一种可视化的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用
阅读：2发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种可视化的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于快速检测领域，公开了一种 可视化 的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用，包括如下步骤：(1)工程菌的制备：利用Red重组法敲除大肠杆菌菌株中β-半乳糖苷酶基因，获得工程菌；(2)工程菌裂解液的制备：测定上述工程菌的生长曲线，制备工程菌裂解液；(3)显色体系的配制：配制显色体系，包括工程菌裂解液、 能量 供应体系、 氨 基酸 混合液 和其他 蛋白质 合成所需的底物混合液；所述能量供应体系含 磷酸 烯醇式丙 酮 酸 。此非细胞显色体系可应用于病原 微 生物 快速检测。本发明所建立的非细胞显色体系，操作简便，耗时短，成本低，微量化并可肉眼观察反应情况。以该体系为 基础 ，可实现通过肉眼观察来判断反应情况，在可视化快速检测方面具有广泛的应用前景。，下面是一种可视化的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种可视化的非细胞体外显色体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)工程菌的制备：
利用Red重组法敲除大肠杆菌菌株中β-半乳糖苷酶基因，获得工程菌；
(2)工程菌裂解液的制备：
测定上述工程菌的生长曲线，制备工程菌裂解液；
(3)显色体系的配制：
配制显色体系，包括工程菌裂解液、能量供应体系、氨基酸混合液和其他蛋白质合成所需的底物混合液；所述能量供应体系含磷酸烯醇式丙酮酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述能量供应体系的浓度为20～
28mM；所述氨基酸混合液的浓度为40～60mM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)；所述工程菌裂解液为敲除β-半乳糖苷酶基因的BL21(DE3)裂解液，即BL21(DE3)ΔlacZ裂解液，浓度为20～30％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸混合液为用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺加入水配成的等摩尔浓度的混合液。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述其他蛋白质合成所需的底物混合液为醋酸镁、谷氨酸钾、醋酸铵、HEPES-KOH、tRNA、叶酸、二硫苏糖醇、腐胺、亚精胺、草酸、ATP、CTP、UTP、GTP、PEG8000、RNA酶抑制剂和氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述显色体系中还添加海藻糖或聚乙烯醇作为保护剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述海藻糖的浓度为0.2～0.6M，聚乙烯醇的浓度为5％～10％。
8.权利要求1～7任意一项所述方法制备的可视化的非细胞体外显色体系。
9.权利要求8所述的可视化的非细胞体外显色体系在病原微生物检测中的应用，其特征在于，设计针对病原微生物检测靶标的Toehold-Switch元件质粒，该质粒5’端部分含有与检测靶标特异结合序列，3’端含有β-半乳糖苷酶基因，将上述质粒和待检样品加入非细胞体外显色体系中，静置反应，通过显色情况来判定体系中检测目标的有无，当呈现黄色时，体系不存在相应检测靶标，当呈现紫色时，体系存在相应检测靶标。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述反应温度为30±5℃，静置时间为20～60min。
一种可视化的非细胞体外显色体系及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 非细胞表达体系是一种以细胞裂解液为基础的体外表达体系，一直被广泛应用于在体内较难表达的蛋白质的合成如膜蛋白、毒性蛋白，以及体外遗传网络的研究(Jessica G.Perez,Jessica C.Stark,and Michael C.Jewett.Cell-Free Synthetic Biology:EngineeringBeyond the Cell[J]Cold Spring HarbPerspect Biol.2016；1:8(12))。目前，已开发出原核和真核两大类非细胞表达系统，其中原核表达系统尤其是大肠杆菌表达系统，由于产率高、稳定性好和成本低的优势，一直备受青睐。
[0003] 在大肠杆菌非细胞表达体系中，大肠杆菌裂解液含有基因表达所需的最基本的物质。该体系的基因的转录一般由外源添加的T7 RNA聚合酶调控，此外还需外源添加氨基酸、NTP及能量物质等蛋白质合成所需的底物。实验室常用的非细胞表达体系中涉及多种能量体系的组成(Kim DM,Swartz JR.Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis[J]BiotechnolBioeng.2001；74(4):309-16.)，如丙酮酸钠/CoA/NAD，PEP/PK，CP/CK，cAMP/CP/CK，每种能量体系组成各有其优势和劣势，比如磷酸烯醇式丙酮酸体系提供能量较快，蛋白产量高，但价格昂贵；丙酮酸钠能量体系价格便宜，但蛋白产量相对较低。
[0004] 目前关于病原微生物检测方法多种多样(Mangal M,Bansal S,Sharma SK,et al.Molecular Detection of Foodborne Pathogens:A Rapid and Accurate Answer to Food Safety[J]Crit Rev Food Sci Nutr.2016；56(9):1568-84.)，比如常见的培养法，RT-PCR，分子信标法，胶体金法等，但是这些检测方法需要昂贵的仪器和设备，技巧性极强，并且需要专业的操作人员，不具有简单、快速、易于便携的特点，因此在偏远地区以及缺乏专业技术人员的现场很难通过这些手段进行检测。综上，开发简单、快速，无需昂贵仪器的检测方法迫在眉睫。
发明内容
[0005] 针对上述问题，我们建立一种依赖于β-半乳糖苷酶水解底物的显色表达体系，首先，敲除大肠杆菌自身β-半乳糖苷酶基因消除背景干扰；接着，优化非细胞体系的组成成分，提高非细胞体系的表达效率。本发明的主要目的在于建立一种简单、快速、可视化的微量非细胞显色体系。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种可视化的非细胞体外显色体系的制备方法，包括如下步骤：
[0008] (1)工程菌的制备：
[0009] 利用Red重组法敲除大肠杆菌菌株中β-半乳糖苷酶基因，获得工程菌；
[0010] (2)工程菌裂解液的制备：
[0011] 测定上述工程菌的生长曲线，制备工程菌裂解液；
[0012] (3)显色体系的配制：
[0013] 配制显色体系，包括工程菌裂解液、能量供应体系、氨基酸混合液和其他蛋白质合成所需的底物混合液；所述能量供应体系含磷酸烯醇式丙酮酸。
[0014] 优选地，所述能量供应体系的浓度为20～28mM；所述氨基酸混合液的浓度为40～60mM。
[0015] 优选地，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)；所述工程菌裂解液为敲除β-半乳糖苷酶基因的BL21(DE3)裂解液，即BL21(DE3)ΔlacZ裂解液。
[0016] 优选地，所述氨基酸混合液(含20种氨基酸)为用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺加入水配成的等摩尔浓度的混合液。
[0017] 优选地，所述其他蛋白质合成所需的底物混合液为醋酸镁、谷氨酸钾、醋酸铵、HEPES-KOH、tRNA、叶酸、二硫苏糖醇、腐胺、亚精胺、草酸、ATP、CTP、UTP、GTP、PEG8000、RNA酶抑制剂和氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷。
[0018] 优选地，所述显色体系中还添加海藻糖或聚乙烯醇作为保护剂，海藻糖的浓度为0.2～0.6M，聚乙烯醇的浓度为5％～10％。
[0019] 所述的可视化的非细胞体外显色体系在病原微生物检测中的应用，具体地，设计针对病原微生物检测靶标的Toehold-Switch元件质粒，该质粒5’端部分含有与检测靶标特异结合序列，3’端含有β-半乳糖苷酶基因；将上述质粒和待检样品加入非细胞体外显色体系中，静置反应，通过显色情况来判定体系中检测目标的有无，当呈现黄色时，体系不存在相应检测靶标，当呈现紫色时，体系存在相应检测靶标。
[0020] 优选地，所述反应温度为30±5℃，静置时间为20～60min。
[0021] 一种可视化的非细胞显色体系建立，包括如下步骤：
[0022] (1)大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ工程菌的构建
[0023] 利用Red重组方法敲除大肠杆菌BL21(DE3)中β-半乳糖苷酶基因获得BL21(DE3)ΔlacZ工程菌。
[0024] (2)工程菌BL21(DE3)ΔlacZ裂解液的制备
[0025] 测定BL21(DE3)ΔlacZ工程菌的生长曲线。根据生长曲线，在OD为0.4～0.6时进行IPTG诱导，待菌生长到OD为3.5～4.0时收集菌体。用S30缓冲液洗涤3次，高压破碎仪20kpsi破碎2次，12,000g，30min后取上清，即为工程菌BL21(DE3)ΔlacZ的裂解液。
[0026] (3)非细胞显色体系组成成分优化
[0027] ①外源添加T7 RNA聚合酶的量的优化；
[0028] ②能量体系组成的优化。
[0029] (4)非细胞显色体系的可视化反应表达
[0030] 配制15μL体系，内含工程菌BL21(DE3)ΔlacZ裂解液、能量供应体系、氨基酸混合液和反应缓冲液；将体系在30℃，静置反应20min，用于表达显色。
[0031] (5)非细胞显色体系的稳定性优化
[0032] 根据保存温度条件，选择合适的外源保护剂，以提高非细胞显色体系的长期稳定性。
[0033] (6)非细胞显色体系在病原微生物检测中的应用
[0034] Toehold-Switch元件是通过调控专利或翻译过程从而调控目的蛋白或生物活性的同源RNA对，由两个称为开关和触发器的RNA链组成，分别称为Switch链和Trigger链。Switch RNA含有被调节基因的编码序列，该编码序列的上游包含有较强的核糖体结合位点(RBS)和起始密码子(AUG)的基于发夹的加工模块，其后是编码添加到目的蛋白基因的N末端的低分子量氨基酸的共同21nt的连接序列。该发夹模块的5’末端的单链前导序列提供Trigger RNA链的初始结合位点。该Trigger RNA含有延伸的单链区域，其完成与发夹的分支迁移过程以暴露RBS和起始密码子，由此启动目的蛋白基因的翻译表达。
[0035] 本发明非细胞显色体系应用时搭配Toehold-Switch元件，该元件5’端部分含有与检测靶标特异结合序列，3’端含有β-半乳糖苷酶基因。若检测样本中存在检测靶标时，该元件与检测靶标结合，可成功表达β-半乳糖苷酶，此时该体系呈现紫色；相反，若不存在相应检测靶标时，该体系呈现黄色。将该显色体系结合Toehold-Switch元件应用于病原微生物的快速检测，如GII.4型诺如病毒，GII.17型诺如病毒，人冠状病毒，寨卡病毒和金黄色葡萄球菌等的检测中，当体系中出现检测目标时，体系颜色由浅黄色变为紫色，肉眼即可判断检测目标的有无，并确定其特异性。本发明细胞显色体系的应用不限于上述几种病原微生物，只要设计了对应的Toehold-Switch元件，病原微生物都可以被检测出来。
[0036] 本发明的优点是：操作简便，耗时短，低成本，微量化(10～15μL)并可肉眼观察反应情况；所述显色体系可在添加保护剂的情况下，在相应的保存条件下延长保存时间。为其应用提供便利；所述显色体系可实现通过肉眼观察颜色变化判断反应情况，可在病原微生物检测方面得到广泛应用。附图说明
[0037] 图1为实施例2中BL21(DE3)ΔlacZ工程菌的生长曲线图。
[0038] 图2为实施例3中非细胞显色体系组分优化图；A为T7 RNA聚合酶优化图，B为能量组成体系优化图。
[0039] 图3为实施例3中pET28a-lacZ质粒在微量非细胞显色体系中的表达图。
[0040] 图4为实施例4中非细胞显色体系在不同保护剂和保存条件下的结果图；A为保护剂海藻糖和聚乙烯醇在4℃保存条件下的结果图，B为保护剂海藻糖和聚乙烯醇在-20℃保存条件下的结果图。
[0041] 图5为实施例5中非细胞显色体系在GII.4-NoV，GII.17-NoV，HCoV和Zika的检测结果图；A为4种病原微生物交叉检测结果图，B为4种病原微生物交叉检测显色图。
[0042] 图6为实施例5中非细胞体系在金黄色葡萄球菌中的检测结果图。
具体实施方式
[0044] 实施例1大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ工程菌的构建
[0045] 1.根据敲除靶基因序列设计同源臂序列：
[0046]
[0047] 2.以pKD4质粒为模板，用上述同源臂引物进行卡那抗性基因的扩增，具体步骤如下：
[0048] (1)PCR反应体系(50μL)：
[0049]
[0050] (2)PCR扩增反应程序
[0051]
[0052] (3)PCR反应结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小约为1.6kb的包含linker序列的基因片段，对PCR产物进行纯化回收，得到含有卡那抗生素基因的同源臂片段，置于-20℃保存待用
[0053] 3.利用Red同源重组的原理与方法敲除BL21(DE3)(购买于天根生化科技有限公司)的lacZ基因，具体敲除方法如下：
[0054] (1)将pKD46质粒化学转化入待敲除的BL21(DE3)菌株中。
[0055] (2)将上述回收得到的含有卡那抗生素基因的同源臂片段通过电转化的方法导入进大肠杆菌BL21(DE3)/pKD46，电转化参数如下：电转化设备：eppendorf 2510；电转电压：2.0KV，4ms。
[0056] (3)添加了终浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB平板进行筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证，将构建的突变株命名为BL21(DE3)ΔlacZ。
[0057] 实施例2大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ裂解液的制备
[0058] 1.大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ工程菌生长曲线的测定：
[0059] (1)从平板上挑取上述构建的BL21(DE3)ΔlacZ单菌落接种于5mL LB培养基中，37℃摇床220rpm培养过夜。
[0061] (3)1h后取样测定OD600，之后每半小时取样1次检测OD600，3次重复并记录。
[0062] (4)当OD600在0.4～0.6时往1瓶培养基中添加1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，与对照组一起每隔半小时取样测定OD600，3次重复并记录。
[0063] (5)根据数据作图BL21(DE3)ΔlacZ工程菌的生长曲线，如图1所示。
[0064] 2.大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ裂解液的制备：
[0065] (1)从平板上挑取上述构建的BL21(DE3)ΔlacZ单菌落接种于5mL LB培养基中，37℃摇床220rpm培养过夜。
[0066] (2)将种子液以1:100转接至300mL的2×YTPG培养基中，继续37℃摇床220rpm培养。
[0067] (3)按照1中所测定的生长曲线，当培养约2h，至菌浓度OD600值为0.4～0.6时，加入1mM IPTG进行诱导，继续培养。当菌浓度OD600值达到3.5～4时开始收集菌体。
[0068] (4)用预冷的S30 Buffer(10mM Tris(pH8.2)，14mM醋酸镁，60mM谷氨酸钾，2mM二硫苏糖醇)重悬菌体，振荡器充分混匀，4℃，8000g离心7min，倒去上清。此步骤重复3次。
[0069] (5)每1g菌体加入1mL预冷S30 Buffer，充分混匀。
[0070] (6)用高压细胞破碎仪20kpsi破碎细胞2次。将破胞液4℃，12,000g离心20min，取上清。
[0072] 实施例3非细胞显色体系建立及验证
[0073] 1.pET28a-lacZ载体构建：
[0074] PCR扩增大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)基因，然后连接至表达载体pET28a(实验室保存)中，构建可成功表达β-半乳糖苷酶的重组表达质粒。具体构建方法如下：
[0075] (1)设计扩增lacZ基因的引物：
[0076]
[0077] (2)PCR反应体系(50μL)：
[0078]
[0079] (3)PCR扩增反应程序：
[0080]
[0081] PCR反应结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收3100bp左右的目的片段。
[0082] (4)将回收产物和pET28a质粒同时做BamHI/Hind III双酶切，酶切体系如下(50μL)：
[0083]
[0084] 置于37℃恒温PCR仪中反应3h。酶切反应完后，纯化回收。
[0085] (5)将步骤(4)中得到的回收产物进行T4连接酶连接，具体操作如下：连接反应体系(20μL)：
[0086]
[0087] 置于16℃恒温PCR仪中反应12h。
[0088] (6)连接反应完毕后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中,然后将菌液涂至含卡那青霉素(终浓度为50μg/mL)的LB固体平板中，置于37℃培养箱培养过夜。转化方法采用的是化学转化法。
[0089] (7)对平板中长出的单克隆进行测序鉴定。筛选出正确携带lacZ基因的质粒pET28a-lacZ。
[0090] 2.非细胞显色体系建立：
[0091] (1)体系组分的优化
[0092] BL21(DE3)ΔlacZ工程菌本身经IPTG诱导后可产生T7 RNA聚合酶，由于T7 RNA聚合酶在该显色体系中必不可少，因此猜想额外添加T7 RNA聚合酶是否可以提高显色体系的快速及大量表达，达到更好的显色效果。经实验验证，额外添加T7 RNA聚合酶(购于NEB，#M0251S)，反应体系的表达量反而降低，结果如图2A所示。因此，该显色体系不需额外添加T7 RNA聚合酶。
[0093] 非细胞体系中，可提供能量的体系组成有多种，我们选择了价廉的丙酮酸盐(Sodium pyruvate，SP)能量体系和快速提供ATP的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)能量体系。经实验比较发现，PEP的效果优于SP的效果，如图2B所示，原因可能是PEP可快速供能，使体系快速达到显色效果。
[0094] (2)体系组分的确立及可视化表达
[0095] 体系中各组分的用量见表1：
[0096]
[0097]
[0098] 混合液A的组成成分见表2：
[0099]试剂 使用浓度 储存温度
醋酸镁 12mM -20℃
谷氨酸钾 90mM -20℃
醋酸铵 80mM -20℃
HEPES-KOH 57mM -20℃
DTT 2mM -20℃
腐胺 1mM -20℃
亚精胺 1.5mM -20℃
草酸 4mM -20℃
亚叶酸 0.034mg/mL -20℃
tRNA 0.171mg/mL -20℃
醋酸镁 12mM -20℃
谷氨酸钾 90mM -20℃
醋酸铵 80mM -20℃
HEPES-KOH 57mM -20℃
DTT 2mM -20℃
腐胺 1mM -20℃
亚精胺 1.5mM -20℃
草酸 4mM -20℃
亚叶酸 0.034mg/mL -20℃
tRNA 0.171mg/mL -20℃
[0100] 按照表1和表2配制15μL反应体系，加入质粒pET28a-lacZ(13.3ng/μL)，30℃，静置20min后观察颜色变化，并测定OD570值，结果如图3所示：在30℃静置20min后，反应体系颜色由浅黄色变为紫色。
[0101] 实施例4非细胞显色体系的稳定性探索
[0102] 非细胞显色体系中含有多种酶成分，在4℃或-20℃条件下放置1周后，活性明显下降。海藻糖作为一种新型的生物分子保护剂，得到了广泛的研究，常被用作蛋白质的稳定剂；也有文献报道聚乙烯醇常被用作添加剂来保持反应体系中酶的活性。为了提高显色体系的稳定性，研究了海藻糖(Trehalose)(购于北京普博欣生物技术有限公司，CAS#99-20-7)和聚乙烯醇(PVA)(购于Sigma-Aldrich，360627)对显色体系稳定性的影响。实验结果如图4所示，随着保存时间的延长，该显色体系的活性均降低；在4℃保存条件下，体系中添加海藻糖的稳定效果优于聚乙烯醇；但在-20℃保存条件下，体系中添加聚乙烯醇的稳定效果优于海藻糖。因此，可根据不同的保存条件，选择不同的添加保护剂以延长体系的保存时间。
[0103] 实施例5非细胞显色体系在病原微生物检测中的应用
[0104] 本实施例应用于RNA检测的Toehold-Switch开关，检测目标是GII.4型诺如病毒，针对此靶标设计Toehold-Switch元件，结合非细胞显色体系，通过体系颜色的变化判断检测靶标的存在情况。
[0105] 将实验室筛选得到的针对GII.4型诺如病毒、GII.17型诺如病毒和人冠状病毒的Toehold-Switch元件，以及文献报道的寨卡病毒Toehold-Switch元件等应用上述非细胞体外显色体系，通过是否显色来判定体系中检测目标的有无。按照表1和2配制非细胞显色体系，质粒为针对各检测靶标的Toehold-Switch元件质粒，30℃条件下与不同靶标的Trigger质粒作用1h后，观察体系颜色变化情况并测定OD570，结果如图5所示。结果显示：当体系中无GII.4型诺如病毒靶标Trigger质粒时，体系颜色没有变化，显示浅黄色，OD值较低；当体系中存在GII.4型诺如病毒靶标Trigger质粒后，体系颜色发生变化，由浅黄色变为紫色，OD570值升高。
[0106] 同理，本实施例结合Toehold-Switch开关，检测目标是金黄色葡萄球菌，针对此靶标设计Toehold-Switch元件，结合非细胞显色体系，通过体系颜色的变化判断检测靶标的存在情况。
[0107] 将实验室筛选的得到的针对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的Toehold-Switch元件等应用于上述非细胞体外显色体系，通过是否显色来判定体系中检测目标的有无。按照表1和2配制非细胞显色体系，质粒为针对各检测靶标的Toehold-Switch元件质粒，30℃条件下与不同靶标的Trigger质粒作用0.7h后，观察体系颜色变化情况并测定OD570，结果如图6所示。结果显示：当体系中无金黄色葡萄球菌靶标Trigger质粒时，体系颜色没有变化，显示浅黄色，OD值较低；当体系中存在金黄色葡萄球菌靶标Trigger时，体系颜色发生变化，由浅黄色变为紫色，OD570值升高。
[0108] 综上，我们建立了一种可视化的微量非细胞体外显色体系，该显色体系可应用于病原微生物的检测，当体系中出现检测目标时，体系颜色由浅黄色变为紫色，肉眼即可判断检测目标的有无。
[0109] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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