陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其应用
阅读：63发布：2020-05-12
专利汇可以提供陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种陆地 棉 磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的 氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了所述基因GhPIPLC2-2在培育 耐盐性 植物 或提高植物耐盐性中的应用。实验证实过表达GhP-PLC2-2基因的拟南芥中对盐敏感，敲除或RNAi该基因将显著提高植物的盐抗性，预示GhPIPLC2-2基因在应用于培育耐盐植物中具有重要作用。，下面是陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其应用专利的具体信息内容。
1.一种陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名为陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因编码的氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种含有权利要求1所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP。
4.权利要求1所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2在提高植物耐盐性中的应用。
5.权利要求1所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2在培育耐盐性植物中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述植物是拟南芥或棉花。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述拟南芥是Col-0野生型，所述棉花品种是中9807。
8.权利要求3所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因的植物表达载体pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP在提高拟南芥或棉花耐盐性中的应用。
9.权利要求3所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因的植物表达载体pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP在培育耐盐性拟南芥或棉花中的应用。
陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 人口增长和农业生态环境变化影响着人们的粮食安全。高盐胁迫将导致农作物减产。为了减轻高盐胁迫对粮食生产安全的影响，人们需要培育新的适应“高盐环境”的农作物品种，以期待这些品种可以承受在高盐胁迫下具有良好的生长发育，实现在盐碱地高产丰产，以满足人们对农产品日益增长的需求。因此，培育耐盐植物具有重要意义。
[0003] 磷脂是生物膜的一个重要的成分，磷脂中的一些成员具有重要的信号传导等生物学功能。磷脂酶可切割磷脂中的相关化学键以维持膜脂质的稳态和稳定。磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是水解磷脂甘油侧的磷酸二酯键，生成二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)和磷酸化的头部基团的酶类。根据底物特异性，植物中的PLC可分为三类：作用于常见磷脂(如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)的非特异性PLC(non-specific PLC，NPC)，水解磷酸肌醇的磷酸肌醇特异性PLC(phosphoinositide-specific PLC；PI-PLC)和水解糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)-锚定蛋白的GPI-PLC等。研究表明一些磷脂酶参与了植物应对一些生物或非生物胁迫，诸如干旱、低温、高热、高盐、高渗、重金属胁迫、磷缺乏、病原体侵染等。此外某些类型磷脂酶还能调节植物的发育过程，诸如参与调解花粉管的生长、胚胎发生以及根和叶的发育等。越来越多的结果表明，磷脂酶在植物生长，发育以及应对非生物和生物胁迫中起着重要作用。
[0004] PI-PLC可水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)产生二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-triphosphate，IP3)。PI-PLC在植物不同的发育阶段和各种组织如叶、根、茎、花和果实中表达。在拟南芥、水稻等多种植物中，干旱、寒冷、盐、热、ABA和水杨酸(SA)等显著诱导PI-PLC的表达，PI-PLC可在植物生长发育和应激反应中发挥重要作用。尽管PI-PLC的信号传导功能已在动物系统中得到了较为明确的阐述，但PI-PLC在植物中的作用机理仍有待进一步探究。为了更好地了解植物PI-PLC的功能，在棉花中探讨PI-PLC并研究其功能也是非常必要的。然而检索发现有关陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其在提高植物耐盐性中的应用尚未见报道。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其在提高植物耐盐性中的应用。
[0006] 本发明所述的陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名为陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为1737bp。进一步的，所述GhPIPLC2-2基因含有9个外显子，8个内含子。
[0007] 本发明还公开了所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因编码的氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码578个氨基酸。进一步的，所述GhPIPLC2-2基因编码的蛋白含有氨基酸数578个，理论等电点6.02，分子量为66126.45Da。
[0008] 本发明还提供了含有上述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的表达载体。所述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。
[0009] 任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，诸如：pCAMBIA1300-GFP、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pX-YFP、pBI121等载体，本发明优选的是pX-YFP载体。
[0010] 上述pCAMBIA1300-GFP等载体可从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心等机构(公司)获取。本发明涉及的pX-YFP载体及其应用见相关文献(Tian Y,Fan M,Qin Z,et al.Hydrogen peroxide positively regulates brassinosteroid signaling through oxidation of the BRASSINAZOLE-RESISTANT1 transcription factor[J].Nature Communications,2018,9(1):1063.)。
[0011] 本发明所述含有陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP。
[0012] 本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2在提高植物耐盐性中的应用。
[0013] 本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2在培育耐盐性植物中的应用。
[0014] 上述的应用中：所述植物优选是拟南芥或棉花。进一步优选所述拟南芥是Col-0野生型，所述棉花品种是中9807。
[0015] 本发明所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因的植物表达载体pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP在提高拟南芥或棉花耐盐性中的应用。
[0016] 本发明所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因的植物表达载体pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP在培育耐盐性拟南芥或棉花中的应用。
[0017] 本发明中首先在棉花9807植株中克隆到磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2；实验发现在200mM NaCl盐胁迫3h和6h的条件下，四叶期叶片中的GhPIPLC2-2均表现出GhPIPLC2-2基因表达水平的上调，体现在高盐胁迫3h时GhPIPLC2-2表达水平上调
3.96倍，高盐胁迫6h时GhPIPLC2-2表达水平上调7.89倍。利用Gateway系统将GhPIPLC-2-2基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(Thermo Fisher Scientific，货号12536017)，Cloning Vectors PDONR221图谱参见图1。通过转化的方法该质粒在大肠杆菌
TransT5α中得到大量克隆，进行LR反应把GhPIPLC2-2基因连接到表达载体pX-YFP中获得植物表达载体pX-GhPIPLC2-2-YFP，其在大肠杆菌TransT5α中表达后提取质粒，将质粒转入农杆菌菌株GV3101中，利用农杆菌介导法将GhPIPLC2-2基因导入拟南芥(Col-0)中，对GhPIPLC2-2基因的抗逆功能进行了验证。结果显示：本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的表达受高盐胁迫诱导。通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过研究发现转基因植株的对高盐更敏感，敲除或RNAi该基因将显著提高植物的盐抗性，预示GhPIPLC2-2基因应用于培育耐盐植物或在提高植物耐盐性中具有重要作用。因此，可通过基因编辑或RNAi方法，下调陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2基因的表达，通过分子检测和植株抗逆性测定选出抗性明显提高的转基因植株。在进一步通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，即可筛选出耐盐性明显提高的转基因材料。
3.96倍，高盐胁迫6h时GhPIPLC2-2表达水平上调7.89倍。利用Gateway系统将GhPIPLC-2-2基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(Thermo Fisher Scientific，货号12536017)，Cloning Vectors PDONR221图谱参见图1。通过转化的方法该质粒在大肠杆菌
TransT5α中得到大量克隆，进行LR反应把GhPIPLC2-2基因连接到表达载体pX-YFP中获得植物表达载体pX-GhPIPLC2-2-YFP，其在大肠杆菌TransT5α中表达后提取质粒，将质粒转入农杆菌菌株GV3101中，利用农杆菌介导法将GhPIPLC2-2基因导入拟南芥(Col-0)中，对GhPIPLC2-2基因的抗逆功能进行了验证。结果显示：本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的表达受高盐胁迫诱导。通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过研究发现转基因植株的对高盐更敏感，敲除或RNAi该基因将显著提高植物的盐抗性，预示GhPIPLC2-2基因应用于培育耐盐植物或在提高植物耐盐性中具有重要作用。因此，可通过基因编辑或RNAi方法，下调陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2基因的表达，通过分子检测和植株抗逆性测定选出抗性明显提高的转基因植株。在进一步通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，即可筛选出耐盐性明显提高的转基因材料。
[0018] 本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次在棉花9807植株中克隆到磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2，并通过实验证实过表达GhPPLC2-2基因的拟南芥中对盐敏感，敲除或RNAi该基因将显著提高植物的盐抗性，预示GhPIPLC2-2基因在应用于培育耐盐植物在提高植物耐盐性中具有重要作用。附图说明
[0019] 图1、 Cloning Vectors PDONR221图谱。
[0020] 图2、盐胁迫下棉花GhPIPLC2-2基因在叶片中的表达模式。
[0021] 图3、大肠杆菌TransT5α的菌落PCR鉴定
[0022] 其中：泳道1为DNA Marker DL2000；泳道2～9号是菌落PCR结果。
[0023] 图4、植物表达载体pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP的T-DNA区
[0024] 图5、pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP质粒转化大肠杆菌TransT5α的菌落PCR鉴定[0025] 其中：泳道1为DNA Marker DL2000；泳道2～17号是菌落PCR结果。
[0026] 图6、转GhPIPLC2-2-YFP基因拟南芥的免疫印迹分析
[0027] 使用anti-YFP抗体对不同转基因植物中YFP蛋白质水平的免疫印迹分析。其中anti-actin蛋白的抗体作为对照。OE1～OE17为转GhPIPLC2-2-YFP基因拟南芥株系。M为蛋白质maker(Themo Scientific,#26616)。
[0029] 其中：a、1/2MS培养基；b、150mMNaCl的1/2MS培养基。
[0030] 图8、NaCl胁迫下拟南芥幼苗主根的根长。
[0031] 图9、200mM NaCl胁迫5d后拟南芥的表型。
[0032] 图10、200mM NaCl胁迫5d后拟南芥的生物量。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
[0034] 下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。
[0035] 下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 实施例1:高保真PCR扩增GhPIPLC2-2目的基因
[0037] 取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京，RN38)说明书，提取植物总RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit(TaKaRa，大连，RR047A)反转录试剂盒反转录得到cDNA。以特异引物进行高保真PCR扩增。
[0038] 特异引物序列如下：
[0039] GhPIPLC2-2-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGTCCAAACAAACTTACAGGG；
[0040] GhPIPLC2-2-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGATGAATTCAAAGTGCATAAGGAGC。
[0041] 下划线表示BP反应同源重组位点。
[0042] PCR反应总体积为50μL，反应体系为：10μL 5×pfu Buffer，1μL dNTP，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL FastPfuDNA Polymerase，1μL稀释十倍的cDNA模板，ddH2O补齐至50μL。
[0043] PCR扩增条件，预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec，最后72℃延伸10min。
[0044] 将PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收(TIANGEN，北京)纯化后，连接到PDONR221载体上。然后转化大肠杆菌TransT5α，进行测序分析。通过上述步骤，获得了陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的cDNA的核苷酸序列。
[0045] 具体的，通过高保真酶扩增获得陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhPIPLC2-2的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为1737bp。所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，编码578个氨基酸。
[0046] 实施例2：GhPIPLC2基因在盐胁迫下的表达模式分析
[0047] 陆地棉中9807(Gossypiumhirsutum L.Var.Zhong9807)种子经消毒后种植在温室中，生长条件为：30℃/25℃，相对湿度为60～70％，光照14h，黑暗10h，光子通量密度为800μmol m-2s-1。生长至四叶期时，进行盐(200mM NaCl)处理，处理时间分别是3h和6h。提取总RNA并反转为cDNA，稀释10倍后用于实时荧光定量PCR分析。陆地棉Histone基因(GenBank accession number NC_006639)为内标。荧光定量PCR反应试剂盒为TAKARA的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，反应在 96System荧光定量仪中进行，进行3次生物学重复，实验结果用相对定量2-ΔΔCt法计算GhPIPLC2-2基因的表达量。
[0048] 其中涉及引物序列为：
[0049] GhPIPLC2-2-qRT-F：AGAGGATGATTCACAACGGGG；
[0050] GhPIPLC2-2-qRT-R：GCTGCGACTTTTCTCCATCATC；
[0051] 所设PCR程序为预变性95℃5min，39个循环：95℃，20sec；60℃，20sec；72℃，20sec。
[0052] 结果表明，在盐胁迫3h和6h后，GhPIPLC2-2均表现出基因表达水平上调，在盐胁迫3h时表达水平上调3.96倍，在盐胁迫6h时表达水平上调7.89倍(图2)。因此，GhPIPLC2-2基因的表达受高盐诱导。
[0053] 实施例3：GhPIPLC2-2基因功能的验证
[0054] 1、拟南芥表达载体的构建
[0055] 取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京，DP432)说明书，提取植物总RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit(TIANGEN，北京，RN38)反转录试剂盒反转录得到cDNA。以特异引物进行高保真PCR扩增。特异引物序列如下：
[0056] GhPIPLC2-2-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGTCCAAACAAACTTACAGGG；
[0057] GhPIPLC2-2-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGATGAATTCAAAGTGCATAAGGAGC(下划线表示BP同源重组位点)
[0058] PCR反应总体积为50μL，反应体系为：10μL5×pfu Buffer，1μL dNTP，1μL正向引物，1μL反向引物，1μLFastPfuDNA Polymerase，1μL稀释十倍的cDNA模板，ddH2O补齐至50μL。PCR扩增条件为：预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec，最后72℃延伸10min。
[0059] 将PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收(TIANGEN，北京，DP209)纯化后连接到 Cloning Vectors pDONR221载体上(图1)，然后转化大肠杆菌感受态细胞TransT5α，进行菌落PCR验证。菌落PCR鉴定所用引物序列是：M13F，TGTAAAACGACGGCCAGT；
GhPIPLC2-2-R，GATGAATTCAAAGTGCATAAGGAGC，菌落PCR预期大小为1737bp条带，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果参见图3，目的条带结果与预期相符，大小基本正确。挑取大小正确的菌落进行测序分析，结果表明GhPIPLC2-2基因正确连接到pDONR221载体中。
GhPIPLC2-2-R，GATGAATTCAAAGTGCATAAGGAGC，菌落PCR预期大小为1737bp条带，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果参见图3，目的条带结果与预期相符，大小基本正确。挑取大小正确的菌落进行测序分析，结果表明GhPIPLC2-2基因正确连接到pDONR221载体中。
[0060] 测序正确的菌株提取质粒后，将所提取的质粒浓度稀释为70ng/μL，将pX-YFP载体的浓度也稀释为70ng/μL，按照反应体系：1μLpDORN221-GhPIPLC2-2，1μL pX-YFP,0.5μL LR酶(invitrogen，#1993359)，25℃金属浴中反应1h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TransT5α，获得用于拟南芥转化的植物表达载体：pX-bar-GhPIPLC2-2-YFP，植物表达载体T-DNA区如图4所示。
[0061] 菌落PCR鉴定所用引物序列是：
[0062] GhPIPLC2-2-F:ATGTCCAAACAAACTTACAGGG；
[0063] CFP-N:CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG；
[0064] 菌落PCR预期大小为1737bp条带，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果参见图5，目的条带结果与预期相符，大小基本正确。大小正确的菌株提取质粒转化农杆菌GV3101后用于浸染野生型拟南芥Col-0植株。
[0065] 2、拟南芥转基因植株的获得
[0066] (1)在-80℃冰箱中取出已转化目的基因的农杆菌菌株(菌株名称：GV3101)，用接种环沾取菌液在YEB固体培养基(含50μg/mL Rif，50μg/mL Km)上划线，28℃生化培养箱中培养2～3d。
[0067] (2)在YEB固体培养基上挑取单菌落，接种于30mL YEB液体培养基中(含50μg/mL Rif，50μg/mL Km)，28℃220rpm摇床震荡培养24h，OD600至0.8～1.5后备用。
[0068] (3)将摇好的农杆菌菌液加入50mL灭过菌的离心管中，25℃，4000rpm离心10min。弃掉上清液，收集菌体。用40mL灭菌重悬液(8μL SilwetL-77，2g蔗糖，40mL H2O)将收集菌体悬浮，用移液枪缓缓吹打使其混匀。
[0069] (4)野生型拟南芥在转化前一天需浇足水。转化前将拟南芥上的白色果荚全部剪掉，然后将拟南芥花序全部浸入农杆菌重悬液中，浸泡30sec。将侵染过的Col-0拟南芥置于温室中培养，待种子成熟后将其收获得T1代种子。
[0070] 3、拟南芥转基因植株的免疫印迹分析
[0071] 将单株收取的T2代种子消毒后铺于1/2MS培养基上，置于光照培养箱生长一周左右，每种材料称取叶片约30mg，迅速冻于液氮里。将样品充分研磨破碎后，加入2倍体积的SDS loading bufer，充分混匀后于离心机中4℃、15000rpm离心15分钟，取上清于新的离心管中，进行SDS-PAGE。
[0072] (1)上样
[0073] SDS-PAGE电泳浓缩胶浓度为5％，pH＝6.8；分离胶浓度为8％，pH＝8.8。加满新鲜的电泳缓冲液于电泳内槽，外槽中加电泳液至电泳槽中间凸起处，将蛋白样品上样。
[0074] (2)电泳
[0076] (3)转膜
[0077] 截取大小合适的NC膜及4张waterman滤纸，将切好的2张waterman滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放入半干转印槽中间位置(注意每层之间不要有气泡)，将切好的NC膜，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的两张waterman滤纸上(注意每层之间不要有气泡)，将切好的PAGE胶，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的NC膜上(注意每层之间不要有气泡)，将切好的剩余2张waterman滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的PAGE胶上(注意每层之间不要有气泡)，将圆筒状50ml离心管放在waterman滤纸上，轻压滚动，驱赶气泡。然后盖上黑色盖板(注意方向，注意卡槽入槽)再盖上乳白色盖板。转膜条件设置为15V电压，进行15min电泳。
[0078] (4)免疫反应
[0079] 转完膜后将膜直接放入10ml含有5％的脱脂奶粉的TBST液中(方皿中)，置于摇床上摇动封闭1h，1h后将封闭液倒掉，将一抗(Protein Find Goat Anti-gfp mousemonoclonal Antibody，HT801)用10ml含有5％的脱脂奶粉的TBST稀释至适当浓度(1/
5000稀释)倒入刚才的方皿中，室温下孵育2h。然后用TBST在室温下在摇床上洗两次，每次
10min。然后将1/5000稀释好的HRP标记的二抗稀释液(Protein FindTM Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate，HS201-01)倒入刚才的方皿中，室温下孵育1h，用TBS液T在室温下摇床上洗两次，每次10min；进行化学发光反应。
5000稀释)倒入刚才的方皿中，室温下孵育2h。然后用TBST在室温下在摇床上洗两次，每次
10min。然后将1/5000稀释好的HRP标记的二抗稀释液(Protein FindTM Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate，HS201-01)倒入刚才的方皿中，室温下孵育1h，用TBS液T在室温下摇床上洗两次，每次10min；进行化学发光反应。
[0080] (5)化学发光成像
[0081] 在干净的实验台面上铺一层透明包花玻璃纸，将NC膜正面朝上放在玻璃纸上，将化学发光液(TanonTM high-sig ECL western blotting substrate，天能180-501)等体积混匀后均匀撒在NC膜上，左右抖动铺纸10次左右(目的是将底物充分均匀分布在膜上)，盖上盖纸经化学发光底物显色液显色10min进行曝光成像分析。结果如图6所示。免疫印迹结果表明GhPIPLC2-2-YFP基因在拟南芥中进行了表达。挑选出了蛋白表达水平较高的OE-11和OE-15株系用于后续实验分析。
[0082] 4、转基因拟南芥的耐盐性
[0083] 4.1盐胁迫下转基因拟南芥的萌发率
[0084] 将转基因OE-11、OE-15株系种子与野生型(Col-0)拟南芥种子经消毒液消毒后，分别播种于1/2MS培养基和含150mM NaCl的1/2MS培养基中，春化3d，放置于光照培养箱内，分别于播种后的0、24、36、48、60、72、84h统计萌发率并进行统计分析。
[0085] 结果表明，在1/2MS培养基中点播后60h，拟南芥各株系的萌发率接近100％，表明实验所用拟南芥的种子质量良好，均能萌发。在150mM NaCl的1/2MS培养基中点播后84h后，拟南芥各株系的萌发率不再增加，株系OE-11、OE-15的萌发率分别只有野生型拟南芥的50.49％和29.83％，且过表达株系OE-11、OE-15拟南芥较野生型拟南芥相比萌发延迟1d(图
7)。因此，GhPIPLC2-2基因对盐胁迫敏感，敲除该基因将能显著提高植物的耐盐性。
7)。因此，GhPIPLC2-2基因对盐胁迫敏感，敲除该基因将能显著提高植物的耐盐性。
[0086] 4.2、盐胁迫下拟南芥根系的生长
[0087] 将转基因OE-11、OE-15株系的拟南芥种子与野生型拟南芥(col-0)种子灭菌后，分别播种于1/2MS培养基和含150Mm NaCl的1/2MS培养基中，春化3d后，放置于光照培养箱内，竖直生长7d后，分别统计各株系拟南芥主根的长度。
[0088] 结果表明，在1/2MS培养基中竖直生长7d后，株系OE-11、OE-15和野生型植株的主根长度在20.46～24.27mm之间，野生型对照与过表达株系主根长度差异不显著(图8)。在150mM NaCl的1/2MS培养基中竖直生长7d后，株系OE-11、OE-15和野生型植株的主根长度在
7.21～10.69mm之间，野生型对照与过表达株系主根长度差异显著，其中株系OE15的主根长度为野生型对照的82.51％，株系OE11的主根长度为野生型对照的67.45％(图8)。因此，转GhPIPLC2-2基因拟南芥种子的主根长度显著低于与野生型拟南芥，GhPIPLC2-2基因对盐敏感，推测敲除该基因将能显著提高拟南芥的耐盐性。
7.21～10.69mm之间，野生型对照与过表达株系主根长度差异显著，其中株系OE15的主根长度为野生型对照的82.51％，株系OE11的主根长度为野生型对照的67.45％(图8)。因此，转GhPIPLC2-2基因拟南芥种子的主根长度显著低于与野生型拟南芥，GhPIPLC2-2基因对盐敏感，推测敲除该基因将能显著提高拟南芥的耐盐性。
[0089] 4.3盐胁迫下拟南芥的生物量
[0090] 将野生型拟南芥种子与转基因OE-15株系种子经消毒液消毒后，播种于1/2MS培养基，光照培养箱萌发生长7d后移苗至蛭石中，置于温室中培养(培养条件：光照强度为120μ-2 -1mol m s 、温度为22℃，相对湿度为40％，光周期为16h光照、8h黑暗)。拟南芥小苗生长至4周大时用200mM NaCl进行盐胁迫处理，胁迫处理5d后测定植株生物量。
[0091] 结果表明，在正常生长条件下，OE-15株系拟南芥单株鲜重为0.1933±0.0153g，野生型株系单株鲜重为0.2000±0.010g，二者生物量差异不显著。在200mMNaCl处理5d后，OE-15株系叶片表现出明显的盐害症状，长势显著弱于野生型对照(图9)。OE-15株系拟南芥单株鲜重为0.0783±0.0044g，株系OE-15的单株生物量只有野生型对照的47.46％(图10)。因此，转GhPIPLC2-2基因拟南芥对盐胁迫表现更为敏感，敲除该基因将能显著提高植物的盐抗性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种天然气生物乳液压裂液及其制备方法和应用 | 2020-05-08 | 65 |
| 一种基于多级生物自调节体系的凡纳滨对虾高密度养殖方法 | 2020-05-13 | 502 |
| 一种膜生物膜培养驯化工艺及处理高盐废水用膜生物膜反应装置 | 2020-05-08 | 131 |
| 一种负载金-功能化多孔TiO2薄膜及在SALDI-MS分析中的应用 | 2020-05-08 | 513 |
| 一种以改性凹土为交联剂的聚丙烯酸增稠剂及其制备方法 | 2020-05-11 | 117 |
| 一种用于稠油的水溶性洗油剂及其制备方法 | 2020-05-12 | 235 |
| 一种基于乙二醛酶活力筛选耐盐萱草品种的方法 | 2020-05-11 | 112 |
| 一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺 | 2020-05-12 | 88 |
| 一种水稻苗期耐盐性的快速鉴定方法 | 2020-05-12 | 164 |
| 一种耐腐蚀、抗紫外蹦蹦云 | 2020-05-08 | 763 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈