(一)技术领域
[0001] 本
发明涉及一种艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法。(二)背景技术
[0002] 艾滋病(AIDS)是由人类免疫
缺陷病毒(HIV)引起的，自1981年首次报道以来，已经成为严重危害公共卫生的重大传染病之一。截止2012年全球共有3530万(3220万～3880万)人感染艾滋病病毒。2012年约230万人新发感染艾滋病病毒，约160万人死于与艾滋病相关
疾病。在中国2015年检测发现的艾滋病感染者超过11万例，截止2015年底全国报告现存活病例超过57万。近年来艾滋病感染者人数依然保持较快增加，艾滋病防治形势依然严峻。
[0003] 检测发现是控制艾滋病蔓延的重要手段，建立快速、敏感、特异的艾滋病病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在传染病病原体检测方面得到广泛的应用，它利用PCR技术实现对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性，克服了常规血清学和普通PCR方法的诸多不足，具有广阔的应用价值。多重荧光PCR技术进一步实现多任务检测，更具省时省
力的优点。(三)发明内容
[0004] 本发明目的是提供一种艾滋病病毒HIV多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，克服了常规血清学和普通PCR方法的诸多不足，具有广阔的应用价值。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种艾滋病病毒HIV多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针：
[0007] 标签引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'；
[0008] LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’；
[0009] LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’；
[0010] LTR荧光探针：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；
[0011] GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’；
[0012] GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’；
[0013] GAG荧光探针：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’；
[0014] RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’；
[0015] RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’；
[0016] RNase P荧光探针：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'；
[0017] 其中，FAM、HEX和CY5为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团，LTR和GAG是所检测的HIV特异性靶基因，RNase P是人类核糖核酸酶P基因(管家基因)作为内控靶基因。
[0018] 本发明关键在于特异性加尾引物和探针的设计，试剂盒内的其它组分为本领域常规用于PCR试剂，如dNTP mix、MgCl2、buffer、Taq酶等，本领域普通技术人员可根据常识进行选择，可自行配制，也可选用常见商品化产品。本发明所述PCR反应试剂包括：1×Ex Taq PCR Buffer，Mg2+，dNTP，Ex Taq和DNA模板。
[0019] 本发明还提供一种所述艾滋病病毒多重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，具体所述方法为：
[0020] (1)提取待测样品DNA：所述样品DNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒
说明书进行提取。
[0021] (2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂、标签引物Tag、LTR基因特异性引物和探针、GAG基因特异性引物和探针、RNase P内控靶基因引物和探针构成PCR反应体系，进行多重荧光PCR扩增反应；
[0022] (3)荧光PCR检测以Ct值﹤50并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<40且扩增曲线呈S型可直接判定为阳性；Ct值在40～50之间需重复实验，两次实验均能得到S型扩增曲线方则判定为阳性；如果没有扩增曲线或无Ct值产生则判定为阴性。
[0023] 所述多重荧光PCR扩增反应的条件为：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(检测FAM、HEX和CY5荧光)，共50个循环。
[0024] 所述PCR反应体系为25μl，各成分终浓度为：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L 2+
Mg ，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上游引物、0.04μmol/L LTR下游引物、0.04μmol/L GAG上游引物、0.04μmol/L GAG下游引物，0.01μmol/L RNaseP上游引物、0.01μmol/L RNaseP下游引物，0.4μmol/L标签引物Tag，0.16μmol/L LTR荧光探针，0.40μmol/L GAG荧光探针，0.32μmol/L RNase P荧光探针，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。
[0025] 与
现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明试剂盒对艾滋病病病毒HIV前病毒DNA核酸的检测简便快速，具有高度的特异性和灵敏度，检出限可达20拷贝/反应；设计了内控基因的检测有利于监测PCR体系的正常运行，双色荧光探针设计能同时对HIV病毒的LTR基因和GAG基因进行检测避免漏检。针对多重PCR体系，特别设计同源加尾的序列，有利于显著抑制引物二聚体产生而提高检测灵敏度；该方法可直接从
全血或外周血淋巴细胞富积液样本中检测HIV病毒核酸，从核酸提取到完成检测少于3.5小时，有利于HIV感染诊断尤其是HIV窗口期患者、HIV
抗体不确定者、婴儿感染早期诊断等。(四)
附图说明
[0026] 图1多重荧光PCR原理图，A为本发明所述多重荧光PCR检测
流程图：加尾的特异性引物扩增目标
片段，标签引物进一步扩增目标产物，特异性探针与目标片段结合产生荧光
信号；B为加尾引物抑制引物二聚体产生的原理：加尾引物虽可形成二聚体，但其可形成“锅柄”状结构抑制下一步引物二聚体的进一步生成。
[0027] 图2为多重荧光PCR检测LTR基因的灵敏度结果(FAM信号)。
[0028] 图3为多重荧光PCR检测GAG基因的灵敏度结果(HEX信号)。
[0029] 图4为多重荧光PCR检测HIV阳性感染者的典型结果。(五)具体实施方式
[0030] 下面结合具体
实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0031] 实施例1
[0032] 1材料与方法
[0033] 1.1临床标本：
[0034] HIV感染者全血样本来自浙江省疾病
预防控制中心所建立的艾滋病阳性样本库。
[0035] 1.2引物与探针
[0036] 从美国GenBank下载不同亚型的HIV参考株基因序列，用
生物学
软件进行同源性比较，基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为：
[0037] 标签引物Tag：5'-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3'
[0038] LTR上游引物：5'-Tag-GCCTCAATAAAGCTTGCC-3’
[0039] LTR下游引物：5'-Tag-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’
[0040] LTR荧光探针：5'-FAM-AAGTRGTGTGTGCCC-BHQ1-3'；
[0041] GAG上游引物：5'-Tag-TTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAG-3’
[0042] GAG下游引物：5'-Tag-CYCTGCTTGCCCATACTATATGTT-3’
[0043] GAG荧光探针：5'-HEX-ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-BHQ1-3’
[0044] RNase P上游引物：5'-Tag-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
[0045] RNase P下游引物：5'-Tag-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
[0046] RNase P荧光探针：5'-CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3'
[0047] 引物和探针委托上海生工
生物工程有限公司合成。
[0048] 1.3荧光PCR反应体系和条件的优化：
[0049] 选用大连Takara公司的EX Taq酶及配套的dNTP、10×PCR buffer等组分，按说明书操作配置反应体系。针对荧光PCR反应体系主要对包括MgCl2浓度、各引物和探针的浓度、Taq酶用量等进行优化，针对反应程序主要对
退火温度和时间、循环数等进行优化。
[0050] 结果判断：荧光PCR检测以Ct值﹤50并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<40且扩增曲线呈S型可直接判定为阳性；Ct值在40～50之间需重复实验，两次实验均能得到S型扩增曲线方则判定为阳性；如果没有扩增曲线或无Ct值产生则判定为阴性。
[0051] 1.4荧光PCR特异性试验
[0052] 用11例已知健康人的血样和98例已知HIV感染者血样，经提取DNA核酸后进行检测，以考察所建立新方法的特异性。由于HIV具有高度变异性，产生了许多具有独特基因序列特征的组、亚型和流行重组型(Circulating Recombinant Forms，CRFs)。为了考察本方法对于不同型别HIV的检测能力，用已定型的HIV核酸进行实验，包括56例CRF01_AE，13例CRF07_BC，11例CRF08_BC，15例B亚型，2例C亚型和1例G亚型。考察的已定型的HIV核酸涵盖绝大多数浙江省已检测发现的HIV毒株类型。
[0053] 1.5荧光PCR敏感性试验
[0054] 利用pTG19-T载体构建重组质粒作为检测模板，并经计算准确定量其拷贝数。分别在反应体系(同1.3)中加入对应拷贝数的检测模板1×107cps(copies，拷贝数)、1×106cps、1×105cps、1×104cps、1×103cps、500cps、100cps、50cps、10cps和1cps，以此考察(检测体系和程序采用1.3最终优化后的结果)检测体系的灵敏度。
[0055] 根据检测需要在每个反应体系(同1.3，是在前面灵敏度的
基础进一步考察精确的灵敏度(10-100cps/反应))加入10cps、20cps、40cps、50cps、60cps、80cps和100cps检测模板进一步考察(检测体系和程序采用1.3最终优化后的结果，结果发现最终检测灵敏度是20cps/反应)精确的灵敏度。所有的灵敏度实验均设置重复管以考察检测体系的重复性。
[0056] 2结果
[0057] 2.1荧光PCR反应体系及条件
[0058] 通过对荧光PCR反应体系及程序的系列优化，最后构建的多重荧光PCR体系为25μl，各成分终浓度为：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.04μmol/L LTR上下游引物和GAG上下游引物，0.01μmol/L RNaseP上下游引物，0.4μmol/L标签引物，0.16μmol/L LTR探针，0.40μmol/L GAG探针，0.32μmol/L RNase P探针，1.5U Ex Taq，5.0μl DNA模板。用ABI 7500 FAST荧光PCR仪按下列参数进行：94℃3min；94℃15s，52℃20s，72℃30s(检测荧光FAM、HEX和CY5)，50个循环。
[0059] 2.2特异性试验
[0060] 用98例已知HIV感染者(涵盖不同亚型)和11例已知健康人全血样本进行检测结果显示98例已知HIV感染者检测为阳性，11例已知健康人检测为阴性，说明本方法能准确区分HIV感染者和健康人，而且能检测不同亚型的HIV核酸，未出现假阴性现象。
[0061] 2.3敏感性试验
[0062] 通过对1cps～1×107cps的梯度浓度的质粒模板考查，结果本方法的检测灵敏度为10-50cps/反应，进一步细化的质粒模板梯度(10cps～100cps)检测下限为20cps/反应，典型结果如图2和图3。
[0063] 2.4临床样本的检测
[0064] 对HIV感染者的临床全血样本提取核酸后进行检测，结果能得到S型扩增曲线，典型结果见图3。
