以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型及其构建和应
用
技术领域
[0001] 本
发明属于
生物医药领域，涉及一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型STAT3活性细胞为
基础的抗肿瘤药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
背景技术
[0002]
信号转导及转录激活因子3（STAT3）作为重要的转录因子在癌症的发生和发展中发挥着重要的的作用，被公认为是癌症相关蛋白。在许多肿瘤细胞中，如结肠癌、
乳腺癌、神经胶质瘤细胞、
肺癌、头颈部癌等等细胞中，STAT3常常以持续活化的形式存在，STAT3受到上游信号细胞因子刺激或在某些酪
氨酸激酶持续活化的状态下，其C端705位酪氨酸被磷
酸化而形成二聚体，进而入核调节转录，启动一系列基因的调控，在促进细胞转化、转移、防止凋亡方面发挥多重作用。通常胞外调节STAT3的细胞因子的有IL-6，LIF，OSM，EGF，PDGF，G-CSF等，胞内维持STAT3持续活性的因素来自于上游受体或非受体酪氨酸激酶的持续活化或自身突变。研究表明，抑制STAT3活性将会大大降低多种肿瘤细胞的生长、生存和转移，从而大大降低它们恶性程度（Ni等人：Cancer Res 2000； Leong等人：Proc Natl Acad Sci 2003； Barton等人： Mol Cancer Ther 2004； Kortylewski等人： Nat Med2005； Xin等人：Cancer Res 2009）。此外研究表明，在不少肿瘤细胞中，STAT3可以促进和维持NF-κB的活性，而NF-κB则是肿瘤发生和转移的另一重要促成因素，在这一类肿瘤中抑制STAT3活性，不仅抑制了STAT3本身调控的肿瘤相关基因，也在一定程度上下调NF-κB的活性，达到一点双靶的目的（Yang J等人：Cancer Res 2005； Yang J等人：Genes & Dev
2007； Torres J等人： Nat Cell Biol 2008；Lee H等人：Cancer Cell 2009；Yu H等人：
Nat Rev Cancer 2009）。
[0003] 目前基于STAT3为靶点的药物筛选系统通常具有效率低下、步骤繁琐等缺点，例如每次筛药都需要使用外源细胞因子例如白细胞介素6（IL-6）和白细胞抑制因子（LIF）激活细胞内STAT3，额外的步骤将使筛药系统的
稳定性大大降低，成本也因IL-6或LIF的使用将大大增加。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对
现有技术中存在的问题，提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建方法。
[0006] 本发明还有一个目的，就是提供一种以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在抗肿瘤药物筛选中的应用。
[0007] （一）以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型
[0008] 本发明以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型，是利用含有STAT3特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型STAT3活性细胞为基础，构建成稳定的以STAT3信号为靶点高通量抗肿瘤药物筛选细胞模型。
[0009] 所述STAT3的特异性结合序列为 5’-TT(C/A)CNNNAA-3’，N为
碱基。
[0010] 所述报告系统载体是在含有
荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。
[0011] 所述具有组成型STAT3活性细胞为：DU145
前列腺癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人
宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。
[0012] （二）以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型的构建。
[0013] 本发明以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型的构建，包括以下工艺步骤：
[0014] （1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有STAT3特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA
片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当STAT3活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制STAT3活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的
水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。
[0015] （2）细胞模型的构建：将报告系统载体
转染具有组成型STAT3活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对已知STAT3信号
抑制剂（如PD-180970，等已知特定细胞中STAT3上游信号抑制剂）有响应的克隆，即为以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型。
[0016] 在具有组成型STAT3活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化，当使用STAT3信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。
[0017] （三）以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型在抗肿瘤药物筛选中的应用。
[0018] 本发明以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型用于筛选由STAT3组成型活化造成的癌变及肿瘤的
治疗药物。具体筛选抗肿瘤药物的方法包括以下工艺步骤：
[0019] （1） 将所述抗肿瘤药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；
[0020] （2）在培养基中加入待筛选化合物0.1 μl~2μl，继续培养24 小时；
[0021] （3）在上述96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/
化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
[0022] （4）以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40%以上得到复筛产物，即为以STAT3为靶点的抑制药物。
[0023] 本发明相对于现有技术具有以下优点：以STAT3信号通路为靶点，采用基于具有组成型STAT3活性（即持续STAT3活性）的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，得到的稳定细胞模型，无需使用外加刺激，可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从“细胞培养→激活STAT3→加化合物→检测”简化为 “细胞培养→加化合物→检测”，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。
附图说明
[0024] 图1为使用 Western-Blot 方法检测本发明所涉及的细胞中 STAT3活性结果。
[0025] 图2为使用凝胶
电泳阻抑试验（EMSA）检测本发明所涉及的细胞中 STAT3 活性结果。
[0026] 图3为所用报告载体基本骨架。
[0027] 图4为所构建的报告系统载体 SIE-luc 插入序列的测序结果图。
[0028] 图5为利用 293T 细胞检测报告系统载体 SIE-luc响应能
力。
[0029] 图6为使用 Western-Blot 方法检测A549细胞在已知抑制剂PD180970处理后的STAT3活性变化。
[0030] 图7为抗肿瘤药物筛选细胞模型A549R对 STAT3活性降低或升高的响应。
[0031] 图8为使用Western-Blot 方法检测所筛的化合物3412对STAT3活化的抑制能力。
具体实施方式
[0032] 下面以A549细胞为例，本发明抗肿瘤药物筛选细胞模型的结构、构建方法和应用作进一步说明。
[0034] 仪器：PerkinElmer Victor3 荧光/化学发光分析仪。
[0035] 试剂：性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；引物合成及测序，上海生工提供；DMEM（高糖）及胎
牛血清购自Hyclone（Thermo公司），转染试剂 GenEscort II 购自南京慧基生物；萤火虫荧光素酶测定
试剂盒购自Promega公司；IL-6购自Peprotech公司；PD180970及 Puromycin 购自 Sigma-Aldrich 公司；用于筛药的96孔板购自Corning公司；待筛选的化合物来自国家小分子化合物资源中心；各种
抗体购自Cell Signaling Technology公司。
[0036] 1、报告系统载体构建
[0037] 将人工合成的包含的 16 个 SIE（即STAT3特异性结合序列）以及通用的 TATA 盒辅助序5’-TATATAA-3’ 的DNA片段，以 KpnI 和 HindIII 的酶切位点插入到通用的荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro，得到的报告系统载体命名为SIE-luc。上述STAT3特异性结合序列包含8 个5’-TTCCCGTAA-3’（M67序列，hyperactive mutated form of SIE ），8 个 5’-TTCCTGTAA-3’（来自Ly6E基因）交替连接，两种元件对STAT3都具有高度特异的亲和力。荧光素酶报告载体 pBR322 - luc - puro由 pBR322载体 HindⅢ 和SalⅠ之间插入北美萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，参见J R de Wet等人：Mol. Cell. Biol. 1987） 报告基因和嘌呤霉素基因（Puromycin，参见Lacalle RA等人：Gene.1989，GenBank：M25346.1）所得，并且荧光素酶报告基因和嘌呤霉素筛选基因通过内部核糖体进入序列 （IRES）相连，嘌呤霉素基因终止密码子下游有AATAAA 序列为poly A加尾信号。pBR322-luc-puro多克隆位点位于原EcoRⅠ和 HindⅢ之间（参见图3）。
[0038] 至此，在pBR322-luc-puro荧光素酶报告载体上的完整插入序列如下（测序结果见图4）：
[0039]。
[0040] 2、报告系统载体性能测试
[0041] 由于 293T 细胞对各种外源细胞因子的刺激比较敏感，便于在外加细胞因子刺激时检测相应信号通路的活化情况，所以使用该细胞作为代表检测报告系统载体是否响应正常。结果（见图5）表明，在相应信号通路活化时所使用报告系统载体响应正常，刺激后与刺激前荧光素酶活性的比例约为18.7：1，其中293T细胞使用IL-6刺激激活。将293T 细胞于12 孔板生长至 50%~70%
密度，转染SIE-luc（2 μg/孔），载体与转染试剂的使用比例为
1:2（即2 μg质粒，4 μl转染试剂，各溶于50 μl DMEM 无血清培养基，混合成 100 μl 预混液，室温静置20 min，再加入150 μl无血清 DMEM，混匀后加入 12 孔板各孔内）4小时后换成完全培养基（即含有10%胎牛血清的DMEM培养基），12 小时以后，用 IL-6 (250 ng/ml)处理 24 小时，吸去培养基，加入200μl 裂解液裂解细胞，轻摇10min，取150 μl于96孔板中，加入20 μl普通萤火虫荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪立即测定（1min 以内）荧光素酶的活性，对照及处理各3个重复，并独立重复试验3次（***，p<0.001）。
[0042] 3、药物筛选模型细胞选择
[0043] 通过Western-Blot及EMSA凝胶阻抑实验分析细胞中 STAT3 的活性，得到多种适用与本报告系统载体的STAT3 活性高（无需额外使用 IL-6 等细胞因子刺激细胞）的肿瘤细胞系（图1，图2），图1为使用Western-Blot方法检测本发明所涉及的细胞中 STAT3 活性结果。结果表明包括 A549 在内的一系列肿瘤细胞比正常细胞具有更高的 STAT3活性，以 STAT3 第 705 位酪氨酸（Tyr705）的
磷酸化表征，标注为“pTyr705-STAT3”，磷酸化水平越高，活性越高。图2为使用凝胶电泳阻抑试验（EMSA）检测本发明所涉及的细胞中STAT3活性结果。表明图1中所用几种肿瘤细胞活化的STAT3都比正常细胞HME1具有更高的DNA结合能力。其中，HME1，人乳腺表皮细胞（正常对照细胞）；DU145，前列腺癌细胞；HepG2，人肝癌细胞；H1299和A549为人肺癌细胞，HCT119，人结肠癌细胞；Hela，人
宫颈癌细胞；MCF-7、MDA-MB-468和 MDA-MB-231为人乳腺癌细胞。
[0044] 4、药物筛选模型构建及性能测试
[0045] 将 SIE-luc 转染 A549 细胞（10cm 培养皿） 48 小时后，1 传 3，并加入 puromycin 进行阳性克隆筛选，初始浓度为 5 μg/ml，2 周后降为 2.5 μg/ml。待形成克隆（共约 3 周）后，用胰酶消化单克隆于 96 孔板，长起后再转入 48 孔板，6 孔板直至 10 cm 培养瓶和冻存，期间用终浓度为 2.5 μg/ml puromycin 的继续维持 2 周。首选选取荧光素酶阳性的克隆，再检测这些克隆是否响应正常；虽然是组成型活化，细胞一般还能对外加细胞因子有所反应，故所选阳性克隆的荧光素酶活性在外加IL-6刺激时应当还能有所增加。经过验证，外加IL-6（250 ng/ml）刺激时还能使该细胞模型STAT3活性提升2.5倍左右，并且由于是组成型激活，使用 STAT3信号通路的抑制剂都应能使荧光素酶的活性减少。 PD180970为酪氨酸激酶 Src 的抑制剂，文献报道 A549细胞持续活化的 STAT3 对 PD180970 敏感；所选用的PD180970 （250 nM）浓度经细胞生长抑制实验证实对 A549 细胞无生长抑制（24 小时）；使用PD180970在不影响细胞生长的浓度下都显著抑制了STAT3的活性（参见图6Western-Blot分析，A549细胞传代于10 cm培养皿中，至60%~70%汇合度时，加入250 nM PD180970处理24h，同时加入DMSO作为对照），从而抑制了荧光素酶的表达达52.2%。经筛选最终选择第18号克隆，标记为A549R，参见图7（***，p<0.001）。细胞接种于 96 孔板（10,000个/孔，100 μl） 生长 12 小时，换含有上述IL-6（250 ng/ml）或抑制剂PD180970（250 nM）的新培养液，继续培养 24 小时后，加入50 μl 稳定型荧光素酶底物（Steady-Glo），避光反应10 min后使用荧光/化学发光分析仪测定荧光素酶的活性。
[0046] 5、模型应用
[0047] 将药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；加入待筛选化合物0.25 μl（25 μM），继续培养24 h，在相应96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率。得到 8 种有抑制性、且抑制率在40%以上的化合物，把这8 种化合物浓度减半再次筛选，并以化合物细胞毒性实验（这里用MTT实验）消除化合物对细胞模型的直接损伤，得到仍对药物筛选细胞模型荧光素酶活性抑制率在40%以上的化合物有1种（抑制率达70%），即为能特异性抑制STAT3的复筛产物，为编号是3412的化合物。
[0048] 经Western-Blot分析验证该编号为3412的化合物除了可以抑制A549R中STAT3报告系统所产生的荧光外，对人前列腺癌细胞DU145持续活化的STAT3，以及IL-6诱导的293T中STAT3的活化有非常好的抑制效果（参见图8），证明该药物筛选模型不仅有良好的可行性和可靠性，同时有良好的通用性（所筛的化合物能在多种情况下抑制STAT3的活性）。
其中，DU145细胞传代于10 cm培养皿中，至60%汇合度时，加入编号为3412的化合物（10 μM）处理2h，同时以加入DMSO作为对照；293T细胞传代于10 cm培养皿中，至60%汇合度时，加入编号为3412的化合物（10 μM）与预处理30 min，再加入IL-6（250 ng/ml）处理
2h。
[0049] 上述实验证明，通过以STAT3为靶点的抗肿瘤药物筛选细胞模型复筛得到的化合物确为以STAT3为靶点的抑制药物，从而证明该药物筛选细胞模型的有效性。
[0050] 大量实验表明，在多种具有组成型STAT3活性的细胞中，本发明以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型都能取得便捷、快速、高效的筛选效果。
