急性反应期蛋白SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用
阅读：845发布：2020-05-08
专利汇可以提供急性反应期蛋白SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且急性反应期蛋白SAA1在构建 电离 辐射 后致死性 预测模型 或制备 试剂 盒 、试剂中的应用，属于核辐射损伤检测技术领域。为了解决如何预测或评估待测个体辐射致死性，本 发明 提供了一种待测个体接受 电离辐射 后，体内急性反应期蛋白SAA1含量的二次增加作为致死指标，在评估受照个体受到电离辐射后的致死性中的应用，如构建评估预测模型、相关产品试剂盒或试剂。此外，本发明还证明了SAA1或SAA1与外周血淋巴细胞数量联合可检测受照个体受照剂量或区分受照剂量范围，可用于制备相关检测试剂盒或试剂。本发明有利于放射损伤的评估及检测。，下面是急性反应期蛋白SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用专利的具体信息内容。
1.急性反应期蛋白SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测模型的因变量为致死指标，所述致死指标为待测个体接受电离辐射后，体内急性反应期蛋白SAA1含量的二次增加。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
4.急性反应期蛋白SAA1在制备评估或预测电离辐射后致死性的试剂盒或试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述急性反应期蛋白SAA1在待测个体经辐射后含量二次增加作为所述试剂盒的靶向检测指标。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
7.急性反应期蛋白SAA1在制备评估电离辐射药物药效和/或预后的试剂盒或试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
9.急性反应期蛋白SAA1在制备检测电离辐射后受照剂量或区分受照剂量范围的试剂盒或试剂中的应用。
10.急性反应期蛋白SAA1与外周血淋巴细胞数量联合在制备检测电离辐射后受照剂量或区分受照剂量范围的试剂盒或试剂中的应用。
急性反应期蛋白SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型或制
备试剂盒、试剂中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于核辐射损伤检测技术领域，具体涉及一种急性反应期蛋白SAA1在构建电离 辐射后致死性预测模型或制备试剂盒、试剂中的应用。
背景技术
[0002] 核恐怖袭击、核电站事故、放射源事故等情况可造成处在上述环境中的人体产生急性放 射损伤。不同程度放射性损伤采用的救治方案不同，比如，轻度放射性损伤通过营养、休息 等支持性治疗方式逐步恢复，而致死性照射需要采用骨髓移植等方式进行治疗。如何判断人 员是否受照以及受照人员受到的放射损伤是否致死至关重要！
[0003] SAA1是一种急性反应期蛋白，它在局部或轻微炎症可有十倍左右升高，在机体出现严 重感染时会有上百倍的升高。SAA1主要由肝脏合成，由如LPS这样的外源的Toll样受体配 体，及如白介素1β、白介素6和肿瘤坏死因子这样的内源的细胞因子诱导产生。此外，除肝 脏外的其他人体组织，如乳腺组织、结肠、食道、肾脏、大肠、脑垂体及脾脏都可检测到SAA1。 由SAA1基因编码的SAA1蛋白在人和小鼠中高度相似，并在高密度脂蛋白重塑，脂质代谢， 抗菌感染，免疫调节和肿瘤病理学中起作用。
[0004] 在发生放射性事件时，需要大规模的人口筛选来对暴露的个体进行分类，而随后的受照 剂量评估是对大规模伤亡的紧急受害者的重要初步筛查。根据暴露剂量不同，有的仅需要支 持性护理，而对于高剂量的暴露，则需要医疗干预，如干细胞移植。因此，对于受照剂量的 估计，可以判断患者的暴露剂量是否需要谨慎部署的医疗资源和护理。
[0005] 然而由于个体差异，个体损伤程度会有很大差异，因此直接评估辐射损伤程度才是最终 目标。而在估计辐射剂量的前提下，对受到相同剂量辐射的严重受损个体的识别仍然是一个 挑战。专利申请CN 110308285A中公开了急性反应期蛋白SAA与IL-1α联合作为组合标志物可 用于评估待测个体受照射剂量，但是由于该组合标志物在死亡组和存活组之间没有差异，导 致该组合标志物也难以用于预测死亡率。
发明内容
[0006] 针对如何预测或评估待测个体辐射致死性的问题，本发明提供了一种急性反应期蛋白 SAA1在构建电离辐射后致死性预测模型中的应用。
[0007] 进一步地限定，所述预测模型的因变量为致死指标，所述致死指标为待测个体接受电离 辐射后，体内急性反应期蛋白SAA1含量的二次增加。
[0008] 进一步地限定，所述二次增加是指在待测个体接受电离辐射后，体内急性反应期蛋白SAA1含量首次增加后下降，然后再次迅速增加。
[0009] 进一步地限定，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
[0010] 本发明还提供了急性反应期蛋白SAA1在制备评估或预测电离辐射后致死性的试剂盒或 试剂中的应用。
[0011] 进一步地限定，所述急性反应期蛋白SAA1在待测个体经辐射后含量二次增加作为所述 试剂盒的靶向检测指标。
[0012] 进一步地限定，所述二次增加是指在待测个体接受电离辐射后，体内急性反应期蛋白 SAA1含量增加后下降，然后再次迅速增加。
[0013] 进一步地限定，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
[0014] 进一步地限定，所述SAA1单独作为检测靶标即可获得评估或预测结果。
[0015] 本发明还提供了急性反应期蛋白SAA1在制备评估电离辐射药物药效和/或预后的试剂盒 或试剂中的应用。
[0016] 进一步的限定，所述电离辐射的强度为8Gy以上。
[0017] 进一步的限定，所述药物用于预防或治疗电离辐射。
[0018] 进一步的限定，所述药物选自小分子多肽。
[0019] 进一步地限定，所述急性反应期蛋白SAA1单独作为评估的靶标蛋白。
[0020] 进一步地限定，所述急性反应期蛋白SAA1在待测个体经辐射后含量二次增加作为所述 试剂盒的靶向检测指标。
[0021] 进一步地限定，所述二次增加是指在待测个体接受电离辐射后，体内急性反应期蛋白 SAA1含量增加后下降，然后再次迅速增加。
[0022] 为了解决如何检测受照个体受照剂量的问题，本发明还提供了一种急性反应期蛋白SAA1 在制备检测电离辐射后受照剂量或区分受照剂量范围的试剂盒或试剂中的应用。
[0023] 本发明还提供了一种急性反应期蛋白SAA1与外周血淋巴细胞数量联合在制备检测电离辐 射后受照剂量或区分受照剂量范围的试剂盒或试剂中的应用。
[0024] 有益效果
[0025] 本发明建立了小鼠辐射模型，并在早期响应于全身和部分身体辐射评估了SAA1表达的 变化，以C57BL/6J小鼠为动物模型进行不同剂量的全身照射，并加氨磷汀进行保护；接受 放射治疗的鼻咽癌患者作为人类受照模型。结果表明，各剂量照射组小鼠血清中SAA1在6 小时内出现不同程度增加，在12小时达到峰值，在第3天降低，从第5天到第7天观察到血 清中SAA1水平第二次增加，且第二次增加与随后的小鼠死亡情况有关，在放射治疗后的鼻 咽癌患者的人血清中同样检测到SAA1增加，上述实验证实了SAA1单独作为人体辐射暴露 中生物标志物的可行性，且SAA1在待测个体接受辐照后第二次升高可作为预测辐射致死的 指标，可用于构建电离辐射后致死性预测模型，预测放射致死性。本发明还证明了SAA1或 SAA1联合外周血淋巴细胞数量，可估算受照个体的辐射剂量，并对剂量范围进行分类，有 助于对受损个体进行识别。
附图说明
附图说明
[0026] 图1.不同剂量全身照射小鼠30天存活率分析、体重分析和外周血细胞分析，其中a为0、 1、2、4、8和12Gy照射雌性C57BL/6J小鼠的30天存活率；b为0、1、2、4、8和12Gy 照射雌性C57BL/6J小鼠的不同时间体重；c-f分别为0、1、2、4、8和12Gy照射雌性C57BL /6J小鼠的不同时间的淋巴细胞、红细胞、血小板和白细胞的数量变化，每组n＝8；
[0027] 图2.不同剂量全身照射后小鼠血清中SAA1的时间和剂量反应，其中a为0、1、2、4、 8和12Gy照射雌性C57BL/6J小鼠在照射后0.125、0.5、1、2、3、5和7天的SAA1浓度； 分别暴露于辐射后第(b)0.25，(c)0.5，(d)1，(e)2，(f)3，(g)5和(h)7天SAA1 浓度随照射剂量的变化情况，每个黑点代表一只动物，每组n＝8；
[0028] 图3.照射后小鼠血清中SAA1浓度和全身感染参数分析，其中a为8Gy全身照射后第 0、1、5和7天，对31只小鼠(第7天7只小鼠，在第0、1和5天每组8只小鼠，图中No.1-No.8) 血清中的SAA1和LPS，以及肝脏中16S rRNA表达量；b为12Gy全身照射后第0、0.125、 0.5、1、2、
3、5和7天，23只小鼠(第7天2只小鼠，第0、0.125、0.5、1、2、3、5天每 组3只小鼠,图中No.1-No.3)血清中的SAA1和PCT浓度；
3、5和7天，23只小鼠(第7天2只小鼠，第0、0.125、0.5、1、2、3、5天每 组3只小鼠,图中No.1-No.3)血清中的SAA1和PCT浓度；
[0029] 图4.局部照射小鼠血清SAA1变化情况，a为C57BL/6J小鼠的肝脏在PBI-1和PBI-3 中屏蔽，在PBI-2和PBI-4组中暴露肝脏；b为在8Gy照射后12小时，对照组，全身照射和 PBI组的血清中SAA1浓度和(c)肝脏中的mRNA表达，每组n＝6，与对照组相比，*P＜ 0.05，**P＜0.01，***P＜0.001和****P＜0.0001；
[0030] 图5.放射治疗对鼻咽癌患者血清SAA1的影响，(a)散点图显示17例鼻咽癌放疗前及 放疗后SAA1浓度(P＜0.0001)；(b)SAA1作为预测鼻咽癌患者放射线暴露生物标志物的 ROC曲线。
具体实施方式
[0032] 下述实施例中所用的实验动物为：雌性C57BL/6J小鼠(6-8周龄)，购买自北京维通利 华实验动物技术公司，在军事科学院军事医学研究院(北京)饲养。小鼠在特定的无病原体， 在控制的温度、湿度下，12/12小时的光/暗循环下被置于统一的笼子中，实验前饲养一周， 称重19-21g。动物的护理和处理按照《中国AMMS实验动物护理和使用指南》进行，所有动 物实验均经北京放射医学研究所(北京)动物护理和使用委员会批准。
[0033] 本发明所述的急性反应期蛋白SAA1，鼠源SAA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示； 氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；人源SAA1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；氨基酸序 列如SEQ ID No.4所示。
[0034] SAA1和降钙素原(PCT)检测使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，其中(小鼠 SAA1 ELISA试剂盒产品信息：EK1190，BOSTER，武汉，中国；人SAA1 ELISA试剂盒产 品信息：EK1544，BOSTER，武汉，中国；PCT ELISA试剂盒产品信息:E1071M，Cuxabo， 武汉，中国，操作方法按说明书。
[0035] 脂多糖测定鲎试剂产品信息:EC80545，biondo，厦门，中国。
[0036] TRIzol产品信息:Invitrogen,Carlsbad,CA,USA。
[0037] PrimeScript RT试剂盒产品信息:Takara,Shiga,Japan。
[0038] iTaq Universal SYBR Green Supermix产品信息:BioRad,Rachmond,CA,USA。
[0039] 天根基因组DNA试剂盒产品信息:天根，北京，中国。
[0040] 实施例1.动物模型照射实验。
[0041] 1.全身照射(TBI)、局部照射和样品采集
[0042] 在时间和剂量反应研究实验中，将小鼠置于有机玻璃透明盒中以防止运动，并用剂量率 为85.08cGy/min的钴-60放射源进行照射，单次照射剂量为0，1,2,4、8和12Gy。
[0043] 在照射后不同时间点(0.25、0.5、1,2,3、5和7天)，摘眼球取全血，随后用脱颈法处 死小鼠。在上述相同辐射条件下，另一组小鼠从尾静脉采集血液20μL，分析血细胞变化，在 辐射后1、3、7、11、15、20、25和30天称重，并观察其存活情况。
[0044] SAA1浓度动态监测的实验中的研究，将小鼠随机订上标有随机数字的耳环，订上耳环 后饲养5天直至恢复正常状态，10Gy照射组小鼠被置于有机玻璃透明盒中，接受剂量率为 73.02cGy/min的60Co源γ射线照射，总剂量为10Gy，各组小鼠分别在照射前4天和照射后 1、3、5、7天从尾静脉采集剂量约40μL静脉血，并观察各组小鼠受照后30天内的存活情况。
[0046] 血清分离，全血4℃静置1小时后，5000rpm/min，4℃离心分离5分钟，保存于-80℃ 备用。
[0047] 2.氨磷汀处理小鼠
[0048] 小鼠随机订上标有随机数字的耳环，订上耳环后饲养5天直至恢复正常状态，照射完成 前0.5小时腹腔注射浓度为150mg/kg的氨磷汀，在照射前4天和照射后1、3、5、7天从尾 静脉采集剂量约为40μL静脉血，并观察各组小鼠受照后30天内的存活情况。
[0049] 3.ELISA
[0050] SAA1和降钙素原(PCT)使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒操作方法按说明书。
[0051] 4.LPS检测
[0052] 使用脂多糖测定鲎试剂检测血清中脂多糖活性。在90μL的样品处理液中稀释10μL血清， 在热固性试管中稀释后，在70℃水浴中放置10分钟，然后冰浴3分钟。血清样品中LPS浓 度采用标准内毒素标准曲线进行测定。
[0053] 5.DNA的分离和定量PCR分析
[0054] 将适量的肝脏切成，放入含有200μL生理盐水的EP管中。根据制造商的说明书，使用 天根基因组DNA试剂盒分离总DNA。利用16S rRNA基因靶向引物，正向引物： AACGCGAAGAACCTTAC，反向引物：CGGTGTGTACAAGACCC，使用iTaq Universal SYBR Green Supermix在BIORAD CFX96仪器上使用进行定量PCR。
[0055] 统计分析使用IBM SPSS 21进行统计分析。对正态分布的数据进行t检验，以评估两组 间的差异，非正态分布数据采用非参数检验。通过多元线性回归分析统计分析血清SAA1水 平作为全身照射后预测受照剂量可行性。采用非参数Spman秩相关方法，对8Gy照射小鼠 的SAA1与LPS及16S rRNA进行了二元相关分析，并对12Gy照射小鼠进行SAA1和PCT 的相关分析。根据受试者操作特性(ROC)曲线确定预测截止值；生存分布由Log-rank检验 确定；用Mann Whitney u检验放疗前后患者的SAA1浓度。
[0056] 结果如下：
[0057] 1.不同剂量照射后小鼠存活率、体重和外周血细胞数量变化
[0058] 对小鼠进行0、1、2、4、8和12Gy等不同剂量照射，观察照射后小鼠存活率、体重以 及外周血血细胞数量变化。如图1中a所示，0、1、2、4Gy照射后，小鼠30天内存活率为 100％，12Gy照射后30天存活率为0％，8Gy照射后30天内有5只小鼠死亡，3只小鼠存活。 体重和淋巴细胞等指标的变化呈现时间和剂量依赖性(图1中b-f)。
[0059] 2.全身照射致C57BL/6J小鼠血清SAA1浓度升高
[0060] 为了评估小鼠全身照射后血清SAA1浓度的时间与剂量效应，在C57BL/6J小鼠受1、2、 4、8和12Gy全身照射后0.25、0.5、1、2、3、5和7天通过ELISA方法检测血清SAA1浓 度。图2中a展示了各剂量组SAA1浓度在照后6小时开始增加，12小时时达到峰值，然后 在第3天基本恢复至起始水平。图2中b、c、d、e、f、g及h分别展示了各剂量照后0.25, 0.5,1,2,3,5及7天的SAA1浓度。在照后第5天，8Gy组8只小鼠中有2只小鼠出现SAA1 大幅度再次上升(60.66μg/ml和113.26μg/ml，单位下同)，12Gy组的8只小鼠中有6只SAA1 再次上升(109.62,
301.87,365.43,424.15,332.16,284.66μg/ml)。在照后第7天，8Gy组的8 只小鼠中有4只SAA1大幅度再次上升(156.79,106.12,170.22,107.31μg/ml)，12Gy组存活 的2只小鼠SAA1均大幅度上升(234.23，114.54μg/ml)。
301.87,365.43,424.15,332.16,284.66μg/ml)。在照后第7天，8Gy组的8 只小鼠中有4只SAA1大幅度再次上升(156.79,106.12,170.22,107.31μg/ml)，12Gy组存活 的2只小鼠SAA1均大幅度上升(234.23，114.54μg/ml)。
[0061] 3.照射后血清SAA1升高并非由感染造成
[0062] 感染是受全身照射后急性放射病的症状之一，此部分实验探索了SAA1的升高是否由全 身感染引起。作为细菌感染的直接因素，LPS是革兰氏阴性菌中的内毒素，16S rRNA是与细 菌编码的rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。细菌易位被确定为肝组织 中的细菌负荷，并且可以通过使用16S rRNA基因的定量PCR来定量。在8Gy全身照射组 我们测定了共31只小鼠第0,1,5天和第7天(第7天每组7只小鼠)中每一只的血清LPS 活性和肝脏16S rRNA表达量。结果显示(图3中a)，在同一小鼠的血清SAA1水平、LPS 活性和肝脏16S rRNA表达量没有观察到一对一的对应关系。以8Gy照射7天后的参数为例， 7只小鼠的SAA1浓度分别为156.79、0.12、18.92、0.51、106.12、170.22和107.31μg/ml， LPS水平为
0.97,0.03,0.18,1.56,0.03,0.06,及0.98EU/ml，肝脏中16S rRNA的倍性变化分 别为：
1.14,4.03,1.73,1.28,2.39,3.44及3.39倍。除了测量直接的细菌感染指标(LPS和16S rRNA)外，我们选取部分12Gy全身照射小鼠(7天有2只小鼠，0、0.25、0.5、1、2、3、 5天各3只小鼠)，分析照射后的第0、0.25、0.5、1、2、3、5、7天的血清PCT浓度(细菌 感染的标志物)水平，并分析其与SAA1表达水平的相关性。结果如图3中b所示，PCT水 平与SAA1表达水平并不相关。例如，第1天和第5天小鼠(各3只)的SAA1浓度分别为 38.26、28.40、40.11μg/ml和
109.62、301.87、0.25μg/ml，而第1天和第5天的PCT浓度分别 为0.14、0.16、0.12ng/ml和
0.25、0.13、0.15ng/ml。
0.97,0.03,0.18,1.56,0.03,0.06,及0.98EU/ml，肝脏中16S rRNA的倍性变化分 别为：
1.14,4.03,1.73,1.28,2.39,3.44及3.39倍。除了测量直接的细菌感染指标(LPS和16S rRNA)外，我们选取部分12Gy全身照射小鼠(7天有2只小鼠，0、0.25、0.5、1、2、3、 5天各3只小鼠)，分析照射后的第0、0.25、0.5、1、2、3、5、7天的血清PCT浓度(细菌 感染的标志物)水平，并分析其与SAA1表达水平的相关性。结果如图3中b所示，PCT水 平与SAA1表达水平并不相关。例如，第1天和第5天小鼠(各3只)的SAA1浓度分别为 38.26、28.40、40.11μg/ml和
109.62、301.87、0.25μg/ml，而第1天和第5天的PCT浓度分别 为0.14、0.16、0.12ng/ml和
0.25、0.13、0.15ng/ml。
[0063] 急性放射病的晚期进展和症状与经典感染非常相似。LPS作为诱导SAA1和PCT的外源 性Toll样受体配体都是菌血症的生物标志物。16S rRNA基因在细菌中高度保守，是鉴定和分 类原核生物的标准方法。本发明通过在同一血清中测定SAA1、PCT和LPS，并在同一小鼠 的肝脏中评价16S rRNA表达，双变量相关分析结果显示，8Gy全身照射小鼠血清SAA1浓 度与LPS活性和肝脏16S rRNA表达量没有相关关系。12Gy全身照射小鼠血清SAA1和PCT 浓度没有相关关系，即SAA1增加而不与感染相关。
[0064] 4.局部照射后SAA1变化情况
[0065] 在辐射事故中，个体部分受照比全身受照更常见。如上所示，肝脏是受照后SAA1的主 要来源，在屏蔽肝脏条件下照射小鼠SAA1的变化情况尚不清楚。为了探讨在屏蔽肝脏条件 下SAA1的变化水平，通过四种局部照射模式照射动物，暴露头部和上半部胸部(PBI-1)， 屏蔽头部和上半部分胸部(PBI-4)，屏蔽后半腹和后腿(PBI-2)，暴露后半腹部和后肢(PBI-3)， 如图4中a所示，PBI-1和PBI-2之间的唯一区别是，在PBI-1中肝脏被屏蔽，而在PBI-2中 则没有；同样，在PBI-3中肝脏被屏蔽，而在PBI-4中则没有。图4中b,c展示了8Gy照射 后12h小鼠血清SAA1和肝脏SAA1的mRNA水平变化。与对照组相比，肝暴露组(PBI-2 和PBI-4)倍数均高于肝未暴露组(PBI-1和PBI-3)。为验证照射后0.5天SAA1浓度预测全 身照射剂量的阈值是否同样适用于局部照射，选择3.26μg/ml计算对照组和PBI组(PBI-1、 PBI-2、PBI-3、PBI-4)，得到22/24的灵敏度、24/24的特异性和24/24的精确度。因此，可 证明全身照射后
0.5天的SAA1浓度临界值也适用于局部辐射。然后，为了探讨SAA1是否 可以作为小鼠PBI照射面积的生物标志物，使用受试者-操作者曲线(ROC)对大面积肝脏局 部照射(PBI-2和PBI-4)和屏蔽肝脏小面积局部照射(PBI-1和PBI-3)进行区分，得到 11.46μg/ml的临界值，敏感性12/12，特异性11/12，精确度12/13。
0.5天的SAA1浓度临界值也适用于局部辐射。然后，为了探讨SAA1是否 可以作为小鼠PBI照射面积的生物标志物，使用受试者-操作者曲线(ROC)对大面积肝脏局 部照射(PBI-2和PBI-4)和屏蔽肝脏小面积局部照射(PBI-1和PBI-3)进行区分，得到 11.46μg/ml的临界值，敏感性12/12，特异性11/12，精确度12/13。
[0066] 5.SAA1预测小鼠全身照射受照剂量及区分受照剂量范围
[0067] 为探讨血清SAA1水平是否可作为小鼠受照剂量的预测指标，我们以SAA1浓度和外周 血淋巴细胞总数为自变量，以辐射剂量为因变量，在0.25、0.5、1,2的时间点进行多元线性 回归分析。结果表明(表1)，TBI小鼠的辐射剂量可在暴露后2天内单独测定血清SAA1浓 度，尤其是照射后第0.5天，相关系数为R2＝0.802(n＝48，P＜0.001)。此外，将SAA1浓 度与外周血淋巴细胞总数作为自变量相，可以得到较好的辐射剂量估算效果，尤其是照射后 第0.5天和第2天，相关系数分别为R2＝0.829(n＝48，P＜0.001)和R2＝0.840(n＝48，P ＜
0.001)。由上述结果可知，SAA1与辐照剂量呈现良好的线性回归，如受照后12小时，若 单独以SAA1为自变量，当血清中SAA1浓度为25μg/ml时，可通过公式推算出辐照剂量为
4.389Gy；若以SAA1与淋巴细胞数共同作为自变量分析，当血清SAA1浓度为25μg/ml、淋 巴细胞数为1×109/L时，可通过公式推算出辐照剂量为4.845Gy。
0.001)。由上述结果可知，SAA1与辐照剂量呈现良好的线性回归，如受照后12小时，若 单独以SAA1为自变量，当血清中SAA1浓度为25μg/ml时，可通过公式推算出辐照剂量为
4.389Gy；若以SAA1与淋巴细胞数共同作为自变量分析，当血清SAA1浓度为25μg/ml、淋 巴细胞数为1×109/L时，可通过公式推算出辐照剂量为4.845Gy。
[0068] 表1.血清SAA1浓度与淋巴细胞数量和照射剂量之间的多元线性回归分析[0069]
[0070] 注：n为回归方程的建立所用数据的动物数量。
[0071] 除了辐射剂量之外，根据剂量范围对患者进行分类也很重要。利用受试者-操作者曲线(ROC)在照射后2天内确定SAA1阈值，以建立灵敏度、特异性和精确度(表2)。当受照 后6小时，2.155μg/ml可作为截点值将受照个体分为受4Gy以下照射和受8Gy以上照射两类， 且正确率为16/17，即17个个体中16个可被正确分类；当受照后12小时，3.26μg/ml可作为 截点值将受照个体分为未受照/受照1Gy和受2Gy以上照射两类，且正确率为31/31，即全部
31个个体都可被正确分类；当受照后1天，0.72μg/ml可作为截点值将受照个体分为未受照/ 受照1Gy和受2Gy以上照射两类，且正确率为32/33，即33个个体中32个可被正确分类； 当受照后2天，4.16μg/ml可作为截点值将受照个体分为受4Gy以下照射和受8Gy以上照射 两类，且正确率为16/17，即17个个体中16个可被正确分类。
31个个体都可被正确分类；当受照后1天，0.72μg/ml可作为截点值将受照个体分为未受照/ 受照1Gy和受2Gy以上照射两类，且正确率为32/33，即33个个体中32个可被正确分类； 当受照后2天，4.16μg/ml可作为截点值将受照个体分为受4Gy以下照射和受8Gy以上照射 两类，且正确率为16/17，即17个个体中16个可被正确分类。
[0072] 表2.照后2天内SAA1区分受照剂量范围的临界值
[0073]
[0074] 6.SAA1二次增加与辐射致死的相关关系
[0075] 由图2中g和图2中h可以看出，小鼠受到8Gy和12Gy全身照射后第5天和第7天， 出现SAA1第二次增加的小鼠数量与造模组小鼠死亡数量(图1中a)大致相同，这也是本 发明至关重要的发现，SAA1的第二次增加为辐射诱导的死亡的预测指标。
[0076] 为了评估SAA1二次增加是否是预判辐射引起死亡的有用指标，本发明从10Gy组的20 只小鼠中收集动态血清样品(5次，暴露前4天和暴露后1,3,5和7天)。10Gy照射后小鼠 动态SAA1浓度和相应的存活时间列于表3中，其中每一行代表来自单个动物的连续血液样 品的SAA1浓度变化和相应的存活时间。共有92只未受照射小鼠被用于计算SAA1浓度的平 均值和标准差(表4)，使用1.15μg/ml(平均值+2×标准差)的截止值预测照射后30天内的 后续致死率。第5天，17只死鼠中8只和3只活鼠中1只SAA1浓度高于1.15μg/ml，灵敏度 为8/
17，特异性为2/3，精确度为8/9。另外，在第7天，16只死鼠中的13只和3只活鼠中 的1只SAA1浓度高于1.15μg/ml，敏感性为13/16，特异性为2/3，精确度为13/14。
17，特异性为2/3，精确度为8/9。另外，在第7天，16只死鼠中的13只和3只活鼠中 的1只SAA1浓度高于1.15μg/ml，敏感性为13/16，特异性为2/3，精确度为13/14。
[0077] 表3. 10Gy照射后30天内的动态SAA1浓度和相应的死亡时间
[0078]
[0079]
[0080] 表4. 92只正常小鼠SAA1浓度
[0081]
[0082]
[0083]
[0084] 在确定照射后小鼠SAA1二次增加和辐射致死性之间的相关性后，我们评估了氨磷汀(一 种辐射保护剂)对致死剂量照射后小鼠SAA1二次增加的影响，以探索辐射后小鼠SAA1二 次增加的作用。
[0085] 实验结果显示，暴露于10Gy的小鼠在第7天开始死亡，20只小鼠中只有3只存活到第 30天，而在10Gy照射前给予氨磷汀预防组(供8只小鼠)中，只有2只小鼠在照射后第20 天死亡，其余6只小鼠全部活存到第30天。上述结果进一步支持照射后小鼠血清SAA1二次 增加可作为预测辐射致死的指标。
[0086] 因此，在临床应用中，连续监测患者血清SAA1浓度对于评估预后具有极其重要的意义。 此外，氨磷汀(一种能减少辐射损伤的辐射防护剂)在10Gy照射前注射可以抑制SAA1的 二次增加，而对照射后SAA1的第一次增加没有影响。这一结果进一步证实，SAA1的二次 增加是辐射后存活的一个有用指标。
[0087] 实施例2.鼻咽癌患者放疗后SAA1升高的检测。
[0088] 在证明了SAA1可以作为小鼠照射模型的生物标志物后，本发明还考察了SAA1是否可 以用作人类照射模型的生物标志物。由于伦理和道德层面的限制，本发明以接受放射治疗的 鼻咽癌患者作为人类照射模型，检测了肿瘤患者放疗前后血清SAA1浓度。
[0089] 病人及血清样品收集：收集中国市南方医院17例签署了知情同意书鼻咽癌患者的血清标 本。所有标本来源于南方医科大学的临床研究启动项目，由广东省教育厅的高级大学建设基 金(LC2016 PY015)提供，https://www.clinicaltrials.gov/_研究方案获得伦理委员会/机构的 批准(编号：NFEC-2018-013)。使用6MV直线加速器的准直光子束包围鼻咽及其邻近区域， 如鼻后窝、鼻窦部分、咽旁间隙和颅底。鼻咽和颈部的总剂量分别为70Gy和63Gy。放射治 疗前3～7天和放疗后1～4天采集血液标本。然后，以3000转/分的速度25℃下离心10分 钟分离血清，-80℃储存备用。
[0090] ELISA：SAA1使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒操作方法按说明书。
[0091] 表5显示了在本研究中考虑的所有17个鼻咽癌患者的临床参数和相应的SAA1浓度。如 图5中a所示，每位患者血清SAA1浓度均较照射前升高，放疗后浓度中位数(44.63μg/ml) 显著高于放疗前浓度(0.54μg/ml)。图5中b显示SAA1作为鼻咽癌患者放疗的生物标志物的 ROC曲线，曲线下面积(AUC)为0.941±0.05，截断值为9.34μg/ml，灵敏度为18/18，特异 性为16/18，精确度为18/20。
[0092] 表5：17位鼻咽癌患者临床信息及SAA1浓度
[0093]
[0094]
[0095] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应 该以权利要求书所界定的为准。
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