技术领域
[0001] 本
发明属于
植物组织培养领域，具体地说，涉及一种金龙胆草组织培养方法。
背景技术
[0002] 金龙胆草(Conyza blinii H.Lév.)属于菊科白酒草属两年生草本植物，又称熊胆草等，生长在海拔2000米左右的疏林地带，主要分布于四川攀西地区、
云南中南部及贵州西部的部分地区。作为药用植物其表现为性寒、味极苦，有清热、消炎、解毒、祛淤、消肿等功效，对祛痰、止咳、平喘、急慢性支气管炎、咽喉炎、支气管
肺炎等有显著疗效。金龙胆草药材的获取方式主要依靠采集野生植株，然而野生种金龙胆草散落分布在狭小的区域中，采集困难且数量无法满足药材市场及科研的需求。因此，我们需要一种快速繁殖金龙胆草的技术和方法以保证基本的科研和市场需求。
发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种金龙胆草组织培养方法，解决了
现有技术中存在的污染率高、死亡率高、褐化率高、出根率低以及移栽存活率低的问题。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种金龙胆草组织培养方法，包括以下步骤：
[0005] 1)外植体的选择与灭菌：采集生长健壮且无病虫害的新叶作为外植体；将外植体于流
水下冲洗30min，沥干残留水份，置于
冰上放置1h；冰浴结束后放入干净的大培养皿带进超净
工作台用70％酒精浸泡5s-30s，取出后立即用大量无菌水冲洗3-5遍，然后放入0.1％HgCl2浸泡6-9min，结束后立即用大量无菌水冲洗3-5遍，之后将外植体放在无菌
滤纸上吸干水份，备用；
[0006] 2)外植体的接种与培养：将处理好的外植体用无菌手术刀均匀切割成1cm2以上的
片段；切割完全后，按每个培养皿3个外植体将其均匀接种在预先准备好的愈伤组织诱导培养基上，用
封口膜将培养皿封好放入无光照的
培养箱进行黑暗培养，之后转入光照培养箱光照培养；在配置愈伤组织诱导培养基时向愈伤组织诱导培养基中加入1-5mg·L-1的
抗坏血酸；
[0007] 3)愈伤组织诱导出芽：将长势良好的愈伤组织分割成米粒大小，按每个培养皿5个均匀接种在含有不同
激素及配比的芽诱导培养基上，用封口膜将培养皿封好放入光照培养箱光照培养，培养条件与步骤2)中的光照培养条件相同，培养2周；
[0008] 4)增殖分化培养：当愈伤组织长出许多不定芽后，将分化较好的愈伤组织转接入含有不同激素及配比的增殖分化培养瓶中，按照步骤2)中所述的光照培养条件进行培养；经过几轮继代培养后，得到大量分化苗；
[0009] 5)根的诱导：将长势良好且苗高在2cm的分化苗用无菌手术剪剪下，一苗一株，避开侧芽，将其接种到含有不同激素及配比的生根诱导培养基上进行生根诱导培养；培养条件与步骤2)中的所述培养条件所述相同；7d-10d开始出根；
[0010] 6)炼苗与移栽：在分化苗分化出根后，再培养3周时间，待无菌苗各部位组织器官分化完全且长势健壮后，将培养瓶放入炼苗室，打开瓶盖炼苗3d；然后，小心取出试管苗，用
自来水洗去根部残留的培养基，注意不要损伤植株，移栽到组培苗专用营养土中，进行正常化管理，移栽成活率在90％以上。
[0011] 进一步地，步骤1)中的外植体的灭菌条件为：先用70％酒精浸泡10s，然后再用0.1％HgCl2浸泡8min。
[0012] 3、根据
权利要求1所述的金龙胆草组织培养方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养条件为：在20℃的条件下，黑暗培养3d，之后光照培养3周。
[0013] 进一步地，步骤2)中的培养条件为：在20℃的条件下，黑暗培养3d，之后光照培养3周。
[0014] 进一步地，光照培养过程中的光照强度为2000lx，周期为16h/d。
[0015] 进一步地，步骤2)中的愈伤组织诱导培养基具体是：MS+2,4-D1.0mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1。
[0016] 进一步地，步骤3)中的芽诱导培养基为：MS+NAA 0.1mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1。
[0017] 进一步地，步骤4)中的增殖分化培养基为：MS+GA3 1.0mg·L-1+Vc5.0mg·L-1。
[0018] 进一步地，步骤5)中的生根诱导培养基为：1/2MS+GA3 0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。
[0019] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0020] 1)本发明优化了灭菌条件，降低了外植体的污染率和死亡率。
[0021] 2)本发明调整了激素种类及配比并加入抗
氧化剂，有效抑制了愈伤组织形成过程中褐化率高的问题。
[0022] 3)本发明调整了激素种类及配比，解决了分化苗出根时间长以及出根率低的问题。
[0023] 4)本发明优化了炼苗条件，改善移栽方法，提高移栽存活率。
[0024] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
[0025] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性
实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0026] 图1是本发明金龙胆草组织培养方法的
流程图；
[0027] 图2是本发明从外植体到完整植株的整个过程；
[0028] 其中，a是愈伤组织；b是诱导出的芽；c是增殖分化长出的分化苗；d～f分别是开始出根、出根3d和出根一周的结果；g是根系完全形成后的完整植株。
具体实施方式
[0029] 以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0030] 本发明提供一种金龙胆草组织培养方法，如图1所示，包括以下步骤：
[0031] 1)外植体的选择与灭菌：采集生长健壮且无病虫害的新叶、老叶(相对新叶)、叶柄、茎节等组织器官作为备用外植体；将外植体于流水下冲洗30min，沥干残留水份，置于冰上放置1h；冰浴结束后放入干净的大培养皿带进超净工作台用70％酒精浸泡5s-30s，取出后立即用大量无菌水冲洗3-5遍，然后放入0.1％HgCl2浸泡6-9min，结束后立即用大量无菌水冲洗3-5遍，之后将外植体放在无菌滤纸上吸干水份，备用；通过实验，最终筛选出最佳的外植体为新叶，最佳灭菌组合为：70％酒精浸泡10s+0.1％HgCl2浸泡8min；
[0032] 2)外植体的接种与培养：将处理好的外植体用无菌手术刀均匀切割成1cm(茎节和叶柄)和1cm2(新叶和老叶)以上的片段，切割的时候尽量制造伤口，但不能过度损伤外植体。切割完全后，按每个培养皿3个外植体将其均匀接种在预先准备好的愈伤组织诱导培养基上，用封口膜将培养皿封好放入无光照的培养箱黑暗培养3d，之后转入光照培养箱光照培养。其中，培养箱的
温度为20℃，光照强度为2000lx，周期为16h/d；在光照培养过程中，温度对外植体的褐化有比较大的影响，将培养箱的温度设计成一个温度梯度(15℃、20℃、25℃)，最终发现20℃为最适温度。同时为减少材料的褐化率，在配置培养基时向愈伤组织诱导培养基中加入了1-5mg〃L-1的抗坏血酸(Vc)。经过一系列的前期处理与培养，大约3周左右，最终根据在不同培养基、不同培养条件下各外植体的存活率(即长出愈伤组织的外植体)筛选出最佳的愈伤组织诱导培养基和培养条件；其中，最佳愈伤组织诱导培养基为MS+-1 -1 -12,4-D 1.0mg·L +6-BA 1.0mg·L +Vc 5.0mg·L ；最佳培养条件为：在20℃的条件下，黑暗培养3d，之后光照培养3周；
[0033] 3)愈伤组织诱导出芽：将长势良好的愈伤组织分割成米粒大小，按每个培养皿5个均匀接种在含有不同激素及配比的芽诱导培养基上，用封口膜将培养皿封好放入光照培养箱光照培养，培养条件与之前相同。经过大约2周左右时间，最终根据出芽率筛选出最佳的芽诱导培养基为：MS+NAA0.1mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1；
[0034] 4)增殖分化：当愈伤组织长出许多不定芽后，为加快芽的分化与生长，将分化较好的愈伤组织转接入含有不同激素及配比的增殖分化培养瓶中，按照步骤2)所述培养条件进行培养；经过几轮继代培养后，得到大量分化苗；最终筛选出最佳的增殖分化培养基为：MS+GA3 1.0mg·L-1+Vc 5.0mg·L-1；
[0035] 5)根的诱导：将长势良好且苗高在2cm左右的分化苗用无菌手术剪剪下，尽量一苗一株，避开侧芽，然后将其接种到含有不同激素及配比的生根诱导培养基上进行生根诱导培养。培养条件与步骤2)所述相同。最快为7d，平均为10d开始出根。经过重复试验，筛选出最佳生根诱导培养基为：1/2MS+GA3 0.1mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1；
[0036] 6)炼苗与移栽：在分化苗分化出根后，再培养3周左右时间，待无菌苗各部位组织器官分化完全且长势健壮后，将培养瓶放入炼苗室，打开瓶盖炼苗3d。然后，小心取出试管苗，用自来水洗去根部残留的培养基，注意不要损伤植株，然后移栽到组培苗专用营养土中，进行正常化管理，移栽成活率在90％以上。
[0037] 本发明所用的MS培养基和1/2MS培养基均指的是含有琼脂和
蔗糖的培养基，其中蔗糖含量为30g·L-1，琼脂含量为7g·L-1，培养基的pH值均为5.8。
[0038] 如图2所示，可以看出用本方法培养外植体诱导出的愈伤组织质地均匀，
颜色正常，无明显的褐化出现；诱导出的芽和增殖分化出的分化苗数量较多且生长旺盛；诱导出根的时间较短，且根系形态正常，待形成完整植株后对环境的适应性较高，缩短实验周期，有利于快速繁殖大量植株。
[0039] 表1灭菌条件
[0040]
[0041]
[0042] 表2愈伤组织诱导条件
[0043]
[0044]
[0045] 注：“+”表示有，“-”表示没有。“+”越多表明程度越大。
[0046] 表3生根诱导条件
[0047]
[0048] 注：“+”表示有，“-”表示没有。“+”越多表明程度越大。
[0049] 从表1至表3可知，本发明优化了灭菌条件，降低了外植体的污染率和死亡率；调整了激素种类及配比并加入一定比例的抗
氧化剂，有效抑制了愈伤组织形成过程中褐化率高的问题；本发明调整了激素种类及配比，解决了分化苗出根时间长以及出根率低的问题。本发明优化了炼苗条件，改善移栽方法，提高移栽存活率。
[0050] 上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、
修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
