缺失OMPDC和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗
阅读：855发布：2024-02-28
专利汇可以提供缺失OMPDC和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 预防 弓形虫感染的减毒活 疫苗 ，该疫苗含有同时缺失了 乳清 酸核苷‑5‑ 磷酸 脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸核苷‑5‑磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的减毒活疫苗具有几乎无毒 力 的优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，可用于预防弓形虫的急慢性及先天性感染，且由于该疫苗虫株 切除 了药物抗性筛选标签，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。，下面是缺失OMPDC和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗专利的具体信息内容。
1.一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其特征在于：含有同时缺失了乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其特征在于：所述基因缺失疫苗以无血清的DMEM溶液或者PBS作为溶剂制成弓形虫疫苗虫株的速殖子混悬液。
3.如权利要求1或2所述的预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其特征在于，所述弓形虫疫苗虫株的构建方法如下：
1)出发弓形虫虫株具有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
2)通过同源重组的方法，经过药物筛选、PCR鉴定获得的弓形虫疫苗虫株为缺失乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因，并且该疫苗虫株切除了药物筛选标签。
缺失OMPDC和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 弓形虫可以感染包括人在内的几乎所有的温血动物，引起一种人畜共患弓形虫病。人和动物主要由于误食被弓形虫和其卵囊污染的肉类而感染，全球大概有1/3的人存在弓形虫感染。当人体免疫功能正常，感染弓形虫一般不会表现明显的临床症状，而在免疫缺陷的个体中，感染弓形虫则会导致发烧、失明、脑炎等，严重威胁人类的生命健康。在畜牧业生产中，弓形虫感染导致猪、羊等流产、死胎、畸形胎儿，造成重大的经济损失。然而，针对弓形虫病的预防至今没有良好的疫苗，DNA等亚单位疫苗仅能产生极低的部分免疫保护效果且处于科研阶段，目前市场上唯一的商品化弓形虫疫苗是从羊流产死胎中分离得到的弓形虫S48株，通过在实验室传统传代致弱后制备，该疫苗存在着毒力返强的风险，且并不适用于我国的畜牧业养殖中。
[0003] 尿苷酸(UMP)是所有其他嘧啶核苷酸的前体，是组成RNA的重要核苷酸之一。弓形虫体内的尿苷酸的合成有两个途径，从头途径和补救途径。其中从头途径是合成尿苷酸的最主要途径，补救途径合成的量不能满足弓形虫的需要。乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(OMPDC)是弓形虫尿苷酸从头合成途径的最后一个关键酶，它可催化乳清酸核苷酸脱羧形成尿苷酸。弓形虫体内尿苷酸含量不足则会引起严重的遗传损伤，使得弓形虫丧失复制的能力，进而影响其毒力。此外，本研究小组前期开发出了一种缺失乳酸脱氢酶1(LDH1)的弓形虫突变体，发现该突变体能在体外正常生长，但感染动物后不能在体内复制，显著降低致病性。基于弓形虫病防治存在的问题和本课题组的前期研究基础，我们采用基因编辑技术，构建具有良好免疫原性和免疫保护力的减毒弓形虫疫苗虫株，其应用对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要价值和意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种预防弓形虫感染的基因缺失疫苗。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，该疫苗含有同时缺失了乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的弓形虫疫苗虫株，其中，乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0006] 所述的预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其中，弓形虫疫苗虫株以无血清的DMEM溶液或者PBS作为溶剂制成疫苗虫株的速殖子混悬液。
[0007] 所述的预防弓形虫感染的减毒活疫苗，其中，所述弓形虫疫苗虫株的构建方法如下：
[0008] 1)出发虫株为具有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0009] 2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒的构建:以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用上下游引物扩增，将MIC3靶点特异的gRNA替换为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因靶点特异的gRNA，转换DH5α得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒，其中，上游引物gRNA-ompdc-Fw:
[0010] 5’–GAGCTTGACTCCACCCTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’下游引物gRNA-R为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；
[0011] 3)ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板的制备：将乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的5’同源臂，3’同源臂和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记进行连接所得；
[0012] 4)弓形虫基因敲除虫株△ompdc::DHFR的获得：将步骤1)中虫体悬液与步骤2)中得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒以及步骤3)得到的ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板片段混匀后通过电转化制得弓形虫基因敲除虫株△ompdc::DHFR；
[0013] 5)△ompdc::DHFR虫株DHFR药物筛选标签的删除：通过Cre质粒对△ompdc::DHFR虫株中插入的DHFR序列进行切除；
[0014] 6)pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒的构建：以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用上下游引物扩增，将MIC3靶点特异的gRNA替换为乳酸脱氢酶1基因靶点特异的gRNA，转换DH5α得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒，其中，上游引物gRNA-ldh1-Fw：
[0015] 5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’，
[0016] 下游引物gRNA-R为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’；
[0017] 7)ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备：将从含有乳酸脱氢酶1基因的5’同源臂，3’同源臂的以及pUC19载体片段的pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒中扩增得到的大片段和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记片段进行连接所得；
[0018] 8)弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR的获得：将步骤5)中构建的虫株悬液与步骤6)中得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒以及步骤7)得到的ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板片段混匀后通过电转化制得弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR；
[0019] 9)弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR药物筛选标签的删除：通过Cre质粒对弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR中插入的DHFR序列进行切除。
[0020] 其中，所述ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板的制备具体为：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增ompdc-5’UTR和ompdc-3’UTR，从带loxp-DHFR-loxp的质粒中扩增获得loxp-DHFR-loxp片段，利用所设计引物线性化pUC19载体，通过多片段连接酶ExnaseTM MultiS连接各个片段，构建重组质粒pompdc-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::
ompdc-3UTR，利用高保真酶KD Plus对pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR。
ompdc-3UTR，利用高保真酶KD Plus对pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR。
[0021] 其中，所述ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备具体为：设计带有同源臂的引物利用高保真酶KD plus从质粒pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR中扩增ldh1-5UTR-pUC19-3UTR-ldh1片段，从含有loxp-DHFR-loxp片段的的质粒中扩增loxp-DHFR-loxp片段，通过多片段连接酶ExnaseTM MultiS连接各个片段，构建重组质粒pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR，利用高保真酶KD Plus对pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR。
[0022] 所述的预防弓形虫感染的基因缺失疫苗的用途，其中，所述基因缺失疫苗应用于动物弓形虫感染的免疫保护。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] 本发明提供的是一种用于的预防动物弓形虫病的减毒弓形虫活疫苗，该疫苗虫株由于敲除了ompdc和ldh1两个基因，具有几乎无毒力的优点，且该疫苗虫株不形成缓殖子包囊，克服了单敲除ldh1虫株仍存在极少数缓殖子包囊的缺点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，可用于预防弓形虫的急慢性及先天性感染，由于该疫苗虫株切除了药物抗性筛选标签，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。附图说明
[0025] 图1为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(ompdc)基因的敲除示意图；
[0026] 图2为Δompdc::DHFR虫株的PCR鉴定条带图；
[0027] 图3为Δompdc::DHFR虫株DHFR药筛标签切除的鉴定条带图；
[0028] 图4为乳酸脱氢酶1(ldh1)基因敲除示意图；
[0029] 图5为ΔompdcΔldh1::DHFR虫株的PCR鉴定条带图；
[0030] 图6为ΔompdcΔldh1::DHFR虫株药物筛选标签DHFR切除鉴定；
[0031] 图7为ΔompdcΔldh1虫株在小鼠(KM)的毒力试验；
[0032] 图8为ΔompdcΔldh1虫株免疫保护试验。
具体实施方式
[0033] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 实施例1：弓形虫营养缺陷型虫株△ompdc△ldh1的构建
[0035] (1)出发虫株ME49
[0036] ME49是球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，具有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
[0037] (2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒的构建
[0038] pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒为CRISPR/Cas9系统的CRISPR质粒，该质粒构建以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用NEB公司Q5点突变试剂盒( Site-Directed Mutagenesis Kit)将MIC3靶点特异的gRNA替换为基因ompdc靶点特异的gRNA，具体操作步骤如下：
[0039] ①利用gRNA在线设计网站
[0040] (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计gRNA引物：上游引物gRNA-ompdc-Fw:
[0041] 5’–GAGCTTGACTCCACCCTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’
[0042] 下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’。
[0043] ②在已灭菌的PCR管配制如下反应体系：
[0044]
[0045] ③PCR反应条件如下：
[0046]
[0047] ④PCR反应结束以后，在PCR管反应体系中加入0.7μl DpnI，放入PCR仪37℃进行消化30min。
[0048] ⑤取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：
[0049]
[0050] 在PCR仪中，25℃反应15min。
[0051] ⑥取全部步骤⑤的PCR产物转入100μl DH5α感受态细胞中转化，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜。
[0052] ⑦挑取单菌落于5mlLB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。
[0053] ⑧各取⑦中的菌液700μl与300μl 50％的无菌甘油于1.5mlEP管中混匀，-80℃保菌；余下菌液用于质粒提取，提取质粒后将该质粒与原始模板质粒进行凝胶电泳鉴定对比，用限制性内切酶SalI对对比正确的质粒进行酶切鉴定，反应体系如下：
[0054]
[0055] 将如上体系放置于37℃培养箱中3-5h后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性克隆质粒的酶切产物为两条大小分别为6kb和3.7kb的目的带。
[0056] ⑨将鉴定为阳性克隆的质粒送生物公司测序，测序引物为MIC3反向引物，若测序结果显示靶点序列被全部替换，则该质粒构建成功。
[0057] ⑩利用TRANSGEN公司的质粒提取试剂盒( Hipure Plasmid MaxiPrep Kit)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc)进行质粒提取，测定浓度、备用。
[0058] (3)ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板的制备
[0059] 该质粒的构建是利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit)将基因ompdc的5’同源臂，3’同源臂和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记进行连接所得，具体操作步骤如下所示：
[0060] ①在ToxoDB网站上输入拟敲除基因ompdc的Gene ID，确定该基因所在的locus，通过该基因所在的基因组序列确定它的5’同源臂(ompdc-5’UTR)和3’同源臂(ompdc-3’UTR)；
[0062] ③利用所设计的引物(表1)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA序列中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带loxp-DHFR-loxp的质粒中扩增获得loxp-DHFR-loxp片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物的浓度，-20℃保存备用。
[0063] 表1.构建pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒引物
[0064]
[0065] ④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：
[0066]
[0067] 充分混匀，PCR仪37℃反应30min，冰上放置5min。
[0068] ⑤将10μl连接产物全部加入100μl DH5α感受态细胞中进行转化，涂LB/Amp平板，培养箱37℃倒置培养过夜。
[0069] ⑥挑取上一步培养过夜平板中的单菌落于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV瓶中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。
[0070] ⑦各取上一步振荡培养过夜的菌液700μl分别与300μl 50％的无菌甘油于EP管，-80℃保菌。
[0071] ⑧利用TRANSGEN( Hipure Plasmid MaxiPrep Kit)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)质粒提取试剂盒对上一步余下菌液提取质粒，对所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0072] ⑨将上一步鉴定疑似正确的质粒送生物公司测序，利用M13正向和反向引物进行测序分析，比对测序结果正确即可认为pompdc-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒构建成功，将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存。
[0073] ⑩利用U5ompdc-Fw上游引物和U3ompdc-Rw下游引物，利用高保真酶KD Plus对pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段(ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR)，对扩增到的目的片段进行切胶回收，测定浓度、备用。
[0074] (4)弓形虫基因敲除虫株△ompdc::DHFR的获得
[0075] ①收取步骤(1)所述还在纳虫泡中即将溢出的Ⅱ型弓形虫ME49速殖子，用3μm孔径的无菌滤膜过滤除去宿主细胞碎片，1000rcf离心10min，弃净上清，用7-8ml的Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl2,pH＝7.6)重悬虫体沉淀，1000rcf再次离心10min，弃净上清。
[0076] ②用250-300μl Cytomix重悬虫体沉淀，将全部虫体悬液加入4mm电转杯中，按照质粒和同源模板片段DNA摩尔比＝5:1比例(7500ng：1500ng)，加入电转杯中步骤(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒和步骤(3)ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板片段。
[0077] ③用移液枪将DNA和ME49虫体悬液混合均匀，避免出现气泡。
[0078] ④转染：将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置程序1600V、25μF、50Ω、4mm，电击一次后，将程序更改为1500V、25μF、50Ω、4mm，电击两次。
[0079] 将电击后的DNA虫体悬液混合液迅速吸出加入T25细胞瓶中(HFF宿主细胞+DMEM+2％FBS+双抗)，并加入终浓度250uM的尿嘧啶(后续培养过程中均需加入终浓度为250uM的尿嘧啶)，置于培养箱内培养。
[0080] ⑤待60-80％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，将细胞裂解使虫体从宿主细胞中释放虫体；取1000μl左右虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，按照培养基：乙胺嘧啶体积比10000:1的比例加入乙胺嘧啶进行药物筛选。
[0081] ⑥按照⑤中所述连续药筛三至五代，药筛稳定后，将虫子置于含有宿主细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接4块96孔板)，剩余虫子可用DNA基因组提取试剂盒提取基因组，利用表2所示引物对其进行鉴定。图1所示为检测同源臂整合效率以及基因敲除效率，PCR1扩增到目的条带说明ompdc的5’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR2扩增到目的条带说明ompdc的3’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR3目的条带是检测敲除基因ompdc是否还存在在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明ompdc被成功敲除。
[0082] 表2.△ompdc::DHFR单克隆虫株PCR鉴定引物
[0083]
[0084] ⑦在96孔板中培养10-12天后观察是否有单克隆的存在，利用无菌枪头将单克隆对应孔的宿主细胞刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，培养5d左右，当60％～70％的宿主细胞被裂解时，用无菌枪头刮取100μl虫液到新的24孔板中继续培养，其余剩下虫液用于DNA提取并利用表1所示引物鉴定单克隆。
[0085] ⑧若PCR1和PCR2有特异性目的条带而PCR3无目的条带(如图2所示)，说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△ompdc::DHFR；将确定为△ompdc::DHFR的虫株从24孔板中传入T25培养瓶扩大培养；对T25扩大培养后的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3鉴定，PCR反应体系如下，若鉴定结果与之前一直，则可在扩大后进行冻存。
[0086] 在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
[0087]
[0088] PCR反应条件如下：
[0089]
[0090] ⑨PCR产物的鉴定：取反应完成的PCR产物10μl，琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，表示△ompdc::DHFR虫株构建成功。
[0091] (5)△ompdc::DHFR虫株DHFR药物筛选标签的删除
[0092] 在构建△ompdc::DHFR虫株时，外源性的插入了经过突变，缺失内含子的DHFR序列，使得转染后的虫株具有了药物抗性，便于在构建过程中用药物乙胺嘧啶进行筛选。在外源性插入的DHFR序列的两端各有一个loxp位点，可用Cre质粒对其进行切除。
[0093] ①收集步骤(5)中的新鲜的△ompdc::DHFR虫株速殖子，用孔径为3μm的滤器过滤，去除宿主细胞碎片，纯化速殖子。
[0094] ②将收集到的纯化的速殖子1000rcf离心10min，弃净上清，加入7-9ml的电转缓冲液Cytomix重悬沉淀后，1000rcf离心10min，弃净上清。
[0095] ③用250-300μl的电转缓冲液Cytomix重悬速殖子沉淀，加入4mm的电转杯中，并加入2μg-4μg的Cre质粒，混匀，避免出现气泡。
[0096] ④将含有速殖子悬液、Cre质粒的电转杯放入Bio-Red电转仪中进行转染，转染程序为：1600V、25μF、50Ω、4mm，用此程序点击三次。
[0097] ⑤将转染后的混合液迅速传入含有宿主细胞的T25细胞瓶中培养。
[0098] ⑥待有20％-30％的速殖子从纳虫泡中溢出时，收集速殖子，按3个/孔的量传入96孔板进行切除DHFR标签虫株的筛选。
[0099] ⑦在96孔板中培养10-12天后观察是否有单克隆的存在，利用无菌枪头将单克隆对应孔的宿主细胞刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，培养5d左右，当60％～70％的宿主细胞被裂解时，用无菌枪头刮取100μl虫液到新的24孔板中继续培养，其余剩下虫液用于DNA提取并利用表3所示引物鉴定单克隆。
[0100] 表3.△ompdc::DHFR虫株药物筛选标签切除的PCR鉴定引物
[0101]
[0102] ⑧因为弓形虫的基因组中原本就含有DHFR序列，该引物能在野生型虫株的基因组中扩增到一条700bp大小的目的带，在△ompdc::DHFR虫株中能扩增到大小分别为700bp、235bp的两条目的带，△ompdc::DHFR虫株在经过Cre质粒转染后，若我们外源性插入的loxp-DHFR-loxp同源模板片段被切除，则只能扩增到一条700bp大小的目的带，如图3所示，得到切除药筛标签的基因敲除虫株△ompdc。
[0103] (6)pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒的构建
[0104] ①引物设计同步骤(2)所述，上游引物gRNA-ldh1-Fw:
[0105] 5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’
[0106] 下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’
[0107] ②在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
[0108]
[0109] 后续步骤如同(2)中③至⑨所述操作。最后利用质粒提取试剂盒提取质粒，测定浓度，-20℃保存备用。
[0110] (7)ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备
[0111] 该质粒的构建是利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit)将从含有基因LDH1的5’同源臂，3’同源臂的以及pUC19载体片段的pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒中扩增得到的大片段和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记片段进行连接所得，具体操作步骤如下所示：
[0112] ①设计带有同源臂的引物(表4)利用高保真酶(KD plus)从质粒pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR中扩增ldh1-5UTR-pUC19-3UTR-ldh1片段，用表1所示的引物，同样利用高保真酶从含有loxp-DHFR-loxp片段的的质粒中扩增loxp-DHFR-loxp片段，并回收两个片段，并利用NanoDrop2000测定回收产物的浓度，-20℃保存备用；
[0113] 表4.构建pldh1-5’UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3’UTR质粒引物
[0114]
[0115] ②根据回收产物的浓度配制如下反应体系：
[0116]
[0117] 充分混匀，PCR仪37℃反应30min，冰上放置5min。
[0118] ③将10μl连接产物全部加入100μl DH5α感受态细胞中进行转化，涂LB/Amp平板，培养箱37℃倒置培养过夜。
[0119] ④挑取上一步培养过夜平板中的单菌落于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV瓶中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。
[0120] ⑤各取上一步振荡培养过夜的菌液700μl分别与300μl 50％的无菌甘油于EP管，-80℃保菌。
[0121] ⑥利用TRANSGEN( Hipure Plasmid MaxiPrepKit)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)质粒提取试剂盒对上一步余下菌液提取质粒，对所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；。
[0122] ⑦将上一步鉴定疑似正确的质粒送生物公司测序，利用M13正向和反向引物进行测序分析，比对测序结果正确即可认为pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR质粒构建成功，将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存。
[0123] ⑩利用U5ldh1-Fw上游引物和U3ldh1-Rw下游引物(表4)，利用高保真酶KD Plus对pldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段(ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR)，对扩增到的目的片段进行切胶回收，测定浓度、备用。
[0124] (8)弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR的获得
[0125] ①收取步骤(5)中构建成功虫株△ompdc的新鲜速殖子，用无菌的3μm孔径滤器过滤除去宿主细胞碎片，1000rcf离心10min，弃净上清，用7-8ml电转缓冲液Cytomix重悬虫体沉淀，1000rcf再次离心10min，弃净上清。
[0126] 余下操作步骤同步骤(4)②至⑤。利用表5引物对其进行鉴定，图4所示为检测同源臂整合效率以及基因敲除效率，PCR1扩增到目的条带说明ldh1的5’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR2扩增到目的条带说明ldh1的3’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR3目的条带是检测敲除基因ldh1是否还存在在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明ldh1被成功敲除,如图5所示。
[0127] 表5.△ompdc△ldh1::DHFR单克隆虫株PCR鉴定引物
[0128]
[0129] (9)虫株△ompdc△ldh1::DHFR药物筛选标签的切除
[0130] 同上述步骤(5)一样对虫株△ompdc△ldh1::DHFR进行药物筛选标签DHFR的切除，并利用表3所示引物对其进行鉴定得到△ompdc△ldh1虫株，如图6所示。
[0131] 实施例2弓形虫△ompdc△ldh1虫株的用途
[0132] 2.1基因敲除虫株△ompdc△ldh1稀释注射液
[0133] (1)稀释注射液配方
[0134]
[0135] (2)稀释注射液制作方法
[0136] ①将上述定容好的混合液用磁力搅拌器混匀10min；
[0137] ②超净台中用0.22μm孔径的滤器过滤除菌。
[0138] 2.2△ompdc△ldh1双敲除虫株的小鼠毒力试验
[0139] 1)使用HFF细胞体外培养弓形虫△ompdc△ldh1双敲除虫株速殖子，待有20-30％虫体逸出宿主细胞后，弃去原培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入PBS洗除残留逸出虫体和培养基，洗涤两次，加入步骤(1)配制的稀释注射液；
[0140] 2)用一次性细胞刮将细胞刮下，5ml注射器反复吹打悬液6-8次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用灭菌的3μm孔径滤器过滤纯化虫体；取1ml原始虫液10倍稀释，取10μl 10倍稀释虫液上细胞计数板计数；
[0141] 3)按照104个速殖子/200μl稀释注射液/小鼠，腹腔接种7周龄雌性KM小鼠，每组接10只，每天记录小鼠的存活情况，30天后对结果进行统计，结果如图7。从实验结果可以看出，接种△ompdc△ldh1双敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％，而接种野生型ME49的小鼠在第12d全部死亡。
[0142] 2.3△ompdc△ldh1敲除株对小鼠保护力实验
[0143] 以速殖子剂量为104个/200μl稀释注射液/小鼠，接种昆明鼠(KM)，每组10只。经过一个试验周期，30天后对已免疫过的小鼠及未经免疫的对照组KM小鼠(10只)接种1×104个野生型ME49速殖子。
[0144] 观察并记录记录小鼠的死亡情况，30天后统计小鼠存活率，如图8，对照组小鼠在12天内全部死亡，经△ompdc△ldh1敲除虫株免疫过的小鼠在30天仍没有死亡，说明免疫过△ompdc△ldh1敲除虫株的小鼠获得了抵抗野生株毒力的能力，有成为基因工程疫苗的潜力。
[0145] 本发明提供一种用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗，确立了其免疫剂型，探明了该疫苗的免疫接种程序及接种量，通过动物实验，发现其对于弓形虫感染具有较强的免疫保护作用，且由于该疫苗虫株切除了药物抗性标签，具有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
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