技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一种检测待测DNA的数据利用率的方法及其专用引物组。
背景技术
[0002] 目前医学研究的部分样本类型为福尔
马林固定后
石蜡包埋的样本(以下简称石蜡样本)，如研究抑癌基因时需要提取
肿瘤组织的DNA，新鲜的肿瘤组织不能及时供应(尤其是研究肿瘤的转移灶中的抑癌基因的变化时，转移灶的肿瘤组织非常难得)，就需要从包埋肿瘤组织的石蜡样本中提取DNA。然而，在石蜡样本的制作过程中对其中的DNA会造成一定的影响，如组织到石蜡包埋的时间间隔、固定的福尔马林浓度、固定时间长短、包埋前的脱
水程度、保存的年限等。多数的组织经福尔马林固定后DNA的嘌呤之间及
碱基与组蛋白之间形成了以福尔马林为介质的甲基桥，造成分子间的交联或损伤，如甲
醛导致的交联、DNA断裂、碱基位点缺失、胞嘧啶碱基去
氨基化等。从石蜡样本中提取的DNA的数据利用率直接影响到后续实验。
[0003] 从石蜡样本中提取的DNA大多数都处于降解状态，部分降解至主带只有500bp左右。目前临床检测中，将从石蜡样本中提取的DNA的样本分为A类、B类、C类和D类四类。具体如图1所示(M1和M2均为DNA Marker，16、11、13和25均为从石蜡样本中提取的基因组DNA)。通常情况下，A类和B类的样本数据利用率高，可以进行后续实验；C类和D类的样本数据利用率低，但是部分C类和D类的样本可以进行后续实验，部分C类和D类的样本不可以进行后续实验。因此，通过普通的琼脂糖凝胶
电泳评价DNA是否可以进行后续实验有一定的局限性。
[0004] 目前，检测待测DNA的数据利用率，主要采用KAPA Biosystems公司的KAPA Human Genomic DNA Quantification and QC kit进行，但是该
试剂盒价格较高，检测一个样本的价格达到300多元，样本的检测价格甚至比后续建库的成本还高，在样本量较大的情况下有一定的局限性。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何检测待测DNA的数据利用率，从而判断能否进行后续实验，如建库。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了引物组，所述引物组可由特异引物对甲和特异引物对乙组成；
[0007] 所述特异引物对甲可由用于扩增特异DNA
片段甲的两条引物组成；所述特异DNA片段甲中具有人基因组中引物116/51F和引物116R组成的引物对的靶序列；
[0008] 所述特异引物对乙可由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成；所述特异DNA片段乙中具有人基因组中所述引物116/51F和引物51R组成的引物对的靶序列；
[0009] 所述引物116/51F可为如下a1)或a2)：
[0010] a1)
序列表中序列1所示的单链DNA分子；
[0011] a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
[0012] 所述引物116R可为如下b1)或b2)：
[0013] b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
[0014] b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
[0015] 所述引物51R可为如下c1)或c2)：
[0016] c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
[0017] c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
[0018] 上述引物组中，所述特异引物对甲可由所述引物116/51F和所述引物116R组成。所述特异引物对乙可由所述引物116/51F和所述引物51R组成。
[0019] 含有所述引物组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0020] 所述试剂盒包括记载如下内容的载体：以待测DNA或标准溶液为模板，采用所述引物116/51F和所述引物116R进行QPCR，然后以标准溶液中DNA的浓度和相应的CT值绘制标准曲线，进而得到待测DNA的Q116bp；以待测DNA或标准溶液为模板，采用所述引物116/51F和所述引物51R进行QPCR，然后以标准溶液中DNA的浓度和相应的CT值绘制标准曲线，进而得到待测DNA的Q51bp；根据Q116bp和Q51bp的差异对待测DNA的数据利用率进行预测。
[0021] 所述载体记载有如下内容：所述“根据Q116bp和Q51bp的差异对待测DNA的数据利用率进行预测”为根据Q116bp和Q51bp的比值进行如下预测：
[0022] (D1)如果Q116bp/Q51bp≥0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为35％以上；
[0023] (D2)如果0.18≤Q116bp/Q51bp<0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为22％以上；
[0024] (D3)如果不满足(D1)和(D2)中的任何一种情况，则待测DNA数据利用率小于22％。
[0025] 所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的制备方法可包括将所述引物组中的所述引物116/51F、所述引物116R和所述引物51R分别单独
包装的步骤。
[0026] 所述引物组的应用也属于本发明的保护范围；所述引物组的应用可为如下d1)或d2)：
[0027] d1)制备用于检测待测DNA数据利用率的试剂盒；
[0028] d2)检测待测DNA数据利用率。
[0029] 所述试剂盒在检测待测DNA数据利用率中的应用也属于本发明的保护范围。
[0030] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测DNA数据利用率的方法。
[0031] 本发明所提供的检测待测DNA数据利用率的方法，可包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)和步骤(d)：
[0032] 所述步骤(a)：以待测DNA为模板，采用所述引物组中所述引物116/51F和所述引物116R进行QPCR；
[0033] 所述步骤(b)：以待测DNA为模板，采用所述引物组中所述引物116/51F和所述引物51R进行QPCR；
[0034] 所述步骤(c)：以标准溶液为模板，采用所述引物组中所述引物116/51F和所述引物116R进行QPCR；然后以标准溶液中DNA的浓度和相应的CT值绘制标准曲线，将所述步骤(a)得到的CT值代入所述标准曲线，得到待测DNA的Q116bp；
[0035] 所述步骤(d)：以标准溶液为模板，采用所述引物组中所述引物116/51F和所述引物51R进行QPCR；然后以标准溶液中DNA的浓度和相应的CT值绘制标准曲线，将所述步骤(b)得到的CT值代入所述标准曲线，得到待测DNA的Q51bp；
[0036] 根据Q116bp和Q51bp的差异对待测DNA的数据利用率进行预测。
[0037] 上述方法中，所述“根据Q116bp和Q51bp的差异对待测DNA的数据利用率进行预测”为根据Q116bp和Q51bp的比值对待测DNA的数据利用率进行如下预测：
[0038] (D1)如果Q116bp/Q51bp≥0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为35％以上；
[0039] (D2)如果0.18≤Q116bp/Q51bp<0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为22％以上；
[0040] (D3)如果不满足(D1)和(D2)中的任何一种情况，则待测DNA数据利用率小于22％。
[0041] 上述任一所述待测DNA可为石蜡样本的DNA。
[0042] 上述任一所述待测DNA可为人
全血样本的基因组DNA。
[0043] 上述任一所述标准溶液可为溶液1、溶液2、溶液3或溶液4。具体制备方法如下：取YH-DNA，用含0.05％(v/v)Tween的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液稀释，依次获得YH-DNA浓度为10ng/μL的溶液1、YH-DNA浓度为5ng/μL的溶液2、YH-DNA浓度为2.5ng/μL的溶液3、YH-DNA浓度为1.25ng/μL的溶液4。所述YH-DNA具体可为亚洲人细胞系的基因组DNA。
[0044] 上述任一所述数据利用率、Q116bp和Q51bp均可采用Hiseq 101+8+101测序平台及模式得到。通过比较数据利用率的高低，可以确定DNA分子的损伤程度，进而预测能否进行后续实验(如建库)。数据利用率为35％以上，DNA分子的损伤程度较轻，可以进行后续实验；数据利用率为22％以上，DNA分子的损伤程度较重，但仍可以进行后续实验；数据利用率小于22％，DNA分子的损伤程度较重，且不可以进行后续实验。
[0045] 从石蜡样本中提取的DNA一般存在交联或损伤，如甲醛导致的交联、DNA断裂、碱基位点缺失、胞嘧啶碱基去氨基化等，但交联或损伤的程度无法获知。实验证明，采用本发明提供的方法及其专用引物组可以检测对从石蜡样本中提取的DNA的数据利用率，根据数据利用率预测能否进行后续实验。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
[0046] 图1从石蜡样本中提取的DNA的样本分类。
[0047] 图2采用引物对甲进行QPCR的
溶解度曲线。
[0048] 图3采用引物对乙进行QPCR的溶解度曲线。
[0049] 图4采用引物对甲进行QPCR的标准曲线。
[0050] 图5采用引物对乙进行QPCR的标准曲线。
具体实施方式
[0052] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0053] 10×buffer和dNTP均为TAKARA公司的产品，产品目录号依次为RR006B和RR006B。MgSO4为NEB公司的产品，产品目录为B9004S。TWEEN20 100×为SIGMA公司的产品，产品目录号为P9416。EVA为BIOTIUM公司的产品，产品目录号为31000。ROX为INVITROGEN公司的产品，产品目录号为12223-012。HS TAQ为TAKARA公司的产品，产品目录号为RR006B。
[0054] 实施例1、检测待测DNA数据利用率的引物组的合成
[0055] 检测待测DNA数据利用率的引物组由引物116/51F、引物116R和引物51R组成。各个引物的核苷酸序列如下：
[0056] 引物116/51F：5′-ACTGGCAGCAAGAAAATATGCTA-3′(序列表中的序列1)；
[0057] 引物116R：5′-CCTTATAGGAAACTTCACATCACAGC-3′(序列表中的序列2)；
[0058] 引物51R：5′-CTGGAAAACCCAACTTCTGTACAA-3′(序列表中的序列3)。
[0059] 人工合成引物116/51F、引物116R和引物51R。
[0060] 实施例2、检测待测DNA数据利用率的方法的建立
[0061] 大MIX(7.85μL)由1μL10×buffer、0.1μL MgSO4、0.1μL TWEEN20 100×、0.5μL DMSO、3.35μL ddH2O、2μL Betaine水溶液(浓度为5mol/L)和0.8μL dNTP组成。
[0062] YH-DNA：从深圳华大基因研究院培养的亚洲人细胞系中提取基因组DNA(Wang,J.，et al.，The diploid genome sequence of an Asian individual.Nature，2008.456(7218)：p.60-65).
[0063] 一、标准曲线的制备
[0064] 1、取YH-DNA，用含0.05％(v/v)Tween的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液稀释，依次获得YH-DNA浓度为10ng/μL的溶液1、YH-DNA浓度为5ng/μL的溶液2、YH-DNA浓度为2.5ng/μL的溶液3、YH-DNA浓度为1.25ng/μL的溶液4。
[0065] 2、以步骤1获得的溶液(溶液1、溶液2、溶液3或溶液4)为模板，采用引物对甲(由引物116/51F和引物116R组成)或引物对乙(由引物116/51F和引物51R组成)进行QPCR(需检测三个平行样)。
[0066] 反应体系：0.5μL EVA、0.2μL ROX、0.1μL引物116/51F(浓度为10μM)、0.1μL引物116R或引物51R(浓度为10μM)、0.1μL HS TAQ、7.85μL大MIX、1μL溶液(溶液1、溶液2、溶液3或溶液4)和0.15μL H2O。
[0067] 反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，62℃30s，40个循环；62℃收集
信号。
[0068] 采用引物对甲进行QPCR的溶解度曲线见图2。采用引物对乙进行QPCR的溶解度曲线见图3。
[0069] 以模板在反应体系中的浓度为横坐标，对应的CT值为纵坐标，调整标准曲线。常规的QPCR处理数据，扩增效率尽量保持90％-110％，R2≥0.99，标准曲线的斜率在-3.1至-3.6间，
阈值调至0.096。
[0070] 采用引物对甲调整QPCR的标准曲线见图4。采用引物对乙调整QPCR的标准曲线见图5。
[0071] 二、检测待测DNA数据利用率的方法的建立
[0072] 1、取待测DNA，用含0.05％(v/v)Tween的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液稀释，得到浓度为2ng/μL的待测DNA。
[0073] 2、以步骤1获得的浓度为2ng/μL的待测DNA为模板，采用引物对甲或引物对乙进行QPCR(需检测三个平行样)。
[0074] 反应体系：0.5μL EVA、0.2μL ROX、0.1μL引物116/51F(浓度为10μM)、0.1μL引物116R或引物51R(浓度为10μM)、0.1μL HS TAQ、7.85μL大MIX、1μL待测DNA(浓度为2ng/μL)和
0.15μL H2O。
[0075] 反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，62℃30s，40个循环；62℃收集信号。
[0076] 3、完成步骤2后，QPCR仪器(本实施例采用Hiseq 101+8+101测序平台及模式)根据步骤一的标准曲线自动生成待测DNA的Q116bp和Q51bp，然后计算Q116bp和Q51bp的比值(即Q116bp/Q51bp)，并进行如下判断：
[0077] (D1)如果Q116bp/Q51bp≥0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为35％以上；
[0078] (D2)如果0.18≤Q116bp/Q51bp<0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10，则待测DNA数据利用率为22％以上；
[0079] (D3)如果不满足(D1)和(D2)中的任何一种情况，则待测DNA数据利用率小于22％。
[0080] 实施例3、准确性实验
[0081] 一、实验一
[0082] 待测样本为6例临床新鲜采集的人类全血样本。理论上这6例人类全血样本的基因组DNA的Q116bp/Q51bp≈1。
[0083] 提取待测样本的基因组DNA，然后按照实施例2建立的方法检测。Qubit定量结果见表1中第3列。常规胶图
质量的部分判定结果见表1中第4列。按照实施例2建立的方法检测的部分实验结果见表1中第5列。结果表明，6例人类全血样本的基因组DNA的Q116bp/Q51bp与理论值完全一致。
[0084] 表1.人类全血DNA评价结果
[0085]样本编号 DNA编号 Qubit(ng/μL) 胶图质量 Q116bp/Q51bp
16B0144709 16D0144709-A 86.40 A 1.08
16B0144806 16D0144806-A 35.60 A 0.92
16B0144808 16D0144808-A 44.00 A 1.05
16B0144809 16D0144809-A 89.20 A 1.00
16B1725148 16D1725148-A 56.20 A 1.04
16B1725079 16D1725079-A 61.20 A 0.92
[0086] 二、实验二
[0087] 待测样本为114例临床制作的包埋人组织的石蜡样本。理论上这114例石蜡样本DNA的Q116bp/Q51bp<1。
[0088] 提取待测样本的DNA，然后按照实施例2建立的方法检测。部分实验结果见表2、表3、表4和表5。结果表明，114例石蜡样本DNA的Q116bp/Q51bp<1，与实际情况完全一致；Q116bp/Q51bp≥0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10的石蜡样本的DNA的数据利用率为35％以上，0.18≤Q116bp/Q51bp<0.4、Q116bp≥10且Q51bp≥10的石蜡样本的DNA的数据利用率为22％以上，其余石蜡样本的DNA的数据利用率小于22％。
[0089] 表2.样本评价后测序数据-1
[0090]
[0091] 表3.样本评价后测序数据-2
[0092]
[0093] 表4.样本评价后测序数据-3
[0094]
[0095]
[0096] 表5.样本评价后测序数据-4
[0097]
[0098] 实施例4、引物的特异性实验
[0099] 一、对照引物组的合成
[0100] 对照引物组为对照引物组一或对照引物组二。
[0101] 对照引物组一由引物119/54F、引物119R和引物54R组成。对照引物组二由引物117/52F、引物117R和引物52R组成。
[0102] 各个引物的核苷酸序列如下：
[0103] 引物119/54F：5′-CCAGACTGGCAGCAAGAAAAT-3′；
[0104] 引物119R：5′-CCTTATAGGAAACTTCACATCACAGC-3′；
[0105] 引物54R：5′-CTGGAAAACCCAACTTCTGTACAA-3′；
[0106] 引物117/52F：5′-GACTGGCAGCAAGAAAATATGCTA-3′；
[0107] 引物117R：5′-CCTTATAGGAAACTTCACATCACAGC-3′；
[0108] 引物52R：5′-GATGGAAAACCCAACTTCTGTACAAC-3′。
[0109] 二、引物的特异性实验
[0110] 按照实施例2步骤一的方法，将引物对甲替换为引物对1(由引物119/54F和引物119R组成)、引物对2(由引物119/54F和引物54R组成)、引物对3(由引物117/52F和引物117R组成)或引物对4(由引物117/52F和引物52R组成)，其它步骤均不变。根据QPCR实验的溶解度曲线，判断引物的特异性。判断标准为：如果溶解度曲线为单峰且峰形偏窄，无明显引物二聚体，则引物的特异性较高；否则引物的特异性较差。
[0111] 引物对1进行QPCR的溶解度曲线见图6中A。引物对3进行QPCR的溶解度曲线见图6中B。引物对2进行QPCR的溶解度曲线见图6中C。结果表明，引物对1、引物对2、引物对3和引物对4的溶解度曲线的峰形非单峰，引物的特异性较差。
