分子量5000的离心超滤膜(Millipore公司制造)通过注入 含有3M尿素及0.5M氯化钠的3.3mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4)进 行超滤，以置换液体。将所述含有人载脂蛋白A-II的级分装载于预先 用含有3M尿素及0.5M氯化钠的3.3mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4) 平衡的40μm的I型Macro-prep羟基磷灰石陶瓷(BioRad公司制造) 上，回收未吸附的级分。
然后将此未吸附的级分用截留分子量5000的离心超滤膜 (Millipore公司制造)，通过注入含有150mM氯化钠的20mM磷酸 缓冲液进行超滤，以置换液体。再进行超滤浓缩，使浓缩至含2mg/ml 载脂蛋白A-II。接着用孔径0.22μm的无菌过滤器(Millipore公司制 造)进行无菌过滤，作为载脂蛋白A-II制剂。
实施例5
【0028】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)
将实施例1和实施例4中得到的载脂蛋白A-II制剂的浓度调节至 在OD280nm处的吸光度相同。将本样品作为非还原样品。另外，将 本样品用30mg/ml的DTT(和光纯药公司制造)处理，作为还原样品。 将非还原样品和还原样品在15％的均匀SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行 电泳。其结果示于图1。
【0029】蛋白印迹法
将实施例1和实施例4中得到的载脂蛋白A-II制剂的浓缩调节至 在OD280nm处的吸光度相同。将本样品经SDS-PAGE后，将凝胶上 的蛋白转移到PVDF膜(ATTO公司制造)上，并用山羊抗人载脂蛋 白A-II多克隆抗体(SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY公司制造) 进行第一次反应。然后用经HRP标记的兔抗山羊免疫球蛋白抗体 (DAKO公司制造)进行第二次反应，并通过DAB法显色，其结果 示于图2。
【0030】如图1和图2所示，经SDS-PAGE染色的蛋白——实施 例1的制剂和实施例4的制剂均与抗人载脂蛋白A-II抗体反应，从而 证实二者具有相同的抗原性。而且，在还原电泳图中显示为单一条带。
而且，当比较图1和图2中实施例1的制剂和实施例4的制剂的 条带时，实施例4的制剂的条带位置显示其分子量稍大。这是由于在 重组体中附加了His-Tag的分子量(6个组氨酸残基)所致。
实施例6
【0031】为比较在实施例1和实施例4中制备的制剂，通过制 作肽图进行了检验。
向20μl各制剂经稀释至载脂蛋白A-II为200μg/ml的经配制溶液 中各添加4μl样品缓冲液(350mM Tris-HCl、pH6.8、30％甘油、10％ SDS、0.3％BPB、30％2-巯基乙醇)，在100℃下处理5分钟后进行 SDS-PAGE，并进行CBB染色(PhastGel Blue R，Amersham Biosciences公司制造)。
用电泳后凝胶上10kDa附近的条带全量如下进行凝胶内消化。
用刀将凝胶切成约1mm×1mm，并在1ml纯水中搅拌、洗涤(20 分钟×2次)。然后在50μl含有7M胍及10mM EDTA的0.5M Tris-HCl 缓冲液(pH8.5)中搅拌、洗涤(30分钟)后，再于含1ml 50％的乙 腈及1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH7.8)中搅拌、洗涤(20 分钟×2次)。再于1ml乙腈中搅拌、洗涤(5分钟)后，在干燥袋(ス ピ一ドバツク)内干燥凝胶。向经干燥的凝胶中添加10μl溶于含有 2mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH7.8)的内切蛋白酶Glu-C(V8) (酶∶底物＝1∶1)中。在冰上静置1小时，使凝胶膨胀润湿后，加入20～ 60μl含有2mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH7.8)浸透凝胶，并 在25℃下消化24小时。消化后，在干燥袋内浓缩至全量50μl以下。
向经浓缩的样品中加入0.1％三氟乙酸至达到55μl，并用其中的 50μl在以下条件下进行HPLC分析。
HPLC条件
装置：LC-10Avp系统(岛津制作所制造)
柱：218TP54(4.6mmI.D.×25cm、Vydac公司制造)
柱温度：40℃
流速：1ml/分钟
检测波长：215nm
移动相A：0.1％三氟乙酸
移动相B：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度条件：0/0→0/5→75/55→100/65→100/75→0/85→0/90(％B/ 分钟)
实施例1的肽图结果示于图3，实施例4的肽图结果示于图4。实 施例1及实施例4中配制的制剂，除His-tag部分之外，表现出相同 的肽图，从而证实实施例1和实施例4的制剂相同。
实施例7
【0032】基因重组人载脂蛋白A-II表达载体的构建及利用酵母 制备载脂蛋白A-II的表达株
人工合成了人载脂蛋白A-II基因。其碱基序列如配列表中SEQ ID NO：4所示。
将得到的人载脂蛋白A-II基因插入表达载体pTI1M5(東田英毅、 酵素工学ニユ一ス、第57号、2007年4月)的多克隆位点中，从而 构建了诱导型表达用载体。根据岡崎等(Okazaki et al.，″Nucleic Acids Res.″，18，6485-6489，1990)的方法用此诱导型表达用载体和亮氨酸营养 缺陷型互补载体pAL7转化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) ATCC38399而构建表达株。将所述表达株用5ml含有G418的液体培 养基YELG10(0.5％细菌用酵母提取物、3％葡萄糖、10μg/ml G418) 在32℃下培养7天。将所述培养物在5ml YPDG100(1％细菌用酵母 提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、10μg/ml G418)中于32℃下 培养7天后，再通过离心将菌体和上清分离，回收菌体。将菌体样品 悬浮于0.8ml菌体破碎缓冲液(50mM Tris-HCL、pH7.5、0.1M氯化 钠、蛋白酶抑制剂(Roche公司制造))中，加入等容量的玻璃珠， 用破碎机破碎4次，从而配制成菌体破碎液。将此菌体破碎液离心， 回收含有载脂蛋白A-II的上清。载脂蛋白A-II的表达量为2mg/L。
实施例8
【0033】由基因重组人载脂蛋白A-II的表达株(裂殖酵母)培 养菌体制备载脂蛋白A-II制剂
将实施例7中制备的表达株于300ml YPDG100培养基(1％酵母 提取物，2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.1mg/ml G418)中培养。用3个小 型发酵罐，在30℃下培养66小时，得到总量14.4g(湿重)的菌体。 将从每个小型发酵罐中回收的菌体悬浮于16～17ml破碎缓冲液 (50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1M氯化钠、蛋白酶抑制剂(Roche公 司制造))中，再补入所述破碎缓冲液至配制成20ml的菌体悬浮液。 接着，向配制的20ml各菌体悬浊液中加入同等容量的玻璃珠(直径 0.5mm)，并用破碎机破碎4次(以2500rpm破碎60秒钟)，回收 菌体破碎液13ml。将残留的附着于玻璃珠上的破碎菌体用5ml破碎缓 冲液洗涤，将此洗涤液并入先前的菌体破碎液中。将其以5000g离心 10分钟，取上清。载脂蛋白A-II的表达量为2mg/L。
将配制的上清用下述2种His-Tag柱进行纯化。首先将54ml上清 装载于20ml的TALON单步骤柱(Clontech公司制造)上，用2ml 含有500mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。将此洗脱液用DW稀释3 倍后，装载于0.6ml的His Spin Trap柱(GE Healthcare公司制造) 上，用2ml含有500mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。
然后，将洗脱液用0.5ml的高速离心过滤柱VIVA SPIN500 (Sartorius公司制造)进行浓缩，并进行PBS缓冲液交换(pH7.5)， 从而得到含有载脂蛋白A-II的制剂。
实施例9
【0034】动物实验1
准备22只实验用7周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例1中配制的载脂蛋白A-II以4mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他8只(对照组)共计16只小鼠腹膜内一次施用作 为爆发性肝炎引发剂的700mg/kg半乳糖胺盐酸盐(Sigma公司制造) 和50μg/kg脂多糖(大肠杆菌0111：B4，Sigma公司制造)。另外，将 既未施用载脂蛋白A-II，也未施用爆发性肝炎引发剂的6只小鼠作为 正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂6小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组发症和相对于对照组 的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表2。
【0035】【表2】
实施例1的A-II (4mg/kg)施用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1053±455＊ 2896±862## 51±4 AST(IU/L) 339±99＊ 698±189## 73±5
＊：对于对照组P＜0.05
##：对于正常组P＜0.01
如表2所示，相比正常组，对照组血中的ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例10
【0036】动物实验2
准备18只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例3中配制的载脂蛋白A-II以3mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他6只(对照组)共计14只小鼠以15μg/kg的剂量 静脉内一次施用作为爆发性肝炎引发剂的IV型伴刀豆球蛋白A (Sigma公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未施 用伴刀豆球蛋白A的4只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂8小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表3。
【0037】【表3】
实施例3的A-II (3mg/kg)施用 组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 785±377＊ 3388±1156# 33±2 AST(IU/L) 668±234＊ 2450±750# 64±2
＊：对于对照组P＜0.05
#：对于正常组P＜0.05
如表3所示，相比正常组，对照组血中的ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II施用组中显著被抑制。 根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效果。 A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的副作 用。
实施例11
【0038】动物实验3
准备18只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例3中配制的载脂蛋白A-II以13mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他6只(对照组)共计14只小鼠以15μg/kg的剂量 静脉内施用一次作为爆发性肝炎引发剂的IV型伴刀豆球蛋白A (Sigma公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未施 用爆发性肝炎引发剂的4只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂8小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表4。
【0039】【表4】
实施例3的A-II (13mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 214±33＊ 3388±1156# 33±2 AST(IU/L) 332±28＊ 2450±750# 64±2
＊：对于对照组P＜0.05
#：对于正常组P＜0.05
如表4所示，相比正常组，对照组的血中ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例12
【0040】动物实验4
准备16只实验用8周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例1中配制的载脂蛋白A-II以300mg/kg的剂量静 脉内一次施用给其中的4只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的4只与其他6只(对照组)共计10只小鼠以200μg/kg的剂 量静脉内施用一次作为爆发性肝炎引发剂的抗Fas抗体(Becton Dickinson公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未 施用抗Fas抗体的6只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂4小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表5。
【0041】【表5】
实施例1的A-II (13mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1433±687＊＊ 2199±3389## 58±7 AST(IU/L) 769±226＊＊ 5567±878## 59±3
＊＊：对于对照组P＜0.01
##：对于正常组P＜0.01
如表5所示，相比正常组，对照组的血中ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例13
【0042】动物实验5
准备32只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg 的剂量静脉内一次施用给其中的21只小鼠，从而制备出不采取任何处 理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向10只肝障碍模型小鼠施 用伴刀豆球蛋白A1小时后，以100mg/kg的剂量静脉内一次施用了 实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的11只小鼠 未施用载脂蛋白A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的11只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表6。
【0043】【表6】
实施例1的A-II (100mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 2387±635＊ 6582±1598## 33±2 AST(IU/L) 1854±406＊ 4202±968## 58±2
＊对于对照组P＜0.05
##对于正常组P＜0.01
如表6所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例14
【0044】动物实验6
准备32只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg 的剂量静脉内一次施用给其中的21只小鼠，从而制备出不采取任何处 理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向10只肝障碍模型小鼠施 用伴刀豆球蛋白A1小时后，以500mg/kg的剂量静脉内一次施用了 实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的11只小鼠 未施用载脂蛋白A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的11只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表7。
【0045】【表7】
实施例1的A-II (500mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1473±865＊＊ 6582±1598## 33±2 AST(IU/L) 1257±615＊ 4202±968## 58±2
＊：对于对照组P＜0.05
＊＊：对于对照组P＜001
##：对于正常组P＜001
如表7所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例15
【0046】动物实验7
作为实验动物，使用了24只7周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以 15mg/kg剂量静脉内一次施用给其中的16只小鼠中，从而制备出不采 取任何处理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向8只所述肝障 碍模型小鼠施用伴刀豆球蛋白A1小时后，以500mg/kg的剂量静脉 内一次施用实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的 8只小鼠未施用A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的8只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表8。
【0047】【表8】
实施例1的A-II (500mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1055±281＊＊ 4185±736## 55±4 AST(IU/L) 936±198＊＊ 2831±421## 129±13
＊＊：对于对照组P＜0.01
##：对于正常组P＜0.01
如表8所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在实施例1的载脂蛋白A-II施 用组中显著被抑制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II对爆发性肝炎具 有预防效果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂 会出现的副作用。
工业实用性
【0048】近年来，在日本出现急性肝炎发展为爆发性肝炎的病 症增多的趋势。但是根据患者的主观症状、医生细心注意的诊断，医 疗机关可预知患者的爆发性肝炎化，并通过在合适的时期施用本发明 急性肝炎治疗剂、爆发性肝炎预防、治疗剂来治愈急性肝炎，并提前 防止向爆发性肝炎的发展。另外，即使例如已发生爆发性肝炎的症状， 但仍可通过施用本发明的药剂来缓解所述症状。
附图简述
【0049】
【图1】示SDS-PAGE电泳图。图中，左端的数字表示分子量 (kDa)。
(1)是分子量标记、(2)是实施例1的制剂(非还原)、(3) 是实施例4的制剂(非还原)、(4)是实施例1的制剂(还原)、(5) 是实施例4的制剂(还原)、(6)是分子量标记。
【图2】示蛋白印迹法电泳图。(1)是实施例1的制剂(非还原)、 (2)是实施例4的制剂(非还原)、(3)是实施例1的制剂(还原)、 (4)是实施例4的制剂(还原)。
【图3】示实施例1的制剂(源于血浆的载脂蛋白A-II)的肽图。
【图4】示实施例4的制剂(基因重组的载脂蛋白A-II)的肽图。 在17分钟附近检测出His-Tag相关峰值。
序列表
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
caggcaaagg agccatgtgt gg 22
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcactgggtg gcaggctgtg 20
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>3
<211>77
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
20 25 30
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu
50 55 60
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr Gln
65 70 75 77
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>4
<211>255
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atgcaagcca aggagccctg cgtcgagtcc cttgtctccc aatacttcca aaccgtcacc 60
gactacggta aggaccttat ggagaaggtc aagtcccccg agcttcaagc cgaggccaag 120
tcctacttcg agaagtccaa ggagcaactt acccccctta tcaagaaggc cggtactgag 180
cttgtcaact tcctttccta cttcgtcgag cttggtactc aacccgccac ccaacaccac 240
caccaccacc actga 255
【0006】根据以上情况，非常希望开发出具有以下效果的急性 肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂：通过预知从急性肝炎至爆发 性肝炎的发展而早期开始治疗而防止爆发性化、且即便在爆发性化发 生后也有治疗效果，并且副作用少。
解决课题的技术方案
【0007】本发明人在研究作为血液中的高密度脂蛋白HDL(高 密度脂蛋白)成分的载脂蛋白A-II对机体的作用时偶然发现，所述载 脂蛋白A-II对治疗急性肝炎，预防、治疗爆发性肝炎有效，且也观察 不到副作用。并基于此进行更多研究而完成了本发明。
即，本发明是含有载脂蛋白A-II作为有效成分的急性肝炎治疗剂 或爆发性肝炎预防、治疗剂。
【0008】作为本发明的有效成分的载脂蛋白A-II是高密度脂蛋白 HDL的主要成分。HDL的化学组成的约50重量％是蛋白，其余约50 重量％是以磷脂和胆固醇为主的脂类成分。HDL的蛋白成分中载脂蛋白 A-II的含量仅次于载脂蛋白A-I，其占蛋白成分全体的约20重量％。
已知载脂蛋白A-II的化学结构，其为由77个氨基酸构成的分子 量约为8700的多肽。已知血液中的HDL为在第六个残基半胱氨酸处 以二硫键结合的二聚体结构(The Lipid Vol.2，No.3243-249，1991-4)。
有体外实验报道载脂蛋白A-II的生理作用，如通过将载脂蛋白 A-II取代为载脂蛋白A-I，可活化肝脂肪酶、抑制LCAT(卵磷脂-胆 固醇-酰基转移酶，Lecithin-cholesterol acyltransferase)的活性，载 脂蛋白A-II抑制由凝血因子Vlla的凝血因子V的活化，但尚未明确 其体内作用。
而且，有报道称高脂血症患者的血中载脂蛋白A-II的浓度呈现升 高的趋势，而肝病(例如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等)患 者的血中载脂蛋白A-II的浓度呈现下降的趋势(临床病理 XXIX：2，135～138(1981))。但也仅记载了肝炎患者的载脂蛋白A-II 减少的事实，而未记载向患肝病(尤其是具有患急性肝炎和爆发性肝 炎可能性的患者)施用载脂蛋白A-II可预防或治疗肝炎。
【0009】可通过常规蛋白分离提纯方法从人血浆分离到作为本 发明的有效成分的载脂蛋白A-II，也可使用利用生物的基因重组技术 生产所述载脂蛋白A-II。例如，特开昭63-237789号公报记载了可通 过培养转入了编码载脂蛋白A-II基因的表达载体的大肠杆菌、枯草杆 菌、放线菌等原核细胞生物及酵母等真核生物细胞来制备作为本发明 的有效成分的载脂蛋白A-II。
载脂蛋白A-II只要是具有预防、治疗急性肝炎或爆发性肝炎的效 果的即可，可使用在动物体内的或由动物细胞生产出的载脂蛋白A-II， 也可使用通过基因重组技术使载脂蛋白A-II的结构的一部分缺失、将 结构中的氨基酸取代为其他氨基酸或经修饰的变体，及其糖链经修饰 或缺失的类似物。对于纯度而言，只要是经纯化而在例如还原凝胶电 泳中呈现单一条带的程度即可，无需限定纯化方法或原材料。
【0010】载脂蛋白A-II的具有代表性的制法有，从人血浆或其 衍生物中分离纯化的方法(例如Analytical Biochemistry 178，301-305 (1989))以及利用基因重组技术制备的方法等。人血浆的衍生物是 例如将人血浆用科恩低温乙醇分级分离法得到的沉淀级分IV-1或用 Kistler and Nitschmann法通过低温乙醇分级分离法得到的沉淀级分 B等。
【0011】用人血浆或血浆级分衍生物制备出载脂蛋白A-II的具 体方法有例如以下方法。
首先将含有载脂蛋白A-II的人血浆或人血浆级分衍生物在低温 (例如10℃以下)溶于缓冲液。然后加入例如乙醇/氯仿溶液进行混合， 离心，将下层的脂类成分去除，回收上清蛋白成分。向回收的上清中 添加乙醇，进行离心，将沉淀下来的高分子蛋白去除，回收上清。再 向回收的上清中添加乙醇进行离心，去除沉淀下来的载脂蛋白A-1， 回收含有载脂蛋白A-II的上清。用氯化钠溶液超滤处理含有载脂蛋白 A-II的上清，以去除乙醇。然后再用磷酸缓冲液进行超滤处理后浓缩 至合适浓度。对于脱脂不充分的经纯化载脂蛋白A-II，则通过加入乙 醇/氯仿溶液进行混合，离心而去除下层的脂类成分。上清载脂蛋白 A-II用如上所述的方法进行超滤而去除乙醇，并浓缩至合适浓度。通 过这些操作得到了经纯化的载脂蛋白A-II。
【0012】制备载脂蛋白A-II的另一优选例为利用基因重组技术 的方法。
根据基因重组技术制备载脂蛋白A-II时，首先从DNA文库中得 到编码人载脂蛋白A-II基因的cDNA，用合适的引物扩增所述基因而 得到编码载脂蛋白A-II的多核苷酸。将所述多核苷酸插入克隆载体中 进行克隆后，切出编码载脂蛋白A-II的多核苷酸，并根据本领域公知 的方法将其插入合适的表达载体内。用所述表达载体转化合适的宿主 细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞，或酵母、昆虫细胞、哺 乳动物细胞等真核细胞)，并从所述经转化细胞的培养物中分离纯化 所述载脂蛋白A-II。
优选的宿主细胞有短芽孢杆菌(Bacillus brevis)等细菌类、裂殖 酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母菌。
【0013】当根据基因重组技术由杆菌等微生物进行生产时，用 具有可在微生物中复制的复制原点、启动子、核糖体结合位点、DNA 克隆位点、终止子等的表达载体制成重组了编码载脂蛋白A-II的多核 苷酸的表达载体。可通过用所述表达载体转化宿主细胞后进行培养而 得到的转化体，并从培养物中分离、纯化目的蛋白来得到载脂蛋白 A-II。其中，当向任意的翻译区域前后附加起始密码子和终止密码子 时，可得到含任意区域的蛋白片段。另外，还可作为与其他蛋白的融 合蛋白进行表达。可通过将该融合蛋白用合适的蛋白酶切断来得到重 组的载脂蛋白A-II。
【0014】含有载脂蛋白A-II的制剂可有水溶液、悬浊剂、冻干 剂等，可通过适宜混合药学上可接受的添加剂(稀释剂、pH调节剂、 等渗剂、表面活性剂等)，根据制剂制备中的常规手法将这些制成制 剂。另外，冻干剂在使用时用注射用蒸馏水等溶解液溶解。
【0015】用真核细胞生产重组载脂蛋白A-II时，将编码载脂蛋 白A-II的多核苷酸插入具有启动子、剪接区域、多聚(A)附加位点 等的真核细胞用表达载体来制成重组载体，将所述载体导入真核细胞 内，并从其培养物中分离、纯化目的蛋白即可。其中所述真核细胞一 般使用猴肾细胞COS7、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细 胞，出芽酵母、分裂酵母、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但只要是能 表达重组载脂蛋白A-II的真核细胞均可。将表达载体导入真核细胞的 方法可使用公知的电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE右旋糖酐 法等。
【0016】将重组的载脂蛋白A-II在原核细胞和真核细胞内表达 后，为从培养物中分离纯化目的蛋白，可使用公知的分离操作组合。 例如用尿素等变性剂和表面活性剂进行处理、超声波处理、酶消化、 盐析和溶剂沉淀法、透析、离心、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等 电点电泳、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、逆相层析法 等。
【0017】此外，在宿主细胞内表达的蛋白在经翻译后可在细胞 内经各种修饰。因此，本发明中使用的重组载脂蛋白A-II也包括经N 末端甲硫氨酸脱离、N末端乙酰化、糖链附加、被细胞内蛋白酶的限 制性分解、十四酰化、异戊烯化、磷酸化等翻译后修饰的蛋白。
【0018】这样得到的载脂蛋白A-II中不含有残留杂质。又可与 药学上可接受的媒质均匀混合而制成制剂。其中所述媒质可根据药剂 的施用形态从宽范围内适宜选择。可根据需要将盐、氨基酸、有机酸、 糖醇、白蛋白等蛋白与多元醇等合适的稳定剂共保存。
【0019】本发明的制剂的施用途径非特限于经口和非经口，但 优选静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等非经口施用，其中 静脉注射尤佳。作为注射剂，可根据常规方法将一定量的经纯化载脂 蛋白A-II在无菌条件下与注射用蒸馏水混合即可，此时优选适量配合 缓冲剂、等渗剂、稳定剂等。作为具体例，优选使用磷酸钠、柠檬酸 钠、氯化钠、L-谷氨酸等。
【0020】作为本发明涉及的急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预 防、治疗剂的施用量，可根据对象施用充分发挥效果的量，可根据剂 型、施用方法、每天施用次数、症状程度、体重、年龄等适宜增减。 在对成年人静脉注射的情况下，载脂蛋白A-II通常为约1～ 1000mg/kg，优选约3～500mg/kg。可将所述量分成每天1～3次施用。
发明效果
【0021】本发明涉及的急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治 疗剂以载脂蛋白A-II作为有效成分，无副作用或副作用甚微，安全且 可有效治疗急性肝炎或预防、治疗爆发性肝炎。
实施方式
【0022】以下通过例举实施例及实验例来具体说明本发明。
实施例
实施例1
【0023】含有载脂蛋白A-II的制剂的配制
将基本去除肝炎病毒和其他病原微生物的人血浆作为原料，用人 血浆科恩低温乙醇分级分离法得到IV-1级分。将1.2kg所述级分IV-1 在2～8℃的低温室中溶于含100mM三(羟甲基)氨基甲烷和6M尿 素的，pH被调至7.8～8.2的2.4L溶液中。然后再加入与溶解液等量 的乙醇/氯仿溶液(1∶1)进行混合，在4℃下、以12000g、离心10分 钟，回收上清蛋白成分。向回收的3.4L上清中添加4.1L(1.2倍的量) 乙醇，在4℃下、12000g、离心10分钟，回收上清6.8L。又向回收的 上清中添加5.4L(0.8倍的量)的乙醇，在4℃下、12000g、离心10 分钟，回收含有载脂蛋白A-II的上清12L。对于含有载脂蛋白A-II 的上清，则用截留分子量为10000的超滤膜(Pole公司制造)，通过 注入120L的150mM氯化钠溶液进行超滤，以去除乙醇。接着注入含 有20L 150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7)进行超滤，以置 换溶液。然后，通过超滤将载脂蛋白A-II浓缩至4mg/ml。
接着，向500ml载脂蛋白A-II浓缩液加入等量的乙醇/氯仿(1∶ 1)溶液进行混合，在4℃下、12000g、离心10分钟，去除下层，回 收上清750ml。将上清用截留分子量为10000的超滤膜(Millipore公 司制造)，通过注入25L 150mM氯化钠溶液进行超滤，以去除乙醇。 接着注入20L含有150mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7)进行 超滤，以置换溶液。然后进行浓缩至含有22mg/ml载脂蛋白A-II。随 后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器(Millipore公司制造)进行无菌 过滤，得到载脂蛋白A-II制剂。
对载脂蛋白A-II制剂的分析结果示于表1。
【0024】【表1】
载脂蛋白含量(mg/ml) 21.5 pH 7.3 渗透压比 1.0 内毒素含量(EU/ml) 0.2 磷脂含量(mg/ml) 0.6 性状 呈淡黄色的澄清液 乙醇浓度(％) 0.01
可将通过上述方法制得的制剂直接作为注射液使用。
实施例2
【0025】(1)基因重组人载脂蛋白A-II表达载体的构建
将人肝脏cDNA文库(宝生物公司制造，商品代码9505)作为模 板，通过PCR法克隆人载脂蛋白A-II基因。其中将序列表中SEQ ID NO：1所示序列作为正向引物，以序列表中SEQ ID NO：2所示序列 作为反向引物。将得到的PCR片段用TOPO TA克隆试剂盒 (Invitrogen公司制造)根据TA克隆法克隆于pCR2.1载体 (Invitrogen公司制造)中。
(2)用短芽孢杆菌(Bacillus brevis)制备人载脂蛋白A-II表达 株
通过用含有所得人载脂蛋白A-II基因的载体转化短芽孢杆菌 (Bacillus brevis)来构建表达株。构建表达株的方法根据专利公报第 3734593号记载的方法进行。
首先根据所述专利实施例1的方法构建质粒载体，然后构建插入 了人载脂蛋白A-II基因的质粒载体。然后，根据所述专利实例5所述 方法，用电穿孔法转化短芽孢杆菌H102(FERM BP-1087)。
(3)将所述转化体在TMN培养基中，于30℃下培养3天后，离 心培养液分离上清，得到培养上清。
为了证实所得人载脂蛋白A-II的氨基酸序列，用3100型DNA测 序仪(ABI公司制造)分析pCR2.1载体的碱基序列，当将其转变为 氨基酸时，得到序列表中SEQ ID NO：3所示序列。
此氨基酸序列是与记载于Swiss-Prot Protein Knowledgebase的 人载脂蛋白A-II(初次登录号为P02652)的成熟蛋白部分相同的序列。
实施例3
【0026】由基因重组人载脂蛋白A-II的表达株(短芽孢杆菌) 的培养上清配制含有载脂蛋白A-II的制剂
将表达、分泌人载脂蛋白A-II的短芽孢杆菌的培养上清和含有 1M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH6.6～7.0)等量混合，搅拌后， 使其通过0.45μm过滤器(Millipore公司制造)以去除沉淀。将此滤 液装载于预先用含有0.5M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4) 平衡的His trap FF(GE Healthcare公司制造)上。然后用与进行平 衡时相同的溶液进行洗涤，随后再用含有0.5M氯化钠和40mM咪唑 的20mM磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)洗涤。最后用含有0.5M氯化钠 和500mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)洗脱吸附于His trap FF上的级分。将吸附于His trap FF上的级分的洗脱液用截留分子量 10000的离心超滤膜(Millipore公司制造)通过注入含有150mM氯 化钠的20mM磷酸缓冲液进行超滤，以置换液体。再进行超滤浓缩， 使浓缩至含13mg/ml载脂蛋白A-II。接着用孔径0.22μm的无菌过滤 器(Millipore公司制造)进行无菌过滤，作为载脂蛋白A-II制剂。
实施例4
【0027】同实施例3一样实施His trap FF，将得到的洗脱液组 分用截留分子量5000的离心超滤膜(Millipore公司制造)通过注入 含有3M尿素及0.5M氯化钠的3.3mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4)进 行超滤，以置换液体。将所述含有人载脂蛋白A-II的级分装载于预先 用含有3M尿素及0.5M氯化钠的3.3mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.4) 平衡的40μm的I型Macro-prep羟基磷灰石陶瓷(BioRad公司制造) 上，回收未吸附的级分。
然后将此未吸附的级分用截留分子量5000的离心超滤膜 (Millipore公司制造)，通过注入含有150mM氯化钠的20mM磷酸 缓冲液进行超滤，以置换液体。再进行超滤浓缩，使浓缩至含2mg/ml 载脂蛋白A-II。接着用孔径0.22μm的无菌过滤器(Millipore公司制 造)进行无菌过滤，作为载脂蛋白A-II制剂。
实施例5
【0028】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)
将实施例1和实施例4中得到的载脂蛋白A-II制剂的浓度调节至 在OD280nm处的吸光度相同。将本样品作为非还原样品。另外，将 本样品用30mg/ml的DTT(和光纯药公司制造)处理，作为还原样品。 将非还原样品和还原样品在15％的均匀SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行 电泳。其结果示于图1。
【0029】蛋白印迹法
将实施例1和实施例4中得到的载脂蛋白A-II制剂的浓缩调节至 在OD280nm处的吸光度相同。将本样品经SDS-PAGE后，将凝胶上 的蛋白转移到PVDF膜(ATTO公司制造)上，并用山羊抗人载脂蛋 白A-II多克隆抗体(SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY公司制造) 进行第一次反应。然后用经HRP标记的兔抗山羊免疫球蛋白抗体 (DAKO公司制造)进行第二次反应，并通过DAB法显色，其结果 示于图2。
【0030】如图1和图2所示，经SDS-PAGE染色的蛋白——实施 例1的制剂和实施例4的制剂均与抗人载脂蛋白A-II抗体反应，从而 证实二者具有相同的抗原性。而且，在还原电泳图中显示为单一条带。
而且，当比较图1和图2中实施例1的制剂和实施例4的制剂的 条带时，实施例4的制剂的条带位置显示其分子量稍大。这是由于在 重组体中附加了His-Tag的分子量(6个组氨酸残基)所致。
实施例6
【0031】为比较在实施例1和实施例4中制备的制剂，通过制 作肽图进行了检验。
向20μl各制剂经稀释至载脂蛋白A-II为200μg/ml的经配制溶液 中各添加4μl样品缓冲液(350mM Tris-HCl、pH6.8、30％甘油、10％ SDS、0.3％BPB、30％2-巯基乙醇)，在100℃下处理5分钟后进行 SDS-PAGE，并进行CBB染色(PhastGel Blue R，Amersham Biosciences公司制造)。
用电泳后凝胶上10kDa附近的条带全量如下进行凝胶内消化。
用刀将凝胶切成约1mm×1mm，并在1ml纯水中搅拌、洗涤(20 分钟×2次)。然后在50μl含有7M胍及10mM EDTA的0.5M Tris-HCl 缓冲液(pH8.5)中搅拌、洗涤(30分钟)后，再于含1ml 50％的乙 腈及1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH7.8)中搅拌、洗涤(20 分钟×2次)。再于1ml乙腈中搅拌、洗涤(5分钟)后，在干燥袋(ス ピ一ドバツク)内干燥凝胶。向经干燥的凝胶中添加10μl溶于含有 2mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH7.8)的内切蛋白酶Glu-C(V8) (酶∶底物＝1∶1)中。在冰上静置1小时，使凝胶膨胀润湿后，加入20～ 60μl含有2mM EDTA的100mM磷酸缓冲液(pH7.8)浸透凝胶，并 在25℃下消化24小时。消化后，在干燥袋内浓缩至全量50μl以下。
向经浓缩的样品中加入0.1％三氟乙酸至达到55μl，并用其中的 50μl在以下条件下进行HPLC分析。
HPLC条件
装置：LC-10Avp系统(岛津制作所制造)
柱：218TP54(4.6mmI.D.×25cm、Vydac公司制造)
柱温度：40℃
流速：1ml/分钟
检测波长：215nm
移动相A：0.1％三氟乙酸
移动相B：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度条件：0/0→0/5→75/55→100/65→100/75→0/85→0/90(％B/ 分钟)
实施例1的肽图结果示于图3，实施例4的肽图结果示于图4。实 施例1及实施例4中配制的制剂，除His-tag部分之外，表现出相同 的肽图，从而证实实施例1和实施例4的制剂相同。
实施例7
【0032】基因重组人载脂蛋白A-II表达载体的构建及利用酵母 制备载脂蛋白A-II的表达株
人工合成了人载脂蛋白A-II基因。其碱基序列如配列表中SEQ ID NO：4所示。
将得到的人载脂蛋白A-II基因插入表达载体pTI1M5(東田英毅、 酵素工学ニユ一ス、第57号、2007年4月)的多克隆位点中，从而 构建了诱导型表达用载体。根据岡崎等(Okazaki et al.，″Nucleic Acids Res.″，18，6485-6489，1990)的方法用此诱导型表达用载体和亮氨酸营养 缺陷型互补载体pAL7转化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) ATCC38399而构建表达株。将所述表达株用5ml含有G418的液体培 养基YELG10(0.5％细菌用酵母提取物、3％葡萄糖、10μg/ml G418) 在32℃下培养7天。将所述培养物在5ml YPDG100(1％细菌用酵母 提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、10μg/ml G418)中于32℃下 培养7天后，再通过离心将菌体和上清分离，回收菌体。将菌体样品 悬浮于0.8ml菌体破碎缓冲液(50mM Tris-HCL、pH7.5、0.1M氯化 钠、蛋白酶抑制剂(Roche公司制造))中，加入等容量的玻璃珠， 用破碎机破碎4次，从而配制成菌体破碎液。将此菌体破碎液离心， 回收含有载脂蛋白A-II的上清。载脂蛋白A-II的表达量为2mg/L。
实施例8
【0033】由基因重组人载脂蛋白A-II的表达株(裂殖酵母)培 养菌体制备载脂蛋白A-II制剂
将实施例7中制备的表达株于300ml YPDG100培养基(1％酵母 提取物，2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.1mg/ml G418)中培养。用3个小 型发酵罐，在30℃下培养66小时，得到总量14.4g(湿重)的菌体。 将从每个小型发酵罐中回收的菌体悬浮于16～17ml破碎缓冲液 (50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1M氯化钠、蛋白酶抑制剂(Roche公 司制造))中，再补入所述破碎缓冲液至配制成20ml的菌体悬浮液。 接着，向配制的20ml各菌体悬浊液中加入同等容量的玻璃珠(直径 0.5mm)，并用破碎机破碎4次(以2500rpm破碎60秒钟)，回收 菌体破碎液13ml。将残留的附着于玻璃珠上的破碎菌体用5ml破碎缓 冲液洗涤，将此洗涤液并入先前的菌体破碎液中。将其以5000g离心 10分钟，取上清。载脂蛋白A-II的表达量为2mg/L。
将配制的上清用下述2种His-Tag柱进行纯化。首先将54ml上清 装载于20ml的TALON单步骤柱(Clontech公司制造)上，用2ml 含有500mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。将此洗脱液用DW稀释3 倍后，装载于0.6ml的His Spin Trap柱(GE Healthcare公司制造) 上，用2ml含有500mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。
然后，将洗脱液用0.5ml的高速离心过滤柱VIVA SPIN500 (Sartorius公司制造)进行浓缩，并进行PBS缓冲液交换(pH7.5)， 从而得到含有载脂蛋白A-II的制剂。
实施例9
【0034】动物实验1
准备22只实验用7周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例1中配制的载脂蛋白A-II以4mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他8只(对照组)共计16只小鼠腹膜内一次施用作 为爆发性肝炎引发剂的700mg/kg半乳糖胺盐酸盐(Sigma公司制造) 和50μg/kg脂多糖(大肠杆菌0111：B4，Sigma公司制造)。另外，将 既未施用载脂蛋白A-II，也未施用爆发性肝炎引发剂的6只小鼠作为 正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂6小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组发症和相对于对照组 的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表2。
【0035】【表2】
实施例1的A-II (4mg/kg)施用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1053±455＊ 2896±862## 51±4 AST(IU/L) 339±99＊ 698±189## 73±5
＊：对于对照组P＜0.05
##：对于正常组P＜0.01
如表2所示，相比正常组，对照组血中的ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例10
【0036】动物实验2
准备18只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例3中配制的载脂蛋白A-II以3mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他6只(对照组)共计14只小鼠以15μg/kg的剂量 静脉内一次施用作为爆发性肝炎引发剂的IV型伴刀豆球蛋白A (Sigma公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未施 用伴刀豆球蛋白A的4只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂8小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表3。
【0037】【表3】
实施例3的A-II (3mg/kg)施用 组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 785±377＊ 3388±1156# 33±2 AST(IU/L) 668±234＊ 2450±750# 64±2
＊：对于对照组P＜0.05
#：对于正常组P＜0.05
如表3所示，相比正常组，对照组血中的ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II施用组中显著被抑制。 根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效果。 A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的副作 用。
实施例11
【0038】动物实验3
准备18只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例3中配制的载脂蛋白A-II以13mg/kg的剂量静脉 内一次施用给其中的8只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的8只与其他6只(对照组)共计14只小鼠以15μg/kg的剂量 静脉内施用一次作为爆发性肝炎引发剂的IV型伴刀豆球蛋白A (Sigma公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未施 用爆发性肝炎引发剂的4只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂8小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表4。
【0039】【表4】
实施例3的A-II (13mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 214±33＊ 3388±1156# 33±2 AST(IU/L) 332±28＊ 2450±750# 64±2
＊：对于对照组P＜0.05
#：对于正常组P＜0.05
如表4所示，相比正常组，对照组的血中ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例12
【0040】动物实验4
准备16只实验用8周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将实施例1中配制的载脂蛋白A-II以300mg/kg的剂量静 脉内一次施用给其中的4只小鼠(A-II施用组)。10分钟后，向A-II 施用组的4只与其他6只(对照组)共计10只小鼠以200μg/kg的剂 量静脉内施用一次作为爆发性肝炎引发剂的抗Fas抗体(Becton Dickinson公司制造)。另外，将既未施用载脂蛋白A-II制剂，也未 施用抗Fas抗体的6只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂4小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹部 大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的丙 氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各平 均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检验 (Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对照 组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表5。
【0041】【表5】
实施例1的A-II (13mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1433±687＊＊ 2199±3389## 58±7 AST(IU/L) 769±226＊＊ 5567±878## 59±3
＊＊：对于对照组P＜0.01
##：对于正常组P＜0.01
如表5所示，相比正常组，对照组的血中ALT及AST显著增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例13
【0042】动物实验5
准备32只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg 的剂量静脉内一次施用给其中的21只小鼠，从而制备出不采取任何处 理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向10只肝障碍模型小鼠施 用伴刀豆球蛋白A1小时后，以100mg/kg的剂量静脉内一次施用了 实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的11只小鼠 未施用载脂蛋白A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的11只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表6。
【0043】【表6】
实施例1的A-II (100mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 2387±635＊ 6582±1598## 33±2 AST(IU/L) 1854±406＊ 4202±968## 58±2
＊对于对照组P＜0.05
##对于正常组P＜0.01
如表6所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例14
【0044】动物实验6
准备32只实验用7周龄雌性Balb/c小鼠(日本Charles River公 司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以15mg/kg 的剂量静脉内一次施用给其中的21只小鼠，从而制备出不采取任何处 理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向10只肝障碍模型小鼠施 用伴刀豆球蛋白A1小时后，以500mg/kg的剂量静脉内一次施用了 实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的11只小鼠 未施用载脂蛋白A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的11只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表7。
【0045】【表7】
实施例1的A-II (500mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1473±865＊＊ 6582±1598## 33±2 AST(IU/L) 1257±615＊ 4202±968## 58±2
＊：对于对照组P＜0.05
＊＊：对于对照组P＜001
##：对于正常组P＜001
如表7所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在A-II制剂施用组中显著被抑 制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II制剂对爆发性肝炎具有预防效 果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂会出现的 副作用。
实施例15
【0046】动物实验7
作为实验动物，使用了24只7周龄雄性Balb/c小鼠(日本Charles River公司制造)。将IV型伴刀豆球蛋白A(Sigma公司制造)以 15mg/kg剂量静脉内一次施用给其中的16只小鼠中，从而制备出不采 取任何处理也表现出爆发性肝炎的肝障碍模型小鼠。向8只所述肝障 碍模型小鼠施用伴刀豆球蛋白A1小时后，以500mg/kg的剂量静脉 内一次施用实施例1中配制的载脂蛋白A-II(A-II施用组)。剩余的 8只小鼠未施用A-II(对照组)。另外，将既未施用伴刀豆球蛋白A， 也未施用载脂蛋白A-II的8只小鼠作为正常组。
在施用载脂蛋白A-II制剂24小时后，在二氧化碳麻醉下，从腹 部大动脉处采血得到血清。测定所述血清中作为肝功能障碍的指标的 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，算出各 平均值±标准误差。有关ALT及AST的统计学解析，则分别通过t检 验(Excel、Microsoft)检查相对于正常组的对照组的发症和相对于对 照组的A-II施用组的效果来进行。
其结果示于表8。
【0047】【表8】
实施例1的A-II (500mg/kg)施 用组 对照组 正常组 ALT(IU/L) 1055±281＊＊ 4185±736## 55±4 AST(IU/L) 936±198＊＊ 2831±421## 129±13
＊＊：对于对照组P＜0.01
##：对于正常组P＜0.01
如表8所示，相比正常组，对照组的ALT及AST显示出增加。 但是，对照组中呈现的肝功能高度障碍在实施例1的载脂蛋白A-II施 用组中显著被抑制。根据此实验证实了载脂蛋白A-II对爆发性肝炎具 有预防效果。A-II制剂施用组中未发现曾认为施用载脂蛋白A-II制剂 会出现的副作用。
工业实用性
【0048】近年来，在日本出现急性肝炎发展为爆发性肝炎的病 症增多的趋势。但是根据患者的主观症状、医生细心注意的诊断，医 疗机关可预知患者的爆发性肝炎化，并通过在合适的时期施用本发明 急性肝炎治疗剂、爆发性肝炎预防、治疗剂来治愈急性肝炎，并提前 防止向爆发性肝炎的发展。另外，即使例如已发生爆发性肝炎的症状， 但仍可通过施用本发明的药剂来缓解所述症状。
附图简述
【0049】
【图1】示SDS-PAGE电泳图。图中，左端的数字表示分子量 (kDa)。
(1)是分子量标记、(2)是实施例1的制剂(非还原)、(3) 是实施例4的制剂(非还原)、(4)是实施例1的制剂(还原)、(5) 是实施例4的制剂(还原)、(6)是分子量标记。
【图2】示蛋白印迹法电泳图。(1)是实施例1的制剂(非还原)、 (2)是实施例4的制剂(非还原)、(3)是实施例1的制剂(还原)、 (4)是实施例4的制剂(还原)。
【图3】示实施例1的制剂(源于血浆的载脂蛋白A-II)的肽图。
【图4】示实施例4的制剂(基因重组的载脂蛋白A-II)的肽图。 在17分钟附近检测出His-Tag相关峰值。
序列表
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
caggcaaagg agccatgtgt gg 22
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcactgggtg gcaggctgtg 20
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>3
<211>77
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu Met Glu Lys Val Lys Ser Pro
20 25 30
Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln
35 40 45
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu
50 55 60
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln Pro Ala Thr Gln
65 70 75 77
<110>Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>急性肝炎治疗剂或爆发性肝炎预防、治疗剂
<160>4
<210>4
<211>255
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atgcaagcca aggagccctg cgtcgagtcc cttgtctccc aatacttcca aaccgtcacc 60
gactacggta aggaccttat ggagaaggtc aagtcccccg agcttcaagc cgaggccaag 120
tcctacttcg agaagtccaa ggagcaactt acccccctta tcaagaaggc cggtactgag 180
cttgtcaact tcctttccta cttcgtcgag cttggtactc aacccgccac ccaacaccac 240
caccaccacc actga 255
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 预防接种操作台 | 2020-05-11 | 963 |
| 预防接种专用针头 | 2020-05-12 | 949 |
| 预防接种操作台 | 2020-05-11 | 473 |
| 疾病预防用磁疗按摩器 | 2020-05-12 | 674 |
| 疾病预防接种装置 | 2020-05-12 | 907 |
| 疾病预防消杀器 | 2020-05-11 | 713 |
| 预防接种急救箱 | 2020-05-11 | 783 |
| 卫生防疫预防消毒柜 | 2020-05-13 | 404 |
| 预防接种操作辅助器 | 2020-05-13 | 436 |
| 疾病预防用化验采样器 | 2020-05-12 | 641 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
预防热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈