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一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法

阅读：212发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法，属于食品分析和食品安全技术领域。本发明构建一种应用HS-SPME-Arrow技术快速检测酒精饮料中EC含量的方法，与GC-MS的SIM模式相结合，克服其他高含量物质的干扰，以EC-D5作为内标，通过比较不同的前处理手段、萃取头纤维、萃取条件、检测器升温程序等方式，开发出一种经济灵敏、适用性广、易于定量的检测方法；采用加标回收实验对该方法进行评价，并以该方法的检测限等参数为依据，说明能满足酒精饮料中EC污染状况调查的要求；采用优化后的方法对市售酒精饮料中EC含量进行调查，证明该方法在蒸馏酒和发酵酒中均可适用。，下面是一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的预处理方法，其特征在于，所述方法为采用HS-SPME-Arrow固相微萃取技术对待测酒精饮料进行萃取；HS-SPME-Arrow萃取头涂层材料包括100μm PDMS、100μm PA、120μm DVB/PDMS、120μm CAR/PDMS或120μm DVB/CAR/PDMS。
2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的酒精饮料样品酒精度稀释为2-15％vol。
3.根据权利要求2所述的预处理方法，其特征在于，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的加盐量为0.2～0.6g/mL稀释后的酒样。
4.根据权利要求1-3任一所述的预处理方法，其特征在于，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的萃取温度为35～70℃；萃取时间为30-60min。
5.一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法，其特征在于，所述方法是采用权利要求1～4任一所述的预处理方法处理待测样品，之后联用GC-MS结合内标法检测待测样品中的氨基甲酸乙酯含量。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述内标物为氨基甲酸乙酯-D5。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述GC-MS中色谱条件：毛细管色谱柱为DB-FFAP，升温程序为：初始柱箱温度40-50℃，保持2-4分钟后以5-8℃/分钟升温到150-
170℃，再以10℃/分钟升温到230-250℃，保持3-5分钟。
8.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述GC-MS中质谱条件：离子源电压为70eV，离子源温度为200-250℃，传输线温度为240℃，检测器电压为1430V；采集质量数范围为35-400amu，采集频率为50-200spectra/s。
9.根据权利要求1～8任一所述的方法，其特征在于，所述酒精饮料包含蒸馏酒或发酵酒。
10.权利要求1～4任一所述的预处理方法或权利要求5～8任一所述的检测方法在检测氨基甲酸乙酯含量的应用。

说明书全文

一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法，属于食品分析和食品安全技术领域。

背景技术

[0002] 酒精饮料(白酒、黄酒、啤酒、葡萄酒等)是传统发酵工业非常重要的一部分产品，也是全球范围广泛消费的饮料，但在其发酵过程中可能衍生出一些有害的化学物质，危害消费者身体健康。特别是，在酒精饮料的发酵、加热和储存过程中，会伴随产生一种叫做氨基甲酸乙酯(EC)的多位点致癌物，能在动物体内引发多种癌症且可遗传。

[0003] 由于EC属于低分子量物质，它的检测很容易受到基质效应的影响，较适合依靠仪器分析检测，随着检测仪器的不断更新，越来越多的先进技术被应用于EC的分析中，比如高效液相色谱仪(HPLC)结合荧光检测器(FLD)或质谱检测器(MSD)、气相色谱仪(GC)与质谱仪(MS)联用、全二维色谱技术等，其中，GC-MS相对简单，可以提供一种灵敏度高、选择性好的方法，对痕量物质能进行明确的定性和定量工作。EC在酒精饮料中属于痕量物质，前处理方法直接影响到其检测，常用的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、固相微萃取等。目前，关于酒精饮料中EC检测的现有标准有SN/T 0285-2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法》，采用固相萃取的前处理方式结合仪器分析，通过外标法进行定量，但是这种方法对样品的预处理非常复杂，材料重复使用率差，成本高，而且外标法的准确度和稳定性有待提高。液液萃取同样存在过程繁琐，耗时长等缺点，萃取剂一般为有毒化学试剂，使用不当会对操作人员造成一定伤害。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明构建一种应用HS-SPME-Arrow技术快速检测酒精饮料中EC含量的方法，与GC-MS的SIM模式相结合，克服其他高含量物质的干扰，以EC-D5作为内标，通过比较不同的前处理手段、萃取头纤维、萃取条件、检测器升温程序等方式，开发出一种经济灵敏、适用性广、易于定量的检测方法；采用加标回收实验对该方法进行评价，并以该方法的检测限等参数为依据，期望能满足酒精饮料中EC污染状况调查的要求；采用优化后的方法对市售酒精饮料中EC含量进行调查，验证该方法的适用范围。

[0005] 本发明的第一个目的是提供一种检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的预处理方法，所述方法为采用HS-SPME-Arrow固相微萃取技术对待测酒精饮料进行萃取；HS-SPME-Arrow萃取头涂层包括100μm PDMS、100μm PA、120μm DVB/PDMS、120μm CAR/PDMS或120μm DVB/CAR/PDMS。

[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的酒精饮料样品酒精度稀释为2-15％vol。

[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的加盐量为0.2～0.6g/mL稀释后的酒样。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的萃取温度为35～70℃。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述HS-SPME-Arrow固相微萃取技术的萃取时间为30-60min。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，HS-SPME-Arrow前处理具体操作步骤为：将样品用超纯水稀释至2～15％vol，取5mL稀释后的酒样及1～3g 氯化钠置于20mL顶空瓶中，密封后通过多功能自动进样系统MPS2进行HS-SPME操作，酒精饮料样品在35～70℃下平衡5～10min，萃取30～60min，转速设置为400～1000r/min。

[0011] 优选地，HS-SPME-Arrow固相微萃取条件为：酒精度稀释为6-15％vol；加盐量为0.2-0.4g/mL稀释后的酒样；萃取温度为60～70℃；萃取时间为45-60min。

[0012] 进一步优选地，HS-SPME-Arrow固相萃取条件为：将样品用超纯水稀释到酒精度为10％vol，取5mL稀释后的酒样及1.5g氯化钠置于20mL顶空瓶中，萃取温度为60℃，萃取时间为45分钟。

[0013] 本发明的第二个目的是提供一种快速检测酒精饮料中氨基甲酸乙酯含量的方法，所述方法是采用上述预处理方法处理待测样品，之后联用GC-MS结合内标法检测待测样品中的氨基甲酸乙酯含量。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述内标物为氨基甲酸乙酯-D5。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述GC-MS中色谱条件：毛细管色谱柱为DB-FFAP，升温程序为：初始柱箱温度40-50℃，保持2-4分钟后以5-8℃/分钟升温到150-170℃，再以10℃/分钟升温到230-250℃，保持3-5分钟。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述GC-MS中质谱条件：离子源电压为70eV，离子源温度为200-250℃，传输线温度为240℃，检测器电压为1430V；采集质量数范围为35-400amu，采集频率为50-200spectra/s。

[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述酒精饮料包含蒸馏酒或发酵酒。

[0018] 本发明的第三个目的是提供一种上述方法在检测氨基甲酸乙酯含量的应用。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 本发明将HS-SPME-Arrow技术应用在酒精饮料的EC检测中，集采样、萃取、进样于一体，单个样品分析只需要37min，所构建方法不受酒精饮料种类的限制，在蒸馏酒和发酵酒中均可适用。该方法的线性相关系数R2>0.99，线性良好；加标回收率为92.87％～107.83％，精密度良好；相对标准偏差(RSD)<5％，方法的准确度良好；检测限为0.81μg/L，定量限为2.7μg/L，灵敏度高，可以满足酒精饮料中EC分析检测的要求。
附图说明

[0021] 图1：实施例2的五种不同萃取头涂层对EC检测的影响图。

[0022] 图2：实施例3的酒精度对EC检测的影响图。

[0023] 图3：实施例3的NaCl添加量对EC检测的影响图。

[0024] 图4：实施例3的萃取温度对EC检测的影响图。

[0025] 图5：实施例3的萃取时间对EC检测的影响图。

[0026] 图6：实施例4的37分钟和47分钟升温程序对EC检测的影响图。

[0027] 图7：对比例1的HS-SPME-Arrow-GC-MS和HS-SPME-GC-MS对EC检测的影响图。

具体实施方式

[0028] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

[0029] 设备：HS-SPME-Arrow萃取头DVB/CAR/PDMS(2cm,50/30μm，瑞士思特斯分析仪器有限公司)，气相色谱-质谱联用仪7890N GC-5977MS(美国安捷伦公司)，毛细管色谱柱DB-FFAP(60m×0.25mm×0.25μm，美国安捷伦公司)，多功能自动进样系统MPS 2(德国Gerstel公司)，超纯水仪Milli-Q(美国密理博公司)；超声波清洗仪SB-25-12D(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

[0030] 试剂：氨基甲酸乙酯标准品(纯度大于99％，美国sigma公司)，氨基甲酸乙酯-D5标准品(纯度大于98％，百灵威公司)，色谱级乙醇(美国Sigma-Aldrich公司)，正构烷烃C5～C30(美国Sigma-Aldrich公司)，氯化钠(中国国药上海化学试剂公司)

[0031] 酒样：主要分为发酵酒和蒸馏酒两种，以葡萄酒和黄酒为发酵酒代表，以白酒为蒸馏酒代表，共检测酒精饮料19份，包括7种黄酒(H1-H7)，6种葡萄酒(W1-W6)和6种白酒(B1-B6)，尽可能涵盖人们日常消费的酒精饮料品牌和种类。

[0032] 实施例1：采用HS-SPME-Arrow-GC-MS检测酒精饮料

[0033] 前处理方法：称量1.5g氯化钠于20mL顶空瓶中，加入5mL稀释后酒精度为10％vol的酒样，用微量进样器加入50μL的EC-D5(10mg/L)为内标，用带有PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封，通过自动进样系统进行顶空固相微萃取。

[0034] 采用HS-SPME-Arrow固相微萃取技术进样，涂层为2cm 1.1mm/120μm三相萃取头(DVB/CAR/PDMS)，萃取温度60℃，样品平衡时间5min，振动速度为250rmp，萃取深度22mm，萃取时间45min，进样深度38mm，萃取完成后，将萃取头置于气相色谱注射口，在250℃下解吸附5min，然后进行气质检测分析。

[0035] 色谱条件：载气为高纯He，纯度>99.999％，载气流速1mL/min，初始柱箱温度50℃，保持2分钟后以5℃/分钟升温到170℃，再以10℃/分钟升温到230℃，保持5分钟。进样口温度250℃。

[0036] 质谱条件：离子源电压为70eV，离子源温度为230℃，传输线温度为240℃，检测器电压为1430V；采集质量数范围为35-400amu，采集频率为100spectra/s。

[0037] 实施例2：HS-SPME-Arrow萃取头涂层的选择

[0038] 萃取头涂层纤维的选择是HS-SPME-Arrow方法的关键，对2cm 1.1mm/100μm PDMS、2cm 1.1mm/100μm PA、2cm 1.1mm/120μm DVB/PDMS、2cm 1.1mm/120μm CAR/PDMS、2cm
1.1mm/120μm DVB/CAR/PDMS五种型号的萃取头涂层进行选择，其他参数参考实例1，结果如图1所示。可以看出不同萃取头吸附EC的量不同，三相萃取头DVB/CAR/PDMS的吸附效果最好，其次是CAR/PDMS和PA，PDMS对EC的吸附效果最差。这是由于不同材料的涂层的极性、选择性、稳定性都不同，EC作为一种极性亲水化合物，用具有极性纤维膜的萃取头萃取效果好，因此本研究选择吸附效果最好的DVB/CAR/PDMS三相萃取头。

[0039] 实施例3：HS-SPME-Arrow萃取条件的选择

[0040] 当酒精饮料中乙醇浓度较高时，会显著抑制EC的吸附，因此选择不同的酒精稀释度2％vol、4％vol、6％vol、8％vol、10％vol、15％vol对待测样品中的EC进行检测，用超纯水稀释到对应酒精度后，按实施例1所述进行HS-SPME-Arrow-GC-MS分析，所检测到的EC峰面积如图2所示。可见，随着酒精度的增加，EC峰面积增大，但酒精度继续增加，乙醇会在萃取头上产生竞争性吸附，降低EC的响应值，所以对于酒精度较高的蒸馏酒等，可以通过稀释降低高酒精浓度的竞争性作用来提高检测的灵敏度。最终选择10％vol为样品的稀释后酒精度。

[0041] 在样品中添加NaCl可利用盐析效应改变化合物进入涂层的分配系数，使EC这样的极性小分子在液相中的溶解度下降，更容易从液相向气相转移，提高萃取的效率。考虑到NaCl的溶解度，在待测酒样中分别添加0、1.5、3g的NaCl，其他实验参数参考实施例1，考察离子强度对萃取效果的影响，结果见图3。可见，添加1.5gNaCl的酒样萃取效果比不添加的峰面积高出一倍，离子的添加确实对液体基质中组分的顶空吸附有促进作用，继续添加时，酒样中NaCl已接近饱和，峰面积变化不大，且浪费药品，综合考虑，本发明选择NaCl添加量为1.5g作为离子强度调节剂，即0.3g/mL酒样。

[0042] 萃取温度对萃取效果有较大的影响，在一定范围内随着温度的上升，萃取效率会有所提高。比较萃取温度在40℃、50℃、60℃、70℃下的萃取效率，其相应的EC峰面积如图4所示，可以看出，当萃取温度在60℃以上时，EC的响应值变化不明显，而且当萃取温度在60℃以上时会有干扰峰出现，可能是高温造成了某些化合物的分解，影响目标物的检测，所以选择60℃为最佳萃取温度。

[0043] 对于EC的顶空萃取，一般需要较长的时间才能达到平衡，这是由于酒样的复杂基质导致对EC的竞争性吸附。比较15、30、45和60min的萃取时间对萃取效率的影响，如图5所示。30min的峰响应值比15min时增加显著，45min时峰面积处于最大值，再延长萃取时间峰面积增加并不明显。从提高效率的角度考虑，本发明选用的HS-SPME-Arrow前处理的萃取时间为45min。

[0044] 实施例4：GC-MS升温程序的优化

[0045] 对GC-MS的升温程序进行优化，通过查阅文献，找到了多种用于EC检测的升温程序，对其中两种具有代表性的程序进行比较，分别为：柱箱初始温度50℃，保持2min后以5℃/min升温到130℃，保持10min，再以10℃/min升温到230℃，保持9min，总共耗时47min；第二种是柱箱初始温度50℃，保持2min后以5℃/min升温到170℃，再以10℃/min升温到230℃，保持5min，总共耗时37min。按照实施例1中所述方法对酒样中EC提取后，通过37min或47min升温程序检测萃取得到的EC，两种升温程序分析后的色谱图如图6所示，深色表示
37min的升温程序结果，浅色表示47min的升温程序结果，可以发现这两种升温程序的响应和峰形相似，47min的峰宽较宽、略有拖尾现象，从节约成本上考虑，本研究选择总耗时较短的37min升温程序。

[0046] 实施例5：方法学验证

[0047] 对标准系列工作液用所优化的方法进行检测，EC的62m/z和EC-D5的64m/z峰面积手动积分校正后，以峰面积的比值为x轴，系列工作液的浓度与内标浓度的比值为y轴，构建2
EC的标准曲线，曲线相关系数R ＝0.9973，表明该标准曲线在较宽的浓度范围内有良好的线性，可以用于EC的定量检测。以3倍和10倍信噪比时的物质浓度对方法检测限和定量限进行估测，计算得本方法的检测限为0.81μg/L，定量限为2.7μg/L。根据酒样中EC的大概含量范围设定三个不同浓度水平进行添加，分别计算出回收率和精密度，测定结果如表1所示，此样品中EC的本底值为127.03μg/L，加标实验的平均回收率在92.87％～107.83％范围内，可以证明方法的准确度较高；相对标准偏差(RSD)在0.23％-4.48％之间，在国标要求的
10％范围以内，证明此方法的灵敏度较高，其准确度和精密度都能满足酒精饮料中EC分析检测的要求。

[0048] 表1 EC的回收率和精密度(n＝3)

[0049]

[0050] 实施例5：方法适用性分析

[0051] 用所构建的优化方法对市售19份酒精饮料(7种黄酒，6种白酒、6种葡萄酒)进行EC含量检测，按照类型进行分类汇总，结果如表2所示。在所检测的酒精饮料样品中，黄酒和白酒的EC检出率为100％，黄酒EC含量范围为58μg/L～177μg/L，平均含量为117.45μg/L；白酒EC含量范围为52μg/L～342μg/L，平均含量为212.08μg/L；而在所选葡萄酒样品中，EC仅在一种葡萄酒中被检出，且浓度很低、检测值为22.12μg/L。可以看出，EC在发酵过程中天然产生，而且在酒精饮料中检出率较高，平均含量范围较宽，其中以白酒为代表的蒸馏酒中EC含量明显高于发酵酒中，对不同酒精饮料检测的实验结果表明，所建立的方法能够快速准确地对EC进行分析检测，而且不受酒精饮料种类的限制，在蒸馏酒和发酵酒中均有不错的表现。

[0052] 表2市售酒精饮料的EC含量

[0053]

[0054] 对比例1：

[0055] 采用GC-MS检测HS-SPME-Arrow和HS-SPME萃取得到的EC，将实施例1中的SPME Arrow技术替换成SPME技术，其他条件或者参数与实施例1一致，两种前处理方法处理后的色谱图如图7所示，深色线条表示HS-SPME-Arrow技术的萃取结果，浅色线条表示普通HS-SPME的萃取结果，可以明显看出经过HS-SPME-Arrow技术前处理的目标峰峰形和响应更好，EC与EC-D5也能较好分离，这与它涂层面积大、吸附微量物质更多相符，比普通HS-SPME更适合用于EC的定量检测。

[0056] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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