基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针
阅读：499发布：2024-02-16
专利汇可以提供基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了基于1,8‑二 氨 基 萘 单元的 次氯酸 和一 氧 化氮 荧光 探针及其制备方法和应用，优选两种探针分子：基于单通道响应的次氯酸荧光探针A与基于双通道响应的检测次氯酸和一氧化氮的荧光探针B。本发明优点是基于1,8‑二氨基萘单元，通过简单的合成与纯化方法制备新颖的探针A与探针B分子，具有高选择性，探针A分子可用于 水 溶液中HOCl的测定，探针B分子可用于水溶液和细胞中定量检测次氯酸和一氧化氮，以及细胞中的 生物 成像。，下面是基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针专利的具体信息内容。
1.基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针：
(ⅰ)基于单通道检测次氯酸的荧光探针具有如下结构：
其中：R1，R2，R3，R4，R5独立地选自氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基；R1，R2，R3，R4，R5可以相同或不同。
(ⅱ)基于双通道响应的检测次氯酸和一氧化氮的荧光探针具有如下结构：
其中：R1，R2，R3，R4，R5独立地选自氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基；R1，R2，R3，R4，R5可以相同或不同。
2.根据权利要求1(ⅰ)所述的化合物，其优选为以下结构，命名为探针A：
3.根据权利要求2所述的化合物，基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针，其特征在于，将6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛与1,8-二氨基萘反应得到的目标化合物，即为优选的检测次氯酸的荧光探针A。
4.根据权利要求3所述的高选择性检测次氯酸的荧光探针A的制备方法，其特征在于其具体步骤为：
室温氩气保护下，6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(100mg，0.389mmol)溶解于10mL无水乙醇中，分批加入1,8-二氨基萘(68mg，1.1eq)。氩气保护下，回流过夜，反应体系冷却至室温。
生成的沉淀用乙酸乙酯重结晶纯化得到产物。
5.根据权利要求1(ⅰ)所述的荧光探针A在单通道检测次氯酸的应用，其特征在于，荧光探针A在454nm处有荧光发射，其强度与次氯酸浓度呈线性关系，可用于在水溶液和细胞中定量检测HOCl，以及在细胞中生物成像的应用。根据权利要求6所述的荧光探针在单通道检测次氯酸的应用。
6.根据权利要求1(ⅱ)所述的化合物，其优选为以下结构，命名为探针B：
7.根据权利要求6所述的化合物，基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮的双通道荧光探针，其特征在于，将6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛与N-叔丁氧羰基(Boc)-1,8-二氨基萘缩合反应后，经硼氢化钠(NaBH4)还原，再用三氟乙酸(TFA)脱去保护基团Boc，进一步处理后可得到目标化合物，即为优选的检测次氯酸和一氧化氮的荧光探针B。
8.根据权利要求7所述的双通道检测次氯酸和一氧化氮的目标荧光探针制备方法，其特征在于其具体步骤为：
室温氩气保护下，N-Boc-1,8-二氨基萘(301mg,1.16mmol)，加入12mL无水乙醇溶解后，往其加入6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(300mg,1.16mmol)，滴入几滴冰醋酸后搅拌12小时。
随后向体系分批加入NaBH4(88mg，2.0eq.)，继续搅拌2小时。减压除去溶剂，得到的粗产物为黄色固体，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到N-Boc-N’-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘。将上述化合物(100mg，0.2mmol)溶解于5mL二氯甲烷，氩气保护下，缓慢滴加三氟乙酸(0.21mL，14.0eq)。滴加完毕后，室温下继续搅拌12个小时后得到粗产物，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到目标产物N-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘，即荧光探针B。
9.根据权利要求1(ⅱ)所述的双通道检测次氯酸和一氧化氮的应用，其特征在于，所述探针B用于在水溶液和细胞中双通道定量检测HOCl和NO，以及在细胞中生物成像的应用。
10.根据权利要求13所述的荧光探针在双通道检测次氯酸和一氧化氮的应用，其特征在于，所述荧光探针检测HOCl通道的荧光发射峰值在463nm，其荧光强度与次氯酸浓度呈线性关系；所述荧光探针检测NO通道的荧光发射峰值在512nm，其荧光强度与一氧化氮浓度呈线性关系。
基于1，8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及一类荧光探针，特别涉及一类灵敏度高、响应迅速的基于1,8-二氨基萘单元的次氯酸和一氧化氮荧光探针，其合成方法、在水溶液和细胞中定量检测次氯酸和一氧化氮，以及细胞中生物成像的应用，属于检测技术领域。
背景技术
[0002] 活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)和活性氮化合物(reactive nitrogen species，RNS)广泛参与生物体的多种生理、病理过程，长期以来备受关注。作为一种ROS，次氯酸(HOCl)可以由髓过氧化物酶-H2O2-Cl-系统产生，可以保护身体免受病原体的侵入。然而，过量的HOCl也会导致多种病理过程，如癌症、阿尔茨海默症、以及心肌梗塞、动脉粥样硬化等多种心血管疾病。HOCl还作为一种高效的杀菌剂，还广泛应用于净水领域。
HOCl的检测具有重要意义。
HOCl的检测具有重要意义。
[0003] HOCl的检测的传统方法包括极谱法、库仑法、化学发光法、比色法以及碘量滴定法等。这些方法虽然相对成熟，但步骤相对繁琐、仪器要求较高。基于荧光信号变化的荧光探针技术所需要的仪器简单，有着高选择性和高灵敏性，响应时间快，检测浓度范围广，能够进行实时、原位检测。荧光探针结合显微成像技术，在生物成像领域有着巨大的应用前景。
[0004] 一氧化氮(NO)是一种RNS，是生物体内一种重要的信号小分子，在生物体内的信号传导和免疫调节中起着不可或缺的作用。生物体内的NO可由L-精氨酸在一氧化氮合酶的作用下产生的，广泛参与细胞免疫和氧化还原等多种生理、病理过程。当细胞器中含有过量的NO时，它会迅速变成其它ROS和RNS，如·OH和ONOO-，严重破坏各种酶，DNA和蛋白质等。因此，NO的检测具有重要意义。
[0005] 近年来，多种检测ROS/RNS的荧光探针应运而生，但是依旧存在着合成步骤较多、纯化步骤繁琐、选择性较差等问题。因此，发展合成步骤简单，高选择性以及灵敏度高的荧光探针是本领域技术与科研人员急需要解决的问题。特别是，如心血管疾病、神经系统紊乱、肾病、肿瘤等许多疾病都与HOCl和NO二者的水平密切相关。就目前的技术而言，针对次氯酸或一氧化氮的单通道探针种类相对较多，但是缺少一种能同时检测不同ROS/RNS的荧光探针。本发明的特点是采用基于1,8-二氨基萘单元作为反应识别基团，发明的荧光探针A能
高选择性单通道检测HOCl；荧光探针B能高选择性双通道检测HOCl和NO。
高选择性单通道检测HOCl；荧光探针B能高选择性双通道检测HOCl和NO。
发明内容
[0006] 本发明提供基于1,8-二氨基萘单元的探针A与探针B，其具有高灵敏度以及高选择性的特点。探针A用于水溶液条件下单通道定量检测HOCl，探针B用于在水溶液和细胞中双通道定量检测HOCl和NO，以及在细胞中生物成像的应用。
[0007] 所述的单通道HOCl荧光探针A的分子结构式如下：其中：R1，R2，R3，R4，R5独立地选自氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基；R1，R2，R3，R4，R5可以相同或不同。
[0008] 优选的，本发明所述的单通道HOCl荧光探针A的分子结构式如下：
[0009] 优选的，本发明所述的探针A的制备路线如下所示：
[0010] 室温下，6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(100mg，0.389mmol)溶解于10mL无水乙醇，分批加入1,8-二氨基萘(68mg，1.1eq)。氩气保护下，回流过夜。反应体系冷却至室温，生成的沉淀用乙酸乙酯重结晶纯化得到产物。
[0011] 所述的探针A的合成路线简单，产物易于提纯。
[0012] 探针A自身几乎没有荧光，与HOCl作用后荧光显著增强。
[0013] 所述的探针A与HOCl作用后，在310nm波长处激发，在454nm处产生特定的荧光发射峰。其荧光强度与HOCl浓度呈线性关系。可应用于定量检测水体系中的HOCl，检测限为72.3nM，达到ppt级别。
[0014] 荧光探针A与HOCl反应的专一性强，选择性高，抗多种干扰物。
[0015] 本发明的探针A是一种高选择性的HOCl荧光探针，可用于定性、定量检测水体系中的HOCl及其含量。
[0016] 所述双通道检测次氯酸和一氧化氮荧光探针B的分子结构式如下：其中：R1，R2，R3，R4，R5独立地选自氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基；R1，R2，R3，R4，R5可以相同或不同。
[0017] 优选的，本发明所述双通道检测次氯酸和一氧化氮荧光探针B的分子结构式如下：
[0018] 优选的，本发明所述双通道检测次氯酸和一氧化氮荧光探针B的制备路线如下：
[0019] 室温下，N-叔丁氧羰基-1,8-二氨基萘(301mg，1.16mmol)溶解于12mL无水乙醇，加入6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(300mg，1.0eq)，滴入几滴冰醋酸后搅拌12小时。随后向体系分批加入NaBH4(88mg，2.0eq.)，继续搅拌2小时。减压除去溶剂，得到黄色固体。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到N-Boc-N’-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘。将该化合物(100mg，0.2mmol)溶解于5mL二氯甲烷，氩气保护下，缓慢滴加三氟乙酸(0.21mL，14当量)。滴加完毕后，室温下继续搅拌12个小时后得到粗产物。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到N-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘，即荧光探针B。
[0020] 所述的探针B的合成路线简单，产物易于提纯。
[0021] 探针B自身几乎没有荧光，与HOCl或NO作用后荧光显著增强，并产生不同的特定发射波长。
[0022] 所述的探针B与HOCl作用后，在365nm波长处激发，在463nm处产生特定的发射波长。其荧光强度与HOCl浓度呈线性关系。可应用于定量检测水体系中HOCl，检测限为32.7nM，达到ppb级别。
[0023] 所述的探针B与NO作用后，在365nm波长处激发，在512nm处产生特定的发射波长。其荧光强度与NO浓度呈线性关系。可应用于定量检测水体系中NO，检测限为0.51μM，达到ppb级别。
[0024] 探针B能对HOCl与NO进行双通道定量检测，反应的专一性强，选择性高，抗多种干扰物。
[0026] 图1.多种ROS/RNS对探针A(10.0μM)的荧光发射性能的影响
[0028] 图3.不同pH(6.5-10.0)的水体系中，NaClO对探针A(10.0μM)的荧光发射性能的影响
[0029] 图4.HOCl浓度与荧光探针A(10.0μM)发射强度的关系图及检测限
[0030] 图5.pH＝7.4的水体系中，NaOCl的浓度对探针A(10.0μM)的荧光发射性能的影响[0031] 图6.多种ROS/RNS对探针B(5.0μM)的荧光发射性能的影响
[0032] 图7.pH＝7.4的水体系中，探针B(5.0μM)的荧光发射强度与NaOCl的作用时间进程图
[0032] 图8.不同pH(5.5-9.5)的水体系中，NaClO对探针B(5.0μM)的荧光发射性能的影响[0033] 图9.pH＝7.4的水体系中，NaOCl的浓度对探针B(5.0μM)的荧光发射性能的影响[0034] 图10.pH＝7.4的水体系中，探针B(10.0μM)的荧光发射强度与NO的作用时间进程图
[0035] 图11.pH＝7.4的水体系中，NO的浓度对探针B(5.0μM)的荧光发射性能的影响
具体实施方式
[0036] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明不受下列实施例的严格限定。
[0037] 实施例1：荧光探针A的制备方法
[0038] 室温条件下，把1,8-二氨基萘(68mg，0.428mmol)加到入10mL含6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(100mg，0.4275mmol)的无水乙醇溶液，在氩气氛围下搅拌6h。反应完成后，沉淀过滤，重结晶得到产物。(产率58％)。熔点：150.2-150.8℃。IR(film，cm-1)：3351.7，1592.4，1495.3，1420.8，1320.9，1257.2，896.1，836.2，809.6，750.2，686.2，631.3，613.8，564.8。
1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)δ＝8.18(d，1H，J＝8.6Hz)，8.10(d，1H，J＝8.8Hz)，8.03(d，1H，J＝1.4Hz)，7.86(dd，1H，J＝1.6，8.8Hz)，7.80(d，1H，J＝8.6Hz)，7.59(dd，1H，J＝3.8，
7.4Hz)，7.39-7.38(m，3H)，7.32-7.24(m，4H)，6.65(dd，1H，J＝1.6，6.6Hz)，5.79(s，1H)，
5.14-5.04(br，2H)。13C NMR(CDCl3,75MHz,ppm)δ＝159.90，146.89，140.76，137.22，
134.85，134.76，132.79，132.70，131.74，130.91，129.33，128.67，128.39，127.87，126.96，
122.73，122.17，119.35，118.23，114.04，106.77，91.01，88.25，68.34。元素分析：C28H19N3，理论值C：84.61，H：4.82，N：10.57；实测值：C：84.94，H：4.97，N：11.03；ESI-MS：C28H19N3，m/z：
398.21(M+1)。
1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)δ＝8.18(d，1H，J＝8.6Hz)，8.10(d，1H，J＝8.8Hz)，8.03(d，1H，J＝1.4Hz)，7.86(dd，1H，J＝1.6，8.8Hz)，7.80(d，1H，J＝8.6Hz)，7.59(dd，1H，J＝3.8，
7.4Hz)，7.39-7.38(m，3H)，7.32-7.24(m，4H)，6.65(dd，1H，J＝1.6，6.6Hz)，5.79(s，1H)，
5.14-5.04(br，2H)。13C NMR(CDCl3,75MHz,ppm)δ＝159.90，146.89，140.76，137.22，
134.85，134.76，132.79，132.70，131.74，130.91，129.33，128.67，128.39，127.87，126.96，
122.73，122.17，119.35，118.23，114.04，106.77，91.01，88.25，68.34。元素分析：C28H19N3，理论值C：84.61，H：4.82，N：10.57；实测值：C：84.94，H：4.97，N：11.03；ESI-MS：C28H19N3，m/z：
398.21(M+1)。
[0039] 实施例2：探针A(10.0μM)的荧光强度与不同ROS/RNS分析物(10eqiuv)的关系。
[0040] 以下实施的案例2-5中，激发波长都是310nm，且激发和发射的狭缝宽度分别设定为3和5nm。除非特别指出，测定的溶液条件是PBS缓冲液和乙腈的混合体系(v/v＝6:4，pH＝7.4)，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有的光谱测试都是在25℃下进行的。
[0041] 固定探针A的浓度为10.0μM。ROS/RNS分析物包括：过氧化氢H2O2、单线态氧1O2、羟基自由基·OH、过氧化亚硝酰ONO2-、一氧化氮NO、次氯酸钠NaClO。它们的浓度均为100μM。每一种分析物加入测试体系后，经充分震荡混合20分钟后进行相应的荧光光谱测试，结果如图1所示。
[0042] 图1表明，在所测试的ROS/RNS物种中，只有NaClO能够使探针在454nm处产生强烈的荧光发射信号，而其它测试的ROS/RNS物种则不产生这个作用，这表明NaClO与探针A能发生专一性的作用，探针A可以在水溶液体系中选择性识别NaClO，并产生特定的荧光发射信号。
[0043] 实施案例3：探针A(10.0μM)的荧光强度与NaOCl(100μM)作用时间的关系
[0044] 探针A的浓度为10.0μM，加入浓度为100μM的NaOCl，快速充分振荡后，立即开始计时，每间隔1分钟即时测定体系在454nm处荧光发射强度。结果如图2所示。
[0045] 图2的结果表明，体系在454nm处的荧光发射强度在5分钟内有明显增长，10分钟后荧光强度趋于稳定。结果表明，该探针A与HOCl的作用在10分钟内基本可以结束，15分钟以后可以认为作用完全。因此，本发明选择的作用时间为20分钟。
[0046] 实施例4：在pH 6.5-10.0范围内，探针A(10.0μM)的荧光强度与NaOCl(100.0μM)的关系
[0047] 固定探针A的浓度为10.0μM，向其加入pH值不同的100.0μM的NaOCl。pH缓冲溶液的pH值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，并且每组设置空白对照组。体系经充分震荡混合20分钟后，测定在454nm处的荧光发射强度。结果如图3所示。结果表明，随着体系pH值的升高，与空白对照组比较，相同浓度的NaOCl对探针A在454nm处的荧光发射强度的增强程度逐渐减弱。
[0048] 进一步，HOCl的pKa值为7.6，可以根据酸碱平衡关系计算得到不同pH下体系中HOCl的浓度。以HOCl的浓度为横坐标，以454nm处的荧光发射强度为纵坐标，绘制得到线性关系图，如图4所示。当HOCl浓度范围为0-12.0μM时，在454nm处的荧光强度与HOCl浓度有较好的线性关系。因此，本发明的探针A是HOCl荧光探针，可以用于水体系中HOCl的定量分析。
[0049] 进一步，HOCl浓度与探针A在454nm处的荧光发射强度的线性关系方程式的斜率为1.49。本实验的标准可通过五次空白样品的平行试验，计算得出标准偏差为3.59×10-8。由此，可以计算得到探针A对HOCl的检测限为72.3nM，达到ppt级别。该数据表明，探针A不仅能够定量检测HOCl，而且具有高灵敏度的优点。
[0050] 实施例5：不同浓度NaOCl对探针A(10.0μM)的荧光光谱的影响
[0051] pH＝7.4条件下，固定探针A的浓度为10.0μM，分别加入浓度为0-120μM的NaOCl水溶液(每组NaOCl浓度以10.0μM递增)，经充分震荡混合20分钟后，测定不同组的荧光光谱，参见图5。在未加入NaClO时，体系几乎没有荧光发射信号。随着溶液中NaClO浓度的增加，体系在454nm处的荧光强度不断增加。
[0052] 进一步，HOCl的pKa值为7.6，可以根据酸碱平衡关系计算得到pH＝7.4下体系中HOCl的浓度。以HOCl的浓度为横坐标，以454nm处的荧光发射强度为纵坐标，绘制得到线性关系图，如图5右上角插图所示。
[0053] 进一步，一次线性关系的图像斜率为6.65，本实验的标准可通过五次空白样品的平行试验，计算得出标准偏差为3.98×10-6。由此，可以计算得到在pH＝7.4下探针A对HOCl的检测限为1.80μM，达到ppm级别。该数据表明，在生理条件下，该探针可以定量检测HOCl，具有高灵敏度的优点。
[0054] 实施例6：一种高选择性的双通道检测次氯酸与一氧化氮荧光探针B的制备方法[0055] 室温下，N-叔丁氧羰基-1,8-二氨基萘(301mg，1.16mmol)溶解于12mL无水乙醇，加入6-(苯基乙炔基)喹啉-2-甲醛(300mg，1.0eq)，滴入几滴冰醋酸后搅拌12小时。随后向体系分批加入NaBH4(88mg，2.0eq.)，继续搅拌2小时。减压除去溶剂，得到黄色固体。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到N-Boc-N’-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘。将该化合物(100mg，0.2mmol)溶解于5mL二氯甲烷，氩气保护下，缓慢滴加三氟乙酸(0.21mL，14当量)。滴加完毕后，室温下继续搅拌12个小时后得到粗产物。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂，柱层析得到N-2-[6-(苯基乙炔基)喹啉]甲基-1,8-二氨基萘，即荧光探针B。(产率62.5％)
[0056] 熔点：164.1-164.6℃.IR(film，cm-1)：3340.0，3320.1，2328.1，1583.6，1519.9，1454.3，1433.1，1417.7，839.0，754.2，688.6。1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)δ＝4.68(s,2H)，
6.54(d，1H，J＝7.0Hz)，6.68(d，1H，J＝7.0Hz)，7.15(d，1H，J＝8.2Hz)，7.19(d，1H，J＝
7.4Hz)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.25-7.27(m，2H)，7.36-7.38(m，3H)，7.46(d，1H，J＝
8.4Hz)，7.56-7.60(m，2H)，7.82(d，1H，J＝8.6Hz)，8.00(s，1H)，8.05(s，1H)，8.07(s，1H)。
13
C NMR(CDCl3，75MHz，ppm)δ＝50.95，89.19，90.65，106.27，113.00，117.14，118.47，
120.47，120.52，121.27，123.07，126.14，126.64，127.06，127.17，128.55，128.66，129.15，
131.04，131.80，132.44，136.35，137.07，144.04，146.14，159.62。元素分析：C28H21N3，理论值：C 84.18,H 5.30,N 10.52.Found:C 84.31,H 5.26,N 11.08.ESI-MS：C28H21N3，m/z：
400.30(M+1)。
6.54(d，1H，J＝7.0Hz)，6.68(d，1H，J＝7.0Hz)，7.15(d，1H，J＝8.2Hz)，7.19(d，1H，J＝
7.4Hz)，7.21(d，1H，J＝7.0Hz)，7.25-7.27(m，2H)，7.36-7.38(m，3H)，7.46(d，1H，J＝
8.4Hz)，7.56-7.60(m，2H)，7.82(d，1H，J＝8.6Hz)，8.00(s，1H)，8.05(s，1H)，8.07(s，1H)。
13
C NMR(CDCl3，75MHz，ppm)δ＝50.95，89.19，90.65，106.27，113.00，117.14，118.47，
120.47，120.52，121.27，123.07，126.14，126.64，127.06，127.17，128.55，128.66，129.15，
131.04，131.80，132.44，136.35，137.07，144.04，146.14，159.62。元素分析：C28H21N3，理论值：C 84.18,H 5.30,N 10.52.Found:C 84.31,H 5.26,N 11.08.ESI-MS：C28H21N3，m/z：
400.30(M+1)。
[0057] 以下实施案例7-14中，激发波长都是365nm，且激发和发射的狭缝宽度分别设定为3和5nm。除非特别指出，测定的溶液条件是PBS缓冲液和乙醇的混合体系(v/v＝1:1，pH＝
7.4)，所使用的探针是实施例6中所制备的探针，且所有的光谱测试都是在25℃下进行的。
激发0波长都是365nm，且激发和发射的狭缝宽度分别设定为3和5nm。
7.4)，所使用的探针是实施例6中所制备的探针，且所有的光谱测试都是在25℃下进行的。
激发0波长都是365nm，且激发和发射的狭缝宽度分别设定为3和5nm。
[0058] 实施例7：探针B(5.0μM)的荧光强度与不同ROS/RNS分析物(0.5mM)的关系。
[0059] 固定探针B分子的浓度为5.0μM。ROS/RNS分析物包括：过氧化氢H2O2、单线态氧1O2、羟基自由基·OH、过氧化亚硝酰ONO2-、一氧化氮NO、次氯酸钠NaClO。它们的浓度均为1.0mM。每一种分析物加入测试体系后，经充分震荡混合20分钟后进行相应的荧光光谱测试，结果如图6所示。
[0060] 图6表明，在所测试的ROS/RNS物种中，只有NaClO或NO能够显著提高探针的荧光发射性能。NaClO的加入使体系在463nm处出现强烈的荧光发射信号，NO的加入使体系在在512nm处出现强烈的荧光发射信号。这表明NaClO或NO可以与探针B能发生不同的专一性的作用，探针B可以在水溶液体系中选择性识别NaClO或NO，并产生不同的特定的荧光发射信号。
[0061] 实施例8：探针B(5.0μM)的荧光强度与NaOCl(0.5mM)作用时间的关系
[0062] 探针B的浓度为5.0μM，加入浓度为0.5mM的NaOCl，快速充分振荡后，立即开始计时，每间隔1秒钟即时测定体系在463nm处荧光发射强度。结果如图7所示。
[0063] 体系在512nm处的荧光发射强度在10秒钟内有明显增长，15秒钟后荧光强度趋于稳定。结果表明，探针B与HOCl的作用在15秒钟内基本可以结束。探针B对NaClO的响应速度快。
[0064] 实施例9：在pH 5.5-9.5范围内，探针B(5.0μM)的荧光强度与NaOCl(100μM)的关系[0065] 固定探针B的浓度为5.0μM，向其加入pH值不同的100μM的NaOCl。pH缓冲溶液的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，并且每组设置空白对照组。体系经充分震荡混合1分钟后，测定在463nm处的荧光发射强度。结果如图8所示。结果表明，随着体系pH值的升高，与空白对照组比较，相同浓度的NaClO对探针A在463nm处的荧光发射强度的增强程度逐渐减弱。
[0066] 与实施例4中类似，以不同pH下体系中HOCl的浓度为横坐标，以463nm处的荧光发射强度为纵坐标，绘制得到线性关系图，如图8右上角插图所示。当HOCl浓度范围为0-100μM时，在463nm处的荧光强度与HOCl浓度有较好的线性关系。因此，本发明中的探针B是HOCl荧光探针，可以用于水体系中HOCl的定量分析。
[0067] 进一步，HOCl浓度与探针B在463nm处的荧光发射强度的线性关系方程式的斜率为2.00。本实验的标准可通过五次空白样品的平行试验，计算得出标准偏差为2.18×10-8。由此，可以计算得到探针B对HOCl的检测限为32.7nM，达到ppb级别。该数据表明，探针B不仅能够定量检测HOCl，而且具有高灵敏度的优点。
[0068] 实施例9：不同浓度NaOCl对探针B(5.0μM)的荧光光谱的影响
[0069] pH＝7.4条件下，固定探针B分子的浓度为5.0μM，分别加入浓度为0-120μM的NaOCl，经充分震荡混合1分钟后，测定不同组的荧光光谱，参见图9。在未加入NaClO时，体系几乎没有荧光发射信号。随着溶液中NaClO浓度的增加，体系在463nm处的荧光强度不断增加。
[0070] 与实施例5中类似，以pH＝7.4下体系中HOCl的浓度为横坐标，以463nm处的荧光发射强度为纵坐标，绘制得到线性关系图，如图9右上角插图所示。
[0071] 一次线性关系的图像斜率为6.24，本实验的标准可通过五次空白样品的平行试-6验，计算得出标准偏差为3.05×10 。由此，可以计算得到在pH＝7.4下探针B对HOCl的检测限为检测线为1.47μM，达到ppb级别。该数据表明，在生理条件下，该探针可以定量检测HOCl，具有高灵敏度的优点。
[0072] 实施案例10：探针B(5.0μM)的荧光强度与NO(0.5mM)反应，随时间荧光响应的变化。
[0073] 封闭体系下氩气气氛中，探针B的浓度是5.0μM，加入浓度为0.5mM的NO，快速充分振荡后，立即开始计时。每间隔1分钟，从体系中取适量体积的溶液，测定其在512nm处荧光发射强度。结果如图10所示。
[0074] 体系在512nm处的荧光发射强度在10分钟内有明显增长，20分钟后荧光强度趋于稳定。结果表明，探针B与HOCl的作用在10分钟内基本可以结束，在20分钟后可以认为反应完全。本发明选择的作用时间为20分钟。
[0075] 实施例11：不同浓度NO对探针B(5.0μM)的荧光光谱的影响
[0076] 固定探针B的浓度为5.0μM，分别通入浓度为0-110μM的NO，NO浓度从0、10、20、30、50、70、90、110μM递增，经充分震荡混合20分钟后，测定不同组的荧光光谱，参见图11。在未加入NO时，体系几乎没有荧光发射信号。随着溶液中NO浓度的增加，体系在512nm处的荧光强度不断增加。
[0077] 以NO的浓度为横坐标，以512nm处的荧光发射强度为纵坐标，绘制得到线性关系图，如图11右上角插图。
[0078] 一次线性关系的图像斜率为2.33，本实验的标准可通过五次空白样品的平行试验，计算得出标准偏差为3.91×10-7。由此，可以计算得到探针B对NO的检测限为0.51μM，达到ppb级别。该数据表明，该探针可以定量检测NO，具有高灵敏度的优点。
[0079] 虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
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