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用于细菌 生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片及检测方法

阅读：759发布：2024-02-25

专利汇可以提供用于细菌生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种用于细菌生物膜抑制剂筛选的微流控芯片及其检测方法。所述芯片由集成微阵列电极的基片和包含微通道的盖片组成，具体包含：进样通道、荧光试剂进样通道、生物膜培养区、生物膜与药物相互作用区、生物膜荧光观测区等功能单元。其可实现细菌生物膜培养、生物膜荧光观测、生物膜阻抗监测等多种功能，可应用于生物膜形成过程观测和监测、药物与生物膜相互作用过程在线原位监测、细菌生物膜抑制剂筛选等。所述的多功能芯片具备原位、无损、实时在线检测生物膜变化的优点，能分析多种不同药物对不同细菌生物膜的作用情况，进而实现生物膜抑制剂的高效筛选。，下面是用于细菌生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片及检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，包括上下叠合的盖片和基片，盖片的下侧分布有微通道和检测区，基片上侧在对应位置集成有叉指微阵列电极；其特征在于，所述微通道和检测区与对应位置的叉指微阵列电极构成一个单元结构，所述芯片具备多个相同的所述单元结构；
每个所述单元结构的微通道分为细菌进样通道、药物进样通道、营养液进样通道、荧光试剂进样通道和废液出样通道，检测区分为生物膜阻抗检测区和生物膜荧光观测区；
所述生物膜阻抗检测区与生物膜荧光观测区通过通道连接，具有平行的两组，药物进样通道和营养液进样通道各连通一组的生物膜阻抗检测区，两组的生物膜荧光观测区分别通过废液出样通道接出废液；
所述细菌进样通道设置在营养液进样通道和药物进样通道之间，分别连通左右两个生物膜阻抗检测区；所述荧光进样通道设置为Y形连通结构，同时向左右两个生物膜荧光观测区注入荧光标记试剂；
所述每个单元结构的叉指微阵列电极均包含与生物膜阻抗检测区和生物膜荧光观测区数量相同的叉指电极，一个叉指电极区域与盖片上的一个生物膜阻抗检测区或生物膜荧光观测区的位置对应且相通。
2.根据权利要求1所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述芯片上至少分布16个所述单元结构，成阵列分布。
3.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述细菌进样通道、药物进样通道、营养液进样通道、荧光试剂进样通道的长度为1～
50mm,宽度为500～2000μm，深度为20～200μm，保证液体混合均匀。
4.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述废液出样通道长度为1～10mm,宽度为500～2000μm，深度为20～200μm。
5.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述生物膜阻抗检测区和生物膜荧光观测区的长度为500～4000μm，宽度为500～4000μm，深度为20～200μm。
6.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述下层基片上的叉指电极的叉指对数为20～100，每根叉指长度为500～1800μm，宽度为10～20μm，间距为0～30μm，厚度为1～200nm。
7.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述盖片制作材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或水凝胶。
8.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述基片材质为玻璃或石英。
9.根据权利要求1或2所述的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，其特征在于，所述基片上微电极由MEMS加工的磁控溅射技术制备，制作材料为金、银、铂、铜、铝或钯。
10.利用权利要求1-9所述的微流控芯片进行生物膜抑制剂筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：、药物进样通道、营养液进样通道、荧光试剂进样通道
(1)将微泵与微流控芯片的废液出样通道连接，启动微泵，通过细菌进样通道向微流控芯片中注入细菌菌液，待细菌细胞成功地粘附到基片上后，通过营养液进样通道通入营养物质以保证细菌在微通道中形成生物膜，同时从药物进样通道中不断地注入含抑制剂的营养液，使抑制剂充分接触细菌；
(2)每隔一段时间停止微泵，待流体静止后，将阻抗信号发生器接口与微流控芯片基片上的叉指微阵列电极进行连接，设置阻抗扰动电压、扫描频率，对叉指电极表面的生物膜进行原位阻抗测试，记录加入抑制剂后不同时刻的生物膜阻抗谱图；用等效电路模型去拟合生物膜阻抗谱图，计算出不同时刻阳性对照组生物膜电阻Rb1，生物膜电容值Cb1，抑制剂组生物膜电阻Rb2，生物膜电容值Cb2。分别以Cb、Rb为横坐标，以时间为纵坐标进行绘图，得到生物膜电阻、生物膜电容随时间的变化情况；以生物膜电阻、生物膜电容的变化过程及趋势分析生物膜的形成过程以及抑制剂与生物膜的作用过程；以阳性对照组和加入抑制剂组生物膜电容差值△C＝(Cb1－Cb2)/Cb1,阳性对照组和加入抑制剂组生物膜电阻差值△R＝(Rb1－Rb2)/Rb1,这两个参数去评价抑制剂的作用效果，用于生物膜抑制剂的筛选；
(3)阻抗检测结束之后，立刻从荧光试剂进样通道中通入不影响细菌活力的荧光试剂标记细菌生物膜，将荧光显微镜镜头聚焦到微流控芯片荧光检测区，记录不同时刻生物膜的荧光图像，观察电极表面粘附的生物膜的生长状态，观察抑制剂对生物膜生长的抑制情况，分析荧光标记的生物膜各个参数的改变，通过这些参数的变化去可视化评价抑制剂对生物膜的作用效果。

说明书全文

用于细菌生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片及检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞和细菌检测技术领域，具体涉及用于细菌生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片。

背景技术

[0002] 生物膜是细菌及其自身分泌的胞外聚合物组成的微生物群落。与浮游菌相比，生物膜具有很强的耐药性，一旦形成便难以彻底清除，给医疗、食品等行业带来了巨大威胁，筛选出能够阻止生物膜形成的抑制剂是解决生物膜难题的有效途径。生物膜抑制剂的筛选实验通常在微孔板中进行，采用结晶紫染色法去评价抑制剂的作用效果。该方法试剂消耗量大，操作步骤繁琐，生物膜染色过程及洗脱过程受人为因素影响，导致实验重现性较差。该方法最大的不足是强行终止生物膜生长过程，无法进行抑制剂与生物膜作用过程分析。
目前，急需发展用于生物膜抑制剂筛选的高效实验技术及方法。

[0003] 微流控芯片分析技术可将不同的功能单元结构集成在芯片上，易于集成化和微型化，不仅极大地降低了试剂消耗量，而且能够实现检测的高通量及高内涵，已应用到细菌和细胞研究当中。如Benoit等(2010)设计并制备了一种用于生物膜培养的微流控装置。通过在96微孔板外部接入微泵输入细菌营养物质，排除细菌排泄代谢废物，以保证生物膜的长期培养。Kim等(2012)以PDMS材料制作了一种包含八个生物膜培养微腔和浓度梯度发生结构的微流控芯片，进行大肠杆菌生物膜的培养，并研究不同浓度7-羟基吲哚对大肠杆菌生物膜的抑制情况。微流控芯片为细菌生物膜培养、生物膜与药物的相互作用提供良好的实验平台。尽管已经有电阻抗分析方法应用于细菌生物膜检测的研究，但目前尚未有将微流控芯片分析技术、生物膜状态在线监测与细菌生物膜抑制剂筛选集成的一体芯片和检测技术，这极大地限制了微流控芯片在研究抑制剂与生物膜相互作用及抑制剂筛选方面的应用。

发明内容

[0004] 本发明提出一种用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，以进行细菌生物膜的在线原位检测和细菌生物膜抑制剂的高通量同步筛选，解决细菌生物膜抑制剂的快速高效筛选的应用需求。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 一种用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，包括上下叠合的盖片和基片，盖片的下侧分布有微通道和检测区，基片上侧在对应位置集成有叉指微阵列电极。

[0007] 所述微通道和检测区与对应位置的叉指微阵列电极构成一个单元结构，所述芯片具备多个相同的所述单元结构，并成阵列分布。

[0008] 每个所述单元结构的微通道分为细菌进样通道、药物进样通道、营养液进样通道、荧光试剂进样通道和废液出样通道，检测区分为生物膜阻抗检测区、生物膜荧光观测区。

[0009] 所述生物膜阻抗检测区与生物膜荧光观测区通过通道连接，具有平行的两组，药物进样通道和营养液进样通道各连通一组的生物膜阻抗检测区，两组的生物膜荧光观测区分别通过废液出样通道接出废液。

[0010] 所述细菌进样通道设置在营养液进样通道和药物进样通道之间，分别连通左右两个生物膜阻抗检测区，这样的布局便于对照实验的实施。所述荧光进样通道设置为Y形连通结构，同时向左右两个生物膜荧光观测区注入荧光标记试剂。

[0011] 所述每个单元结构的叉指微阵列电极均包含与生物膜阻抗检测区和生物膜荧光观测区数量相同的叉指电极，一个叉指电极区域与盖片上的一个生物膜阻抗检测区或生物膜荧光观测区的位置对应且相通。

[0012] 盖片制作材料应具备良好生物相容性、透气透光等性质，以保证生物膜生长所需的氧气、光照等微环境。本发明中，所述盖片的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或水凝胶。

[0013] 基片制作材料应透光，以保证生物膜观测实验的顺利实施。所述基片材质为玻璃或石英。本发明中，所述基片上微电极由MEMS加工的磁控溅射技术制备，制作材料为金、银、铂、铜、铝或钯。

[0014] 本发明中，进样通道长度为1～50mm,宽度为500～2000μm，深度为20～200μm，以保证液体混合均匀。出样通道长度为1～10mm,宽度为500～2000μm，深度为20～200μm。

[0015] 本发明中，生物膜阻抗检测区和荧光观测区长度设置为500～4000μm，宽度为500～4000μm，深度为20～200μm。

[0016] 本发明中，基片上的每个叉指电极的叉指对数为20～100，每根叉指长度为500～1800μm，宽度为10～20μm，间距为0～30μm，厚度为1～200nm。

[0017] 将本发明所述的微流控芯片与蠕动泵连接，能够不断地给细菌生长提供所需的营养物质，并及时排除代谢废物，使研究生物膜形成过程更加接近体内环境。

[0018] 本发明还提供微流控芯片上细菌生物膜抑制剂筛选的方法，包括以下步骤：

[0019] 1、将微泵与微流控芯片的出样口进行连接后启动微泵，以一定的流速向微流控芯片中注入细菌菌液，持续通入菌液一段时间，待细菌细胞成功地粘附到基片上后，从营养液进样通道中以一定的流速通入营养物质以保证细菌在微通道中形成生物膜；同时从药物进样通道中不断地注入含抑制剂的营养液，使抑制剂充分接触细菌。

[0020] 2、每隔一段时间停止微泵，待流体静止后，将阻抗信号发生器接口与微流控芯片基片上的叉指微阵列电极进行连接，设置阻抗扰动电压10～100mv,设置扫描频率0.1～100kHZ，对叉指电极表面的生物膜进行原位阻抗测试，记录加入抑制剂后不同时刻的生物膜阻抗谱图。用合适的等效电路模型去拟合生物膜阻抗谱图，计算出不同时刻阳性对照组生物膜电阻Rb1，生物膜电容值Cb1，抑制剂组生物膜电阻Rb2，生物膜电容值Cb2。分别以Cb、Rb为横坐标，以时间为纵坐标进行绘图，得到生物膜电阻、生物膜电容随时间的变化情况。以生物膜电阻、生物膜电容的变化过程及趋势分析生物膜的形成过程以及抑制剂与生物膜的作用过程。以阳性对照组和加入抑制剂组生物膜电容差值△C＝(Cb1－Cb2)/Cb1,阳性对照组和加入抑制剂组生物膜电阻差值△R＝(Rb1－Rb2)/Rb1,这两个参数去评价抑制剂的作用效果，用于生物膜抑制剂的筛选。

[0021] 3、阻抗检测结束之后，立刻从荧光试剂进样通道中，以一定的流速通入不影响细菌活力的荧光试剂来标记细菌生物膜，将荧光显微镜镜头聚焦到微流控芯片荧光检测区，记录不同时刻生物膜的荧光图像，观察电极表面粘附的生物膜的生长状态，观察抑制剂对生物膜生长的抑制情况，分析荧光标记的生物膜各个参数(生物膜厚度，细菌死活状况)的改变，通过这些参数的变化去可视化评价抑制剂对生物膜的作用效果。

[0022] 本发明的有益效果如下：

[0023] 本发明提出的用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片，具备细菌生物膜培养、生物膜荧光观测、生物膜阻抗监测等多种功能，可对生物膜形成过程、及药物与生物膜作用过程进行原位、实时、在线检测。通过对电阻抗等效电路模型的关键参数和生物膜荧光信号的解析，可以提供抑制剂与生物膜的作用效果，并建立细菌生物膜抑制剂筛选的新途径和新方法。本本发明提出的多功能微流控芯片在用于生物膜抑制筛选上能够克服现有方法存在的试剂消耗量大、侵入式、间断性检测的问题，可采用阻抗和荧光方法对生物膜抑制剂的效果进行多参数评估，可同时进行不同抑制剂并行作用多种细菌生物膜，进行高通量生物膜抑制剂的筛选，为生物膜抑制剂的筛选提供了高效的实验技术及分析方法。附图说明

[0024] 图1为本发明用于生物膜抑制剂筛选的微流控芯片示意图；

[0025] 图2为微流控芯片基片局部结构单元示意图；

[0026] 图3为微流控芯片盖片局部结构单元示意图；

[0027] 图4为阻抗谱图(A阳性对照，B 单宁酸)；

[0028] 图5为阻抗Bode图(A阳性对照，B单宁酸)。

具体实施方式

[0029] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

[0030] 实施例1：

[0031] 如图1所示，用于生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片由两层结构组成，具备16个相同的单元结构，以进行细菌生物膜的在线原位检测和细菌生物膜抑制剂的高通量同步筛选。上层为制作有微通道和检测区的PDMS盖片A，包含16组独立的结构，成上下两层排列，上下两层各排列8组独立的结构；下层为集成微阵列电极的玻璃基片B，玻璃基片B上集成有16组叉指微阵列电极，每组包含四个相同的叉指电极，叉指电极区域与PDMS盖片A上层检测区相对。以上每组微通道和检测区与对应位置的每组叉指微电极阵列构成一个单元结构，即共形成16个。

[0032] 参见图3，PDMS盖片A上每组结构均设置有细菌进样通道2、药物进样通道3、营养液进样通道1、荧光试剂进样通道8、废液出样通道11、12、生物膜阻抗检测区4和5、生物膜荧光观测区9和10。

[0033] 细菌进样通道2设置在营养液进样通道1和药物进样通道3之间，这样的布局便于对照实验的实施。荧光进样通道8设置为Y形连通结构，同时向左右两个生物膜荧光观测区注入荧光标记试剂。

[0034] 细菌进样通道2、药物进样通道3、营养液进样通道1和荧光试剂进样通道8及废液出样通道11和12的长度为4000μm,宽度为500μm，深度为200μm。生物膜阻抗检测区4和5和荧光观测区9和10的长度为4000μm，宽度为2000μm，深度为200μm。

[0035] 参见图2，玻璃基片B上的每组叉指微电极阵列中的每个叉指电极由50对叉指组成，每根叉指长度为1800μm，宽度为20μm，间距为20μm。

[0036] 实施例2：

[0037] 以上微流控芯片通过以下步骤制作获得：

[0038] 首先采用MEMS标准工艺在玻璃基底上制作出叉指微阵列电极，即制备出微流控芯片的基片，在微流控芯片组装前，对玻璃基片彻底清洗干净，然后烘干使用。

[0039] 选用生物相容性良好、透气、透光的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作含微通道的盖片，具体步骤如下：将PDMS与固化剂按照质量比为10:1浇筑到刻有微结构的SU8阳膜上，脱除气泡后，在80℃下固化60～80min，待PDMS盖片凝固后，从SU8阳膜上剥离下来，即得到含微通的PDMS盖片。

[0040] 将PDMS盖片和玻璃基片消毒灭菌后，通过等离子体清洗技术将PDMS盖片和玻璃基片键合在一起，制备得到用于生物膜抑制剂筛选的微流控芯片。

[0041] 实施例3：

[0042] 采用以上微流控芯片检测单宁酸对大肠杆菌生物膜作用效果：

[0043] 将大肠杆菌菌液(OD600＝0.05)通过微泵以1～50μL的流速，注入细菌菌液进样通道2，持续时间60-120min。待大肠杆菌粘附到微通道后，通过微泵以1～50μL的流速，将无菌肉汤培养液注入营养液进样通道1；同时通过微泵以1～50μL的流速，将含最小抑菌浓度单宁酸的无菌肉汤培养液注入药物进样通道3，持续24～48h。每隔一段时间，将叉指电极与阻抗信号发生器进行连接，以扰动电压10-100mv，扫描频率1-100kHZ，用阵列微电极获取生物膜的阻抗信号，对叉指电极表面的生物膜进行原位阻抗测试，记录加入单宁酸前后不同时刻大肠杆菌生物膜阻抗谱图。待阻抗测试完成后，立即将荧光标记试剂CFSE，以1～50μL的流速，注入到荧光试剂进样通道，持续时间10～30min，待生物膜荧光标记完成后，用缓冲溶液以1～50μL的流速冲洗多余的荧光试剂(由于加入的荧光试剂往往会过量，因此，操作中采用缓冲溶液，对多余的荧光试剂进行冲洗去除)，将荧光显微镜的镜头聚焦到生物膜荧光检测区，观察加入单宁酸前后生物膜的生长状态。

[0044] 将加入单宁酸后不同时刻检测得到的生物膜的阻抗谱图进行分析，发现加入单宁酸后，相同频率下测得的生物膜阻抗值明显减小。采用包含生物膜电容和电阻的等效电路模型对生物膜阻抗谱图进行拟合计算，发现加入单宁酸后，生物膜电阻值明显减少，生物膜电容值明显增大，这表明单宁酸抑制了细菌在电极表面的粘附和胞外聚合物的形成。

[0045] 用荧光显微镜观察到单宁酸会阻止细菌在电极表面的粘附，电极表面生长的生物膜面积和厚度均减少，说明单宁酸可以抑制大肠杆菌生物膜的生长。

[0046] 以上微流控芯片可实现细菌生物膜培养、生物膜荧光观测、生物膜阻抗监测等多种功能，可应用于生物膜形成过程观测和监测、药物与生物膜相互作用过程在线原位监测、细菌生物膜抑制剂筛选等。该芯片具备原位、无损、实时在线检测生物膜变化的优点，能分析多种不同药物对不同细菌生物膜的作用情况，进而实现生物膜抑制剂的高效筛选。

[0047] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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