一种微生物包埋固定化小球及其方法与专用装置和应用
阅读：0发布：2020-08-23
专利汇可以提供一种微生物包埋固定化小球及其方法与专用装置和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于微 生物 降解 有机污物技术领域，公开了一种 微生物 包埋固定化小球及其方法与专用装置和应用。所述方法为：(1)将聚乙烯醇和卡拉胶加入 水 中，加热搅拌溶解，再加入埃洛石和 生物炭 ，混合均匀，得到 混合液 ；(2)将混合液保温并在紫外灯照射下灭菌，加入B.brevis菌悬液，搅拌均匀得到包埋液；(3)将包埋液滴加入交联液中，交联 凝结 成球，得到微生物固定化小球。本发明的方法简单，所制备的固定化小球成球效果好，提高了传质性能，结构稳定，通过载体包埋，增强了微生物对外界毒性的耐受 力 ，提高了对污染物的降解能力。另外，本发明利用恒流 泵 等简易装置，可实现小球制备的连续性，有利于实现自动化。，下面是一种微生物包埋固定化小球及其方法与专用装置和应用专利的具体信息内容。
1.一种微生物包埋固定化小球，其特征在于：所述的微生物包埋固定化小球是以卡拉胶、聚乙烯醇、生物炭和埃洛石的交联产物为载体，包埋B.brevis降解菌形成的固定化微生物凝胶小球。
2.根据权利要求1所述微生物包埋固定化小球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇和卡拉胶加入水中，并加热搅拌溶解后，再加入埃洛石和生物炭，搅拌混合均匀，得到混合液；
(2)将混合液于40℃-45℃水浴保温并在紫外灯照射下灭菌，加入B.brevis菌悬液，搅拌均匀得到含B.brevis菌体的包埋液；
(3)将含菌体的包埋液滴加入交联液中，交联凝结成球，得到微生物固定化小球。
3.根据权利要求2所述微生物包埋固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述滴加是通过恒流泵和管道实现的滴加；
步骤(1)所述混合液中卡拉胶的质量百分比为0.25％-1％，聚乙烯醇的质量百分比浓度为4％-10％，埃洛石的质量百分比为2％-6％，生物炭的质量百分比为0.3％-0.6％。
4.根据权利要求2所述微生物包埋固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述加热搅拌的温度为80～100℃，所述加热搅拌直至聚乙烯醇和卡拉胶溶解完全；
步骤(2)中所述包埋液中B.brevis菌悬液的体积百分比浓度为5％-15％；
步骤(2)中所述B.brevis菌悬液的浓度为8.90g/L-9.525g/L。
5.根据权利要求2所述微生物包埋固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述搅拌混合的时间为30-60min；步骤(1)中所述生物炭为玉米秸秆为原料的生物炭；
步骤(2)中所述搅拌的时间为15-30min；步骤(2)中所述B.brevis菌悬液为经过传代培养活化并在含芘的富集培养基中扩大培养的B.brevis降解菌的菌悬液；
步骤(3)中所述交联液为钾盐与硼酸的水溶液；步骤(3)中所述交联的时间为22-26小时；所述交联的温度为28℃-32℃。
6.根据权利要求5所述微生物包埋固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述B.brevis菌悬液的制备方法：经过传代培养活化并在含芘的富集培养基中扩大培养得到B.brevis降解菌的菌液，再用生理盐水离心洗涤菌液得到菌体，再将菌体重悬于无菌的生理盐水中，调节菌液浓度，得到B.brevis降解菌的菌悬液；
芘的浓度为0.1～10mg/L；所述扩大培养的时间为10～16h；所述离心的转速为6000～
10000rpm；离心时间为5～15min；
步骤(3)中所述钾盐为氯化钾、硫酸钾；交联液中钾盐的质量浓度为2％-6％，硼酸的质量浓度为2％-4％。
7.根据权利要求2～6任一项所述微生物包埋固定化小球的制备方法所采用的专用装置，其特征在于：包括反应釜，配料釜，定量输送泵；所述配料釜设有出料口，所述反应釜设有进料口，反应釜的进料口设有1个或多个滴加管，滴加管通过管路同时连接定量输送泵，定量输送泵通过输送管与配料釜的出料口连接。
8.根据权利要求7所述的专用装置，其特征在于：所述滴加管的圆形横截面的直径相同；所述配料釜的外部设有加热装置；所述反应釜中设有搅拌装置。
9.根据权利要求7所述的专用装置，其特征在于：所述滴加管通过固定装置固定，使得滴加管与进料口相对固定，配料通过滴加管进入反应釜中；滴加管的出口在反应釜中液面的上方。
10.根据权利要求1所述微生物包埋固定化小球在处理含芘废水中的应用。
一种微生物包埋固定化小球及其方法与专用装置和应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着人类对石油、煤炭、木材等产品的不断开发利用，多环芳烃在环境中的浓度逐年增加。多环芳烃(PAHs)具有高生物毒性，易在生物体内蓄积，对生物具有致癌、致畸、致突变(三致)的作用，可以通过呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体，破坏人体的免疫系统。芘作为四环多环芳烃，具有稳定的分子结构和难降解性，是指示多环芳烃污染的代表物。微生物降解因其具有环境友好和高效等的特点，成为去除PAHs等毒害性有机物的一个重要的方法。但复杂多变的污染体系会对微生物产生毒害作用，从而影响微生物的生长繁殖；此外，微生物的个体尺寸微小，在实际应用中容易流失，从而降低微生物去除毒害性有机物的效率。因此增强微生物的适应能力，采用一定技术使其保证正常的降解性能甚至增强降解效率是人们越来越关注的问题。微生物固定化技术就是其中一项简单有效且在实际应用中具有重大借鉴意义的降解菌降解性能强化辅助技术。
[0003] 研究最成熟的固定化方法包括三种：吸附固定化方法、交联固定化方法和包埋固定化方法。包埋固定方法是将目标微生物与固定化载体在一定条件下混合处理形成凝胶液将微生物菌种包埋在载体材料内部，塑化后形成强度较大的颗粒材料如凝胶小球等达到固定化的手段。固定化微生物具有游离菌所无法比拟的优点，不仅可以提高菌体的密度，还可以增强微生物对毒害有机物的耐受力。因此，将固定化微生物技术引用于难降解有机物的治理具有一定的可行性。
[0004] B.brevis降解菌属于短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),genebank登录号为KU921105，该菌在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为GDMCC1.825。B.brevis降解菌能有效利用芘等多环芳烃污染物作为唯一的碳源和能源物质，在胞内酶的催化作用下对多环芳烃污染物实现开环降解，使多环污染物变成易降解的污染物甚至是无害物质。但游离B.brevis降解菌适应环境的能力差且易于流失，固定化微生物技术对于提高微生物的降解效率和降解性能具有重要的意义。此外，用注射器逐滴手工制备的固定化小球的传统方法具有效率低的缺点，以致固定化小球技术难以得到广泛推广，因此设计一套价格低廉、简单易得、工作效率高的固定化小球装置显得尤为重要。
发明内容
[0005] 为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种微生物包埋固定化小球及其方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供制备上述微生物包埋固定化小球的专用装置，即通过固定化小球的专业装置实现对微生物的包埋。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述微生物包埋固定化小球的应用。所述微生物包埋固定化小球用于降解多环芳烃有机物污染物。
[0008] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
[0009] 一种微生物包埋固定化小球，所述的微生物包埋固定化小球是以卡拉胶、聚乙烯醇、生物炭和埃洛石的交联产物为载体，包埋B.brevis降解菌形成的固定化微生物凝胶小球。
[0010] 所述微生物包埋固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (2)将混合液于40℃-45℃保温并在紫外灯照射下灭菌，加入B.brevis菌悬液，搅拌均匀得到含B.brevis菌体的包埋液；
[0014] 步骤(3)中所述滴加是通过恒流泵和管道实现的滴加，具体是采用恒流泵将包埋液依次经过输送管和滴加管滴加到交联液中。
[0015] 步骤(1)所述的混合液中卡拉胶的质量百分比为0.25％-1％，聚乙烯醇的质量百分比浓度为4％-10％，埃洛石的质量百分比为2％-6％，生物炭的质量百分比为0.3％-0.6％；
[0016] 步骤(1)中所述加热搅拌的温度为80-100℃，所述加热搅拌直至聚乙烯醇和卡拉胶溶解完全；
[0017] 步骤(1)中所述搅拌混合的时间为30～60min；
[0018] 步骤(1)中所述生物炭优选为玉米秸秆为原料的生物炭，具体制备步骤为：在惰性气体氛围中，将粉碎后的玉米秸秆进行高温热解，采用碱清洗，再用水洗涤至中性，烘干，得到生物炭。所述高温热解的温度为400～800℃，优选为600～750℃；高温热解的时间为2～4h，在进行高温热解时，升温速率为1～10℃/min，优选为5℃/min。所述碱为30wt％的氢氧化钠溶液。
[0019] 步骤(2)中所述包埋液中B.brevis菌悬液的体积百分比浓度为5％-15％；所述菌种：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)
[0020] 步骤(2)中所述搅拌的时间为15-30min；
[0021] 步骤(2)中所述B.brevis菌悬液中含对数生长期的微生物(微生物具体是指B.brevis细菌)为107-109个/mL；菌悬液的浓度优选为8.90g/L-9.525g/L；
[0022] 步骤(2)中所述B.brevis菌悬液为经过传代培养活化并在含芘的富集培养基中扩大培养的B.brevis降解菌的菌悬液；
[0023] 步骤(2)中所述B.brevis菌悬液的制备方法：经过传代培养活化并在含芘的富集培养基中扩大培养得到B.brevis降解菌的菌液，再用生理盐水离心洗涤菌液得到菌体，再将菌体重悬于无菌的生理盐水中，调节菌液浓度，得到B.brevis降解菌的菌悬液；
[0024] 芘的浓度为0.1～10mg/L，优选为1mg/L；所述扩大培养的时间为10～16h，优选为14h；所述离心的转速为6000～10000rpm，优选为8000rpm；离心时间为5～15min，优选为
10min；离心洗涤的次数为2～5次。
10min；离心洗涤的次数为2～5次。
[0026] 步骤(3)中所述交联的时间为22-26小时。所述交联的温度为28℃-32℃。
[0028] 所述微生物包埋固定化小球制备的专用装置，包括反应釜，配料釜，定量输送泵；所述配料釜设有出料口，所述反应釜设有进料口，反应釜的进料口设有1个或多个滴加管，滴加管通过管路同时连接定量输送泵，定量输送泵通过输送管与配料釜的出料口连接。所述滴加管的圆形横截面的直径相同，所述滴加管为软管。所述输送管为软管。所述定量输送泵为恒流泵。所述配料釜的外部设有加热装置。所述反应釜中设有搅拌装置。
[0029] 所述滴加管通过固定装置固定，使得滴加管与进料口相对固定，配料通过滴加管进入反应釜中。所述固定装置为支管架。滴加管的出口在反应釜中液面的上方。
[0030] 采用专用装置制备固定化小球时，其过程为：在配料釜中制得的包埋液，通过恒流泵、输送管和滴加管的作用，传送并滴加到反应釜中，包埋液在反应釜中交联剂的交联作用下形成微生物固定化小球。
[0031] 上述微生物包埋固定化小球(B.brevis降解菌固定化小球)在处理含芘废水中的应用。
[0032] 优选的，所述微生物包埋固定化小球(B.brevis降解菌固定化小球)在处理含芘废水中时，含芘废水中芘的浓度为1-3mg/L，固定化小球在废水中的含量为60g/L-100g/L，降解过程在震荡避光的环境下进行。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
[0034] (1)本发明采用的载体为卡拉胶、聚乙烯醇、生物炭和埃洛石都有来源广泛、价格低廉和对生物无毒性的特点；卡拉胶、聚乙烯醇、埃洛石、生物炭和降解菌菌体按一定比例制备的包埋固定化小球，机械强度大，不易破碎，且可避免水体流动造成的菌体流失脱落的缺陷，大大增加了菌体密度，增强了微生物对外界环境的耐受力，提高了对有机污染物的降解能力；同时卡拉胶的加入可以改善球体中紧密的网格结构提高疏松度并降低传质阻力，埃洛石的加入既能给微生物提供载体又保护了微生物，使微生物免受毒害物质的毒害，提高其对毒害物质芘的去除率，而生物炭的加入，更进一步改善了小球的结构，提高了固定化小球的性能；
[0035] (2)本发明所述微生物固定化小球的专用装置，设备容易获得，制球工艺简单，而且制作过程对生物活性物质较温和，并可实现从原料制备到小球产出的一体化过程，制作过程可实现自动化；整套装置简易，可整体放于超净工作台中，在制作过程中可防止杂菌污染；此外，可在本发明的基础上通过增加恒流泵的通道来成倍提高微生物包埋小球的制备效率；
[0037] 图1为B.brevis降解菌菌悬液的游离菌在不同时间对芘的去除率的曲线图；
[0038] 图2为实施例1制备的微生物包埋固定化小球、对比例1～对比例5制备的固定化小球以及游离菌对芘去除率的柱状图；
[0039] 图3为本发明微生物固定化小球连续制备的专用装置结构示意图，1-配料釜，2-输送管，3-定量输送泵，4-滴加管，5-反应釜，6-固定装置；箭头方向为液体流动方向。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0041] 本发明微生物包埋固定化小球制备的专用装置的结构示意图如图3所示，包括反应釜5，配料釜1，定量输送泵3；所述配料釜设有出料口，所述反应釜设有进料口，反应釜的进料口设有1个或多个滴加管4，滴加管通过管路同时连接定量输送泵3，定量输送泵通过输送管2与配料釜的出料口连接。所述滴加管的圆形横截面的直径相同，所述滴加管为软管。所述输送管为软管。所述定量输送泵为恒流泵。所述配料釜的外部设有加热装置。所述反应釜中设有搅拌装置。
[0042] 所述滴加管通过固定装置6固定，使得滴加管与进料口相对固定，配料通过滴加管进入反应釜中。所述固定装置为支管架。滴加管的出口在反应釜中液面的上方。
[0043] 配料釜和恒流泵放置于工作台上，反应釜放置在圆柱上。
[0044] 实施例中生物炭的制备：将玉米秸秆洗净，烘干去除水分，剪碎，然后放入粉碎机中粉碎；之后将粉碎后的玉米秸秆放入石英舟，将石英舟放入管式炉中；在氮气的保护下以5℃/min的速度升温到700℃，恒温3h，冷却至室温后取出，用30wt％的NaOH溶液清洗3次，之后用蒸馏水洗至中性，烘干，过200目的筛得到生物炭备用。
[0045] 生物炭的各元素含量为：C的含量为79.58％，N的含量为1.57％，O的含量为18.85％。
[0046] 实施例1
[0047] 一种微生物包埋固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0048] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：挑取经传代培养3-5代后的B.brevis降解菌菌落至含2mg/L芘的富集培养基中，恒温震荡培养14h，得到细菌密度很大的浓菌液；在离心温度为4℃和转速为8000r/min的条件下，将浓菌液用无菌生理盐水离心洗涤3次，每次离心时间为10min；洗得的菌体重悬于生理盐水中，在紫外-可见分光光度计的波长为600nm处调节菌液浓度，使其吸光度A＝1，从而制得B.brevis降解菌菌悬液(菌悬液的浓度为9.0g/L)，所制得的菌悬液保存在4℃冰箱中备用；
[0049] 所述富集培养基的配方：将3g牛肉膏、10g蛋白胨和5gNaCl混溶于1L水中，调节pH至7.2；含2mg/L芘的富集培养基：富集培养基灭菌后，将芘储备液过0.22μm滤头以达到灭菌的作用，之后加入富集培养基中，使最终浓度为2mg/L；
[0050] (2)制备菌体包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，再加入埃洛石和生物炭搅拌1小时，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟；之后，将步骤(1)所得的B.brevis降解菌菌悬液加入到混合液中，搅拌15分钟至混合均匀得到含B.brevis降解菌菌体的包埋液；
[0051] 混合液中卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％，埃洛石的重量百分比浓度为4％，生物炭的重量百分比浓度为0.5％，B.brevis降解菌菌悬液占混合液的体积百分比为10％；
[0052] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：将步骤(2)所得的菌体包埋液放置于恒温水浴锅中使包埋液的温度保持在40℃，通过恒流泵将包埋液经过软管缓慢匀速地滴加到由硼酸、氯化钾和水混合配成的交联液中(硼酸的重量百分比浓度为3％，氯化钾的重量百分比浓度为4％)，在搅拌条件下交联形成的固定化小球始终浸没在交联液中，小球成球较好，滴加完后在30℃无光交联24小时，用无菌蒸馏水洗涤，得到微生物包埋固定化小球。
[0053] 实施例2
[0054] 一种微生物包埋固定化小球的制备方法为：
[0055] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0056] (2)制备菌体包埋液：混合液中卡拉胶的重量百分比为0.3％，其他步骤与条件与实施例相同；
[0057] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0058] 实施例3
[0059] 一种微生物包埋固定化小球的制备方法为：
[0060] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0061] (2)制备菌体包埋液：混合液中卡拉胶的重量百分比为1％，其他步骤与条件与实施例相同；
[0062] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0063] 实施例4
[0064] 一种微生物包埋固定化小球的制备方法为：
[0065] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0066] (2)制备菌体包埋液：混合液中聚乙烯醇的重量百分比为4％，其他步骤与条件与实施例相同；
[0067] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0068] 实施例5
[0069] 一种微生物包埋固定化小球的制备方法为：
[0070] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0071] (2)制备菌体包埋液：混合液中聚乙烯醇的重量百分比为10％，其他步骤与条件与实施例相同；
[0072] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0073] 对比例1
[0074] 一种无菌无埃洛石无生物炭的固定化小球的制备：
[0075] (1)制备包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟，得到包埋液；
[0076] 混合液中卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％；
[0077] (2)制备无菌无埃洛石无生物炭固定化小球：与实施例1相同。
[0078] 对比例2
[0079] 一种无菌无生物炭固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0080] (1)制备包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，再加入埃洛石搅拌1h，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟，得到包埋液；
[0081] 混合液中卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％，埃洛石的重量百分比浓度为4％；
[0082] (2)制备无菌无生物炭固定化小球：与实施例1相同。
[0083] 对比例3
[0084] 一种无埃洛石无生物炭固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0085] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0086] (2)制备菌体包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟，将步骤(1)所得的B.brevis降解菌菌悬液加入到混合液中，搅拌15分钟至混合均匀得到含B.brevis降解菌菌体的包埋液；
[0087] 混合液中卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％，B.brevis降解菌菌悬液占混合液的体积百分比为10％；
[0088] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0089] 对比例4
[0090] 一种无生物炭的微生物包埋固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0091] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0092] (2)制备菌体包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，再加入埃洛石搅拌1小时，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟，将步骤(1)所得的B.brevis降解菌菌悬液加入到混合液中，搅拌15分钟至混合均匀得到含B.brevis降解菌菌体的包埋液；
[0093] 混合液中：卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％，埃洛石的重量百分比浓度为4％，B.brevis降解菌菌悬液占混合液的体积百分比为10％；
[0094] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0095] 对比例5
[0096] 一种无埃洛石的微生物包埋固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
[0097] (1)制备B.brevis降解菌菌悬液：与实施例1相同；
[0098] (2)制备菌体包埋液：将卡拉胶(κ-卡拉胶)和聚乙烯醇(聚乙烯醇的平均聚合度为1750±50)加入无菌水中，于90℃下水浴加热搅拌3小时，再加入生物炭搅拌1小时，然后将水浴温度降到40℃，得到混合液；将制得的混合液置于40℃的水浴温度下并在紫外灯照射下灭菌30分钟，将步骤(1)所得的B.brevis降解菌菌悬液加入到混合液中，搅拌15分钟至混合均匀得到含B.brevis降解菌菌体的包埋液；
[0099] 混合液中：卡拉胶的重量百分比浓度0.5％，聚乙烯醇的重量百分比浓度为8％，生物炭的重量百分比浓度为0.5％，B.brevis降解菌菌悬液占混合液的体积百分比为10％；
[0100] (3)制备B.brevis降解菌包埋固定小球：与实施例1相同。
[0101] 性能测试：
[0102] 1、测定游离菌(B.brevis降解菌)在不同时间对芘的去除效果，操作如下：
[0103] 无机盐培养基(即MSM无培养基)于120℃高温灭菌后，分装至5个经灭菌的50Ml锥形瓶，加入经过滤灭菌的芘储备液使各锥形瓶中芘的浓度为2mg/L，再按降解菌菌悬液占溶液体系的体积百分比为10％投加游离的B.brevis降解菌菌悬液(实施例1培养的菌悬液)；将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，于30℃、150r/min的条件震荡培养，每个样品设3个平行；
[0104] 分别在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天定时取样测定各锥形溶液中残留的芘的浓度，样品的处理步骤如下：将上清液转移到聚四氟乙烯的含盖离心管中，用30mL有机萃取剂(二氯甲烷)分3次萃取溶液中残留的芘，每次加入10mL二氯甲烷超声15分钟，然后在4000rpm/min条件下离心10分钟收集上清液；取2mL混匀的萃取液，加入30μL二甲基亚矾，在40℃下氮吹至尽干，再用乙腈替代残留的二氯甲烷3次，每次加入2mL乙腈氮吹至尽干，再用乙腈定容至1mL。测定用高效液相色谱，波长为238nm，流动相为乙腈：水＝90:10，流速为1mL/min，由标准曲线计算出体系芘的浓度。
[0105] 游离菌在不同时间对芘的降解效果如图1所示。图1为B.brevis降解菌菌悬液的游离菌在不同时间对芘的去除率的曲线图。从图1可以看出，0-6天内，去除率比较低且增长比较缓慢，是因为细菌刚从营养丰盛的牛肉膏培养基中转移到营养缺失的无机盐培养基中，同时还受到芘的毒害和胁迫，导致大量细菌失活或死亡，从而在短时间内显示出较低的去除率。而到第8天，芘的去除率出现较快的上升，芘的去除率达到45％左右；然而第10天时候芘的去除率无明显的提高，这可能与后期菌体的代谢活性降低以及污染物浓度下降导致菌体接触的几率降低有关。由此，可见B.brevis降解菌需要较长的适应期、降解周期长且对芘的去除率还相对较低。
[0106] 2、对实施例1制备的微生物包埋固定化小球、对比例1～对比例5制备的固定化小球以及游离菌对芘的去除效果的测试
[0107] 测试步骤如下:
[0108] 将灭菌后的MSM培养基分别分装入多个50mL的锥形瓶中，分别加入2mLB.brevis降解菌菌悬液、2g对比例1～对比例5制备的固定化小球以及2g实施例1的微生物包埋固定化小球，最终体系溶液体积为20mL；再加入经0.22μm滤头过滤灭菌芘储备液，保证芘的最终浓度为2mg/L；将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，于30℃、150r/min的条件震荡培养，每个样品设3个平行；
[0109] 震荡培养两天后定时取样，测定各锥形溶液中残留的芘的浓度。样品的处理步骤如下：将上清液转移到聚四氟乙烯的含盖离心管中，用30mL有机萃取剂(二氯甲烷)分3次萃取溶液中残留的芘，每次加入10mL二氯甲烷超声15分钟，然后在4000rpm/min条件下离心10分钟收集上清液；取2mL混匀的萃取液，加入30μL二甲基亚矾，在40℃下氮吹至尽干，再用乙腈替代残留的二氯甲烷3次，每次加入2mL乙腈氮吹至尽干，再用乙腈定容至1mL。测定用高效液相色谱，波长为238nm，流动相为乙腈：水＝90:10，流速为1mL/min,由标准曲线计算出体系芘的浓度。测试结果如图2所示。图2为实施例1制备的微生物包埋固定化小球、对比例1～对比例5制备的固定化小球以及游离菌对芘去除率的柱状图。
[0110] 由图2可以看出游离菌对芘的去除率最低，B.brevis降解菌游离菌只有16％，实施例1所制备的微生物固定化小球的对芘的去除率最高，其对芘的去除率高达99％左右，且去除率为：实施例1>对比例5(无埃洛石)>对比例4(无生物炭)>对比例3(无埃洛石无生物炭固定化小球)>对比例2(无菌无生物炭固定化小球)>对比例1(无菌无埃洛石无生物炭固定化小球)>游离菌，由此可以看出实施例1(有埃洛石有生物炭)中的去除率最高，研究表明埃洛石具有良好的生物相容性，不仅可以给微生物提供载体，还能保护微生物，使微生物免受毒害物质的毒害，提高其对毒害物质芘的去除率；此外，生物炭具有良好的吸附性能，可以提高固定化小球对污染物的去除率；在埃洛石和生物炭的协同作用下，不仅利用了生物炭的吸附去除作用同时也利用了埃洛石对微生物的保护作用以及微生物的降解作用，极大地增强了固定化小球对污染物芘的去除效果。
[0111] 3、对实施例1～实施例5制备的固定化微生物小球进行物理性能测试：
[0112] (1)拉伸强度：将固定化小球一端固定，另一端施加一定的拉力，直到小球断裂为止，以此拉力值衡量小球的拉伸强度，每个实施例各取30个小球进行测量，取其平均值作为小球的拉伸强度。测试结果如表1所示。
[0113] (2)弹性的测定：以一定的压力(50g砝码)弹压固定化小球10s后，用。游标卡尺测量其形变前后小球的直径，用此值来衡定小球的弹性；每个实施例各取30个小球进行测定，取其平均值。测试结果如表1所示。
[0114] (3)渗透时间：选取形态完好、大小均匀的固定化小球，浸入惰性红墨水中，每隔5min用镊子将小球取出并切开，测定红墨水浸透的厚度，记录小球被红墨水完全浸透的时间。测试结果如表1所示。
[0115] 实施例1～实施例5制备的固定化微生物小球的成球性能如表1所示。
[0116] 表1例1～实施例5制备的固定化微生物小球的物理性能测试结果
[0117] 拉伸强度(N) 弹性(N/cm2) 渗透时间(min)
实施例1 82.3 0.8 40
实施例2 84.2 0.6 30
实施例3 80.4 0.9 50
实施例4 64.3 0.4 25
实施例5 90.5 0.6 60
实施例1 82.3 0.8 40
实施例2 84.2 0.6 30
实施例3 80.4 0.9 50
实施例4 64.3 0.4 25
实施例5 90.5 0.6 60
[0118] 由表1可以看出随着PVA用量的增加，小球的机械强度增加，但传质阻力增加，与此同时成球性下降。此外，小球的弹性先增加再减小，当PVA的重量百分比浓度为8％时，小球的弹性最好。当PVA的重量百分比浓度为8％时，小球成球较好，易于制作，其传质性能及机械性能也较好；当卡拉胶浓度增加时，小球的机械强度变化不明显，但传质阻力有所增加，弹性有所下降，成球性也变差。当卡拉胶浓度较低时，PVA滴入硼酸成型液时，因PVA与硼酸反应速度较慢，两液滴滴下时间相差不大时，两液滴会连在一起，成型较为困难，且在反应也中也易于破碎，当卡拉胶浓度较高时，胶液在45℃时粘度较大，甚至凝固在一起难以成型。因此卡拉胶的最佳重量百分比浓度为0.5％。
[0119] 上述实施例1为本发明较佳的实施方式，但是本发明的实施方式不受上述实例限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效。
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